DE10260264A1

DE10260264A1 - Verfahren und Zelllinie zur Identifizierung proliferationshemmender, anti-inflammatorischer oder proliferationsfördender Wirkstoffe

Info

Publication number: DE10260264A1
Application number: DE2002160264
Authority: DE
Inventors: Michael STÜRZL; Elisabeth Naschberger; Eric Guenzi
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-07-01

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationshemmender, anti-angiogener, invasionshemmender und/oder anti-inflammatorischer Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Zunahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen proliferationshemmende, anti-angiogener, ivasionshemmender und/oder anti-inflammatorische Wirkung indiziert. In einer alternativen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationsfördernder, pro-angiogener, pro-inflammatorischer und/oder invasionsfördernder, angiogen sensitivierender (angiogen sensitivierende, invasionsfördernde) Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbaren ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationshemmender, antiangiogener, invasionshemmender und/oder antiinflammatorischer Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines humanes Guanylat Bindungsprotein-1 (GBP-1) kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorsiche Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Zunahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen proliferationshemmende, anti-angiogene, anti-inflammatorische und/oder invasionshemmende Wirkung indiziert. In einer alternativen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationsfördernder, pro-angiogener, pro-inflammatorischer und/oder invasionsfördernder, angiogen sensitivierender (angiogen sensitivierende, invasionsfördende) Wirkung, wobei man (a) in eukaryontischen Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Abnahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen proliferationsfördernde und/oder pro-angiogene (Angiogenese sensitivierende, invasionsfördend) Wirkung indiziert. Die Erfindung betrifft ferner eine eukaryontische Zelle, die eine Nukleinsäure aufweist, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorsiche Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthält.
In der Beschreibung ist eine Anzahl von Dokumenten aus dem Stand der Technik erwähnt. Der Offenbarungsgehalt dieser Dokumente, einschließlich der Bedienungsanleitungen von Herstellern, ist in seiner Gänze hiermit per Verweis in die Beschreibung übernommen.
Das Endothel ist ein Schlüsselorgan bei zahlreichen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen wie Zell-gesteuerter Immunantwort, Menstruation, Wundheilung, Entzündung, Allergie, Herz-Kreislauferkrankung und Tumorwachstum. Die Pathofunktion des Endothels ist untrennbar mit der Aktivierung von Endothelzellen verbunden.
Die Aktivierung des Endothels ist ein komplexer Vorgang, der durch eine Vielzahl verschiedener löslicher Faktoren gesteuert wird, die im Blut zirkulieren oder von benachbarten Zellen freigesetzt werden (1A). In Folge dieses Prozesses werden die Physiologie und Morphologie der Endothelzellen an die jeweiligen Erfordernisse im Gewebe angepasst. Im Vordergrund stehen hierbei die Steuerung der Zellproliferation, Apoptose, Invasion, Migration und Leukozyten-Adhäsionsfähigkeit von Endothelzellen, wodurch die Neu- und Rückbildung von Gefäßen und die Extravasation von Leukozyten reguliert werden (1A).
Die Vielzahl der beteiligten Faktoren legt nahe, dass mehrere Faktoren denselben Phänotyp steuern und zu wirkungsgleichen Gruppen zusammengefaßt werden können (1B). Zum Beispiel aktivieren die angiogenen Wachstumsfaktoren basic fibroblast growth factor (bFGF) und vascular endothelial cell growth factor (VEGF) die Endothelzellproliferation, wohingegen die inflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1α, IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-α und Interferon (IFN)-γ die Proliferation hemmen und die Leukozyten-Adhäsionsfähigkeit von Endothelzellen erhöhen.
Derzeit gibt es keine geeigneten Methoden mit denen bestimmt werden kann, wo und wann die verschiedenen Faktoren in entzündlichen Geweben auf die Endothelzellen wirken. Daher ist über die räumliche und zeitliche Verteilung der verschiedenen Aktivierungszustände von Endothelzellen im Rahmen entzündlicher Erkrankungen nur sehr wenig bekannt.
Erste Arbeiten, einen molekularen Marker zu identifizieren, der eine Aktivierung von Endothelzellen durch die oben genannten inflammatorischen Zytokine im Gewebe anzeigt, führten zu vergleichenden Untersuchungen zur Genexpression in kultivierten Endothelzellen in Gegenwart unterschiedlicher Aktivierungsbedingungen. Mit diesem Ansatz konnte ein Gen isoliert werden, dessen Expression in Endothelzellen selektiv durch inflammatorische Zytokine induziert wird (2A) (Guenzi et al., 2001; Lubeseder-Martellato et al. 2002). Dieses Gen kodiert für das Guanylat-Bindungsprotein-1 (GBP-1), das zur Proteinfamilie der großen GTPasen gehört.
Um zu bestimmen, ob GBP-1 wie in kultivierten Zellen auch bei Gefäßendothelzellen in humanen Geweben eine Aktivierung durch inflammatorische Zytokine anzeigt, wurden immunhistochemische Untersuchungen zum Nachweis von GBP-1 mittels spezifischer monoklonaler Antikörper durchgeführt. Dazu wurden histologische Schnitte gesunder Haut und von Hauterkrankungen mit einer entzündlichen Komponente, wie zum Beispiel Psoriasis, Arzneimittelgegenreaktion und Kaposi-Sarkom untersucht (2B) Allen genannten Hauterkrankungen ist gemeinsam, dass in den Läsionen fokal konzentriert zahlreiche Entzündungszellen vorliegen, die dieselben inflammatorischen Zytokine freisetzen, die auch zu einer erhöhten GBP-1-Expression führen. In den Gefäßen der gesunden Haut konnte GBP-1 in keinem Fall nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu waren in allen untersuchten entzündlichen Erkrankungen einzelne Gefäße deutlich positiv für GBP-1 (2B, Pfeile). Diese Ergebnisse zeigten, dass GBP-1 tatsächlich auch in humanen Geweben eine inflammatorische Aktivierung von Endothelzellen anzeigt und als molekularer Marker für den Nachweis dieser Aktivierung in Geweben eingesetzt werden kann (Lubeseder-Martellato, Guenzi et al.).
Die Induktion der GBP-1-Expression durch inflammatorische Zytokine geht in Endothelzellen mit einer Hemmung der Zellproliferation einher. Daher wurde untersucht, ob GBP-1 die durch inflammatorische Zytokine induzierte Proliferationshemmung vermittelt. Dazu wurden Endothelzellen mit retroviralen Vektoren transduziert, welche die konstitutive Expression von GBP-1 (GBP-1-Vektor) oder einer antisense-GBP-1-RNA (AS-Vektor) bewirken (3A). Western blot-Analysen belegten, dass Endothelzellen die mit dem GBP-1-Vektor transduziert wurden, GBP-1 sehr stark exprimierten (3B). In Zellen, die mit dem AS-Vektor transduziert wurden, war die Induktion der GBP-1-Expression durch IL-1β effizient blockiert (3B). Nachfolgende Proliferationsexperimente mit den verschiedenen transduzierten Zellkulturen zeigten, dass GBP-1 tatsächlich die durch angiogene Wachstumsfaktoren induzierte Zellproliferation hemmt (3C, weiße Balken) und darüber hinaus notwendig ist, dass inflammatorische Zytokine die Proliferation von Endothelzellen hemmen können (3D). Letzteres äußert sich darin, dass in antisense-GBP-1-RNA exprimierenden Zellkulturen die Hemmwirkung inflammatorischer Zytokine auf die Zellproliferation deutlich herabgesetzt ist (3D, schwarze Balken) (siehe Guenzi et al. 2001).
Weiterführende Untersuchungen zur Struktur-/Funktionsbeziehung der proliferationshemmenden Wirkung von GBP-1 zeigten, dass interessanterweise nicht die GTPase-Funktion (Prakash et al. 2000), sondern ein Abschnitt am C-terminalen Ende des Proteins (helikale Domäne) die Hemmung der Zellproliferation bewirkt (Guenzi et al. 2001; Töpolt et al. 2002). Die Adhäsionsfähigkeit von Endothelzellen für Leukozyten, die ebenfalls durch inflammatorische Zytokine induziert wird, wurde durch GBP-1 nicht beeinflußt (Guenzi et al. 2001). GBP-1 ist somit ein neuer, molekularer Marker für eine entzündliche Gefäßaktivierung, der selektiv die antiproliferative Wirkung inflammatorischer Zytokine auf Endothelzellen steuert.
Die Hemmung der Blutgefäßversorgung stellt ein Prinzip der Tumortherapie dar (Folkman 1995). Aus laufenden klinischen Studien zur antiangiogenen Tumortherapie ist jedoch bekannt, dass die Wirkung gegenwärtig eingesetzter Therapeutika in Tumoren unterschiedlicher Organe sehr stark variiert (Carmeliet und Jain 2000). Es wird vermutet, dass die Heterogenität der Endothelzellen in den unterschiedlichen Bereichen des Körpers dafür verantwortlich ist (Carmeliet and Jain 2000). GBP-1 hemmt die Proliferation mikro- und makrovaskulärer Endothelzellen (Guenzi et al. 2001, Töpolt et al. 2001) und könnte somit ungeachtet der endothelialen Heterogenität in unterschiedlichsten Bereichen des Körpers eine antiangiogene Wirkung entfalten.
Bislang konnte gezeigt werden, dass GBP-1 selektiv durch inflammatorische Zytokine induziert wird und dass dieser Prozeß mit einer-anti-angiogenen Wirkung auf die betreffenden Zellen korreliert (Lubeseder-Martellato et al., 2002). Während man sich die Induktion von GBP-1 über dessen anti-proliferative Wirkung im Prinzip für medizinische Zwecke im Rahmen einer anti-angiogenen Therapie zu Nutze machen könnte, ist der Einsatz inflammatorischer Zytokine für derartige Zwecke aufgrund der pleiotropen und damit auch nachteiligen Effekte dieser Zytokine indiskutabel.
Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass GBP-1 nicht nur die Proliferation von Endothelzellen, sondern hemmt auch die Expression der Metalloproteinase-1 in diesen Zellen effizient hemmt (4A). Diese Wirkung ist ebenfalls anti-angiogen und verhindert das Einwandern (Invasion) von Endothelzellen in die Interstitielle Matrix (4B) und die Ausbildung von Kapillaren (4C). Beides sind unverzichtbare Prozesse im Rahmen der Angiogenese. GBP-1 wirkt somit in doppelter Weise anti-angiogen: über die Hemmung der Proliferation (reguliert durch die helikale Domäne des Moleküls, unabhängig von der GTPase-Funktion) und über die Hemmung der MMP-1-Expression (reguliert durch die GTPase-Funktion benötigt).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit Verfahren bereitzustellen, mit denen Wirkstoffe identifiziert werden können, die derartige anti-inflammatorische oder antiproliferative und insbesondere invasionshemmende anti-angiogene Wirkungen aufweisen, nicht jedoch die diskutierten nachteiligen pleiotropen Effekte der aus dem Stand der Technik bekannten Faktoren.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationshemmender, anti-angiogener, anti-inflammatorischer und/oder invasionshemmender Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Zunahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen/deren proliferationshemmende, antiangiogene, anti-inflammatorische und/oder invasionshemmende Wirkung indiziert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „poliferationshemmende Wirkung", dass die Proliferation, d.h. die zelluläre Vermehrung durch mitotische Teilung, zu mindestens 20%, vorzugsweise zu mindestens 40%, stärker bevorzugt zu mindestens 60%, wie 75% oder 80%, noch stärker bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% gehemmt wird. Idealerweise wird die Proliferation zu mindestens 99% gehemmt.
Der Begriff „anti-inflammatorische Wirkung" bedeutet, dass die Wirkung auf eine Entzündung, also die Wirkung auf die Reaktion eines Gewebes auf eine Schädigung, die insbesondere durch Rötung, Schwellung, Schmerz und/oder Überwärmung gekennzeichnet ist, zu mindestens 20%, vorzugsweise zu mindestens 40%, stärker bevorzugt zu mindestens 60%, wie 75% oder 80%, noch stärker bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% gehemmt wird. Idealerweise wird die Entzündung zu mindestens 99% gehemmt.
Der Begriff „invasionshemmende Wirkung" bedeutet, dass die Durchwanderungsgeschwindigkeit von Zellen durch natürliche oder künstliche extrazelluläre Matrix oder Komponenten gehemmt wird. Diese Wirkung hat zur Folge, dass die Durchwanderungsgeschwindigkeit zu mindestens 20%, vorzugsweise zu mindestens 40%, stärker bevorzugt zu mindestens 60%, wie 75% oder 80%, noch stärker bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% gehemmt wird. Idealerweise wird die Durchwanderungsgeschwindigkeit zu mindestens 99% gehemmt.
Die Invasion von Zellen durch natürliche oder künstliche extrazelluläre Matrix kann mit Hilfe des Boydenkammer-Tests gemessen werden. Die Boydenkammer besteht aus zwei Kammern (obere und untere), die durch eine poröse Membran getrennt sind. Die Membran wird mit extrazellulärer Matrix oder gereinigten Komponenten der extrazellulären Matrix beschichtet. In die untere Kammer wird ein Chemoattraktant gegeben und in die obere Kammer die zu untersuchenden Zellen. Die Zahl der Zellen, die nach dem Untersuchungszeitraum (z.B. 4 h) in die untere Kammer gewandert sind, wird im Verhältnis zur Gesamtzahl der zugegebenen Zellen als prozentualer Anteil der invasiven Zellen angegeben. 80% invasive Zellen bedeutet, dass von 100 zugegebenen Zellen 80 in die untere Kammer eingewandert sind. Wenn in einem weiteren Ansatz dieses Beispiels in Gegenwart eines Hemmstoffes nur 50% der Zellen in die untere Kammer eingewandert sind, dann entspricht die hemmende Wirkung dieses Stoffes 50%.
Im Sinne dieser Erfindung ist ferner zu beachten, dass die o.g. Wirkungen solche auf aktuell vorliegende Proliferationen oder Entzündungen sein können, alternativ dazu also auch prophylaktischen Charakter haben können, d.h. eine mögliche oder erwartete Proliferation oder Entzündung ab initio oder in einem Frühstadium hemmen oder unterbinden.
„Eukaryontische Zellen" schließen sämtliche eukaryontischen Zellen ein, also auch Pflanzenzellen, Hefezellen, Pilzzellen etc. unabhängig davon, ob diese aus einem mehrzelligen Organismus stammen oder einen einzelligen Organismus darstellen.
Bevorzugte eukaryontische Zellen sind Säugerzellen und besonders bevorzugt unter den Säugerzellen sind humane Zellen und Mauszellen. Eukaryontische Zellen im Sinne dieser Erfindung schließen auch Zellen ein, die transformiert sind oder in der Natur nicht vorkommen und beispielsweise Zellen aus Zelllinien sind. „Extrakte" solcher Zellen können durch im Stand der Technik etablierte Verfahren hergestellt werden; vgl. z.B. Sambrook et al. 1989. Zellkulturüberstände werden üblicherweise bei adhärent wachsenden Zellen durch einfache Entnahme, beispielsweise durch Abpipettieren und bei nicht adhärent wachsenden Zellen z.B. durch Abzentrifugation der eukaryontischen Zellen erhalten. Nicht in jedem Falle ist jedoch eine Abtrennung des Überstandes von den Zellen notwendig oder wünschenswert. Daher umfasst die Erfindung auch Ausführungsformen, bei denen auf Expression im Zellkulturgefäß getestet wird, über die besonderen Eigenschaften des jeweiligen Indikatorgens (z.B. im Falle von Luziferase und β-Galaktosidase durch Zugabe von entsprechenden Substraten, oder im Falle des green fluorescent proteins durch Anregung mit Licht in der spezifischen Wellenlänge).
Der Begriff „Promotersequenz eines GBP-1 kodierenden Gens" bezeichnet erfindungsgemäß eine in einem natürlicherweise vorkommenden GBP-1 Gen auftretende Promotorsequenz. Dabei umfassen die GBP-1 kodierenden Gene eine Genfamilie mit mindestens 5 Mitgliedern beim Menschen, mindestens 5 Mitgliedern bei der Maus und mindestens 1 Mitglied beim Hühnchen. Diese Mitglieder der GBP-1 Genfamilie sind durch einen Identitätsgrad von mindestens 80 % auf Aminosäureebene, bzw. 85 % auf Nukleinsäureebene gekennzeichnet. Auf der Basis dieser Informationen ist der Fachmann in der Lage, entsprechende Promotoren auch aus anderen Säugern zu isolieren. Derartige Promotoren können im erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls eingesetzt werden. Damit gehören auch Verfahren, in denen weitere, aus anderen Säugern zu isolierende Promotoren oder Fragment oder Derivate davon mit entsprechender Promotoraktivität eingesetzt werden zur vorliegenden Erfindung. Zur Sequenz des GBP-1 Promotors gehören auch die in 5(A) dargestellten Sequenzen um das 237 bp Fragment (5(B)) herum. Diese Sequenz ist der NCBI-Nukleotiddatenbank zu entnehmen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide). Ein weiteres Beispiel für eine entsprechende Promotorregionen ist die Maus-GBP-1 Promotorregion (Accession-Nummer gi5106533/AF109170 (NCBI)). Diese ist u.a. gekennzeichnet durch ein ähnliches/homologes Promotormodul, wie im humanen GBP-1 Promotor.
Erfindungsgemäß wurde ermittelt, dass die GBP-1 Promotoraktivität auf dem Zusammenspiel einer Interferon regulierbaren Bindungsstelle (ISRE/GAS) für den Interferon Regulator Factor (IRF-1) und einer durch NF-KB aktivierbaren Bindungsstelle (cREL) beruht. Beide Elemente zusammen werden als Modul bezeichnet. Ein rein synthetischer Promotor, der diese beiden Elemente trägt, wird sich somit prinzipiell ebenso verhalten. In jedem Fallkann der Fachmann im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Promotoren auf der Basis dieser Informationen ermitteln.
Erfindungsgemäß wurde ferner ein Fragment der Promotorsequenz identifiziert mit 237 bp, das sich entsprechend verhält und das die GAS/ISRE und NF-KB Bindungsstellen trägt. Es kann erfindungsgemäß natürlich auch jedes beliebige längere Fragment eingesetzt werden, das diese Komponenten enthält, Beispielsweise verhält sich ein Fragment mit 3757 bp, das obige Komponenten enthält in der Funktion entsprechend und es wird teilweise eine etwas höhere Aktivität erreicht (siehe 5).
Der Begriff „die Promotersequenz eines anderen selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbaren Gens" betrifft die natürlicherweise vorkommende Promotersequenz eines Gens, das (zumindest in Menschen) durch mindestens ein (wie zwei oder drei) inflammatorische(s) Zytokine) aus der Gruppe Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Interleukin-1α, Interleukin-1β und Tumornekrosefaktor-α und vorzugsweise alle dieser Zytokine, bevorzugt jedoch nicht durch andere Zytokine, Chemokine oder Wachstums-Faktoren in der Expression induziert wird, es sei denn, dass diese eine proliferationsinhibierende Wirkung auf Endothelzellen aufweisen. Kandidaten für solche Gene können beispielsweise auf der Basis der in Lubeseder-Martellato et al. (2002, hiermit per Referenz in die Beschreibung inkorporiert) identifiziert werden.
Der Begriff „im Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität" bedeutet erfindungsgemäß, dass nicht die gesamte Promotorregion, sondern ein Teil oder Teile davon, vorstehend auch als Module bezeichnet, im Sinne dieser Erfindung verwendet werden können. Die Teile können vom Fachmann auf der Basis seines allgemeinen Fachwissens, jedenfalls aber ohne unzumutbaren Aufwand so zusammengestellt werden, dass die Funktion des natürlichen Promoters, durch die der Initiationspunkt und die Initiationshäufigkeit der Transkription festgelegt werden, erhalten oder im wesentlichen (d.h. zu mindestens 50%, vorzugsweise zu mindestens 75%, stärker bevorzugt zu mindestens 85% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95%) erhalten bleibt oder aber verbessert wird. Während der Begriff „Fragment" impliziert, dass mindestens ein und vorzugsweise eine Kombination von funktionellen Nukleinsäuresequenzen in derselben Ausrichtung wie im natürlichen Gen wie oben beschrieben in die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Nukleinsäure inkorpiert ist, schließt der Begriff „Derivat" ferner ein, dass die funktionellen Nukleinsäuresequenzen neu kombiniert, genetisch modifiziert (z.B. um die Effizienz der Bindung zu erhöhen) oder durch weitere funktionelle Sequenzen, die aus anderen Genen stammen können, ergänzt worden sind. Fragmente wie auch Derivate (und selbstverständlich auch die vollständigen Promotersequenzen) können auf synthetische, semisynthetische, rekombinante und weitere Arten hergestellt werden. „Entsprechende Promoteraktivität" bezieht sich auf die Aktivität des Fragmentes oder Derivates im Vergleich zur Aktivität des natürlichen Promoters, der aus dem natürlich vorkommenden Gen stammt. Mit anderen Worten wird das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Promotorfragment oder -derivat die Funktion des natürlichen Promotors beibehalten oder im wesentlichen beibehalten oder eine verbesserte Aktivität und gesteigerte Sensitivität gegenüber Zytokinen, Chemokinen etc. aufweisen, nicht jedoch eine andere Gewebespezifität. Im Prinzip können die Promotorfragmente und -derivate so ausgestaltet werden, dass sie induzierbar oder nicht induzierbar (= konstitutiv) sind.
Der Begriff „funktionell verknüpft" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Transkription des Reportergens unter der Kontrolle des Promoters, Fragmentes oder Derivates steht.
Der Begriff „Reportergen" bezeichnet ein Gen, dessen Genprodukt sich nach Einführen des Gens in eine Zielzelle oder einen Zielorganismus leicht und beispielsweise biochemisch, immuno-chemisch und insbesondere visuell nachweisen läßt. Erfindungsgemäß wird üblicherweise das Repotergen lediglich die kodierende Sequenz und übliche 3' davon positionierte regulatorische Elemente, nicht jedoch die eigene Promotorregion umfassen. Das Genprodukt ist vorzugsweise ein solches, das normalerweise von der Zelle oder dem Organismus nicht hergestellt wird, also ein heterologes Genprodukt. Reportergen im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch das GBP-1-Gen sein bzw. die kodierende und 3' davon angeordnete regulatorische Regionen. Die GBP-1 kodierende Region kann die natürlicherweise vorkommende Verknüpfung mit dem GBP-1-Promotor aufweisen oder eine rekombinant modifizierte, solange Promotor und kodierende Region funktionell miteinander verknüpft sind. Der Begriff „Reportergen" ist im Stand der Technik gut verstanden und weiterhin durch bevorzugte und nachfolgend aufgeführte Ausführungsformen dargestellt.
Der Begriff „in Kontakt bringen" bedeutet erfindungsgemäß, dass der oder die Wirkstoffkandidaten derart in die räumliche Nähe der Zellen gebracht werden, dass ein unmittelbarer Kontakt der Wirkstoffkandidaten mit der Zelle, beispielsweise über zelluläre Rezeptoren und gegebenenfalls eine Aufnahme in die Zelle stattfinden kann. Die Bedingungen, unter denen der Kontakt stattfindet, ähneln vorzugsweise in vivo Bedingungen, um die Bedingungen, denen die Zelle im Zellverbund ausgesetzt ist möglichst nachzustellen. Zur Kontrolle entsprechender Bedingungen können (a) Kokultivierungen von der Indikatorzelle mit anderen Zellen (Primärzellen, Zelllinien), (b) Kultivierungen der Zellen in zwei- und dreidimensionalen Matrizes (z.B. aus Proteingemischen, die der extrazellulären Matrix entsprechen), (c) Behandlungen mit konditionierten Medien durchgeführt werden. Darüberhinaus kann besonders bei der Applikation auf Endothelzellen die Erzeugung von Strömungsbedingungen berücksichtigt werden. In vitro entsprechen die Bedingungen vorzugsweise physiologischen Bedingungen, wie z.B. durch die Kontaktierung der Zellen inkusive der aus Zelllinien stammenden Zellen in phosphatgepufferter Saline oder einem üblichen Zellkulturmedium. Sofern die Wirkstoffe von Nukleinsäuren kodiert werden und diese Nukleinsäuren in die Zelle eingebracht werden, bedeutet der Begriff „in Kontakt bringen, dass die Nukteinsäuren in die Zellen eingebracht werden (geeignete Techniken sind nachfolgend beschrieben) und die Wirkstoffe, d.h. Peptide oder Polypeptide, in der Zelle synthetisiert und während oder nach der Synthese ihre potentielle Wirkung auf den Promoter ausüben.
Der Begriff (Poly)peptid bezeichnet sowohl Peptide, wobei üblicherweise Aminosäureketten mit bis zu 30 Aminosäuren als Peptide bezeichnet werden wie auch Polypeptide (Proteine), wobei als Polypeptide üblicherweise Aminosäureketten ab 30 Aminosäuren bezeichnet werden.
Der Begriff „Zunahme der Expressionshöhe" bezeichnet erfindungsgemäß eine Zunahme um mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 60%, noch stärker bevorzugt um mindestens 80% und am meisten bevorzugt um mindestens 100%. Die Stärke der Zunahme kann, abhängig vom Reportergen, beispielsweise durch die Intensität der Zellfärbung gemessen werden. In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, dass die Expression des Reportergens beispielsweise über Antikörper, die mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind oder aber mit einem sekundären Antikörper, der gegen den ersten gegen das Reportergen gerichteten Antikörper gerichtet ist und seinerseits mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist, nachgewiesen werden kann. Die Zunahme der Expression kann im Prinzip auf der Ebene der Translationsprodukte (was bevorzugt ist) aber auch auf der Ebene der Transkription mittel in situ-Hybridisierung an Zellen und RT-PCR (Stürzl et al. 1995) gemessen werden.
Der Begriff „indiziert" bedeutet erfindungsgemäß, dass das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens einen ersten Rückschluss darauf zulässt, dass der Wirkstoffkandidat die gewünschte Wirkung aufweist. GBP-1 hemmt die Zellproliferation und die Expression von GBP-1 kann aus diesem Grund durch eine Abnahme der Proliferation gemessen werden. Proliferationsassays stellen somit ein geeignetes Read-Out System zur Bestätigung der Wirkung von Wirkstoffkanditaten, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als proliferationsinhibierend indiziert wurden. Die Wirkung ist vorzugsweise in weiteren Tests zu bestätigen:
Eine Zunahme der Proliferation kann gemessen werden (a) über die Bestimmung der Zunahme/Abnahme der Zellzahl nach einem entsprechenden Untersuchungszeitraum (3-6 Tage) [wird bestimmt durch Zellzählungen mittels Neubauer-Zählkammer oder Coulter-Counter] (b) eine Erhöhung/Erniedrigung der DNA-Replikation [wird bestimmt im Thymidineinbau Expriment nach Gabe radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierter Nukleotide (z.B. H3-Thymidin)], c) über die Zunahme der Stoffwechselaktivität, die direkt mit der Zellzahl korreliert [wird bestimmt über den Nachweis mitochondrialer Dehydrogenasen (MTT-Test).
Ebenso ist es möglich diese Wirkung in Tiermodellen zu testen. Hierfür wird z.B. die Angiogenese experimentell induzierte (Maus-Matrigeltest (Cornali et al. 1996, Am J Pathol) bzw. nach Injektion von Tumorzellen im Tumorwachstumstest).
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Wirkstoffe, gegebenenfalls und gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weiter modifiziert, um beispielsweise mögliche Nebenwirkungen zu mindern, werden in der Bekämpfung und Prophylaxe einer Reihe von Krankheiten eingesetzt werden könne. Beispielweise werden Wirkstoffe, die eine Zunahme der Expressionshöhe des Reportergens in Tumorgefäßendothelzellen bewirken, in der Tumortherapie eingesetzt werden. Wirkstoffe, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden, können auch (a) zur Verhinderung der Vaskularisierung bei chronischen Entzündungen/Wunden* und allergischen Reaktionen* im Sinne einer anti-inflammatorischen Therapie (Psoriasis, allergische Arzneimittelreaktionen), (b) zur Hemmung der Hyperproliferation bei endothelialen Tumorerkrankungen (Angiosarkom, Kaposi-Sarkom*) direkt anti-tumorigen, (c) zur Eindämmung von Gefäßhyperproliferationen (z.B. Hämangiom) mit bekannter oder idiopathischer Genese im Sinne einer kosmetischen bzw. therapeutischen Anwendung, (d) zur Behandlung von Adipositas, die durch eine Hemmung der Angiogenese eingeschränkt werden kann (*Bei inflammatorischen Erkrankungen ist die inflammatorische Aktivierung lokal restringiert und somit kann durch die Induktion der GBP-1 Expression im nicht-inflammatorischen Bereich über die Hemmung der Proliferation ein therapeutischer Effekt erzielt werden.).
Insofern schließt die Erfindung den im Stand der Technik erwachsenen Bedarf nach Methoden, auf einfache und zuverlässige Weise geeignete Wirkstoffkandidaten screenen zu können, ein. Von Vorteil ist auch, dass das erfindungsgemäße Verfahren als Hochdurchsatzverfahren ausgestaltet werden kann und so innerhalb kürzester Zeit große Mengen an Wirkstoffkandidaten auf die gewünschte Aktivität hin geprüft werden können. Weiterhin ist von Vorteil, dass die Durchführung des Tests wesentlich weniger Zeit in Anspruch nimmt (maximale Induktion nach 5 – 12 Stunden) als herkömmliche Verfahren (Zellzahlbestimmung, 3-6 Tage; Thymidineinbautest, 24 Stunden)
Bevorzugt und wie in den Beispielen weiter belegt, kann die Erfindung folgendermaßen umgesetzt werden:
Um GBP-1-induzierende Substanzen zu identifizieren, wurde die Promotorregion des GBP-1-Gens isoliert. Der GBP-1-Promotor wurde mit einem Indikatorgen [Luziferase (luc)-Gen] fusioniert, dessen Expression über eine Lichtreaktion nachgewiesen werden kann. Mit dem entsprechenden Konstrukt wurden Endothelzellen transfiziert und die luc-Expression untersucht. Es zeigte sich, dass alle inflammatorischen Zytokine die luc-Expression induzieren konnten (6A). Dies verdeutlicht, dass der isolierte Promotor dieselben Expressionseigenschaften wie der zelluläre GBP-1-Promotor besitzt.
Im nächsten Schritt wurde mit dem GBP-1-luc-Konstrukt eine stabile Zelllinie erzeugt. Diese Zelllinie wird jetzt für Hochdurchsatzverfahren eingesetzt, in denen die Wirkungen verschiedener chemisch erzeugter und natürlicher Verbindungen auf die GBP-1-Expression untersucht wird. Diejenigen Substanzen, welche die GBP-1-Expression am stärksten induzieren, werden beispielsweise nachfolgend in Mäusen, denen durch Injektion von Tumorzellen Tumoren eingepflanzt wurden, auf ihre antitumorigene Wirkung überprüft (6B). Die erfolgsversprechendsten Kandidaten könnten später eine mögliche Grundlage für die Behandlung von Tumorerkrankungen am Menschen liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die proliferationshemmende Wirkung eine anti-angiogene Wirkung.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff „anti-angiogene Wirkung", dass die Bildung von Kapillaren und Gefäßen im Rahmen angiogenetischer (Sprossung aus bereits bestehenden Gefäßen) und vaskulogenetischer (Gefäßneubildung durch Einwanderung endothelialer Vorläuferzellen) Prozesse unterdrückt wird. Als Unterdrückung wird bezeichnet, dass die Bildung neuer Gefäße mindestens 20%, vorzugsweise zu mindestens 40%, stärker bevorzugt zu mindestens 60%, wie 75% oder 80%, noch stärker bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% unterdrückt wird. Idealerweise wird die Bildung neuer Gefäße zu mindestens 99% unterdrückt.
Darüber hinaus bestand im Stand der Technik Bedarf, Substanzen zu isolieren, die proliferationsfördernde und insbesondere angiogene Wirkungen aufweisen und ebenfalls gezielt, möglichst selektiv in inflammatorischen Geweben und ohne die pleiotropen Effekte der aus dem Stand der Technik bekannten und diese Effekte vermittelnden Faktoren wie saurer und basischer Fibroblastenwachtumsfaktor (aFGF, bFGF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF), platelet derived growth factor (PDGF) wirken.
In einer alternativen Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes proliferationsfördernder, pro-angiogener, proinflammatorischer und/oder invasionsfördernder, angiogen sensitivierender Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Abnahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen/deren proliferationsfördernde, pro-angiogene, proinflammatorische und/oder invasionsfördernde, angiogen sensitivierende Wirkung indiziert.
Angionese wird in vivo über die Zahl der einsprossenden Kapillaren in das Untersuchungsgewebe definiert und in vitro über die Zahl der gebildeten Kapillaren im Kapillarbildungstest bestimmt. Angingen sensitivierend bedeutet, dass ein Wirkstoff per se nicht die Bildung von Kapillaren auslöst, aber die Kapillarbildung durch angiogene Wachstumsfaktoren (z.B. bFGF, VEGF) bei gleichzeitiger Anwesenheit von Angiogenese-hemmenden Substanzen (z.B. inflammatorische Zytokine) fördert. Der Begriff „angingen sensitivierende Wirkung" bedeutet folglich, dass durch die Gabe eines Wirkstoffes in Anwesenheit einer gegebenen Konzentration von bFGF und/oder VEGF und bei gleichzeitiger Anwesenheit inflammatorischer Zytokine die Zahl der gebildeten Kapillarbildung um 10%, vorzugsweise um 20%, weiter bevorzugt um 50%, darüber hinaus bevorzugt um 75%, besonders bevorzugt um 100% ansteigt. Der Kapillarbildungstest ist u.a. beschrieben in Montesano et al. (1983) J Cell Biol. 97: 1658–52, Davis et al. (1996) Exp Cell Res. 224: 39–51 und Yang et al. (1999) Am J Pathol. 155: 887–95.
Der Begriff „invasionsförderne Wirkung" bedeutet, dass die Durchwanderungsgeschwindigkeit und -fähigkeit von Zellen durch natürliche oder künstliche extrazelluläre Matrix oder Komponenten gesteigert wird. Diese Wirkung hat zu Folge, dass die Durchwanderungsgeschwindigkeit und -fähigkeit zu mindestens 20%, vorzugsweise zu mindestens 40%, stärker bevorzugt zu mindestens 60%, wie 75% oder 80%, noch stärker bevorzugt zu mindestens 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% gesteigert wird. Idealerweise wird die Durchwanderungsgeschwindigkeit und -fähigkeit zu mindestens 99% gesteigert.
Vorzugsweise wird zunächst entweder (i) die Expression experimentell induziert wird (z.B. durch Gabe inflammatorischer Zytokine), oder (ii) Zellen verwendet werden, in denen konstitutiv eine hohe Basisaktivität des Promotors vorliegt, oder (iii) der Promotor (bzw. das eingebrachte Expressionskonstrukt) so verändert wird, dass eine hohe konstitutive Expression des Reportergens vorliegt.
Ein Beispiel für (ii) ist die Verwendung einer Zelle mit hoher endogener Expression inflammatorischer Zytokine, ein Beispiel für (iii) ist die Verwendung eines Konstruktes, das neben der GBP-1-Promotor-Indikatorgen Expressionseinheit eine weitere Expressionseinheit trägt, die zur konstitutiven Expression von z.B. Interleukin-1α, Interleukin-1β, Interferon-α, Interteron-β, Interferon-γ, oder Tumornekrosefaktor führt.
Der Begriff „proliferationsfördernde Wirkung" bezeichnet erfindungsgemäß, dass die Proliferation um mindestens 20%, vorzugsweise um mindestens 40%, stärker bevorzugt um mindestens 60%, wie 75% oder 80%, noch stärker bevorzugt um mindestens 90% und besonders bevorzugt um mindestens 95% ansteigt. Idealerweise nimmt die Proliferation um mindestens 99% zu. Eine Zunahme der Proliferation kann gemessen werden (a) über die Bestimmung der Zunahme der Zellzahl nach einem entsprechenden Untersuchungszeitraum (3-6 Tage) [wird bestimmt durch Zellzählungen mittels Neubauer-Zählkammer oder Coulter-Counter] (b) eine Erhöhung der DNA-Replikation [wird bestimmt im Thymidineinbau Experiment nach Gabe radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierter Nukleotide (z.B. H3-Thymidin)], c) über die Zunahme der Stoffwechselaktivität, die direkt mit der Zellzahl korreliert [wird bestimmt über den Nachweis mitochondrialer Dehydrogenasen (MTT-Test).
Des weiteren beschreibt der Begriff „pro-angiogen" auch einen Angionese sensitivierenden Effekt.
Diese Ausführungsform der Erfindung wird vorzugsweise mit Zellen, z. B. Zellen im Gewebeverbund durchgeführt, die inflammatorischen Bedingungen ausgesetzt sind bzw. eine hohe interne GBP-1 Expression aufweisen. In dieser Ausführungsform kann neben einem entsprechenden Indikatorgen bei einer Anwendung in bestimmten Zellen (zum Beispiel Endothelzellen, siehe Tabelle) auch das zelleigene GBP-1 eingesetzt werden. Die Maßgabe hierzu ist, dass GBP-1 von diesen Zellen in den Zellkulturüberstand abgegeben wird. Die Bestimmung des zelleigenen GBP-1 im Zellkulturüberstand stellt somit ein Maß für die Aktivität des GBP-1-Promotors dar. Sekretiertes GBP-1 kann mittels eines bereitgestellten ELISA-Verfahrens nachgewiesen werden; siehe beigefügtes Beispiel 5.
Die Zellen, vorzugsweise Endothelzellen, werden beispielsweise einem Cocktail an inflammatorischen Zytokinen ausgesetzt. Die Kontaktierung mit diesen Zytokinen wird zu einer Zunahme der Expression des GBP-1-Gens führen und die Zellen in einen inflammatorischen Zustand überführen. So behandelte Zellen werden dann dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen. Entsprechend den vorstehenden Ausführungen kann das erfindungsgemäße Verfahren noch durch den vorab durchzuführenden Schritt der Kontaktierung der Zellen mit mindestens einem, vorzugsweise zwei oder drei und besonders bevorzugt mit vier inflammatorischen Zytokinen, wie vorstehend dargestellt, erweitert werden.
Die mit dieser Ausführungsform der Erfindung identifizierten Wirkstoffe sind ebenfalls medizinisch vielfältig einsetzbar. Besonders sind solche Wirkstoffe dazu geeignet die Gefäßeinsprossung unter inflammatorischen Bedingungen zu fördern. Hierzu gehören die Förderung der Ausbildung von kolateral Gefäßen bei Ischämien (z.B. Herzinfarkt, Raucherbein) sowie die Förderung von Wundheilungsprozessen und Transplantatannahme. Durch die Beseitigung der anti-angiogenen Blockade durch GBP-1 könnten die Endothelzellen gegenüber den natürlichen im Gewebe vorhandenen Angiogenesefaktoren sensitiviert werden. Es kann jedoch auch daran gedacht werden, den Wirkstoff zusammen mit Angiogenesefaktoren zu verabreichen. Der Wirkstoff würde dadurch die Effizienz der Angiogenesefaktoren erhöhen.
Vorzugsweise ist diese proliferationsfördernde Wirkung eine pro-angiogene proliferationsfördernde, invasionsfördernde, angiogen-sensitivierende Wirkung.
Der Begriff „pro-angiogene Wirkung" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Ausbildung von Kapillaren und/oder Gefäßen gefördert wird. Hierzu benötigen Endothelzellen mehrere Fähigkeiten: bevorzugt müssen sie proliferieren und zur Auflösung der extrazellulären Matrix mittels freigesetzter Proteasen befähigt sein. Die Hemmung der GBP-1-Expression alleine ist nicht pro-angiogen, aber sie sensitiviert Endothelzellen unter inflammatorischen Bedingungen für die Aktivierung durch angiogene Wachstumsfaktoren, die meist ebenfalls im inflammatorischen Gewebe vorliegen (Gleichgewichtsreaktion) oder gleichzeitig mit dem Wirkstoff verabreicht werden können.
Diese Ausführungsform der Erfindung ist vor allem deshalb bevorzugt, da mit ihr Wirkstoffe bereit gestellt werden können, die die Blutgefäßbildung induzieren und so beispielsweise zur Nachsorge bei Infarkten eingesetzt werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die eukaryontischen Zellen primäre Zellen und vorzugsweise Säugerzellen wie humane Zellen. Ferner bevorzugt sind bei primären Zellen Endothelzellen, Fibroblasten, Glattmuskelzellen oder Zellgemische. Diese Zellen repräsentieren in die in vivo-Situation und zeigen keine deregulierten Wachstums- und Invasionseigenschaften wie z.B. Tumorzellen.
Der Begriff „primäre Zellen" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass Zellen, die frisch aus humanem Gewebe, Organen oder Blut isoliert wurden, ohne dass eine Klonierung oder eine Immortalisierung durchgeführt wurde bzw. keine Tumorzellen sind, kultiviert werden.
Der Begriff „Endothelzellen" schließt im Sinne der Erfindung nicht nur primäre Endothelzellen, sondern auch daraus abgeleitete Zellen ein, die die wesentlichen Differenzierungsmarker von Endothelzellen aufweisen (CD31, Faktor VIIIRA, e-Selektin). Dies können weiter ausdifferenzierte, aber auch dedifferenzierte Zellen sein. Ferner eingeschlossen sind Zelllinien, insbesondere Tumorzelllinien endothelialen Ursprungs. Entsprechendes gilt für die weiteres in dieser bevorzugten Ausführungsform dargestellten Zelltypen.
Entsprechend sind gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die eukaryontischen Zellen Teil einer Zelllinie.
Der Begriff „Zelllinie" definiert Zellen, die frisch aus Gewebe, Blut oder Organen gewonnen sind und sich außerhalb des Organismus unbegrenzt vermehren bzw. wachsen können.
Bevorzugte Zelllinien sind Säugerzelllinien, z.B. humane Zelllinien sowie Tumorzelllinien und dort bevorzugt Tumorzelllinien endothelialen Ursprungs. Beispielhaft sind die nachfolgenden und erfindungsgemäß einsetzbaren Zelllinien aufgeführt: HMEC-1 (Endothelzelllinie human), SVEC4-10 (Endothelzelllinie, Maus) HEK293 und HEK293T (Nierenepithelzellen), HeLa (Zervix-Karzinom), 3T3 (Mausfibroblasten), HepG2 (Leberzellen), U937 (monozytäre Zellen), HUT78 (T-Zellen). Diese Zelllinien sind weithin und frei verfügbar und können darüber hinaus von anerkannten Hinterlegungsstellen käuflich erworben werden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Nukleinsäure durch Transfektion, Transduktion, Mikroinjektion, Elektroporation, Genegunning oder Scratch Loading in die eukaryontische Zelle eingeführt. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und u.a. in Methodenbüchern beschrieben; siehe z.B. Mühlhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics; 3. Auflage, 2002, Spektrum Akademischer Verlag.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Reportergen durch homologe Rekombinanten in das GBP-1 kodierende Gen oder ein anderes selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbare Gen eingeführt. In diesem Falle steht das Reporterkonstrukt unter der Kontrolle des natürlicherweise in der Zelle vorkommenden GBP-1-Promotors oder eines anderen entsprechend aktivierbaren Promotors. Das Repoter(poly)peptid kann als Fusionsprotein mit dem endogenen GBP-1-Protein bzw. einen Fragment davon synthetisiert werden. Alternativ dazu und abhängig von den gewählten zum Target homologen gewählten flankierenden Sequenzen kann das Reporter(poly)peptid auch frei von endogenen GBP-1-Sequenzen synthetisiert werden. Techniken zur homologen Rekombination, die im Sinne der Erfindung eingesetzt werden können, sind beschrieben in Recombinant DNA. 2nd edition. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Scientific American Books, 1992. WH Freeman and Company.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleinsäure ein Expressionsvektor/Expressionsplasmid oder eine virale Nukleinsäure.
Expressionsvektoren/Expressionsplasmide und deren Funktion sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Dies sind üblicherweise Vektorkonstrukte, die z.B. für eine effektive Klonierung einer gewünschten Nukleinsäure, hier einer ein Reporter(poly)peptid kodierenden Sequenz, ein Replikationsmotiv (ori) und eine (multiple) Klonierungsstelle besitzen. Für eine effektive Expression einer kodierenden Nukleinsäure ist eine Vektorsequenz notwendig, die eine Expression des kodierten Peptids oder Proteins initiiert. Hierfür ist ein Startkodon (ATG) notwendig. Des weiteren enthalten geeignete Expressionsvektoren/Expressionsplasmide Promotoren und erfindungsgemäß den oben beschriebenen Promoter oder das Fragment oder Derivat davon. Diese sind wie erwähnt Sequenzbereiche, durch welche die Transkription eines Gens (kodierenden Nukleinsäure) gesteuert wird. Der Fachmann unterscheidet u.a. zwischen schwachen und starken, wie auch zwischen konstitutiv wirkenden, induzierbaren und reprimierbaren Promotoren. Besondere Beispiele für Expressionsvektoren/Expressionsplasmide für das erfindungsgemäße Verfahren sind in den Beispielen dargelegt. Plasmide für solche Promotor-untersuchungen umfassen z.B. pGL3-Basic (Promega), pEGFP-1 (Clontech), pβgal-Basic (Clontech).
Beispiele für die genannten viralen Nukleinsäuren sind dem Fachmann ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Diese viralen Nukleinsäuren enthalten neben der oben beschriebenen kodierenden Nukleinsäuresequenzen weitere Sequenzen, die z.B. für virale Proteine kodieren und/oder für die Replikation der viralen Nukleinsäuren/des Virus in einem Wirt notwendig sind. Besondere Beispiele für virale Nukleinsäuren für das erfindungsgemäße Verfahren sind Vektoren, die z.B. auf Parvo-, Adeno-, Lenti-, Herpes, Baculo- und Retroviren basieren (pBABE-Puro, Guenzi et al. EMBO J 2001).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Transfektion oder Transduktion eine stabile oder transiente Transfektion oder Transdektion.
Unter dem Begriff „stabile Transfektion" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die in die Zelle eingebrachte Nukleinsäure im Rahmen des Zellzyklus vervielfältigt und bei der Zellteilung weiter gegeben wird. Dies bedeutet, dass die eingebrachte Nukleinsäure in einer Langzeitkultur der Zelle „stabil" enthalten bleibt. Vorzugsweise enthält die eingebrachte Nukleinsäure zusätzlich eine Expressionseinheit die ein Resistenzgen trägt (bei stabiler Transfektion und Transdektion) oder sie wird zusammen mit einem Plasmid das für ein Resistenzgen kodiert eingebracht (nur bei stabiler Transfektion). Wenn entsprechende Zellen in einem Selektionsmedium kultiviert werden, das nur solchen Zellen das Wachstum ermöglicht, die ein Resistenzgen aufgenommen haben, bewirkt dieser Vorgang, dass die eingebrachten Nukleinsäuren stabil in der Zelle manifestiert werden.
Alternativ dazu kann für bestimmte Anforderungen die entsprechende Nukleinsäure auch transient transfiziert oder transduziert werden. Bei diesem Prozess werden die Zellen nach dem Einbringen der Nukleinsäure ohne nachfolgenden Selektionsschritt in dem Verfahren eingesetzt. In einer Langzeitkultur ensprechend behandelter Zellen geht die eingebrachte Nukleinsäure verloren.
Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Reportergenen beschrieben worden. Alle diese Reportergene sind im Prinzip für den Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Bevorzugt ist, dass das Reportergen eine Luziferase, Rhodamin, Green Fluorescent Protein oder eine GFP-Variante wie CFP, YFP, eGFP, Venus, oder aber β-Galaktosidase, SEAP oder Laktatdehydrogenase kodiert. Die Verwendung weiterer im Stand der Technik beschriebener Beispiele für Reportergene ist ebenfalls durch das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt; siehe für weitere Beispiele von Reportergenen z.B. Mühlhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics; 3. Auflage, 2002, Spektrum Akademischer Verlag.
Besonders bevorzugt ist ferner, dass endogenes GBP-1 als Reportergen eingesetzt wird, unter anderem in Zusammenhang mit den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen. Da erfindungsgemäß gefunden wurde, dass das GBP-1 Protein aus der Zelle sezerniert wird, kann der Nachweis der Expressionsstärke auf einfache Weise im Überstand erfolgen, beispielsweise mittels eines das GBP-1 Protein spezifisch bindenden Rezeptors. Geeignete Rezeptoren sind vor allem Antikörper oder Fragmente (wie Fab-, F(ab')₂- oder Fv-Fragmente oder Derivate (wie chimäre, humanisierte, bispezifische Antikörper oder scFv-Konstrukte) davon, z.B. monoklonale, aber auch polyklonale Antikörper, schließen ferner aber auch Aptamere ein. Zur Herstellung geeigneter Antikörper vgl. Harlow und Lane, 1988. Der GBP-1 bindende Rezeptor kann markiert sein, beispielsweise eine radioaktive (z.B. ³H oder ¹ ²⁵I) Markierung oder aber eine chemilumineszente, biolumineszente oder andere Markierung tragen. Der Nachweis kann jedoch auch über einen weiteren, für den GBP-1-bindenden Rezeptor spezifischen sekundären Rezeptor, üblicherweise einen xenogenen Antikörper erfolgen, der seinerseits eine nachweisbare Markierung trägt. Allgemein und insbesondere in dieser Ausführungsform kann der Nachweis in geeigneten Standardverfahren wie im RIA, ELISA, EIA und anderen immunologischen Nachweisverfahren erfolgen; sh. auch Harlow and Lane, 1988. Sekretiertes, lösliches GBP-1 kann z.B. in Immunpräzipitationsverfahren (siehe Bespiel 4) oder einem ELISA Verfahren (siehe Beispiel 5) nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch ein Verfahren, wobei der eine oder die mehreren Wirkstoffkandidaten Polypeptide, Peptide oder niedermolekulare Substanzen, Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon oder Aptamere sind. Die Peptide entstammen bevorzugt einer Peptidbibliothek, wie im Stand der Technik bekannt. Peptide oder Polypeptide können beispielsweise auf der Oberfläche von Bakteriophagen als Fusionsproteine mit deren Öberflächenproteinen, beispielweise gpIII oder gpVIII exprimiert werden (Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR.Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. 1994; 12:433–55 Review). Die Peptide oder Polypeptide können, wie vorstehend dargestellt durch geeignete Verfahren in die Zelle eingeführte Nukleinsäure kodiert und in der Zelle exprimiert werden. Auf diese Weise lässt sich die Auswirkung dieser (Poly)peptide auf den GBP-1-Promoter testen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens macht davon Gebrauch, dass das vollständige endogene GBP-1-Gen als Reporterkonstrukt gewählt wird.
Die niedermolekularen Substanzen können organischen oder anorganischen Ursprungs sein. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß, dass die niedermolekularen Substanzen organische niedermolekulare Substanzen sind.
Bevorzugt ist weiterhin ein Verfahren, das ferner den folgenden Schritt umfasst: (c) Bestimmung der Zellproliferation in Gegenwart des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten und Vergleich des bestimmten Wertes mit einem Kontrollansatz, wobei ein Gleich-bleiben oder eine Abnahme der Zellzahl im Vergleich zum Kontrollansatz kennzeichnend ist für eine poliferationshemmende Wirkung und eine Steigerung der Zellzahl im Vergleich zum Kontrollansatz kennzeichnend ist für eine poliferationssteigernde Wirkung.
Ein Einfluss eines Wirkstoffes auf die Zellproliferation kann gemessen werden (a) über die Bestimmung der Zunahme/Abnahme der Zellzahl nach einem entsprechenden Untersuchungszeitraum (3-6 Tage) [wird bestimmt durch Zellzählungen mittels Neubauer-Zählkammer oder Counter-Counter] (b) eine Erhöhung/Erniedrigung der DNA-Replikation [wird bestimmt im Thymidineinbau Experiment nach Gabe radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierter Nukleotide (z.B. H³-Thymidin)], c) über die Zunahme der Stoffwechselaktivität, die direkt mit der Zellzahl korreliert [wird bestimmt über den Nachweis mitochondrialer Dehydrogenasen bestimmt (MTT-Test).
In einer alternativen Ausführungsform ist weiterhin ein Verfahren bevorzugt, das ferner den folgenden Schritt umfasst: (c) Die Bestimmung der Invasion in Gegenwart des einen oder der mehreren Wirkstoffkanditaten und Vergleich des bestimmten Wertes mit einem Kontrollansatz, wobei ein Gleichbleiben oder eine Abnahme invasiver Zellen im Vergleich zum Kontrollansatz kennzeichnend ist für eine invasionshemmende Wirkung und eine Steigerung der Zahl invasiver Zellen im Vergleich zum Kontrollansatz kennzeichnend ist für eine invasionsfördernde Wirkung.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst zusätzlich zu den oben beschriebenen Verfahrensschritten den Schritt der Isolierung des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe.
Nachdem der gewünschte Wirkstoff identifiziert ist, kann er leicht und nach konventionellen Verfahren isoliert werden, beispielsweise aus einer Substanzbibliothek. Er kann aber auch direkt aus dem Testansatz isoliert werden und mit geeigneten Verfahren, beispielsweise NMR, MS, MALDI-TOF, Sequenzierverfahren etc. oder Kombinationen davon weiter analysiert werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die weiteren folgenden Schritte durchgeführt werden, sofern mehrere Wirkstoffkandidaten in ein und demselben Testgefäß getestet werden:

(a) Testen von jeweils mehreren Wirkstoffkandidaten pro Testgefäß, wobei diejenigen Wirkstoffkandidaten in Reaktionsgefäßen, in denen keine Zunahme oder Abnahme der Expressionshöhe beobachtet wird, für die weiteren Tests nicht mehr in Betracht gezogen werden;
(b) Aufteilung der in einem Testgefäß, in welchem ein positives Ergebnis beobachtet wurde, befindlichen Wirkstoffkandidaten in neue Testgefäße und Wiederholung des Tests, wobei wiederum diejenigen Wirkstoffkandidaten in Testgefäßen als Wirkstoffe in Betracht kommen, an denen eine Zunahme bzw. Abnahme der Expressionshöhe beobachtet wird; und gegebenenfalls
(c) Wiederholung von Schritt (b), bis ein einziger Wirkstoff identifiziert ist, bei dem eine anti-angiogene und/oder anti-inflammatorische Wirkung oder eine pro-angiogene Wirkung indiziert ist.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Hochdurchsatzverfahren. Hochdurchsatzverfahren sind im Prinzip im Stand der Technik beschrieben worden, siehe z.B. Takeshita et al, Anal Biochem. (1997) 247(2), 242–6. Beispiele für entsprechende Hochdurchsatzverfahren umfassen Luziferase-Tests, bzw. automatisierte GFP-Nachweise (bei Luc und GFP als Reportergen). Ein weiteres Beispiel stellt den ELISA dar, der üblicherweise in Multiwell-Platten (24 well, 48-well, 96 well und größer) durchgeführt wird. Ein Beispiel für ein solches ELISA-Verfahren ist in Beispiel 5 beschrieben.
Weiter bevorzugt ist dieses Hochdurchsatzverfahren Computer-assistiert. Die Computerassistenz kann sich beispielsweise durch den Einsatz von im Stand der Technik beschriebenen Picking- und/oder Spottingrobotern auszeichnen oder durch den computerisierten Einsatz einer CCD-Kamera zur Auswertung der Versuchsergebnisse.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des identifizierten Wirkstoffs, wobei man:

(a) die Bindungsstelle des Wirkstoffs an seinen Rezeptor identifiziert;
(b) die Bindungsstelle Wirkstoffs an den Rezeptor durch molekulares Modellieren modifiziert; und
(c) Wirkstoff dergestalt modifiziert, daß dessen Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für den Rezeptor durch molekulares Modellieren erhöht wird.

Unter dem Begriff „Rezeptoren" werden im Zusammenhang mit der Erfindung alle Bindungspartner eines Wirkstoffes verstanden, über die dieser Wirkstoff einen durch das erfindungsgemäße Verfahren nachzuweisenden Effekt auf die GBP-1 Expression hat. Dies umfasst z.B. Proteine, Kohlenhydrate und Lipide. Diese Rezeptoren können von der Zelle frei gesetzt werden oder aber an der Zelloberfläche, im Zytoplasma oder im Nukleus lokalisiert sein.
Die oben beschriebenen verschiedenen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind konventionelle Verfahrensschritte und können vom Fachmann mit üblichen Fähigkeiten ohne weiteres ausgeführt werden. Basierend auf den Eigenschaften der in dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Wirkstoffe können weitere biologische Assays vom Fachmann verwendet werden, mit denen die Spezifität und Wirksamkeit der Wirkstoffe getestet werden kann. Durch Modifikation der Aktivität der Zielstrukturen kann die Spezifität und Wirksamkeit dieser Wirkstoffe verändert- und mit diesen Assays getestet werden. Die oben beschriebenen Schritte (a) und (b) können entsprechend konventioneller Protokolle ausgeführt werden. Ein Protokoll zur zielgerichteten Mutagenese (site-directed mutagenesis) ist beschrieben in Ling MM, Robinson BH. (1997) Anal. Biochemical 254: 157–178. Die Verwendung von Verfahren zur Modulierung von Homolgiebereichen in Verbindung mit zielgerichteter Mutagenese zur Analyse von Struktur und Funktionseigenschaften ist zusammengefasst in Szklarz und Halpert (1997) Life Sci. 61:2507–2520. Chimäre Proteine können generiert werden durch Ligation entsprechender DNA-Fragmente mit Hilfe geeigneter, einzigartiger Restriktionsschnittstellen unter Verwendung konventioneller Klontechniken. Diese werden u.a. in Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, a laboratory manual; (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press beschrieben. Eine Fusion von zwei DNA-Fragmenten, die ein chimäres DNA-Fragment bilden und ein chimäres Protein kodieren, kann des weiteren mit Hilfe eines Gateway-Systems (Life technologies) generiert werden. Dieses System basiert auf der DNA-Fusion durch Rekombination. Ein bekanntes Beispiel für das molekulare Modellieren ist das strukturbasierte Design von Substanzen, die an die HIV-Reverse Traskriptase binden; siehe z.B. Mao et al. (2000) Biochem. Pharmacol. 60:1252–1265.
Bindungsstellen von Wirkstoffen können identifiziert werden durch zielgerichtete Mutagenese und Studien mit den genannten Rezeptoren. Hierbei werden die Primärsequenzen der Rezeptoren modifiziert und anschließend wird analysiert, ob diese Modifikation die Bindungsaffinität des Wirkstoffes verändert; dieses Verfahren erlaubt üblicherweise eine genaue Kartierung der Bindungstasche eines Wirkstoffes.
Als Beispiel für Schritt (b) wird u.a. folgendes Protokoll vorgeschlagen: Wenn die Effektorstelle eines Wirkstoffes kartiert wurde, können die exakten Resten, die an der Interaktion der Bindungspartner beteiligt sind, durch Kombination der Informationen erhalten werden, die aus unterschiedlichen Mutagenestudien (Schritt a) und Computersimulation der Struktur der Bindungsstelle erhalten wurden. Dieses Verfahren ermöglicht u.a. eine genaue dreidimensionale Darstellung der Struktur. Wenn der Wirkstoff selbst ein Peptid ist, kann dieses ebenso mutiert werden wie dessen Bindungspartner und die Ergebnisse der unterschiedliche Mutagenesestudien miteinander kombiniert werden. Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt die Modifikation zur Steigerung oder Verbesserung der Bindungsaffinität, der Wirksamkeit oder Spezifität. Wenn, z.B., elektrostatische Interaktion zwischen unterschiedlichen Resten der Zielstruktur oder Abschnitten des Wirkstoffmoleküls existieren, kann die Gesamtladung entsprechender Abschnitte verändert und damit auch die Bindung der Bindungspartner verändert werden.
Zur Identifikation von Bindungsstellen können unterschiedliche Computerprogramme verwendet werden. Folglich können geeignete Computerprogramme verwendet werden zur Identifikation von Interaktionsstellen von putativen Inhibitoren/Enhancern und der Zielstruktur durch computergestützte Suche nach komplementären Strukturmotiven (Fasina, Immunomethods 5 (1995), 114–120). Weitere geeignete Computersysteme zum computergestützten Design von Proteinen und Peptiden sind im Stand der Technik beschrieben, z.B. in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodac, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991. Modifikationen von Wirkstoffen können erhalten werden, z.B., durch Peptidomimetics. Weitere Inhibitoren/Enhancer können ebenso durch die Synthese von kombinatorischen peptidomimetischen Bibliotheken zur sukzessiven chemischen Modifikation und Testung der resultierenden Substanzen identifiziert werden. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von kombinatorischen peptidomimetischen Bibliotheken werden im Stand der Technik beschrieben, z.B. in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715.
Weiter betrifft die Erfindung in einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren, welches ferner die Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des identifizierten Wirkstoffs umfasst, wobei man testet auf

(a) eine Verstärkung der induzierenden oder hemmenden Wirkung auf die GBP-1 Promotoraktivität;
(b) geringere Wirkung auf andere Promotoren; und/oder
(c) geringe Wirkung auf die anti-angiogenen Funktionen des zellulären GBP-1.

Verfahren zur Studie von Promotoraktivitäten sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (siehe u.a. Mülhardt, loc. cit.). Hierbei erfindungsgemäß die Detektion der Expression eines Reportergens zur Bestimmung der Aktivität eines Promotors genutzt.
Eine Verstärkung der induzierenden oder hemmenden Wirkung auf die GBP-1 Promotoraktivität kann erreicht werden durch chemische Modifikation des Wirkstoffes (Derivaterzeugung) und erneute Testung von Derivat-Bibliotheken. Bei Peptiden und Proteinen können ebenfalls modifizierte Derivate (Acetylierung, Glykosylierung usw) oder Fragmenten der Peptiden und Proteinen getestet werden.
Eine geringere Wirkung auf andere Promotoren kann erreicht werden, indem man die Wirkung des Wirkstoffes in analogen Tests bei Verwendung anderer Promotoren fusioniert mit einem Indikatorgen untersucht (z.B viraler SV40-Promotor, CMV-Promotor; zelluläres Bax, Bcl-2-Promotor). Hierbei kann auch die Sekretion von löslichen Faktoren bestimmt werden (Zytokine, Chemokine usw), z.B. unter Verwendung von Bekannten ELISA-Verfahren. Des weiteren kann auch der Zellphänotyp direkt untersucht werden. In diesem Zusammenhang kann sowohl die Morphologie der Zellen untersucht werden, als auch die Induktion von Apoptose in den Zellen (Verfahren zur Analyse von Apoptose umfassen JAM-Test, TUNEL-Test, Cr⁵ ¹-Freisetzungstests u.a.; z.B. beschreiben in Dulat et al. Eur J Immunol. 2001, 31(7):2217–26).
Eine geringe Wirkung auf die anti-aniogenen Funktionen des zellulären GBP-1 kann durch Analyse der Proliferationsaktivität einer Indikatorzelle, die GBP-1 durch retrovirale Transduktion (Vektor pBabePuro, S-GBP-1-Konstrukt) konstitutiv exprimiert, getestet werden. Wenn eine entsprechende Substanz die Proliferation dieser Zelle verstärkt bzw. die MMP-1-Expression erhöht, dann weist dies auf eine abschwächende Wirkung auf die GBP-1-Funktion hin und gilt als Wirkstoff, der nicht für ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignet ist.
Entsprechend einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der identifizierte oder verbesserte Wirkstoff durch Peptidomimetics pharmakologisch weiter verbessert.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren, wobei der Wirkstoff weiter modifiziert wird, um

(i) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, eine modifizierte Organ-, Gewebe- oder Zellspezifizität;
(ii) eine verbesserte Aktivität;
(iii) gesteigerte Toxizität für Tumorzellen (einen verbesserten therapeutischen Index) oder gesteigerte Wirkeffizienz auf Zielzellen;
(iv) verminderte Nebenwirkungen;
(v) ein zeitlicher versetzter Beginn der therapeutischen Wirksamkeit, der Länge der therapeutischen Wirksamkeit;
(vi) veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion);
(vii) modifizierte physikochemische Parameter (Löslichkeit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform);
(viii) verbesserte generelle Spezifität, Organ-/Gewebespezifität; und/oder
(ix) optimierte Verabreichungsform und -route

(i) Veresterung von Carboxylgruppen oder
(ii) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder
(iii) Veresterung von Hydroxylgruppen zu beispielsweise Phosphaten, Pyrophosphaten oder Sulfaten oder "Hemisukzinaten" oder
(iv) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder
(v) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder
(vi) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder
(vii) Einführung von hydrophilen Gruppen oder
(viii) Einführung/Austausch von Substituenten in Aromaten oder Seitenketten, Veränderung des Substituentenmusters oder
(ix) Modifikation durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Gruppen oder
(x) Synthese von homologen Verbindungen oder
(xi) Einführung von verzweigten Seitenketten oder
(xii) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen oder
(xiii) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen oder
(xiv) N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten oder
(xv) Synthese von Mannich-Basen, Iminen oder
(xvi) Umwandlung von Ketonen oder Aldehyden in Schiffs-Basen, Oxime, Acetate, Ketale, Enolester, Oxazolidine, Thiozolidine oder Kombinationen davon zu erreichen.

Die vorstehend dargestellten Schritte sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Sie schließen ein oder beruhen auf quantitativen Struktur-Aktionsbeziehungsanalysen (QSAR; sh. Kubinyi, „Hausch-Analysis and Related Approaches" VCH Verlag, Weinhaim, 1992), kombinatorischer Biochemie, klassischer Chemie und anderen verfahren bzw. Disziplinen; vgl. z.B. Holzgrabe und Bechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140(8), 813–823, 2000.
Einsprechend einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dieses ferner den Schritt der Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinpräparates, wobei man den erhaltenen Wirkstoff mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierte Wirkstoffe können zur Behandlung oder Prophylaxe der oben beschriebenen Erkrankungen als Arzneimittel formuliert werden. Die entsprechende Arzneimittelformulierung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem „pharmakologisch verträglichen Träger" und/oder Verdünnungsmittel und/oder Exzipienten. Beispiele für besonders geeignete pharmakologisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 1000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung entsprechender Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 10 ng- und 10 mg-Einheiten pro Tag bzw. pro Applikationsintervall befinden. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht sollte sich die Dosis in einem Bereich zwischen 1 ng- und 0,1 mg-Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute befinden.
Die entsprechende Zusammensetzung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Des weiteren können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein.
Die Erfindung betrifft ferner eine eukaryontische Zelle, die eine Nukleinsäure aufweist, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorsiche Zytokine induzierbaren Gens oder im Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem heterologen Reportergen enthält.
Die erfindungsgemäße eukaryontische Zelle kann vorzugsweise zum Screenen auf gewünschte Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden, wie vorstehend beschrieben. Sie kann aber auch zur Testung des inflammatorischen oder anti-inflammatorischen und des pro- und anti-angiogene Potentials von natürlicherweise vorkommenden Faktoren eingesetzt werden, wobei die Veränderung der unter der Kontrolle des vorstehend genannten Promotors oder Fragments oder Derivates stehenden Genexpression des heterologen Gens bzw. der heterologen kodierenden Sequenz ein Indiz für eine derartige Wirkung ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle, die stabil oder transient transfiziert oder transduziert ist.
Bevorzugt ist auch, dass die Zelle eine primäre Zelle ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle Teil einer Zelllinie.
Schließlich betrifft die Erfindung ein (nicht-menschliches) transgenes Tier, vorzugsweise einen transgenen Nager und besonders bevorzugt eine transgene Maus oder eine transgene Pflanze, die die erfindungsgemäße eukaryontische Zelle in der Keimbahn und/oder im Soma trägt. Generelle Techniken zur Herstellung transgener Tiere und Pflanzen sind im Stand der Technik bekannt und können im Sinne der Erfindung eingesetzt werden. Die transgenen Tiere und Pflanzen können in der Wirkstoffvalidierung und -testung eingesetzt werden.
Die Figuren zeigen:
1: Komplexität und Redundanz entzündlicher Endothelzellaktivierung.

(A) Die Aktivierung des Endothels bei entzündlichen Prozessen wird durch eine Vielzahl verschiedener löslicher Faktoren aus dem Blut und von benachbarten Zellen gesteuert. Dabei stehen im Rahmen der Neu- und Rückbildung von Gefäßen, sowie der Extravasation von Leukozyten die Steuerung von Zellproliferation, Apoptose, Invasion, Migration und Adhäsionsfähigkeit für Leukozyten im Vordergrund.
(B) Die Vielzahl der beteiligten Faktoren legt nahe, dass mehrere Faktoren ein- und dieselbe Aktivierung beeinflußen und zu wirkungsgleichen Gruppen zusammengefaßt werden können. Gegenwärtig kann nicht bestimmt werden, wann und wo die verschiedenen Faktoren auf die einzelnen Endothelzellen einwirken. Darüber hinaus sind die Beziehungen der meisten Aktivierungsarten zueinander weitgehend unbekannt. Es ist zu bestimmen, ob alle Aktivierungen gleichzeitig in einer Zelle auftreten können (I) oder aufgrund zellbiologischer Restriktionen zeitlich, beziehungsweise räumlich separiert sein müssen (II).

2: Expression von GBP-1 in kultivierten Endothelzellen und in entzündlichen Erkrankungen der Haut.

(A) Western Blot-Analyse der GBP-1 Expression in Endothelzellen, die mit den aufgeführten Faktoren für 24 h stimuliert worden waren. Folgende Konzentrationen wurden eingesetzt: IFN-γ (100 U/ml), 1L-1α (5 ng/ml), IL-1β (200 U/ml), TNF-α (300 U/ml), IL-4 (10 U/ml), IL-6 (50 U/ml), IL-10 (50 ng/ml), IL-18 (100 ng/ml), Oncostatin M (10 ng/ml), MCP-1 (50 ng/ml), PF4 (25 ng/ml), SDF-1α (200 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), VEGF (10 ng/ml), Ang-2 (800 ng/ml) und PDGF B/B (100 ng/ml). Der gleichzeitige Nachweis des Zytoskelettproteins Aktin zeigt, dass gleiche Proteinmengen aufgetragen wurden.
(B) Induktion der GBP-1-Expression in vaskulären Endothelzellen bei Hauterkrankungen mit einer inflammatorischen Komponente. Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von GBP-1 (grün) und dem Endothelzell-assoziierten Antigen CD31 (rot) in Gewebeschnitten von gesunder Haut, Kaposi-Sarkom, entzündlicher Arzneimittelgegenreaktion der Haut und Psoriasis. Die Überlagerung der Bilder zeigt eine Ko-Expression (gelb) von GBP-1 und CD31 (weiße Pfeile). (Modifiziert nach (Lubeseder-Martellato, Guenzi et al. 2002))

3: GBP-1 vermittelt die antiproliferative Wirkung inflammatorischer Zytokine in Endothelzellen.

(A) Schematische Darstellung des retroviralen Expressionsvektors pBabePuro (Kontrollvektor, K-Vektor) in den die cDNA von GBP-1 in beiden Orientierungen für die konstitutive Expression von GBP-1 (GBP-1-Vektor) und für die Expression einer GBP-1-antisense-RNA (AS-Vektor) eingesetzt wurde.
(B) GBP-1-Expression in K-, GBP-1-, und AS-Vektor transduzierten Endothelzellen, die entweder unbehandelt waren oder über einen Zeitraum von 24 h mit 20 U/ml IL-1β stimuliert wurden. Der Nachweis der GBP-1-Expression erfolgte mittels Western-Blot-Analyse mit einem polyklonalen anti-GBP-1-Antikörper. Die gleichzeitige Färbung mit Aktin zeigt, dass gleiche Proteinmengen aufgetragen wurden.
(C) Proliferationsexperimente mit K-Vektor- und GBP-1-Vektor-transduzierten Endothelzellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen angiogener Wachstumsfaktoren (bFGF und VEGF in Kombination).
(D) Proliferationsexperimente von K-Vektor- und AS-Vektor-transduzierten Endothelzellen in Anwesenheit angiogener Wachstumsfaktoren und aufsteigender Konzentrationen von IL-1β. (Modifiziert nach (Guenzi et al. 2001))

4: GBP-1 hemmt die MMP-1-Expression, die Invasion und die Kapillarbildungsfähigkeit von Endothelzellen in Kollagen-I.

(A) MMP-1 wird nicht in GBP-1-exprimierenden Zellen exprimiert und die MMP-1-Expression kann auch nicht durch angiogene Wachstumsfaktoren, wie bFGF und VEGF induziert werden. Kontrolle bezeichnet Endothelzellen, die mit einem Kontrollvektor transduziert wurden. S-GBP-1 bezeichnet Endothelzellen, die mit einem Vektor transduziert wurden, der die konstitutive Expression von GBP-1 in diesen Zellen bewirkt. Die Expression von GBP-1 und von MMP-1 wurden mit Western Blot-Analyse nachgewiesen. Der Nachweis von GAPDH zeigt, dass gleiche Proteinmengen aufgetragen wurden. AWF (+) bedeutet, dass die Zellen mit angiogenen Wachstumsfaktoren behandelt wurden, AWF (–) bedeutet, dass die Zellen nicht mit angiogenen Wachstumsfaktoren behandelt wurden.
(B) GBP-1 hemmt die Einwanderung/Invasion von Endothelzellen in Kollagen-I Matrizes (schwarze Balken), wohingegen die Einwanderungsfähigkeit von Endothelzellen, die mit einem Kontrollvektor transduziert wurden, nicht beeinflusst war (weiße Balken). Kontrolle bezeichnet Endothelzellen, die mit einem Kontrollvektor transduziert wurden. S-GBP-1 bezeichnet Endothelzellen, die mit einem Vektor transduziert wurden, der die konstitutive Expression von GBP-1 in diesen Zellen bewirkt. Invasion wurde im Boyden-kammer Test bestimmt unter Verwendung von porösen Membranen, die mit Kollagen-I beschichtet waren.
(C) GBP-1 hemmt die Bildung von Kapillaren in Kollagen-I. Zellen die mit dem Kontrollvektor transduziert worden waren bildeten nach 48 Stunden Kapillarähnliche Strukturen aus (Kontrolle). Zellen die mit GBP-1 transduziert worden waren konnten im Gegensatz dazu keine Kapillaren ausbilden. Kontrolle bezeichnet Endothelzellen, die mit einem Kontrollvektor transduziert wurden. S-GBP-1 bezeichnet Endothelzellen, die mit einem Vektor transduziert wurden, der die konstitutive Expression von GBP-1 in diesen Zellen bewirkt.

5: Sequenzen von GBP-1 Promotoren.

(A) Sequenz 1 (3757 bp GBP-1 Promotor): Das 237 bp GBP-1 Promotorfragment ist im 3757 bp Promotor enthalten und ist entsprechend gekennzeichnet (Sequenz unterstrichen, fett, kursiv). Sämtliche Sequenzen sind der NCBI-Nukleotiddatenbank zu entnehmen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide).
(B) Sequenz 2 (237 bp GBP-1 Promotor): Das 237 bp GBP-1 Promotorfragment trägt die gekennzeichneten Modulkomponenten ISRE/GAS-Bindungsstelle und NF-KB-Bindungsstelle für die Transkriptionsfaktoren IRF-1 und p65/p50; p65/cRel. Mit Pfeilen sind die 4 möglichen Transkriptionsstartstellen eingezeichnet. Beide Promotoren sind durch die inflammatorischen Zytokine IFN-γ, IL-1β und TNF-α selektiv induzierbar. Des weiteren sind mögliche Kandidaten angegeben (Maus-GBP-1 und GBP-2), die sich so verhalten könnten, wie der humane GBP-1 Promotor.

6: Isolierung des Promotors von GBP-1 für den Einsatz im Hochdurchsatzverfahren zur Identifizierung antiangiogener Substanzen.

(A) Luziferase-Nachweis zur Bestimmung der Aktivität des isolierten und mit dem luc-Gen fusionierten GBP-1-Promotors in Endothelzellen nach Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen.
(B) Schema eines Hochdurchsatzverfahrens für die Identifizierung GBP-1-induzierender antiangiogener Substanzen. Es wurde eine Zelllinie erzeugt, in der das luc-Indikatorgen unter der Kontrolle des isolierten GBP-1-Promotors exprimiert wird. Anhand dieser Zelllinie werden die Wirkungen verschiedener chemisch-erzeugter und natürlicher Verbindungen auf die GBP-1-Expression untersucht. Diejenigen Substanzen, welche die GBP-1-Expression am stärksten induzieren (gelb), werden nachfolgend in Mäusen, denen durch Injektion von Tumorzellen Tumoren eingepflanzt wurden, auf ihre antitumorigene Wirkung überprüft.

7: Sekretion von GBP-1 aus IFN-γ behandelten HUVEC beruht nicht auf einer Zunahme von Apoptose und/oder Zellpermeabilität.
HUVEC Zellen wurden über Nacht kultiviert (Low medium). Anschließend wurden die Zellen mit IFN-γ stimuliert (Konzentration von 100 U/ml für 24 h). Nicht stimulierte Zellen (C) wurden nur mit BSA behandelt. (A) Der Lactatdehydrogenase (LDH) Aktivitätstest zeigt, dass die Stimulation von HUVEC mit IFN-γ die Menge an Lactatdehydrogenase im Kulturüberstand nicht erhöht. LDH Aktivität von Medien denen 1 %, 2.5 % oder 7.5 % Zelllysat zugesetzt wurde, das durch Gefrier-Auftau-Zyklen gewonnen wurde, als Standard. (B) Färbung von HUVEC mit „membrane impermeant dye Dead-Red". Zellen aus drei optischen Feldern wurden ausgezählt und der prozentuale Anteil von Zellen mit gesteigerter Membranpermeabilität (schwarze Säulen) verglichen mit der Gesamtzellzahl.
8: Nachweis von sezerniertem G8P-1 mittels ELISA.
(Low medium). Anschließend wurden die Zellen mit IFN-γ stimuliert (Konzentration von 100 U/ml für 24 h). Nichtstimulierte Zellen (C) wurden nur mit BSA behandelt. Überstände wurden gesammelt und (A) in einem ELISA und (B) mittels Immunpräzipitation und Western Blot analysiert, siehe Beispiel 5. Als Standard des ELISA wurden Verdünnungen von gereinigtem GBP-1-His eingesetzt.
9: Nachweis von zirkulierendem GBP-1 im Plasma von IFN-α-behandelten Patienten
Bei Melanom-Patienten, die für 9 bzw. 28 Tage mit IFN-α behandelt wurden, wurde die Konzentration von zirkulierendem GBP-1 im Plasma mittels ELISA bestimmt. Dargestellt ist der Anstieg der GBP-1 Konzentration von Tag 9 zum Tag 28 bei drei Patienten. ELISA-Mikrotiterplatten wurden mit einem monoklonalen Ratte anti-GBP-1 Antikörper, Klon 1B1, für 16 Stunden bei 4° C beschichtet. Anschließend wurden die Platten mit PBS-T gewaschen (0,1 % Tween 20 in PBS) und für 30 Minuten wurden bei Raumtemperatur (RT) freie Bindungsstellen mit PBS-T/BSA 2 (PBS-TB) abgesättigt. Nach Absaugen des PBS-TB erfolgte eine Inkubation (2 h) mit je 100 μl verschiedener Plasma Proben (1:2) bei RT. Als Standard wurde gereinigtes GBP-1-His Protein, verdünnt in Zellkulturmedium (EBM-0,5% FCS) benutzt. Als Negativkontrolle diente BSA. Die Proben wurden 4x mit PBS-T gewaschen, je 100 μl polyklonaler Kaninchen anti-GBP-1 Antikörper (1:500) zugegeben und für 2 Stunden bei RT inkubiert. Nach viermaligen Waschen mit PBS-T erfolgte eine Inkubation (1 h, RT) mit je 100 μl AP-konjugiertem anti-Kaninchen Antikörper (1:500 verdünnt in PBS-TB). Nach vier weiteren Waschschritten wurde der GBP-1 Protein/Antikörper-Komplex durch Inkubation mit 100 μl P-nitrophenyl-phosphat visualisiert. Die Absorbtion wurde bei 405 nm im Mikroplatten-Reader gemessen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte anhand einer Standardkurve für die steigende Konzentrationen von gereinigtem GBP-1-His verwendet wurden. Die Linearität der Messung ist für einen Bereich von 0,1–100 ng/ml gegeben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Herstellung eines Vektorkonstruktes
Das 237 bp GBP-1 Promotortragment (pro237-GBP-1) wurde mittels PCR-Amplifikation (PCR 2 Advantage Kit, Clontech) von dem Konstrukt pro3757-GBP-1 mit den Oligonukleotiden 5'-ATTTGAAGCTTCTGGTTGAG-3' [einfügen einer Hindlll-Schnittstelle (unterstrichen)] bzw. 5'-TGGCTTCTAGCACTTCTG-3' generiert. Das Konstrukt pro3757-GBP-1 enthält 3757 bp der 5'-regulatorischen Sequenz aufwärts des ATG-Kodons des GBP-1 Gens (gi:4503938, NM_002053) im Vektor pT-Adv (Clontech). Das 237 bp Fragment wurde in Antisense- Orientierung mit dem Vektor pT-Adv ligiert, mit Hindlll geschnitten und in den pGL3-Basic Vektor (Promega) subkloniert. Alle Konstrukte wurden mit dem Endofree Maxi Kit (Qiagen) aufgereinigt und zur Verifizierung sequenziert.
Beispiel 2: Etablierung einer geeigneten Zelllinie
HEK 293 T-Zellen (humane embryonale epitheliale Nierenzelllinie mit humanen Adenovirus Typ 5 (Ad 5) DNA transformiert (ATCC CRL 1573), welche zusätzlich mit SV40 T Antigen transformiert ist) wurden mit 3 × 10⁵ Zellen/Well (6-Multi-Well Platte, Corning) 24 h vor der Transfektion ausgesät. Pro Well der 6-Well Platte wurden gesamt 0,8 μg Plasmid verwendet, wobei das Testplasmid pro237-GBP-1 im Verhältnis 1:5 mit dem Selektionsplasmid pBABE-Puro (P. Monini, Laboratory of Virology, Instituto Superiore di Santiá, Rome, Italien) eingesetzt wurde. Das Testplasmid pro237-GBP-1 enthält das 237 bp Promotorfragment gekoppelt an das Indikatorgen firefly-Luziferase, das Selektionsplasmid pBABE-Puro das Resistenzgen Puromycin, worauf anschließend selektioniert wird. Die Transfektion der Zellen wurde analog Vorschrift des Herstellers mit Effectene (Qiagen) durchgeführt und nach 24 h die Selektion mit 0,7 μg/ml Puromycin (Sigma) begonnen. Bei Tag 8-10 konnte das Wachstum von Einzeiklonen beobachtet werden, die anschließend mit Klonierringen trypsiniert und in Einzelwells einer 96-well Platte (Falcon) überführt wurden. Bei entsprechender Konfluenz wurden die Klone weiter passagiert und auf ihre Reportergen-aktivität im Luziferaseassay untersucht. Die Klone wurden mit inflammatorischen Zytokinen IFN-γ, IL-1β und TNF-α, sowie Buffer für 5 h stimuliert und in 1x „passive lysis buffer" (Promega) abgeerntet. Die Lysate wurden auf firefly-Luziferase-Aktivität untersucht und entsprechend stabile Klone etabliert.
Beispiel 3: Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffkandidaten
Die stabilen Zelllinien, die den GBP-1 Promotor stabil im Genom der HEK 293T Zellen tragen, werden in Multi-Well Platten ausgesät (z.B. 96-Well Platte) und in Folge mit verschiedenen Substanzen inkubiert, die möglicherweise die GBP-1 Promotoraktivität induzieren können. Dies sind z.B. inflammatorische Zytokine wie IFN-γ, IL-1β, oder TNF-α, aber auch chemische Substanzen oder natürliche Agentien aus Naturstoffbanken. In Folge werden die Zellen lysiert und ihre Reportergen-aktivität im Luziferase-assay untersucht.
Das Verfahren, welches hier beschrieben ist, kann prinzipiell in allen verfügbaren eukaryontischen Zelllinien durchgeführt werden, sowie mit verschiedenen Reportergenen (z.B. β-Galactosidase, green fluorescent protein) oder auch verschieden großen Promotorfragmenten (Nachweis erbracht für Promotorfragmente 237-3757 bp 5'-regulatorische Region). Des weiteren können die zu testenden Substanzen extrazellulär aufgebracht oder intrazellulär exprimiert werden.
Beispiel 4: Immunopräzipitation
Frisch hergestellte Zelllysate wurden vorgereinigt durch Inkubation mit 2 μl nicht mit GBP-1 reagierendem Präimmunserum von Kaninchen und 25 μl Protein A/G Agarosebeads für mindestens 3 h bei 4°C auf einer Schüttelplattform. Nach dem Pelletieren der Beads wurde der Überstand mit 25 μl Protein A/G Agarosebeads und 1 μl von polyklonalem Kaninchenserum gegen GPB-1 über Nacht bei 4°C auf einer Schüttelplattform inkubiert. Die Beads wurden vier bis fünf mal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Beads in 30 μl Laemmli-Probenpuffer (2X) resuspendiert und für 5 min gekocht. Die Proben wurden in einer SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und in einem Westernblot oder in einer Autoradiographie analysiert.
Für die Immunopräzipitation von GPB-1 oder MMP-1 aus Zellkulturüberständen wurden 10 ml Kulturmedium auf Eis gestellt, 5 min zentrifugiert bei 1000 rpm, filtriert durch einen Filter mit einer Porengröße von 45 um und in einigen Fällen ein Proteinaseninhibitor-Cocktail (0,02 mg/ml Pankreasextrakt, 5 μg/ml Pronase, 0,5 μg/ml Thermolysin, 3 μg/ml Chymotrypsin und 0,33 jm/ml Papin) zugegeben. Die Vorreinigung wurde ausgeführt durch Inkubation mit 10 μl nicht mit GBP-1 reagierendem Präimmunserum von Kaninchen und 120 μl Protein A/G Agarosebeads für mehr als 3 h bei 4°C auf einer Schüttelplattform. Nach dem Pelletieren der Beads wurde der Überstand mit 120 μl Protein A/G Agarosebeads und 6 μl von polyklonalem Kaninchenserum gegen GPB-1 über Nacht bei 4°C auf einer Schüttelplattform inkubiert. Die Beads wurden vier bis fünf mal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Beads in 60 μl PBS + 60 μl Laemmli-Probenpuffer (2X) resuspendiert und für 5 min gekocht. Üblicherweise wurden 15 μl jeder Probe in einer SDS-PAGE (10%) aufgetrennt und in einem Westernblot analysiert. Ein entsprechendes Experiment ist in 8B dargestellt.
Beispiel 5: GBP-1 ELISA
Für den entwickelten GBP-1 ELISA wurden folgende Puffer verwendet:
PBS enthaltend 0,1% Tween 20 (PBS-T) und PBS enthaltend 0,1% Tween 20 und 2% BSA (PBS-TB).
96-well-ELISA-Platen (Nunc-Immuno Plates) wurden beschichtet mit 100 μl/well anti-GBP-1 Hybridomaüberstand, im Verhältnis 1:5 mit PBS verdünnt oder mit gereinigtem Antikörper in den Konzentrationen von 1–5 μg/ml (Inkubation für 16 h bei 4°C). Die Platten wurden mit PBS-T gewaschen und geblockt mit PBS-TB für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Die wells wurden abgesaugt und als Dubletten für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert mit 100 μl des Standards (GBP-1-His, verdünnt in Zellkulturmedium mit 5% FBS), der gleichen Konzentration von BSA als Kontrolle oder mit 100 μl einer Probe in geeigneter Verdünnung (verdünnt in PBS). Die Wells wurden vier mal mit PBS-T gewaschen und mit 100 μl eines polyklonalen Antikörpers gegen GPB-1, verdünnt in 1:500 in PBS-TB für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Wells wurden vier mal mit PBS-T gewaschen und mit 100 μl einer alkalinen Phosphatase, die an einen anti-Kaninchen Antikörper konjugiert ist (Zymed, Berlin, Germany), verdünnt 1:500 in PBS-TB, für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Wells wurden vier mal mit PBS-T gewaschen und mit 100 μl von p-nitrophenyl phosphate (Zymed) inkubiert. Die Absorption wurde bei 405 nm in einem „microplate reader" (BioRad) bestimmt. Die Konzentration von GPB-1 in der Probe wurde mit Hilfe der Standardkurve berechnet. Das Verfahren zeigte eine Linearität von 0,1 bis 100 ng/ml von GBP-1/well. Die Variabilität der Ergebnisse in unterschiedlichen Assays lag zwischen 2,3 und 6%. Entsprechende Experimente sind in den 8 und 9 dargestellt.
Beispiel 6: Proliferationsassay
Die Zunahme/Abnahme der Proliferation wurde durch Bestimmung der Zellzahl gemessen werden. Zellen wurden hierfür in Multiwellplatten in einem Hungermedium (Low Medium) ausgesät und über Nacht mit dem Wirkstoff behandelt. Nach 3 bis 6 Tagen wurde die Zellzahl durch Auszählung bestimmt und die Zellzahl mit der Zellzahl in Kontrollansätzen verglichen.
Literatur

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Guenzi, Töpolt, Cornali, Lubeseder-Martellato, Jörg, Matzen, Zietz, Kremmer, Nappi, Schwemmte, Hohenadl, Barillari, Tschachler, Monini, Ensoli, and Stürzt: Embo J 20(20): 5568–77. (2001).
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SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationshemmender, anti-angiogener, anti-inflammatorischer und/oder invasionshemmender Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorsiche Zytokine induzierbaren Gens oder im Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Zunahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen proliferationshemmende, antiangiogene, anti-inflammatorische und/oder invasionshemmende Wirkung indiziert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die proliferationshemmende Wirkung eine anti-angiogene Wirkung ist.
Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffes mit proliferationsfördernder, pro-angiogener, pro-inflammatorischer und/oder invasionsfördentder, angingen sensitivierender Wirkung, wobei man (a) eukaryontische Zellen, die eine Nukleinsäure aufweisen, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorsiche Zytokine induzierbaren Gens oder im Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthalten oder Extrakte derartiger eukaryontischer Zellen oder Zellkulturüberstände davon, mit einem oder mehreren Wirkstoffkandidaten in Kontakt bringt; und (b) die Expressionshöhe des von dem Reportergen kodierten Transkripts oder (Poly)peptids misst, wobei eine Abnahme der Expressionshöhe nach Zugabe des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten dessen proliferationsfördernde, pro-angiogene, pro-inflammatorische und/oder invasionsfördernde, angingen sensitivierende Wirkung indiziert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die proliferationsfördernde Wirkung eine pro-angiogene proliferationsfördernde, invasionsfördernde, angiogensensitivierende Wirkung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die eukaryontischen Zellen primäre Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die primären Zellen Endothelzellen, Fibroblasten, Glattmuskelzellen oder Zellgemische sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die eukaryontischen Zellen Teil einer Zelllinie sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleinsäure durch Transfektion, Transduktion, Mikroinjektion, Elektroporation, eine Genegun oder Scratch Loading in die eukaryontische Zelle eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reportergen durch homologe Rekombinanten in das GBP-1 kodierende Gen oder ein anderes selektiv durch inflammatorische Zytokine induzierbare Gen eingeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure ein Expressionsvektor/Expressionsplasmid oder eine virale Nukleinsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Transfektion oder Transduktion eine stabile oder transiente Transfektion oder Transduktion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Reportergen eine Luziferase, Rhodamin, Green Fluorescent Protein oder eine GFP-Variante, β-Galaktosidase, SEAP oder Laktatdehydrogenase kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der eine oder die mehreren Wirkstoffkandidaten Peptide, Polypeptide, niedermolekulare Substanzen, Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon oder Aptamere sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die niedermolekularen Substanzen organische niedermolekulare Substanzen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, ferner umfassend den Schritt (c) Bestimmung der Zellproliferation in Gegenwart des einen oder der mehreren Wirkstoffkandidaten und Vergleich des bestimmten Wertes mit einem Kontrollansatz, wobei ein Gleich-bleiben oder eine Abnahme der Zellzahl im Vergleich zum Kontrollansatz kennzeichnend ist für eine poliferationshemmende Wirkung und eine Steigerung der Zellzahl im Vergleich zum Kontrollansatz kennzeichnend ist für eine poliferationssteigernde Wirkung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 ferner umfassend den Schritt der Isolierung des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die weiteren folgenden Schritte durchgeführt werden, sofern mehrere Wirkstoffkandidaten in ein und demselben Testgefäß getestet werden: (a) Testen von jeweils mehreren Wirkstoffkandidaten pro Testgefäß, wobei diejenigen Wirkstoffkandidaten in Reaktionsgefäßen, in denen keine Zunahme oder Abnahme der Expressionshöhe beobachtet wird, für die weiteren Tests nicht mehr in Betracht gezogen werden; (b) Aufteilung der in einem Testgefäß, in welchem ein positives Ergebnis beobachtet wurde, befindlichen Wirkstoffkandidaten in neue Testgefäße und Wiederholung des Tests, wobei wiederum diejenigen Wirkstoffkandidaten in Testgefäßen als Wirkstoffe in Betracht kommen, an denen eine Zunahme bzw. Abnahme der Expressionshöhe beobachtet wird; und gegebenenfalls (c) Wiederholung von Schritt (b), bis ein einziger Wirkstoff identifiziert ist, bei dem eine anti-angiogene und/oder anti-inflammatorische Wirkung oder eine pro-angiogene Wirkung indiziert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das ein Hochdurchsatzverfahren ist.
Verfahren nach Anspruch 18, das Computer-assistiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 ferner umfassend die Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des identifizierten Wirkstoffs, wobei man (a) die Bindungsstelle des Wirkstoffs an den seinen Rezeptor identifiziert; (b) die Bindungsstelle Wirkstoffs an den Rezeptor durch molekulares Modellieren modifiziert; und (c) Wirkstoff dergestalt modifiziert, dass dessen Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für den Rezeptor durch molekulares Modellieren erhöht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 ferner umfassend die Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des identifizierten Wirkstoffs, wobei man testet auf (a) eine Verstärkung der induzierenden oder hemmenden Wirkung auf die GBP-1 Promotoraktivität; (b) geringere Wirkung auf andere Promotoren; und/oder (c) geringe Wirkung auf die anti-angiogenen Funktionen des zellulären GBP-1.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der identifizierte oder verbesserte Wirkstoff durch Peptidomimetics pharmakologisch weiter verbessert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei der Wirkstoff weiter modifiziert wird, um (i) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, eine modifizierte Organ-, Gewebe- oder Zellspezifizität; (ii) eine verbesserte Aktivität; (iii) gesteigerte Toxizität für Tumorzellen (einen verbesserten therapeutischen Index) oder gesteigerte Wirkeffizienz auf Zielzellen; (iv) verminderte Nebenwirkungen; (v) ein zeitlicher versetzter Beginn der therapeutischen Wirksamkeit, der Länge der therapeutischen Wirksamkeit; (vi) veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion); (vii) modifizierte physikochemische Parameter (Löslichkeit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform); (viii) verbesserte generelle Spezifität, Organ-/Gewebespezifität; und/oder (ix) optimierte Verabreichungsform und -route durch (i) Veresterung von Carboxylgruppen oder (ii) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder (iii) Veresterung von Hydroxylgruppen zu beispielsweise Phosphaten, Pyrophosphaten oder Sulfaten oder "Hemisukzinaten" oder (iv) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder (v) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder (vi) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder (vii) Einführung von hydrophilen Gruppen oder (viii) Einführung/Austausch von Substituenten in Aromaten oder Seitenketten, Veränderung des Substituentenmusters oder (ix) Modifikation durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Gruppen oder (x) Synthese von homologen Verbindungen oder (xi) Einführung von verzweigten Seitenketten oder (xii) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen oder (xiii) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen oder (xiv) N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten oder (xv) Synthese von Mannich-Basen, Iminen oder (xvi) Umwandlung von Ketonen oder Aldehyden in Schiffs-Basen, Oxime, Acetate, Ketale, Enolester, Oxazolidine, Thiozolidine oder Kombinationen davon zu erreichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 ferner umfassend den Schritt der Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinpräparates, wobei man den erhaltenen Wirkstoff mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel oder Exzipienten formuliert.
Eurkaryontische Zelle, die eine Nukleinsäure aufweist, die die Promotorsequenz eines GBP-1 kodierenden Gens, die Promotorsequenz eines anderen selektiv durch inflammatorsiche Zytokine induzierbaren Gens oder ein Fragment oder Derivat davon mit entsprechender Promotoraktivität funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthält.
Zelle nach Anspruch 25, die stabil oder transient transfiziert oder transduziert ist.
Zelle nach Anspruch 25 oder 26, die eine primäre Zelle ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 25 bis 27, die Teil einer Zelllinie ist.