DE10257771A1

DE10257771A1 - Inhibierung der HIV Replikation durch Expression von 'late domain' Peptiden in Zielzellen

Info

Publication number: DE10257771A1
Application number: DE10257771A
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg KRÄUSSLICH; Barbara Dr. Müller
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2004-07-08
Also published as: AU2003289991A1; WO2004058290A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Membran-verankerbare Konstrukte des "late Domain"-Bereichs von Retroviren, insbesondere HIV, kodieren. Die Konstrukte hemmen die Freisetzung von HIV aus infizierten Zellen und können somit für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinfragmente (Peptide) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) mit antiviraler Funktion. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für membranständige virale ,late domain'-Proteine oder -Peptide kodieren, die durch diese Nukleinsäuren kodierten Peptide, sowie die Verwendung dieser Peptide und Nukleinsäuren zur gezielten Hemmung viraler Infektionen.
Das menschliche Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) ist der Erreger der erworbenen Immunschwäche AIDS. Weltweit sind heute ca. 40 Millionen Menschen mit HIV infiziert und drei Millionen Menschen sind 2001 an AIDS verstorben. Obwohl bereits seit einiger Zeit mehrere antivirale Medikamente (Reverse Transkriptase-Inhibitoren und Protease-Inhibitoren) gegen HIV verfügbar sind, wirft die Behandlung von AIDS Patienten auch in entwickelten Ländern sehr große Probleme auf. Aufgrund der sehr raschen Anpassung des Virus durch Mutation treten bei einer Therapie mit einzelnen Wirkstoffen (Monotherapie) schon nach wenigen Wochen resistente Virusvarianten auf. Dieses Problem lässt sich nur sehr begrenzt durch die Kombination mehrerer Medikamente umgehen. Gegenwärtig wird die HIV-Infektion in entwickelten Ländern durch eine intensive medikamentöse Therapie behandelt (highly active antiretroviral therapy, HAART), welche die Einnahme von mindestens drei verschiedenen antiviralen Medikamenten erfordert. Um eine Resistenzentwicklung bei einer HAART zu minimieren, ist die genaue Einhaltung komplizierter Therapieverfahren und eine engmaschige und aufwändige Überwachung des Therapieerfolges erforderlich.
Um die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden, wurde im Zuge der Entwicklung einer effektiven HIV-Vakzine nach HIV-Proteinfragmenten oder -Peptiden gesucht, die in bestimmte Mechanismen der Virusreplikation eingreifen, um gezielt verschiedene Stufen einer HIV-Infektion auszuschalten. Darüber hinaus bietet die Expression antiviral wirksamer Proteine bzw. Peptide in HIV-permissiven Zellen durch gentherapeutische Strategien die Möglichkeit, die Virusreplikation längerfristig zu hemmen und ist damit der Behandlung durch tägliche Einnahme mehrerer Medikamente überlegen. Ein Schritt in der HIV-Replikation, der bisher einer gezielten Hemmung nicht zugänglich war, ist die Freisetzung des Virus von der Plasmamembran.
Das Gag-Protein (Gruppenspezifisches Antigen), das Hauptstrukturprotein von HIV, trägt alle funktionellen Domänen, die zur Partikelbildung und -freisetzung benötigt werden. Das Gag-Pol-Polyprotein birgt zusätzlich funktionelle Domänen für die viralen Enzyme Protease, Reverse Transkriptase und Integrase. Gag und Gag-Pol bilden nach Transport zur Innenseite der Plasmamembran sphärische Partikel. Diese Partikel stülpen sich in einem als ,Knospung' bezeichneten Prozess aus der Membran heraus, bis nur noch ein schmaler Membranschlauch Partikel und Zelle verbindet. Als letzter Schritt der Knospung findet an dieser Stelle eine Membranfusion statt, die das Partikel von der Zelle trennt. Gleichzeitig damit oder kurz darauf werden Gag und Gag-Pol durch die virale Protease in ihre funktionellen Untereinheiten gespalten. Dadurch wird eine morphologische Umlagerung (,Reifung') ausgelöst, die essentiell für die Infektiösität des Virions ist, und die mit den derzeit in der HIV-Therapie verwendeten Protease-Hemmern blockiert werden kann.
Die HIV-Knospung ist ein aktiver Prozess, der eine bisher wenig bekannte zelluläre Maschinerie involviert. Bei Retroviren (einschließlich HIV), sowie einigen anderen Virusgruppen, z.B. Filoviren (Ebola) und Rhabdoviren (Tollwut, Vesicular stomatitis Virus) wurden sogenannte ,late domain'-Proteine identifiziert. Diese enthalten kleine, hochkonservierte Peptidmotive, die für die Virusfreisetzung notwendig sind. Alle bekannten ,late domains' bei Retroviren liegen innerhalb des Gag-Strukturproteins, im Fall von HIV in der C-terminalen Domäne p6. Das zentrale funktionelle Element der ,late domain' bildet bei HIV die Peptidsequenz P(T/S)AP. ,late domain'-Elemente anderer Retroviren, sowie die anderer Virusfamilien, enthalten die Peptidsequenz PPXY als wichtigstes Element, häufig in Kombination mit einer P(T/S)AP-Sequenz. Das PPXY Motiv fehlt bei HIV. Die P(T/S)AP- bzw. PPXY-Elemente können sich zum Teil gegenseitig ersetzen und unabhängig von ihrer Lokalisation innerhalb des Gesamtmoleküls wirken.
Es gibt Hinweise darauf, dass ,late domain'-Peptide intrazelluläre Faktoren binden und zum Ort der Virusfreisetzung rekrutieren (Freed 2002, Perez und Nolan 2002). Mögliche direkte Interaktionspartner von ,late domain' Motiven sind die zellulären Proteine Tsg101 (für PTAP) und die Ubiquitin-Ligase Nedd4 (für PPXY) (VerPlank 2001, Garrus 2001, Kokonyogo 2001). Die Interaktion dieser Faktoren mit dem Virusprotein könnte für die Partikelfreisetzung wichtig sein (Garrus 2001, Kokonyogo 2001), so dass eine gezielte Hemmung dieser Interaktion die Virusproduktion in einem späten Schritt im Replikationszyklus unterbrechen und eventuell in Kombination mit Proteaseinhibitoren die Virusreplikation verhindern würde.
Es wurde nun gefunden, dass die Expression eines Fusionsproteins, welches eine membranständige Version der ,late domain'-Region von HIV-1, p6, enthält, die HIV-Partikelfreisetzung aus der transfizierten Zelle hemmt und nach Transduktion die HIV-Virusreplikation um etwa 90% reduziert. Wahrscheinlich liegt dies daran, dass das erfindungsgemäße Fusionsprotein zur Bindung und Rekrutierung der wirtseigenen Faktoren befähigt sein könnte. Die wirtseigenen Faktoren sollten somit für eine Bindung an ,echte' virale ,late domain'-Peptide nicht mehr zur Verfügung stehen, so dass es nicht zur Partikelbildung bzw. -freisetzung kommt. Die gentherapeutische Blockierung der Virusreplikation zu einem späten Zeitpunkt im Replikationszyklus kann in direkter Verbindung mit bereits zugelassenen antiviralen Medikamenten wirken. Vorteilhaft ist außerdem, dass funktionelle ,late domains' kompakte Peptidmotive sind und sich damit zum Einsatz in gentherapeutischen Vektoren hervorragend eignen. Bei intrazellulärer Expression dieser Peptide ist nur eine geringe Immunogenität zu erwarten. Der unerwartete Effekt wurde unter anderem dadurch erzielt, dass der ,late domain' Anteil des Fusionspeptids mit einem membranverankernden Anteil verknüpft wurde, so dass das Fusionspeptid direkt am Ort der Freisetzung, namentlich an der Plasmamembran, exprimiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Fusionsprotein der allgemeinen Formel
5'-MTS-(Marker)-,late domain'-3'
wobei
„5' " das 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet,
„ 3' " das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet,
„(Marker)" eine optional vorhandene DNA-Region, die für ein Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet
„MTS" die für ein „membrane targeting signal" kodierende DNA-Region, Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet,
und
„late domain" eine DNA-Region, die für den exprimierten Bereich der „late domain", eines Fragments oder Derivates davon, eines Virus kodiert, bezeichnet
Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuren der allgemeinen Formel:
5'-MTS-,late domain'-(Marker)-3'
und
5'-(Marker)-MTS-,late domain'-3'
sowie Fragmente und Derivate davon.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet "Virus" sämtliche Viren, deren Genom mit einem "late domain"-Bereich ausgestattet ist. Beispiele für Viren, die in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, umfassen Retroviren, darunter Leukoseviren, Sarkomviren, z.B. HTLV-I, und insbesondere Lentiviren wie HIV-1 und HIV-2. Die Erfindung umfasst außerdem Filoviren (z.B. Ebola-Virus), Rhabdoviren (z.B. Tollwut-Virus), sowie andere umhüllte Viren wie Herpesviren, Bunyaviren, Arenaviren, Flaviviren und Togaviren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus dem Genom von Retroviren, Filoviren und Rhabdoviren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus dem Genom von Retroviren, insbesondere Lentiviren. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus einem Genomabschnitt von HIV-1, der als p6 bezeichnet wird..
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf DNA-Sequenzen, die für eine „late domain" kodieren, bei denen mindestens ein Nukleotid der offenbarten Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf „late domain"-DNA-Sequenzen, bei denen die ursprüngliche Nukleotidsequenz entweder am 5'-, am 3'- oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des kodierten „late domain"-Bereichs erhalten bleibt.
Darüber hinaus schließt die erfindungsgemäße Definition von „late domain" das Nacheinanderschalten mehrerer „late domains" ein, wobei es unerheblich ist, ob die „late domains" gleich oder verschieden sind, oder ob sie aus dem gleichen oder zwei verschiedenen Viren stammen.
Analog zu dem vorgenannten bezieht sich „Fragmente und Derivate" auf DNA-Sequenzen kodierend für eine MTS, bei denen mindestens ein Nukleotid der ursprünglichen Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf MTS-DNA-Sequenzen, bei denen die ursprüngliche Nukleotidsequenz entweder am 5'-, am 3'- oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des kodierten MTS-Bereichs erhalten bleibt.
Die Erfindung schließt verschiedene Möglichkeiten zum Transport und zur Verankerung des von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten Peptids an der Membran ein. Geeignet sind hierfür alle Peptide, die als intrazelluläres Membran-Targetingsignal fungieren können. „MTS" kann daher für ein Peptid kodieren, das ein Motiv zur intrazellulären Anhängung eines Membranankers birgt, z.B. Palmitoyl, Myristoyl-, bzw. Prenyl oder CaaX-Motiv. Für die vorliegende Erfindung kann es auch zweckmäßig sein, wenn „MTS" für einen Transmembrananker eines Typ I – Transmembranproteins kodiert. Unter einem Typ I – Transmembranprotein versteht der Fachmann ein Transmembranprotein mit extrazellulärem Amino- und intrazellulärem Carboxyterminus.
Geeignet für die Erfindung sind demnach MTS aller dem Fachmann zugänglichen Typ I-Transmembranproteine. Bevorzugt sind MTS von Typ I-Transmembranproteinen, die ausgewählt sind aus der nicht abschließenden Liste von Beispielen wie Ribophorin I und Π, MHC-Klasse I, HIV-1-Vpu, Synaptotagmin II, Maus-CMV-gp48, Mensch-CMV-US11, Calnexin, PERK, UDP-Glucuronosyltransferase, low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR) oder CD34.
Als „Marker" zum Nachweis der durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierten Peptide kommen verschiedene Peptide bzw. dafür kodierende DNA-Sequenzen in Betracht. Generell schließt die Erfindung alle Peptide bzw. Proteine ein, die sich für einen Nachweis, beispielsweise für einen immunologischen Nachweis, eignen. Für die vorliegende Erfindung eignen sich besonders sogenannte Reportergene oder andere Gene, die für Proteine bzw. Peptide kodieren, deren Anwesenheit leicht zu bestimmen ist. Marker, die sich zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eignen, können ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend sogenannte „epitope-tags" (c-Myc, Hämagglutinin, FLAG), Biotin, Digoxygenin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Green Fluorescent Protein (GFP) und Derivate davon mit veränderter Fluoreszenz (EGFP, EYFP, EFCP), β-Galactosidase, Luciferasen, β-Glucuronidase und β-Lactamase. Verfahren zum Nachweis der vorstehenden Marker sind dem Fachmann bekannt.
Der Marker kann auch für ein beliebiges Peptid kodieren, dessen Nachweis mittels dem Fachmann bekannter Methoden unter Verwendung von spezifischen Antikörpern erfolgt, z.B. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), Western Blot, Immunpräzipitation, Enzyme-linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) oder Radioactive Immunoadsorbent Assay (RIA). Vorteilhaft ist es, wenn der zum Nachweis verwendete Antikörper mit einem Molekül gekoppelt ist, das den Nachweis ermöglicht oder dazu beiträgt. Geeignet hierfür sind beispielsweise Biotin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Fluoreszein-Isothiocynat (FITC), Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC), Diamidinophenylindol (DAPI) und Phycoerythrin.
Für die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure keinen für einen Marker kodierenden Bereich enthält. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Nukleinsäure für (gen-)therapeutische Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn die Nukleinsäure für ein möglichst kleines Peptid kodiert und das besagte Peptid möglichst frei von zusätzlichen, für die Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise ungünstig auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz, sowie Fragmente und Derivate gemäß obiger Definition davon, auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz, sowie Fragmente und Derivate gemäß obiger Definition davon, auf.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Expression des von ihr kodierten Peptids in Zellen, insbesondere HIV-infizierten Zellen, eingesetzt.
Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Wirts- bzw. Zielzelle (Transfektion bzw. Transformation) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide, Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen.
Für die Expression und für das Einbringen der Nukleinsäure in die Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem sogenannten Expressionsvektor inseriert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante DNA und einen Expressionsvektor, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen, insbesondere menschlichen, bakteriellen oder einen retroviralen Vektor, Plasmid, Bakteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren, die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet sind. Falls gewünscht oder erforderlich, kann die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten, operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber auch Introns oder ähnliche Elemente sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors, die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen oder dazu beitragen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen retroviralen Vektor inseriert. Retroviren sind sogenannte RNA-Viren, deren Genom nach Infektion einer Zelle revers in DNA transkribiert und in das Wirtszell-Genom integriert wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt hierbei über rezeptorgesteuerte Endozytose. Bei manchen retroviralen Vektoren wird die Expression des Vektors nach Aufnahme des Virus ausgeschaltet, so dass die Zelle nur einmal infiziert wird. Die Integration der viralen DNA in das Genom wird durch ein viralkodiertes Protein, Integrase, bewirkt, wobei der Integrationsort unspezifisch ist. Vektoren auf retroviraler Basis sind aufgrund der vorstehend genannten Eigenschaften insbesondere für die Gentherapie geeignet, denn sie werden durch die rezeptorgesteuerte Endozytose effizienter aufgenommen, und effizienter integriert, da der Prozess enzymatisch erfolgt. Der Fachmann kennt diesen Vorgang auch unter der Bezeichnung „retrovirale Transduktion".
Dem Fachmann ist bekannt, wie solche Vektoren mittels sogenannter „Packaging Cells", die sogenannte Helferviren im Genom tragen, in die Zielzelle eingeschleust werden. Die Erfindung umfasst alle retroviralen Vektoren, die sich beispielsweise von Onko-, Lenti- oder Spumaviren ableiten. Beispielhaft handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen retroviralen Vektor um M159.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, eines Fragments oder Derivats davon, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in eine geeignete Wirtszelle mittels geeigneter Methoden, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle und (c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.
Falls gewünscht oder erforderlich können die gemäß Schritt (c) isolierten Proteine für andere Zwecke weiter aufgereinigt werden. Der Fachmann kennt hierfür zahlreiche Methoden, z.B. Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie, Ionenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affinitätschromatografie und ähnliches.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiertes Fusionspeptid der allgemeinen Formel
NH₂-MTS-(Marker)-,late domain'-COOH
wobei
„NH₂" das aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„COOH" das carboxyterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„(Marker)" ein optional vorhandenes Peptid zum Nachweis des Konstrukts bezeichnet,
„MTS" ein „membrane targeting signal", Fragment oder Derivat davon, bezeichnet,
und
„late domain" die „late domain"-Region, ein Fragment oder Derivat davon, eines Virus bezeichnet.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Fusionspeptid der allgemeinen Formeln
NH₂-MTS-,late domain'-(Marker)-COOH
und
NH₂-(Marker)-MTS-,late domain'-COOH
sowie Fragmente und Derivate davon.
Für die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn das erfindungsgemäße Fusionspeptid keinen Marker enthält. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Fusionspeptid für therapeutische Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn das Fusionspeptid möglichst klein und möglichst frei von zusätzlichen, für die Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise ungünstig auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf Aminosäuresequenzen von „late domain", bei denen mindestens eine Aminosäure durch mindestens eine Aminosäure, die von der ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf „late domain"-Aminosäuresequenzen, bei denen die ursprüngliche Aminosäuresequenz entweder am amino-, am carboxyterminalen oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des „late domain"-Bereiches erhalten bleibt.
Erfindungsgemäß können auch mehrere „late domains" nacheinander geschaltet sein, wobei es unerheblich ist ob die „late domains" gleich oder verschieden sind, oder ob sie aus gleichen oder verschiedenen Viren stammen.
Hinsichtlich der Definitionen von „Marker", „Virus" und „MTS" gelten die vorstehend für die erfindungsgemäße Nukleinsäure gemachten Angaben, die hier auf Proteinebene bezogen sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Fusionspeptid die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Fusionspeptid die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz auf.
In einem weiteren Aspekt führt die Insertion der Nukleinsäuresequenz in erfindungsgemäße, gentherapeutisch anzuwendende Vektoren und das Einbringen der erfindungsgemäßen Vektoren in HIV-infizierte Zellen zur Expression eines Fusionspeptides, wodurch eine starke Hemmung der HIV-Replikation verursacht wird. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten.
In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Freisetzung von infizierten Zellen, wobei dieses das Inkontaktbringen und die Transfektion der HIV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Günstig zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anwesenheit der vorgenannten Reagenzien bzw. der Einsatz der vorstehend genannten Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und die eine Aufnahme der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Zelle ermöglichen bzw. dazu beitragen.
Als mögliche Zielzellen für eine Transfektion/retrovirale Transduktion mit einem erfindungsgemäßen Vektor sind alle Zellarten denkbar. Besonders bevorzugt für das vorstehend genannte Verfahren sind T-Lymphozyten und/oder hämatopoetische Stammzellen. Ganz besonders bevorzugt sind T-Lymphozyten.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Freisetzung, wobei dieses das Inkontaktbringen der HIV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Fusionspeptid oder eines Fragments oder Derivats davon umfasst. Das Verfahren kann in vitro in einer wässrigen Lösung, in vivo in einem geeigneten Zellkultur-Assay, oder in einem Lebewesen mittels geeigneter Verabreichungsformen durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid können im Sinne der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel, optional in Kombination mit einem geeigneten Trägerstoff, verwendet werden.
Dabei ist es unerheblich, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen verabreicht werden. Die Verabreichung der aktiven Substanzen kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Dosis und/oder die Einwirkzeit des Arzneimittels ist variabel und hängt vom physiologischen Zustand der zu behandelnden Person ab. Dabei können Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten eine Rolle spielen. Außerdem kann es von Bedeutung sein, ob die Krankheit akut, chronisch oder prophylaktisch behandelt werden muss.
In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid zur Herstellung eines Arzneimittels, optional in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff, für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten verwendet.
Die Herstellung solcher Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Für die Stabilität und Wirksamkeit des Arzneimittels ist gegebenenfalls die Anwesenheit von Stabilisatoren und Trägersubstanzen wie Stärke, Laktose, Stearinsäure, Fette, Wachse, Alkohole oder physiologische Kochsalzlösungen oder anderer Additiva wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe erforderlich. Arzneimittel in flüssiger Form lassen sich, falls erforderlich, lyophilisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach auch ein Arzneimittel, das, optional in Kombination mit weiteren, pharmazeutisch verträglichen Substanzen und Trägerstoffen, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid enthält, und das für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten geeignet ist.
Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral erfolgen, z.B. in Form von beschichteten oder unbeschichteten Tabletten, Granulaten, harten und weichen Gelatinekapseln, oder sie kann rektal in Form von Zäpfchen erfolgen. Das Arzneimittel kann auch parenteral – unter Umgehung des Verdauungsapparates – z.B. subkutan, intramuskulär oder intravenös in Form von Lösungen für Infusionen oder Injektionen verabreicht werden. Andere geeignete Darreichungsformen betreffen direkte Applizierungen (z.B. auf die Haut) in Form von Salben, Tinkturen, Sprays oder transdermalen therapeutischen Mitteln, oder zu inhalierende Mittel in Form von Nasensprays, Aerosolen, oder in Form von Mikrokapseln, Implantaten oder Stäbchen. Die geeignete Darreichungsform hängt von der Art und der Schwere der Krankheit ab.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, das zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden kann, wobei das Kit mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid umfasst.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1: Klonierung der prototypischen Expressionsplasmide bhd-1a und bhd-1:
Ausgangsvektor für die Konstruktion des Plasmids bhd-1a war der Vektor pEFplink (LIT), der eingesetzte offene Leseraster in eukaryontischen Zellen unter Kontrolle des zellulären EF1-alpha-Promoters exprimiert. In dieses Plasmid wurde eine ,in frame' Fusion aus den kodierenden Sequenzen für srcNLS (PCR-amplifiziert aus pHHR-srcNLS-GFP; R. Welker, unpubliziert) und dem vollständigen p6 Protein von HIV-1 (PCR-amplifiziert aus pNL4-3) kloniert. Zwischen diese beiden Fusionsanteile wurde die ebenfalls mittels PCR amplifizierte kodierende Sequenz für EGFP (aus pEGFP-c1, Clontech) gesetzt. Daraus resultierte Plasmid bhd-1a. Durch Klonierung der gesamten Expressionskassette aus bhd-1a in das Plasmid M159 (zur Verfügung gestellt von Dr. M. von Laer, Georg-Speyer-Haus Frankfurt) entstand der lentivirale Vektor bhd-1. Dieses Plasmid exprimiert das therapeutische Gen unter der Kontrolle des ,long terminal repeat' des Myeloproliferative Sarkom Virus. Durch die ebenfalls im Vektor vorhandene leader-Sequenz 71 des Murinen embryonic stem cell Virus und das beta-Posttranskriptionelle Regulationselement des Waldmurmeltier-Hepatitis B-Virus wird die Expressionseffizienz gesteigert (Schambach 2000).
Beispiel 2: Kultivierung der Zellen und Viren
293T-, COS-7 und Phoenix-ampho-Zellen wurden in Dulbecco's Medium (Invitrogen), komplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS; Sigma), kultiviert. PM-1 und Jurkat-Zellen wurden in RPMI-Medium mit 10% FCS kultiviert.
Replikationskompetente Viren wurden nach Transfektion von 293T Zellen mit dem proviralen Klon pNL4-3 und anschliessender Passage auf PM-1 Zellen gewonnen.
Zur stabilen Transfektion von PM-1 Zellen wurde ein retroviraler Vektor, der für das prototypische Fusionsprotein kodiert (bhd-1) mittels der Verpackungszellinie Phoenixampho (Grigani et al., 1998) verpackt.
Beispiel 3: Expression des prototypischen Fusionsproteins in transfizierten Zellen
Um die Expression und Stabilität des Fusionsproteins zu testen, wurde das entsprechende Expressionskonstrukt zunächst alleine in verschiedene Zellinien (HeLa, 293T, COS-7) transfiziert . In Zellextrakten konnte ein Protein mit dem erwarteten apparenten Molekulargewicht (ca. 35 kDa) nachgewiesen werden, das mit Antiseren gegen EGFP sowie gegen p6 reagiert (Zeichnung 1B). Das Fusionsprotein ist demnach in Zellen stabil, die exprimierte Menge entspricht in etwa der des gut exprimierten Markerproteins EGFP alleine (Blot mit anti-GFP, vgl. Spuren 1 und 3). Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von transfizierten COS-7 (Zeichnung 1C) und HeLa-Zellen (nicht gezeigt) zeigte ein starkes GFP-Signal an der Plasmamembran. Das synthetische Membranlokalisationssignal ist demnach in dem hier verwendeten Kontext funktionell und das Fusionsprotein wird an den beabsichtigten Wirkungsort innerhalb der Zelle transportiert.
Beispiel 4: Ko-Transfektionsexperiment zum Nachweis der inhibitorischen Wirkung des neuen Fusionsproteins
Durch Ko-Transfektion des prototypischen Vektors mit dem Plasmid pKHIV wurde auf einfache Weise die inhibitorische Wirkung des Fusionsproteins auf die Partikelfreisetzung untersucht (Zeichnung 2). pKHIV (LIT) ist ein nicht-infektiöses subvirales Derivat des proviralen Klons pNL4-3, das die kodierenden Regionen von HIV-1 (mit Ausnahme von nef) unter Kontrolle des CMV major late-Promotors enthält. Die viralen Hauptstrukturproteine Gag und Gag-Pol werden exprimiert und bilden virusähnliche Partikel, die normal in den Zellkulturüberstand freigesetzt werden (da in pKHIV die ,long terminal repeats' und die Primerbindungsstelle fehlen, sind die entstehenden Partikel nicht infektiös). Bei Anwesenheit eines inhibitorisch wirksamen Fusionsproteins in der gleichen Zelle sollte entsprechend weniger Virusprotein ins Medium freigesetzt werden. Dieses Plasmid wurde zusammen mit dem Vektor bhd-1a (bzw. zur Negativkontrolle mit dem Leervektor pEFplink oder dem EGFP-Expressionsplasmid pEGFP-c1) in 293T-Zellen transfiziert. Bei den Kotransfektionen wurden jeweils equimolare Mengen der beiden Plasmide eingesetzt. Die Immunoblot-Analyse des Zellextraktes mit anti-GFP-Antiserum zeigte, dass das Fusionsprotein in vergleichbarer Menge zum Kontrollprotein EGFP exprimiert wurde (Zeichnung 2, oben). 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellkulturüberstände geerntet, durch 0,45 μm Filter filtriert und in Ultrazentrifugenröhrchen auf ein Saccharosekissen (20% w/w in phosphatgepufferter NaCl-Lösung) geschichtet. Durch Zentrifugation (90 min; 39000 rpm, SW-41 Rotor) wurden die Viruspartikel aus dem Überstand pelletiert und anschliessend vollständig auf ein SDS-Gel aufgetragen. Durch Immunoblot mit Antiserum gegen HIV-1 Capsid wurden die pelletierten Viruspartikel nachgewiesen. Wie Zeichnung 2 zeigt, werden bei gleicher Menge an intrazellulär exprimiertem Gag-Protein (Zeichnung 2, Mitte) in Anwesenheit des Fusionsproteins deutlich weniger Viruspartikel freigesetzt (unten) als in den Kontrollansätzen.
Beispiel 5: Infektion von stabil transduzierten PM-1 und Jurkat-Zellen zum Nachweis der inhibitorischen Wirkung auf die Virusreplikation.
Mit Hilfe von Verpackungszellinien wurden stabil mit bhd-1 transduzierte PM-1 und Jurkat-Zellen hergestellt. Durch hohe Transduktion oder durch FACS-Sortierung wurde ein Anteil von ca. 80% EGFP positiver Zellen erreicht. Im Vergleich zu untransduzierten, bzw. mit einem nur EGFP-exprimierenden Kontrollvektor (M56) transduzierten Zellinien sollten diese Zellen eine verminderte Virusreplikation erlauben. Dies wurde durch Infektion mit den HIV-1 Isolaten NL4-3, bzw. dem besonders aggressiven Isolat D117II getestet. Die Virusreplikation über bis zu 3 Wochen wurde durch Bestimmung des Capsidproteins p24 im Medium verfolgt. Wie Zeichnung 3 zeigt, war in diesen Experimenten die Freisetzung von p24 in bhd-1 transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen um etwa 90% inhibiert. Durch Expression des Prototyp-Fusionsproteins kann also die HIV-1 Replikation effizient gehemmt werden.
Beschreibung der Zeichnungen:
Zeichnung 1:

(A) Schematischer Aufbau des getesteten prototypischen Inhibitorproteins. SrcNLS: von den Erfindern entwickeltes synthetisches Membranlokalisationssignal (R.Welker, unpubliziert); EGFP: grün fluoreszierendes Protein; p6: komplette kodierende Sequenz des p6 Proteins von HIV-1 NL4-3.
(B) Ein eukaryotischer Expressionsvektor, der für das in (A) skizzierte Fusionsprotein kodiert, wurde transient in 293T-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und der Gesamtextrakt mittels Immunoblot auf das Vorhandensein des Fusionsproteins untersucht (Spur 3). Als Kontrolle wurden parallel mit Leervektor transfizierte Zellen (Spur 2), sowie mit dem Plasmid pEGFP-c1 (Clontech) transfizierte Zellen (Spur 1) verwendet. Das Bild zeigt Immunoblots entwickelt mit den angegebenen Antiseren; auf der linken Seite sind die Positionen der Molekulargewichts-Standards (MW in Kilodalton) aufgetragen. In den mit Inhibitorkonstrukt transfizierten Zellen wird ein Protein der erwarteten Grösse (ca. 35 kDa) detektiert, das sowohl mit Antiserum gegen p6, als auch mit Antiserum gegen GFP reagiert.
(C) COS-7 Zellen wurden mit dem Inhibitorkonstrukt bhd-1a transfiziert und 48 h nach Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die intrazelluläre Lokalisation des srcNLS-EGFP-p6-Fusionsproteins zu bestimmen. Man erkennt ein starkes Fluoreszenzsignal an der Plasmamembran.

Zeichnung 2:
293T-Zellen wurden mit gleichem Mengen eines nicht-infektiösen HIV-1 Derivats (pKHIV) und dem Inhibitorkonstrukt kotransfiziert. Als Negativkontrolle wurde anstelle des Inhibitorkonstruktes der Expressionsvektor ohne kodierende Sequenz bzw. das EGFP-exprimierende Plasmid pEGFP-c1 (Clontech) eingesetzt. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und gleiche Mengen des Zellextrakts mittels Immunoblot auf Expression des inhibitorischen Proteins (oben) und dem von pKHIV kodierten HIV Hauptstrukturprotein Gag (Mitte) getestet. Aus dem Zellkulturüberstand wurden die freigesetzten subviralen Partikel mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen gereinigt, vollständig auf ein SDS-Gel aufgetragen und durch Immunoblot nachgewiesen (unten).
In allen Ansätzen werden vergleichbare Mengen an Gag-Protein exprimiert (Mitte), die Freisetzung von Gag-Partikeln ist jedoch in Anwesenheit des inhibitorischen Proteins im Vergleich zu den beiden Kontrollen deutlich reduziert (unten).
Zeichnung 3:
Zwei verschiedene T-Zell-Linien (Jurkat und PM-1) wurden stabil mit dem Inhibitorkonstrukt transduziert und anschliessend mit den HIV-1 Isolaten NL4-3 und D117II infiziert. Als Mass für die Virusfreisetzung wurde zu mehreren Zeitpunkten nach Infektion HIV-1 Capsidprotein (p24) im Zellkulturüberstand mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus zwei Ansätzen. In Zellen, die mit dem Inhibitorkonstrukt bhd-1 transduziert wurden, ist die Virusreplikation im Vergleich zur Kontrolle um etwa 90% reduziert.
Diese Daten wurden von Frau PD Dr. D. v. Laer, Georg-Speyer-Haus Frankftut/M., zur Verfügung gestellt SEQUENCE LISTING

Claims

Nukleinsäure der allgemeinen Formel 5'-MTS-(Marker)-,late domain'-3' wobei „5'" das 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet, „3'" das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet, „(Marker)" eine optional vorhandene DNA-Region, die für ein Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet. „MTS" die für ein „membrane targeting signal" kodierende DNA-Region, Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet, und „late domain" eine DNA-Region, die für den exprimierten Bereich der „late domain", eines Fragments oder Derivates davon, eines Virus kodiert, bezeichnet, ein Fragment oder Derivat davon.
Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Filoviren, Rhabdoviren und Retroviren.
Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Retrovirus ist.
Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus ein Lentivirus ist.
Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Lentivirus HIV-1 ist.
Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass „MTS" die Nukleotide 1 bis 63 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz umfasst.
Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass sie keine für einen „Macker" kodierende DNA-Region enthält.
Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
Rekombinante DNA, die eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 enthält.
Expressionsvektor, der eine rekombinante DNA gemäß Anspruch 10 enthält.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass er ein retroviraler Vektor ist.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der retrovirale Vektor M159, ein Fragment oder Derivat davon, ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Peptids, das von der Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 kodiert wird, umfassend die folgenden Schritte: (a) Einbringen eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 in eine Wirtszelle, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle, und (c) Isolierung des Peptids aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.
Fusionspeptid der allgemeinen Formel NH₂-MTS-,late domain'-(Marker)-COOH wobei „NH₂" das aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet, „COOH" das carboxyterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet, „(Marker)" ein optional vorhandenes Peptid zum Nachweis des Konstrukts bezeichnet, „MTS" ein „membrane targeting signal", Fragment oder Derivat davon, bezeichnet, und „late domain" den „late domain", Fragment oder Derivat davon, eines Virus bezeichnet, ein Fragment oder Derivat davon.
Fusionspeptid, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass „MTS" die Aminosäuren 1 bis 21 der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz umfasst.
Fusionspeptid, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass es keinen Marker enthält.
Fusionspeptid mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
Fusionspeptid mit der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.
Verwendung eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 zur Behandlung von HIV-Infektionen.
Verwendung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass HIV-infizierte Zellen mit dem Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 transfiziert werden.
Verwendung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die HIV-infizierten Zellen T-Lymphozyten sind.
Verfahren zur Hemmung einer HIV-Freisetzung, umfassend das Inkontaktbringen einer HIV-infizierten Zelle mit dem Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19.
Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder eines Fusionspeptids gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9, eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und eines Fusionspeptids gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten.
Arzneimittel zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einen Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder ein Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19, optional in Kombination mit weiteren pharmazeutisch verträglichen Substanzen und/oder Trägerstoffen.
Kit, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder ein Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder ein Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19.