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DE10261125A1 - Preparing stem cells from pancreas, useful as transplants for treating type I diabetes, by converting pancreatic tissue to a suspension and cell selection, applicable to small biopsy samples - Google Patents

Preparing stem cells from pancreas, useful as transplants for treating type I diabetes, by converting pancreatic tissue to a suspension and cell selection, applicable to small biopsy samples Download PDF

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DE10261125A1
DE10261125A1 DE2002161125 DE10261125A DE10261125A1 DE 10261125 A1 DE10261125 A1 DE 10261125A1 DE 2002161125 DE2002161125 DE 2002161125 DE 10261125 A DE10261125 A DE 10261125A DE 10261125 A1 DE10261125 A1 DE 10261125A1
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Germany
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stem cells
cells
suspension
pancreatic tissue
diabetes
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DE2002161125
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German (de)
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Jochen Seißler
Monika Herten
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CARDION AG
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CARDION AG
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells

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Abstract

Preparing stem cells (SC) from the pancreas comprising generating an SC-containing suspension by chemical, preferably biochemical, treatment of pancreatic tissue, then performing a selection for SC, is new.

Description

Der Diabetes mellitus ist eine Erkrankung, die mit einer chronischen Hyperglykämie (Blutzuckererhöhung) einhergeht und in der Folge einer Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen (Typ 1 Diabetes) auftritt. Beide Formen des Diabetes sind mit einer deutlich gesteigerten Komorbidität von Herz- Kreislauferkrankungen und der Gefahr der Entwicklung von diabetesspezifischen Folgeerkrankungen der Augen (Retinopathie mit der Gefahr der Erblindung), der Nieren (Nephropathie bis zur Dialysepflichtigkeit) und des Nervensystems (Polyneuropathie) verbunden. Obwohl die Einführung moderner Behandlungskonzepte zur Verbesserung der Stoffwechseleinstellung von Diabetikern geführt hat, wird das Ziel einer normnahen Blutzuckereinstellung von der Mehrheit der Patienten nicht erreicht. Schon nach nur zehnjähriger Diabetesdauer sind bei 20 – 30 % der Patienten Folgeerkrankungen nachweisbar. Das Ziel einer Heilung des Diabetes kann nur durch eine Zellersatztherapie durch Transplantation von isolierten Langerhans'schen Inseln oder β-Zellen erreicht werden. Aufgrund des Mangels an Spenderorganen kann diese Therapie jedoch bisher nur wenigen Patienten angeboten werden. Eine mögliche Alternative, um große Mengen von β-Zellen herzustellen, ist die Verwendung von Stammzellen. Da der Einsatz von embryonalen Stammzellen beim Menschen mit großen ethischen Bedenken behaftet ist, war es das Ziel dieser Studie, Stammzellen aus adultem Pankreasgewebe zu isolieren.Diabetes mellitus is a disease that with chronic hyperglycemia (Blood sugar increase) goes hand in hand and as a result of the destruction of the insulin-producing β cells (type 1 diabetes) occurs. Both forms of diabetes are evident with one increased comorbidity of cardiovascular diseases and the risk of developing diabetes-specific secondary diseases of the eyes (retinopathy with the risk of blindness), the kidneys (nephropathy up to the need for dialysis) and the nervous system (polyneuropathy). Although the introduction of modern treatment concepts has improved the metabolism of diabetics, is the goal of a standard blood sugar control by the majority the patient has not reached. After just ten years of diabetes are at 20 - 30 % of patients detectable secondary diseases. The goal of a cure diabetes can only be achieved through cell replacement therapy through transplantation of isolated Langerhans Islets or β cells can be achieved. Due to the lack of donor organs, this can However, therapy has so far only been offered to a few patients. A possible Alternative to great Amounts of β cells is the use of stem cells. Because the use of embryonic stem cells in humans with large ethical With concerns, the aim of this study was to study stem cells isolate from adult pancreatic tissue.

Bisher wurde die Isolierung von Stammzellen aus isolierten Inseln (Zulewski/Habener, Diabetes 2001), Insel/Pankreasgangpräparationen (Ramiya/Peck/Cornelius, HMR 1997, Nat Med. 2000) oder isolierten Pankreasgängen (Bonner-Weir, PNAS 2000) beschrieben. Das heißt, dass bisher eine aufwendige Methode der Zellisolierung durchgeführt werden musste, um die Stammzellen anzuzüchten. Diese Methoden wären mit wenig Material (z. B. Pankreasbiopsie) nicht anwendbar.So far, the isolation of stem cells from isolated islands (Zulewski / habener, Diabetes 2001), island / pancreatic duct preparations (Ramiya / Peck / Cornelius, HMR 1997, Nat Med. 2000) or isolated pancreatic ducts (Bonner-Weir, PNAS 2000). That means that so far an elaborate Method of cell isolation had to be done to the stem cells to breed. These methods would be not applicable with little material (e.g. pancreatic biopsy).

Aufgabe der Erfindung war die Bereitstellung eines Verfahren, das in einfacher Weise Stammzellen von hoher Güte bereitstellt. Zur Lösung dieser Aufgabe wird Pankreasgewebe durch chemische, insbesondere biochemische Behandlung in eine Stammzellen enthaltende Suspension überführt, die anschließend einer Selektion unterzogen wird.The object of the invention was to provide a Process that provides high quality stem cells in a simple manner. To the solution This task is accomplished by chemical, in particular, pancreatic tissue biochemical treatment in a suspension containing stem cells, which is then a Is subjected to selection.

Erfindungsgemäß ist beliebiges Pankreasgewebe verwendbar, wobei sogar äußerst geringe Mengen ausreichen, wie beispielsweise Biopsiematerial, insbesondere auch Gewebe einer Feinnadelbiopsie und sogar Gewebe einer Aspirationsbiopsie. Die erfindungsgemäß hergestellten Stammzellen lassen sich bisher unbegrenzt und sehr schnell vermehren. Weiterhin wird ein klonieren der Stammzellen auf Einzelzellebene ermöglicht. Zur Isolation von Stammzellen aus beliebigem Pankreasgewebe sind sämtliche Substanzen geeignet, die zum Vereinzeln von Zellen beitragen. Komplexbildner wie EDTA scheinen geeignet. Bevorzugt erfolgt ein Verdau des Pankreasbindegewebes. Hierzu eignen sich Enzyme wie Collagenase oder Trypsin. Mittels Verdau sind Einzelzellen aus dem Gesamtpankreasgewebe erhältlich. Einzelzellen und auch Stammzellen aufweisende Sphäroide können in Suspension dispergiert werden.Any pancreatic tissue is according to the invention usable, even extremely small amounts sufficient, such as biopsy material, in particular Tissue from a fine needle biopsy and even tissue from an aspiration biopsy. The produced according to the invention So far, stem cells can be proliferated indefinitely and very quickly. Furthermore, the stem cells are cloned at the individual cell level allows. All are for the isolation of stem cells from any pancreatic tissue Suitable substances that contribute to the separation of cells. complexing like EDTA seem appropriate. The pancreatic connective tissue is preferably digested. Enzymes such as collagenase or trypsin are suitable for this. through For digestion, single cells are available from the entire pancreatic tissue. Single cells and also spheroids containing stem cells can be in Suspension are dispersed.

Unter Selektion wird jede Technik oder Technologie verstanden, die nicht auf manuelle Sortierung angewiesen ist. Eine geeignete Selektionsmöglichkeit ist das Anheften unerwünschter Zellen an Träger. Dies geschieht beispielsweise durch einen Kultivierungsschritt auf Collagen beschichteten Platten, bei dem vorhandene Fibroblasten enffernt werden. Analog hierzu können auch Kunststoffflaschen verwendet werden, die vorzugsweise mit einem Trägermaterial wie Collagen benetzt worden sind, wobei sich die Fibroblasten an den Kunststoffwänden anheften. Ggf. mitanhaftende gewünschte Zellen lassen sich durch Schütteln wieder in Suspension bringen.Every technique is under selection or technology that doesn't rely on manual sorting is. A suitable selection option tacking is more undesirable Cells on carrier. This happens, for example, through a cultivation step on collagen coated plates from which existing fibroblasts are removed become. Analogously to this also plastic bottles are used, preferably with a support material how collagen has been wetted, with the fibroblasts on the plastic walls to pin. Possibly. adherent desired Cells can be shaken bring it back into suspension.

Die Selektion kann auch mittels Antikörpern durchgeführt werden. Mit Antikörpern können einerseits die unerwünschten Zellen gebunden werden, andererseits können mit spezifischen Antikörpern gegen CD9 die gewünschten Zellen selektiv gebunden werden. Eine geeignete Arbeitstechnik hierfür ist die Antikörper auf sogenannte magnetic beats aufzubringen und auf diese Weise von der Suspension abzutrennen.The selection can also be carried out using antibodies. With antibodies can on the one hand the undesirable Cells are bound, on the other hand, with specific antibodies against CD9 the desired Cells are selectively bound. A suitable working technique for this is the antibody apply so-called magnetic beats and in this way from the Separate suspension.

Mit dieser Arbeitstechnik ist es erstmals möglich, besonders elegant Zellen selektiv abzutrennen.With this working technique it is possible for the first time selectively separate cells particularly elegantly.

Eine weitere Technik ohne manuelle Selektion ist die ebenfalls anwendbare Dichtegradientenzentrifugation.Another technique without manual Selection is the density gradient centrifugation that can also be used.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten adulten pankreatischen Stammzellen (APSC) vermehren sich sehr schnell (1). Damit sind sie für die Gewinnung großer Zellzahlen für die Differenzierung geeignet. Weiterhin lassen sich die Zellen in der Zellkultur bisher zeitlich unbegrenzt vermehren, d. h. bislang bereits über ein Jahr. Außerdem konnten die Stammzellen auf Einzelzellebene kloniert werden. Somit sind Zelllinien erhältlich, die lediglich von einer Zelle abstammen und daher nicht mehr mit anderen Zellen kontaminiert sind.The adult pancreatic stem cells (APSC) produced by the process according to the invention multiply very quickly ( 1 ). They are therefore suitable for the extraction of large numbers of cells for differentiation. Furthermore, the cells in the cell culture have so far been able to multiply indefinitely, that is to say over a year. In addition, the stem cells could be cloned at the single cell level. This means that cell lines are available that are derived from just one cell and are therefore no longer contaminated with other cells.

Im folgenden wird die Erfindung mit Bezug auf Beispiele verdeutlicht.In the following the invention with Clarified with reference to examples.

1 zeigt eine Wachstumskurve der Stammzellen mH1 4.4 und mH9 4.1. Hierbei wurden jeweils zweimal 105 Zellen am Tag 0 auf eine 20 ml Zellkulturflasche ausgesät. Die Bestimmung der Zellen erfolgte am Tag 3, 5 und 7. 1 shows a growth curve of the stem cells mH1 4.4 and mH9 4.1. In this case, 10 5 cells were seeded twice on a 20 ml cell culture bottle on day 0. The cells were determined on days 3, 5 and 7.

2 zeigt Stammzellenmarker und β-Progenitor-Zellmarker der Mausklone mH1 4.4 und mH9 4.1. Diese Marken wurden mit einer RT-PCR analysiert. Die angewendete PCR wurde mit spezifischen Primern gegen β-Aktin, Oct4, BCRP1, Nestin, Sox1, Pdx1, Ngn3, Nkx6.1 und Pax6 durchgeführt. Gezeigt ist die PCR mit und ohne (-RT) Reverse Transkription der mRNA. 2 shows stem cell markers and β-progenitor cell markers of the mouse clones mH1 4.4 and mH9 4.1. These marks were analyzed with an RT-PCR. The PCR used was carried out with specific primers against β-actin, Oct4, BCRP1, Nestin, Sox1, Pdx1, Ngn3, Nkx6.1 and Pax6. Shown is the PCR with and without (-RT) reverse transcription of the mRNA.

3 ist eine phasenmikroskopische Aufnahme der mH1 4.4 Zellen bei niedriger (A) und hoher (B) Zelldichte. 3 is a phase micrograph of the mH1 4.4 cells with low (A) and high (B) cell density.

4 ist eine phasenmikroskopische Aufnahme der mH9 4.1 Zellen bei niedriger (A) und hoher (B) Zelldichte. 4 is a phase micrograph of the mH9 4.1 cells with low (A) and high (B) cell density.

5 ist eine FACS Analyse der mH1 4.4 und mH9 4.1 Zellen. Hierbei handelt es sich um eine Markierung der Zellen mit einem PE-markierten Anti-CD9 Antikörper. Die gestrichelte Linie ist die Isotop Kontrolle. 5 is a FACS analysis of the mH1 4.4 and mH9 4.1 cells. This involves labeling the cells with a PE-labeled anti-CD9 antibody. The dashed line is the isotope control.

Beispiel 1example 1

Einzelzellen aus dem Gesamtpankreasgewebe werden aus 1 g eines einem Menschen entnommenen Pankreasgewebes durch Collagenaseverdau mit 3 mg/ml Collagenase während 15–20 min Behandlung bei 37°C hergestellt. Die Einzelzellen werden 3 mal mit 10 ml Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) gewaschen. Darauf erfolgt ein Kultivierungsschritt der Zellsuspension mit einer Konzentration von 1 × 104 Zellen / ml DMEM auf mit 5 μg / cm2 Collagen vorbeschichteten Zellkulturflaschen. Die Zellen werden kontinuierlich in 10 ml DMEM-Medium, 10 % FCS, 2 mMol Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin mit 5 ng/ml EGF (Komplettmedium) kultiviert. Nach einem Tag sind die Fibroplasten an der Flasche angewachsen. Die Flasche kann dann leicht geschüttelt werden. Die in Suspension befindlichen Zellen werden gewaschen und mit frischem Komplettmedium in eine neue Flasche gefüllt. Nach einigen Wochen können die Zellen mit Stammzelleigenschaften gemäß 2 gewonnen werden. Diese Zellen vermehren sich sehr schnell, eignen sich als dauerhafte Quelle von Stammzellen und können auf Einzelzellebene kloniert werden.Single cells from the total pancreatic tissue are produced from 1 g of pancreatic tissue taken from a human by collagenase digestion with 3 mg / ml collagenase during 15-20 min treatment at 37 ° C. The individual cells are washed 3 times with 10 ml of Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM). This is followed by a cultivation step of the cell suspension with a concentration of 1 × 10 4 cells / ml DMEM on cell culture bottles precoated with 5 μg / cm 2 collagen. The cells are continuously cultured in 10 ml DMEM medium, 10% FCS, 2 mmol glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin with 5 ng / ml EGF (complete medium). After a day, the fibroblasts have grown on the bottle. The bottle can then be shaken gently. The cells in suspension are washed and filled with fresh complete medium into a new bottle. After a few weeks, the cells with stem cell properties can be changed 2 be won. These cells multiply very quickly, are suitable as a permanent source of stem cells and can be cloned at the single cell level.

Beispiel 2Example 2

Einzelzellen aus dem Gesamtpankreasgewebe werden aus 1/2 Organ einer Maus durch Collagenaseverdau mit 3 mg/ml Collagenase während 15–20 min Behandlung bei 37°C hergestellt. Die Einzelzellen werden 3 mal mit 10 ml DMEM gewaschen. Darauf erfolgt ein Kultivierungsschritt der Zellsuspension mit einer Konzentration von 1 × 104 Zellen / ml DMEM auf mit 5 μg / cm2 Collagen vorbeschichteten Zellkulturflaschen. Anschließend werden die Zellen kontinuierlich in 10 ml DMEM-Medium, 10 % FCS, 2 mMol Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin mit 5 ng/ml EGF (Komplettmedium) kultiviert. Nach 24 h sind die Fibroplasten an der Flasche angewachsen. Die Flasche kann dann leicht geschüttelt werden. Die in Suspension befindlichen Zellen werden gewaschen und mit frischem Komplettmedium in eine neue Flasche gefüllt. Nach einigen Wochen können die Zellen mit Stammzelleigenschaften gemäß 2 gewonnen werden. Die 3 und 4 zeigt eine phasenmikroskopische Aufnahme der Stammzellen mH1 4.4 und mH9 4.1 bei niedriger (A) und hoher (B) Zelldichte. Diese Zellen vermehren sich sehr schnell (1), sind seit 14 Monaten unbegrenzt vermehrbar, eignen sich als dauerhafte Quelle von Stammzellen und können auf Einzelzellebene kloniert werden. In der FACS Analyse zeigt sich die Expression von CD9 auf den Stammzellen nach Färbung mit einem PE-markierten Anti-CD9 Antikörper (5).Single cells from the entire pancreatic tissue are produced from 1/2 organ of a mouse by collagenase digestion with 3 mg / ml collagenase during 15-20 min treatment at 37 ° C. The single cells are washed 3 times with 10 ml DMEM. This is followed by a cell suspension cultivation step with a concentration of 1 × 10 4 cells / ml DMEM on cell culture bottles precoated with 5 μg / cm 2 collagen. The cells are then continuously cultured in 10 ml DMEM medium, 10% FCS, 2 mmol glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin with 5 ng / ml EGF (complete medium). After 24 hours, the fibroplasts on the bottle have grown. The bottle can then be shaken gently. The cells in suspension are washed and filled with fresh complete medium into a new bottle. After a few weeks, the cells with stem cell properties can be changed 2 be won. The 3 and 4 shows a phase micrograph of the stem cells mH1 4.4 and mH9 4.1 with low (A) and high (B) cell density. These cells multiply very quickly ( 1 ), have been reproducible indefinitely for 14 months, are suitable as a permanent source of stem cells and can be cloned at the individual cell level. The FACS analysis shows the expression of CD9 on the stem cells after staining with a PE-labeled anti-CD9 antibody ( 5 ).

Beispiel 3Example 3

Einzelzellen aus dem Gesamtpankreasgewebe werden aus menschlichem Biopsiegewebe von ca. 5 mm Länge und 2 mm Radius durch Collagenaseverdau mit 3 mg/ml Collagenase während 15–20 min Behandlung bei 37°C hergestellt. Die Einzelzellen werden 3 mal mit 10 ml DMEM gewaschen. Darauf erfolgt ein Kultivierungsschritt der Zeltsuspension mit einer Konzentration von 1 × 104 Zellen / ml DMEM auf mit 5 μg / cm2 Collagen vorbeschichteten Zellkulturflaschen. Die Zellen werden kontinuierlich in 10 ml DMEM-Medium, 10 % FCS, 2 mMol Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin mit 5 ng/ml EGF (Komplettmedium) kultiviert. Nach 24 h sind die Fibroplasten an der Flasche angewachsen. Die Flasche kann dann leicht geschüttelt werden. Die in Suspension befindlichen Zellen werden gewaschen und mit frischem Komplettmedium in eine neue Flasche gefüllt. Nach einigen Wochen können die Zellen mit Stammzelleigenschaften gemäß 2 gewonnen werden. Diese Zellen vermehren sich sehr schnell, eignen sich als dauerhafte Quelle von Stammzellen und können auf Einzelzellebene kloniert werden.Single cells from the entire pancreatic tissue are produced from human biopsy tissue of approximately 5 mm in length and 2 mm in radius by collagenase digestion with 3 mg / ml collagenase during 15-20 minutes of treatment at 37 ° C. The single cells are washed 3 times with 10 ml DMEM. This is followed by a cultivation step of the tent suspension with a concentration of 1 × 10 4 cells / ml DMEM on cell culture bottles precoated with 5 μg / cm 2 collagen. The cells are continuously cultured in 10 ml DMEM medium, 10% FCS, 2 mmol glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin with 5 ng / ml EGF (complete medium). After 24 hours, the fibroplasts on the bottle have grown. The bottle can then be shaken gently. The cells in suspension are washed and filled with fresh complete medium into a new bottle. After a few weeks, the cells with stem cell properties can be changed 2 be won. These cells multiply very quickly, are suitable as a permanent source of stem cells and can be cloned at the single cell level.

Claims (14)

Verfahren zur Herstellung von Stammzellen aus Pankreas, dadurch gekennzeichnet, dass aus Pankreasgewebe durch chemische, insbesondere biochemische Behandlung eine Stammzellen enthaltende Suspension erzeugt wird, die anschließend einer Selektion unterzogen wird.Process for the production of stem cells from pancreas, characterized in that a suspension containing stem cells is produced from pancreatic tissue by chemical, in particular biochemical treatment, which suspension is then subjected to a selection. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine chemische Behandlung mit EDTA-Lösung erfolgt.A method according to claim 1, characterized in that chemical treatment with EDTA solution takes place. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine biochemische Behandlung mit einem Enzym erfolgt.A method according to claim 1 or 2, characterized in that biochemical treatment with an enzyme. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Behandlung ein Verdau ist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the biochemical treatment is a digestive process. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Behandlung mit Collagenase oder Trypsin erfolgt.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that a treatment with Collagenase or trypsin occurs. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion durch Entfernung der Nicht-Stammzellen erfolgt.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that that the selection is made by removing the non-stem cells. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Entfernen durch Anhaften auf einen Träger erfolgt.A method according to claim 6, characterized in that the removal is done by adhering to a support. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass Nicht-Stammzellen an Antikörpern gebunden und entfernt werden.A method according to claim 6 or 7, characterized in that that non-stem cells of antibodies bound and removed. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Selektion durch Bindung von Antikörpern an die Stammzellen erfolgt.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that that a selection is made by binding antibodies to the stem cells. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper gegen CD9 gerichtet ist.A method according to claim 9, characterized in that the antibody is directed against CD9. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass mit Antikörpern gekoppelte magnetic beats zur Selektion verwendet werden.Method according to one of claims 8 to 10, characterized in that that coupled with antibodies magnetic beats can be used for selection. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Pankreasgewebe ein Biopsiegewebe ist.Method according to one of claims 1 to 11, characterized in that that the pancreatic tissue is a biopsy tissue. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen auf Einzelzellebene kloniert werden.Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that that the stem cells are cloned at the single cell level. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Zellkulturen der Stammzellen kontinuierlich in der Zellkultur vermehrt werden können.Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that that cell cultures of the stem cells continuously in the cell culture can be increased.
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