DE10234200A1

DE10234200A1 - Säugetier regulatorische T-Zellen und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE10234200A1
Application number: DE10234200A
Authority: DE
Inventors: Jochen Dr. Hühn; Joachim Dr. Lehmann; Alf Prof. Dr. Hamann
Original assignee: Universitatsklinikum Charite Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2004-02-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft regulatorische alpha¶E¶·-·CD25·+·CD4·+·, alpha¶E¶·+·CD25·+·CD4·+· und/oder alpha¶E¶·+·CD25·-·CD4·+· T-Zellen von Säugern und deren Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Modulation von Entzündungsreaktionen. Diese Entzündungsreaktionen betreffen insbesondere die Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Autoimmunerkrankung, wie rheumatische Entzündung, sowie eine Behandlung von tumoralen Erkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft regulatorische α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen von Säugern und deren Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Modulation von Entzündungsreaktionen. Diese Entzündungsreaktionen betreffen insbesondere die Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Autoimmunerkrankung, wie rheumatische Entzündung, sowie eine Behandlung von tumoralen Erkrankungen.

Die sogenannte „immunologische Toleranz" ist gekennzeichnet durch einen physiologischen Status, in dem das Immunsystem nicht gegen "körpereigene" Komponenten oder gegen ungefährliche Antigene (z.B. Nahrungsmittelantigene) reagiert. Die Unterscheidung zwischen "Selbst" und "Nicht-Selbst" bzw. "Gefahr" und "keine Gefahr" spielt daher eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung immunologischer Toleranz. Immunologische Toleranz von T-Zellen wird auf verschiedenen Ebenen entwickelt. Zunächst kommt es bei der Reifung von T-Zellen im Thymus zu einer Deletion von solchen T-Zellen, die eine hohe Reaktivität gegenüber Selbst-Antigenen zeigen. Dieser Schritt wird "negative Selektion" oder "zentrale Toleranz" genannt. Da zwar sehr viele, jedoch nicht alle Selbst-Antigene im Thymus exprimiert werden, können immer einige T-Zellen den Thymus verlassen, welche einen T-Zell-Rezeptor exprimieren, der ein bestimmtes körpereigenes Antigen erkennt, welches nur in der Peripherie (also irgendwo im Körper) und nicht im Thymus exprimiert wird. Daher gibt es in jedem Organismus potentiell autoreaktive T-Zellen innerhalb der Peripherie.

Um die T-Zellen kontrollieren zu können, werden weitere Ebenen der Toleranz, die sogenannten "peripheren Toleranzmechanismen" benötigt. Zu diesen "peripheren Toleranzmechanismen" gehören u.a. die regulatorischen T-Zellen, welche in den letzten Jahren intensiv untersucht wurden. Kurz zusammengefaßt sind die folgenden Charakteristika regulatorischer T-Zellen bekannt:

1. Sie bilden eine Untergruppe der CD4⁺ T-Helfer-Zellen;
2. Der bekannteste zelluläre Marker ist CD25 (α-Kette des Interleukin-2-Rezeptors);
3. Sie zeigen einen "anergen" Phänotyp (niedrige Proliferationsrate und niedrige Interleukin-2-Produktion);
4. Sie produzieren immunsuppressiver Zytokine, wie etwa IL-10 und TGFβ;
5. Sie bewirken die Inhibierung der Proliferation naiver T-Zellen; und
6. Sie inhibieren B-Zellen und zytotoxische T-Zellen.

Alle diese oben genannten Eigenschaften machten die regulatorischen T-Zellen zu einem interessanten Studienobjekt, insbesondere im Fall von Autoimmunerkrankungen, wie autoimmune Gastritis (McHugh RS, Shevach EM, J Immunol 2002 Jun 15;168(12):5979–83) oder Diabetes (Gregori S, et al. Diabetes 2002 May; 51(5):1367–74) und Entzündungen, wie zum Beispiel Colitis (Singh B, Immunol Rev 2001 Aug;182:190–200).

Immunreaktionen finden entweder in den sekundären lymphoiden Organen (Lymphknoten und Milz) oder in dem "betroffenen" Gewebe statt. Grundsätzlich wird die Immunantwort in den sekundären lymphoiden Organen initiiert. Die Antigene werden im "betroffenen" Gewebe von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) wie z.B. dentritischen Zellen (DCs) aufgenommen und so verarbeitet, daß sie den T-Zellen präsentiert werden können. Diese initiale Präsentation findet nicht im "betroffenen" Gewebe statt, sondern die Antigenbeladenen APCs wandern über die Lymphe in den nächsten ("drainierenden") Lymphknoten. Hier kommt es zum Kontakt von den Antigen-beladenen APCs mit den naiven, d.h. bisher Antigen-unerfahrenen T-Zellen, welche kontinuierlich "auf der Suche nach Antigen" durch die verschiedenen sekundären lymphoiden Organe patrolieren. Wenn sie auf "ihr" Antigen treffen, kommt es erstens zur Vermehrung/Proliferation der naiven, Antigen-spezifischen T-Zellen (klonale Expansion). Zweitens verändern diese T-Zellen ihren Phänotyp, da sie nun ja nicht mehr naiv und Antigen-unerfahren sind, und nehmen einen "Effektor/Memory"-Phänotyp an. Eine dieser Veränderungen betrifft die Moleküle, welche für die Einwanderung (Migration) in bestimmte Gewebe notwendig sind (siehe unten). Diejenigen Moleküle, welche eine Einwanderung in die sekundären lymphoiden Organe ermöglicht haben, werden "abgeschaltet". Statt dessen exprimieren die T-Zellen nun Moleküle, die ihnen die Einwanderung in Entzündungsgebiete ermöglichen. Nach der klonalen Expansion und der Veränderung des Migrationsphänotyps verlassen die T-Zellen die sekundären lymphoiden Organe und zirkulieren durch den Organismus, bis sie auf das Entzündungsgebiet treffen, in das sie nun einwandern können. Die Charakterisierung des Migrationsphänotyps gibt demnach Aufschluß dar über, ob die T-Zellen eher in sekundäre lymphoide Organe oder in Entzündungsgebiete einwandern können.

Die Einwanderung/Migration von T-Zellen aus dem Blutstrom/Zirkulation in das Gewebe erfolgt durch eine Abfolge von spezifischen Interaktionen der T-Zellen mit dem Blutgefäß-Endothel, die durch spezifische Moleküle vermittelt werden. Dieser sogenannte "Multi-Step"-Prozess ermöglicht die gezielte und spezifische Einwanderung von T-Zellen in das Zielgewebe, da jeder dieser Schritte erfolgen muß, um eine Einwanderung zu ermöglichen. Dadurch wird die unspezifische und möglicherweise aus immunologischer Sicht unerwünschte Einwanderung verhindert.

1. Der erste Schritt der Interaktion von T-Zellen mit dem Endothel wird durch Selektine vermittelt. Selektine sind Moleküle, welche an spezifische Kohlenhydratstrukturen binden. Durch diese Interaktionen kommt es zur Reduktion der Flußgeschwindigkeit der T-Zelle und aufgrund der Scherkräfte des Blutstroms zum Rollen der T-Zellen entlang des Endothels.
2. Dieses langsame Rollen ermöglicht es der T-Zelle, mit ihren spezifischen Chemokin-Rezeptoren an Chemokine zu binden, welche an das Proteoglykangerüst der Endothelzellen immobilisiert sind. Chemokine sind Botenstoffe, welche eine Wanderung von Zellen entlang eines Chemokin-Gradienten induzieren (Chemotaxis).
3. Die Bindung des Chemokins an den Chemokin-Rezeptor auf der T-Zelle induziert darüber hinaus noch ein Signal, welches zur Aktivierung von spezifischen Integrinen führt. Ohne dieses Signal befinden sich die Integrine in einem niedrig-affinen Zustand. Erst durch das Chemokin-Signal werden die Integrine in einen hoch-affinen Zustand versetzt, der die feste Bindung an die Integrin-Liganden auf den Endothelzellen ermöglicht. Dadurch kann es zur Auswanderung der T-Zellen in das Gewebe entlang des Chemokin-Gradienten kommen. Die drei Molekülklassen (Selektine, Chemokine und Integrine) bestehen jeweils aus zahlreichen Migliedern. Von einigen dieser Moleküle ist bekannt, daß sie eine spezifische Funktion bei der Einwanderung entweder in sekundäre lymphoide Organe oder Entzündungsregionen haben. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das Integrin α_Eβ₇, dessen Expression die untersuchten regulatorischen T-Zellen charakterisiert, bei der Interaktion mit dem Endothel keine Rolle spielt.

In Salomon und Bluestone (Annu Rev Immunol 2001;19:225–52) werden CD28 und CTLA-4 als Ziel für die Modulation von Immunreaktionen diskutiert. Diese Moleküle spielen nicht nur für die inflammatorischen Reaktionen eine Rolle, sondern auch für die inhibitorischen/regulatorischen. So sind CD28-vermittelte Signale für die Homeostase von CD25⁺CD4⁺ regulatorischen T-Zellen von Bedeutung und CTLA-4 wird verstärkt auf regulatorischen T-Zellen exprimiert. CTLA-4 vermittelte Effekte sind jedoch schwer genau zu untersuchen, da dieses Molekül sowohl auf den regulatorischen Zellen exprimiert als auch auf den inflammatorischen Zellen induziert wird.

Die US 6,383,487 beschreibt Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung der Transplantat-Abstoßung auf Basis von monoklonalen Antikörpern gegen CD25. Regulatorische T-Zellen werden nicht verwendet. Aus den US-Patenten 6,407,241; 6,369,204; 6,359,126; 6,358,976; 6,358,970; 6,358,915; 6,355,482; 6,352,977 sind weiterhin Inhibitoren und die Inhibierung von Integrinen bekannt. Regulatorische T-Zellen werden hier ebenfalls nicht beschrieben.

Kürzlich wurde von McHugh et al. (Immunity, Vol. 16, 311–323, February 2002) das Integrin α_Eβ₇ als ein Marker für regulatorische T-Zellen beschrieben und die CD25+CD4+ regulatorische T-Zellpopulation molekulargenetisch analysiert. Dabei wurde durch Analyse der mRNA aus diesen Zellen untersucht, welche Gene in den regulatorischen T-Zellen exprimiert werden. Vergleichspopulation waren CD25^–CD4⁺ T-Zellen.

Es stellte sich heraus, daß u.a. das Integrin α_Eβ₇ verstärkt in den CD25⁺CD4⁺ T-Zellen exprimiert wird. McHugh et al. haben dann in einem in vitro Proliferationsassay die regulatorische Kapazität der α_E ^–CD25⁺ mit den α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ T-Zellen verglichen. Als Kontrollzellen wurden CD25⁺CD4⁺ und CD25^–CD4⁺ 7-Zellpopulationen verwendet. Dabei stellte sich heraus, daß die α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ T-Zellen die potentesten Regulatoren sind.

Quiding-Jarbrink M et al. (Gut 2001 Oct;49(4):519–25) beschreiben die Rolle eines anderen beta7-Integrins (α₄b₇) in einem Infektionsmodell. Das Integrin α_Eβ₇ und die Verwendung von regulatorischen T-Zellen zur Therapie werden weder beschrieben, noch nahegelegt.

WO 00/40604 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulation der Zytokin-Freisetzung von alpha_E beta 7 exprimierenden Zellen. Dabei werden bindende Polypeptide und andere Moleküle erwähnt, die selektiv an alpha_E beta 7 binden und dadurch die Th2 Zytokin Antwort verstärken oder inhibieren. US 5,594,120 ; US 6,057,423 ; US 6,063,906 und WO 95/22610 beschreiben die Integrin alpha E Untereinheit und dagegen gerichtete Antikörper, sowie deren Verwendung.

Im Hinblick auf die oben genannten Eigenschaften von regulatorischen T-Zellen ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, spezifische Säugetier-regulatorische T-Zellen und deren Verwendungen bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von entzündlichen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen, die eine effektive Therapie ermöglichen und gegenüber den bisher bekannten Therapien von entzündlichen Erkrankungen entscheidende Vorteile aufweisen.

Diese Aufgabe wird gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Entzündungsreaktionen gelöst.

Unter „regulatorischen T-Zellen" sollen im folgenden, wenn nicht anders angegeben, die regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers verstanden werden. Darunter sollen auch z.B. genetisch modifizierte T-Zellen oder andere, eine Immunreaktion beeinflussende Zellen verstanden werden, solange wie diese die hier beschriebenen Modulationen von Entzündungsreaktionen bewirken können. Grundsätzlich charakterisiert die Expression des Integrin α_Eβ₇ die erfindungsgemäßen regulatorischen T-Zellen.

Als „Modulation" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird dabei eine Therapie bei Auftreten akuter Entzündungsreaktionen verstanden, die sowohl eine Gabe von aktivierten oder inhibierten regulatorischen T-Zellen als auch eine Aktivierung oder Blockierung der Aktivitäten der regulatorischen T-Zellen umfassen, kann. Weiterhin soll darunter auch eine Prophylaxe einer potentiell auftretenden Entzündungsreaktion und/oder die Verhinderung einer Verstärkung des Entzündungsgeschehens verstanden werden.

Der Begriff der „Entzündungsreaktion" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist als weit gefaßt zu betrachten und umfaßt somit „klassische" Entzündungsreaktionen, wie die Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Reaktion im Rahmen einer Autoimmunerkrankung, insbesondere bei einer rheumatischen Erkrankung/Entzündung. Umfaßt sind aber auch „entzün dungsähnliche" Immunreaktionen wie tumorale Erkrankungen, insbesondere die Reaktion des Immunsystems auf tumorale Erkrankungen. Diese werden ebenfalls durch regulatorische T-Zellen beeinflußt und können daher gemäß der vorliegenden Erfindung moduliert werden.

Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung, bei der die Modulation von Entzündungsreaktionen die Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Autoimmunerkrankung, insbesondere eine rheumatische Entzündung, umfaßt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer regulatorischen α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen. Dieser Subtyp von regulatorischen T-Zellen und sein Zusammenhang mit Erkrankungen war bisher nicht bekannt. Das zur Verfügung stellen dieser regulatorischen T-Zellen eröffnet somit völlig neue Möglichkeiten der Modulation von Entzündungsreaktionen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit auch eine Säugetier regulatorische α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle.

Das Molekül α_Eβ₇ gehört zur Gruppe der Integrine. Integrine sind Heterodimere, welche aus einer α-Kette und einer β-Kette bestehen. Integrine werden auf verschiedenen Zelltypen exprimiert und spielen eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion. Von dem Integrin α_Eβ₇ ist bekannt, daß es verstärkt auf intraepithelialen Lymphozyten (IELs) exprimiert wird. Im epithelialen Gewebe bindet das Integrin an Epithelzellen, welche den α_Eβ₇-Liganden – das E-Cadherin – exprimieren. Darüber hinaus ist das Integrin α_Eβ₇ aber auch auf ca. 5–6 % der CD4+ T-Zellen in sekundären lymphoiden Organen (Lymphknoten und Milz) exprimiert. Im Rahmen der Vorarbeiten zu der vorliegenden Erfindung wurden diese T-Zellpopulationen genauer charakterisiert und folgenden Beobachtungen gemacht:

1. Die Expression des Integrins α_Eβ₇ auf CD4+ T-Zellen aus sekundären lymphoiden Organen korreliert mit der Expression von anderen Molekülen, die als Marker für regulatorische T-Zellen gelten. Besonders sind hierbei das Molekül CD25 (siehe oben) und CD45RB hervorzuheben. Der Expressionslevel des Moleküls CD45RB unterscheidet solche T-Zellen, die noch keinen Kontakt mit Antigen hatten ("naive" T-Zellen; hohe Spiegel an CD45RB = CD45RB^high) und solche, welche schon Kontakt mit Antigen hatten ("Effektor/Memory/Gedächtnis"-Zellen; niedrige Spiegel an CD45RB = CD45RB^low). Die Mehrheit der α_Eβ₇-exprimierenden Zellen koexprimiert das Molekül CD25 (ca. 75 %) und ist in dem CD45RB^low-Kompartiment lokalisiert.
2. Das Integrin α_Eβ₇ unterteilt daher das bisher bekannte, "klassische" regulatorische Kompartiment (CD25⁺CD4⁺) in zwei verschiedene Zellpopulationen (α_E ⁺CD25⁺ und α_E ^–CD25⁺). Darüber hinaus konnte noch eine zusätzliche T-Zellpopulation, die nur das Integrin α_Eβ₇, aber kein CD25 exprimiert (α_E ⁺CD25^–), gefunden werden. Im Gegensatz zu der Publikation von McHugh et al. konnte erfindungsgemäß das Integrin α_Eβ₇ nicht nur als Marker für hochpotente CD25⁺CD4⁺ regulatorische T-Zellen identifiziert, sondern auch eine CD25-negative regulatorische T-Zellpopulation aufgefunden werden, welche durch das Integrin α_Eβ₇ identifziert werden kann. Dabei unterscheidet sich das Migrationsverhalten von regulatorischen T-Zellpopulationen wesentlich (siehe unten), so daß neue Möglichkeiten bei der Modulation von Entzündungsreaktionen möglich werden. Auch in der Publikation von McHugh et al. werden mögliche Differenzen zwischen den α_E ^–CD25⁺ und den α_E ⁺CD25⁺ CD4⁺ T-Zellen hinsichtlich deren Migrationsverhaltens nicht erwähnt.
3. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde weiterhin die regulatorische Kapazität dieser drei T-Zellpopulationen (α_E ⁺CD25^–, α_E ⁺CD25⁺ und α_E ^–CD25⁺) sowohl in einem in vitro als auch einem in vivo System untersucht. Dabei stellte sich heraus, daß die α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ T-Zellen die potentesten regulatorischen T-Zellen sind. Aber auch die CD25-negativen Zellen (α_E ⁺CD25^–) besitzen regulatorische Aktivität.
4. Des weiteren konnten die Erfinder zeigen, daß die drei regulatorischen T-Zellpopulationen (α_E ⁺CD25^–, α_E ⁺CD25⁺ und α_E ^–CD25⁺) sich nicht nur hinsichtlich ihrer regulatorischen Potenz, sondern auch in Bezug auf die Expression verschiedener Zytokine und des immuninhibitorischen Moleküls CTLA-4 unterscheiden. Dieses kann als Indiz für die Verwendung unterschiedlicher regulatorischer Mechanismen angesehen werden.

Die Erfinder haben in einigen Vorexperimenten untersucht, ob sich die drei regulatorischen T-Zellpopulationen (α_E ⁺CD25^–, α_E ⁺CD25⁺ und α_E ^–CD25⁺) auch in der Expression bestimmter Selektine bzw. in der Responsivität auf bestimmte Chemokine unterscheiden.

1. Die α_E ^–CD25⁺CD4⁺ T-Zellen, sowie die Kontrollzellen (α_E ^–CD25^–) zeigen eine höhere Frequenz an L-Selektin-exprimierenden Zellen (CD62L^high) als die beiden α_E ⁺CD4⁺ T-Zellpopulationen. Bei dieser Analyse wurden CD4+ T-Zellen aus verschiedenen sekundären lymphoiden Organen (Milz, mesenteriale Lymphknoten und periphere Lymphknoten) untersucht. Von dem Molekül L-Selektin ist bekannt, daß es verstärkt auf naiven, Antigenunerfahrenen T-Zellen exprimiert wird und mit spezifischen Kohlenhydratstrukturen interagieren kann, die hauptsächlich auf Endothelzellen innerhalb von Lymphknoten vorhanden sind. T-Zellen, welche das L-Selektin in hoher Menge exprimieren (CD62L^high), können also in sekundäre lymphoide Organe einwandern.
2. Im Gegensatz dazu zeigen die α_E ^–CD25⁺CD4⁺ T-Zellen sowie die Kontrollzellen (α_E ^– CD25^–) eine niedrigere Frequenz an P-Selektin-bindenden Zellen (P-Selektin-IgG-binding) als die beiden α_E ⁺CD4⁺ T-Zellpopulationen. Bei dieser Analyse wurden CD4+ T-Zellen aus verschiedenen sekundären lymphoiden Organen (Milz, mesenteriale Lymphknoten und periphere Lymphknoten) mit einem rekombinanten P-Selektin-IgG-Fusionsprotein gefärbt. Von dem Molekül P-Selektin ist bekannt, daß es verstärkt auf Endothelzellen exprimiert wird, welche einer Entzündungsregion benachbart sind. Im Gegensatz zum L-Selektin ist hier der Selektin-Ligand auf der T-Zelle exprimiert. P-Selektin wird durch inflammatorische Mediatoren wie Histamin, LPS oder TNFα auf den Endothelzellen induziert. Der P-Selektin-Ligand ist nur auf Antigen-erfahrenen Effektor/Memory-Zellen vorhanden. Somit wird gewährleistet, daß nur Effektor/Memory-Zellen in entzündliche Regionen einwandern. Die höhere Frequenz an P-Selektin-bindenden Zellen innerhalb der beiden α_E ⁺CD4⁺ T-Zellpopulationen deutet also auf eine präferentielle Migration dieser Zellen in Entzündungsgebiete hin.
3. In einem sogenannten Chemotaxis-Experiment haben die Erfinder die Responsivität der drei regulatorischen T-Zellpopulationen (α_E ⁺CD25^–, α_E ⁺CD25⁺ und α_E ^–CD25⁺) auf verschiedene Chemokine getestet. Dabei wurden Gesamt-CD4⁺ T-Zellen aus sekundären lymphoiden Organen in einem Zwei-Kammer-System in die obere Kammer gegeben. In der unteren Kammer befindet sich das Chemokin. Die beiden Kammern sind durch eine Membran miteinander verbunden, welche Poren enthält und das Durchwandern der Zellen erlaubt. Nach bestimmten Zeitpunkten wurde analysiert, welche Zellen sich entlang des Chemokin-Gradienten in die untere Kammer bewegt haben. Vier verschiedene Chemokine wurden untersucht. Bei SDF-1, einem Chemokin, das für die Homeostase in nicht-entzündlichen Situationen wichtig ist (also auch bei der Migration durch sekundäre lymphoide Organe), zeigten sich keine Un terschiede. Aber auch bei MIG, einem Chemokin, das in entzündlichen Regionen gebildet wird, konnte kein spezifisches Chemotaxisverhalten festgestellt werden. Jedoch zeigten die beiden α_E ⁺CD4⁺ T-Zellpopulationen eine niedrigere Chemotaxis gegenüber SLC, einem Chemokin, welches bei der Einwanderung von naiven T-Zellen in sekundäre lymphoide Organe eine zentrale Rolle spielt. α_E ^–CD4⁺ T-Zellen waren jedoch verstärkt SLCresponsiv. Im Gegensatz dazu war die Chemotaxis gegenüber TARC, einem Chemokin, welches in entzündlichen Regionen gebildet wird, bei den beiden α_E ⁺CD4⁺ T-Zellpopulationen erhöht.
4. In einem sogenannten "Homing"-Experiment haben die Erfinder untersucht, in welche Gewebe/lymphoide Organe die regulatorischen T-Zellpopulationen einwandern. Dazu wurden die drei T-Zellpopulationen (α_E ⁺CD25^–, α_E ⁺CD25⁺ und α_E ^–CD25⁺) isoliert und mit radioaktivem Chrom (⁵¹Cr) markiert. Diese markierten Zellen wurden gesunden Mäusen in den Blutstrom (Schwanzvene) gespritzt. Nach drei Stunden wurden die verschiedenen Organe präpariert und die darin enthaltene Radioaktivität gemessen. Dadurch kann festgestellt werden, in welche Organe die jeweiligen T-Zellpopulationen eingewandert sind. Dabei zeigte sich, daß die α_E ^–CD25⁺CD4⁺ T-Zellen eine erhöhte Einwanderung in die Lmphknoten (pLN, mLN, Peyer'sche Plaques) zeigen, während die beiden α_E ⁺CD4⁺ T-Zellpopulationen verstärkt in die Leber einwandern. Von der Leber ist bekannt, daß Effektor/Memory-Zellen verstärkt in dieses Organ einwandern.

Diese Experimente deuten darauf hin, daß sich die beiden regulatorischen T-Zellpopulationen, welche das Integrin α_Eβ₇ exprimieren (α_E ⁺CD25⁺ und α_E ⁺CD25^–) und die α_E ^–CD25⁺CD4⁺ T-Zellen tatsächlich in ihrem Migrationsverhalten unterscheiden. Während die α_E ^–CD25⁺CD4⁺ T-Zellen einen Phänotyp aufweisen, der eher eine Migration in sekundäre lymphoide Organe erlaubt ("naive-like"), zeichnen sich die beiden α_E ⁺CD4⁺ regulatorischen T-Zellpopulationen eher durch einen Phänotyp aus, der eine Migration in entzündliche Regionen ermöglicht ("effector/memory-like").

Erfindungsgemäß können die neu aufgefundenen "naiven" α_E ^–CD25⁺CD4⁺Zellen somit in der Modulation präventiv in "Vakzinierungen/Impfungen" eingesetzt werden, weil sie voraussichtlicherweise die Generierung von autoreaktiven Effektorzellen verhindern – also bevor die Autoimmunreaktion bzw. Transplantatabstoßungsreaktion angelaufen ist. Der Vorteil bei den α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen liegt in ihrem inflammatorischen Migrationsverhalten, wie im Rahmen der vorliegenden Beschreibung näher erläutert wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße Verwendung in Kombination mit Entzündungs-modulierenden Faktoren. Als modulierende Faktoren können Antikörper, insbesondere gegen Integrin α_E, CD4 und/oder CD25 oder Zytokine, insbesondere IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGFβ, TNFα und/oder IFNγ verwendet werden. Die Verwendung kann entweder in Kombination mit den erfindungsgemäßen regulatorischen T-Zellen erfolgen, oder in einer zeitlich beabstandeten Weise, bei der die beiden Bestandteile – bevorzugt in einer Arzneimittelverpackung zusammengefaßt – nacheinander angewendet werden. Die Zytokine können weiterhin zu einer weiteren Differenzierung der regulatorischen T-Zellen verwendet werden (siehe z.B. Barrat FJ, et al. J Exp Med 2002 Mar 4;195(5):603– 16; Papiernik M; Immunol Rev 2001 Aug;182:180–9). Die erfindungsgemäße Verwendung kann weiterhin eine ex vivo Expansion und/oder Prä-Aktivierung oder Prä-Inhibierung der regulatorischen T-Zellen einschließen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung von modulatorischen Substanzen der Aktivität einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺' α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers, das ein a) in Kontakt bringen einer potentiell modulatorischen Substanz mit einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺' α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers, und b) Messen der Aktivität der Säugetier-regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺' α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle umfaßt. Die oben genannten Zellen wurden bisher nicht zum Screenen auf solche Modulatoren verwendet. Screening-Verfahren sind im Stand der Technik in vielen verschiedenen Ausführungen bekannt und diese Verfahren können ohne Probleme an die hier erforderlichen Umstände angepaßt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Aktivators der Aktivität einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺' α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, insbesondere der Abstoßung nach Transplantation oder Autoimmunerkrankungen, insbesondere rheumatischen Entzündungen. Der erfindungsgemäß verwendete Aktivator induziert die Aktivität der regulatorischen T-Zellen, wodurch deren Entzündungs-dämpfenden Wirkungen zur Ausprägung kommen und die Entzündung effektiv bekämpft werden kann.

Auch hier kann die Verabreichung der Aktivatoren zusammen mit einer Gabe von ex-vivo expandierten und/oder präaktivierten regulatorischen T-Zellen erfolgen. Auch in diesem Fall wirken sich die Migrationseigenschaften der α_E ⁺CD4⁺regulatorischen Zellen sehr positiv aus.

Im Gegensatz zu der Aktivierung im Falle der Entzündungsdämpfung betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Inhibitors der Aktivität einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation von Immunreaktionen, insbesondere bei tumoralen Erkrankungen. Im Falle von Tumorerkrankungen ist es erwünscht, daß die Entzündungsdämpfende Aktivität der regulatorischen T-Zellen verhindert wird, damit der Tumor effektiv durch den körpereigenen Mechanismus bekämpft werden kann. Auch hier kann u.U. die Verabreichung der Inhibitoren zusammen mit einer Gabe von geeignet modifizierten ex-vivo expandierten und/oder präinaktivierten regulatorischen T-Zellen erfolgen, um eine große Zahl von inaktivierten regulatorischen T-Zellen im Organismus zu erhalten und die aktivierten regulatorischen T-Zellen „auszuverdünnen".

Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Entzündungsreaktionen zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren das oben genannte Screening Verfahren umfaßt. Die als Modulatoren identifizierten Substanzen oder die Derivate (zum Beispiel physiologisch verträgliche Salze davon) der modulatorischen Substanz der Aktivität einer Säugetier-regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺' α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle werden dann mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger gemischt. Verfahren zur Herstellung solcher Arzneimittel sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen unter anderem orale, subkutane und/oder intravenöse Darreichungsformen.

Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Entzündungsreaktionen zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren das a) Isolieren von regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen, b) die in vitro-Expansion der isolierten T-Zellen, und c) gegebenenfalls Modulieren der ex vivo isolierten T-Zellen, und d) das Mischen der isolierten T-Zellen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Verfahren zur Herstellung solcher Arzneimittel und pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik ebenfalls gut bekannt und umfassen unter anderem orale, subkutane und/oder intravenöse Darreichungsformen.

Weiterhin von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen in einem Säugetiers, das die Verabreichung von Säugetierregulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen umfaßt. Bevorzugterweise wird als die Entzündungsreaktion eine Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Autoimmunerkrankung, insbesondere rheumatische Entzündung, behandelt.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modulation von Immunreaktionen in einem Säuger, wobei das Verfahren die Verabreichung von inaktivierten und/oder die Blockierung der Aktivität von Säugetier regulatorischen α_E ^– CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen umfaßt. Bevorzugterweise wird als die Immunreaktion eine tumorale Erkrankung behandelt. Weiterhin umfaßt eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß als Blockierung eine Entfernung der Säugetier-regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen aus dem Patienten durchgeführt wird.

In der Zusammenschau ergibt sich durch die vorliegende Erfindung eine erhebliche Verbesserung der bisher möglichen Therapien im Bereich der Autoimmunerkrankungen. So sind als Vorteile der zellulären Therapie geringe Nebenwirkungen und eine autologe Transplantation ohne die für den Patienten mit erheblichen Nebenwirkungen verbundene Immunsuppression zu nennen. Weiterhin wird eine gezielte Modulation des Immunsystems hervorgerufen, bei der eine einfache Isolierung von regulatorischen T-Zellen aus dem peripheren Blut der Patienten und ex vivo Expansion und Modulation mit bekannten Zytokin-Cocktails möglich ist. Dann kann eine Retransfusion der ex vivo expandierten und eventuell modulierten regulatorischen T-Zellen in Form eines spezifischen „personalisierten" Arzneimittels erfolgen. Schließlich erlaubt die vorliegende Erfindung die gezielte Induktion des speziellen gewünschten Migrations-Phänotyps der CD4⁺ T-Zellen.

Da die beschriebene "zelluläre" Therapie sehr aufwendig ist, da für jeden einzelnen Patienten die regulatorischen T-Zellpopulationen gewonnen und ex vivo expandiert werden müssen, um Abstoßungsreaktionen gegenüber den transferierten Zellen oder sogenannte GVH-Reaktionen ("graft-versus-host") zu vermeiden, wird mit der vorliegenden Erfindung zudem ein Verfahren zum Screening nach modulierenden Substanzen offenbart, welche gezielt in vivo die α_E ⁺CD4⁺ T-Zellen mobilisieren und aktivieren können.

Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele unter bezug auf die beigefügten Zeichnungen weiter erläutert werden, ohne jedoch durch diese Beispiele begrenzt zu werden. In den Figuren zeigen:

1: Die Expression von α_Eβ₇ Integrin auf CD4⁺ T-Zellen ist mit CD25 und CD45RB^low korreliert.
Die FACS Analyse von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten zeigt (a) die Expression von α_E und CD25 innerhalb der CD4⁺ T-Zellen (3.6 f 0.7% α_E ⁺CD25⁺, 9.9 + 2.5% α_E ^–CD25⁺ und 1.2 ± 0.3% α_E ⁺CD25^–; Mittel ± SD von sechs unabhängigen Experimenten), (b) Expression von α_E und CD45RB auf CD4⁺ T-Zellen (ein repräsentatives von vier unabhängigen Experimenten). Der Memory (CD45RB^low) Zustand von α_E ⁺ Zellen ist nicht mit der CD25 Expression korreliert (Daten nicht. gezeigt).

2: α_E ⁺CD25⁺ Zellen produzieren keine proinflammatorischen Zytokine nach Stimulierung und α_E ⁺CD25^– Zellen zeigen ein besonderes Muster von Th2 Zytokinen.
Sortierte CD25⁺ und CD25^– Zellen wurden mit PMA/Ionomycin re-stimuliert und auf Expression von CD4, α_E, CD45RB und intrazellulären Zytokinen gefärbt. Die Frequenzen der Zytokin-produzierenden Zellen wurden durch „gating" auf die folgenden Subpopulationen analysiert: (a) Memory (CD45RB^low) α_E ^–CD25^–, (b) α_E ^–CD25⁺, (c) α_E ⁺CD25⁺ und (d) α_E ⁺CD25^– CD4⁺ T-Zellen (ein Repräsentatives von drei unabhängigen Experimenten). Ähnliche Ergebnisse wurden durch Stimulierung der Zellen mit anti-CD3 plus anti-CD28 (11) erhalten. Die Expression von α_E und CD45RB war während der Restimulierung stabil (Daten nicht gezeigt).

3: α_E ⁺CD25⁺ Zellen zeigen die stärkste regulatorische Kapazität in vitro.
Die regulatorischen Kapazitäten der angegebenen CD4⁺ Subpopulationen wurden bestimmt nach 80 h ko-Kultur mit CFSE-markierten naiven CD4⁺ T-Zellen. Als positive und negative Kontrollen wurden naive T Zellen allein mit oder ohne anti-CD3 kultiviert. Gezeigt sind (a) Fluoreszenz-Intensitäten von CFSE⁺-T-Zellen bei einem Regulator/Target Verhältnis von 1:9, und (b) der Vergleich der regulatorischen Kapazitäten von allen Subsets bei verschiedenen Regulator/Target Verhältnissen (α_E ⁺CD25⁺/-⧠-, α_E ^–CD25⁺/-Δ-, α_E ⁺CD25^–/-O- oder α_E ^–CD25^– /-⦁-). Gezeigt ist die mittlere Zahl von Zellteilungen der CFSE⁺ T-Zellen (ein repräsentatives von sechs unabhängigen Experimenten; Regulator/Target Verhältnis 1:1 aus einem Experiment).

4: Alle regulatorischen T-Zell-Subsets benötigen Zellkontakt, um ihre regulatorische Funktion auszuüben.
(a) CFSE-markierte naive CD4⁺ T-Zellen und die angezeigten CD4⁺ Subpopulationen wurden bei einem Regulator/Target Verhältnis von 1:3 für 80 h zusammen mit Kontroll-Antikörpern oder neutralisierenden Antikörpern gegen IL-10 oder TGFβ ko-kultiviert. Gezeigt ist % Inhibierung der naiven T-Zellproliferation (ein repräsentatives von zwei unabhängigen Experimenten), (b) CFSE-markierte naive CD4⁺ T-Zellen wurden zusammen mit den angezeigten CD4⁺ Subpopulationen bei einem Regulator/Target Verhältnis von 1:1 für 80 h ko-kultiviert oder die CFSE⁺ Zellen und die regulatorischen T-Zellen wurden durch ein Transwell^TM-Insert getrennt. Gezeigt ist die mittlere Zahl von Zellteilungen der CFSE⁺ T-Zellen (ein repräsentatives von zwei unabhängigen Experimenten).

5: α_E ⁺CD4⁺ T-Zellen, CD25⁺ und CD25^– supprimieren induzierte Kolitis in SCID Mäusen.
(a) SCID Mäuse erhielten 3 x 10⁵ CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen allein (-∎-, n = 17) oder in Kombination mit 1 × 10⁵ CD4⁺ T Zellen von jeder Subpopulation (Regulator/Target Verhältnis 1:3): CD45RB^low (-⦁-, n = 4), α_E ⁺CD25⁺ (-⧠-, n = 4), α_E ^–CD25⁺ (-Δ-, n = 4) oder α_E ⁺CD25^– (-O-, n = 4). Das Fortschreiten der Kolitis wird durch den angepaßten Körpergewichtsverlust verfolgt. (b) SCID Mäuse erhielten 3 × 10⁵ CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen allein (-∎-, n = 7) oder in Kombination mit 5 × 10⁴ CD4⁺ T-Zellen von jeder Subpopulation (Regulator/Target Verhältnis 1:6): α_E ⁺CD25⁺ (-⧠-, n = 8), α_E ^–CD25⁺ (-Δ-, n = 8) oder α_E ⁺CD25^– (-O-, n = 8). Kontrollmäuse, die nur PBS allein erhielten (-⦁-, n = 5) unterscheiden sich nicht von Mäusen, die CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen plus CD45RB^low in einem Verhältnis von 3:1 erhielten (Daten nicht gezeigt).

Fig. 6: Intestinale Pathologie in SCID Mäusen, die mit CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen und Subsets von regulatorischen CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert waren. SCID Mäuse erhielten 3 × 10⁵ CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen allein oder in Kombination mit 1 × 10⁵ CD4⁺ T Zellen von jeder Subpopulation (Regulator/Target Verhältnis 1:3). Nach der Untersuchungsperiode wurden Gewebe für die histologische Untersuchung entnommen. Repräsentative Photomikrographien zeigen schwere Kolitis (transmurale Infiltrationen mit Ulzeration) in Mäusen, die CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen allein erhielten (a) und vollständigen Schutz von Kolitis in Mäusen, denen zusätzlich CD45RB^low (b), α_E ⁺CD25⁺ (c), α_E ^–CD25⁺ (d) oder α_E ⁺CD25^– (e) CD4⁺ T-Zellen gegeben wurde.

7: FACS Re-Analyse von sortierten CD4⁺ T-Zell Subsets.
Die von dem in dem in Materialien und Methoden beschriebenen Sortierverfahren erhaltenen Zellen wurden mittels Durchflußzytometrie reanalysiert. Gezeigt sind Daten von einem repräsentativen aus sechs Experimenten.

8: Expression von CTLA-4 korreliert mit α_E und nur zu geringerem Ausmaß mit CD25. Zellen isoliert aus Lymphoidgeweben wurden auf die Oberflächenexpression von CD4, α_E und CD25 sowie auf die intrazelluläre Expression von CTLA-4 gefärbt. Gezeigt ist die CTLA-4-Expression (fette Linie) plus Isotypen-Kontrolle (gepunktete Linie) innerhalb der angegebenen CD4⁺ Subpopulationen (Zahlen geben die Frequenz CTLA⁺ Zellen an; ein repräsentatives von fünf unabhängigen Experimenten).

9: Stabilität von α_E Expression auf CD4⁺ T-Zell Subsets nach in vitro Stimulierung.
Die Expression von α_E (a) und CD25 (b) auf den angegebenen CD4⁺ T-Zell-Subsets wurde nach 80 h Stimulierung innerhalb des in vitro Proliferationstests (Zahlen geben die Frequenz von positiven Zellen an) bestimmt. Gezeigt ist eines von jeweils sechs (α_E) oder zwei (CD25) Experimenten.

10: Suppression durch die regulatorischen T-Zell Subsets wird nicht durch Abtötungs-Mechanismen vermittelt.
(a) Sortierte CD25⁺ und CD25^– Zellen isoliert aus vereinigten Lymphoidgeweben wurden mit APC plus anti-CD3 (1 ug/ml) für 18 h re-stimuliert und danach auf die Expression. von CD4, α_E und Fast gefärbt. Gezeigt, ist die Fast-Expression (fette Linie) plus Isotypen-Kontrolle (gepunktete Linie) innerhalb der angegebenen CD4⁺ Subpopulationen. Die Expression von α_E war während der Restimulierung stabil (Daten nicht gezeigt), (b) Die regulatorischen Kapazitäten der angegebenen CD4⁺ Subpopulationen, isoliert aus Lymphoidgeweben von Perforindefizienten oder C57B16 Mäusen wurden nach 80 h ko-Kultur mit CFSE-markierten naiven CD4⁺ T-Zellen von C57B16 Mäusen (Regulator/Target Verhältnis 1:3) bestimmt. Gezeigt ist die mittlere Zahl der Zellteilungen der Zellen (ein repräsentatives von zwei unabhängigen Experimenten).

11: Ähnliche Zytokin-Expressionsmuster nach Restimulierung mit anti-CD3 plus anti-CD28.
Sortierte CD25⁺ und CD25^– Zellen wurden mit Platten gebundenem anti-CD3 plus anti-CD28 (5 ug/ml jeweils) restimuliert und auf Expression von CD4, α_E CD45RB und intrazelluläre Zytokine gefärbt. Die Frequenzen von Zytokin-produzierenden Zellen wurden durch „gating" auf die folgenden Subpopulationen analysiert: Memory (CD45RB^low) α_E ^–CD25^–, α_E ^–CD25⁺, α_E ⁺CD25⁺ und α_E ⁺CD25^– CD4⁺ T-Zellen. Die Expression von α_E und CD45RB war während der Restimulierung stabil (Daten nicht gezeigt).

Tabelle 1: α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ T-Zellen zeigen das höchste regulatorische Potential in vivo.

SCID Mäuse erhielten 3 × 10⁵ CD45RB^highCD4⁺ T-Zellen allein oder in Kombination mit CD4⁺ T-Zell Subpopulationen wie angegeben, Kontrollmäuse erhielten nur PBS. Die klinischen und histologischen Werte sind als Mittelwerte gezeigt. Das Auftreten von Kolitis wurde durch die Gesamtanalyse der Körpergewichte plus klinische und histologische Parameter ermittelt. Die Daten für Mäuse, die entweder CD45RB^high oder CD45RB^high plus CD45RB^lowCD4⁺ T-Zellen erhielten sind aus den zwei unabhängigen Experimenten zusammengesetzt.

Materialien und Methoden

Mäuse

Weibliche Balb/c und C57B16 Mäuse wurden in unserem Tierstall gehalten und in einem Alter von 6–12 Wochen verwendet. Für die Analyse der Zytokin-Expression wurden ungefähr 10 Monate alte Balb/c Mäuse verwendet. Perforin-defiziente Mäuse (Kagi, D., et al. (1994) Nature 369, 31–7) wurden freundlicherweise von U. Steinhoff zur Verfügung gestellt. Weibliche C.B-17 SCID wurden von Charles River (Sulzfeld, FRG) erhalten und in einem Alter von 5–9 Wochen verwendet. Alle Tierexperimente wurden unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen und in Übereinstimmung mit Instituts-, staatlichen und Bundesrichtlinien durchgeführt.

Antikörper, Färbung und Sortierungsreagenzien

Die folgenden Antikörper wurden in unserem Labor gereinigt und markiert: anti-FcR II/III (2.4G2), anti-CD3 (145.C11), FITC- und Cy5-markierter anti-CD4 (GK1.5), biotinylierter anti-α_E (M290), anti-CTLA-4 (4F10), anti-IL-10 (JES5.2A5.7G4), PE-markierter anti-IL-13 (382.13.11) und Ratten IgG₁ Isotypenkontrolle (1A5). Die folgenden Antikörper und sekundären Reagenzien (FITC-, PE-, Cy5-, APC-markiert oder biotinyliert) wurden von BD Phar-Mingen (Heidelberg, FRG) gekauft: anti-CD4 (RM4-5), anti-CD62L (Mel-14), anti-CD25 (PC61), anti-CD25 (7D4), anti-CD38 (90), anti-CD45RB (16A), anti-CD44 (IM7), anti γδTCR (GL3), anti-FasL (MLF3), anti-IL-2 (JES6-5H4), anti-IL-4 (11B11), anti-IL-5 (TRFK5), anti-IL-10 (JESS-16E3), anti-TNFα (MP6-XT22), anti-IFNγ (XMG1.2), Streptavidin (SA), anti-Hamster IgG, und Isotypenkontrollen. Polyklonaler anti-TGFβ wurde von R&D (Wiesbaden, FRG) gekauft. Alle Microbeads wurden von Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, FRG) erhalten.

Zellreinigung und Kulturbedingungen

CD4⁺ T-Zell-Subsets wurden von vereinigten Milz, peripheren und mesenterialen Lymphknoten (pLN, mLN) von Balb/c Mäusen isoliert. Dazu wurden CD4⁺ T-Zellen unter der Verwendung des MACS MultiSort-Kits und des AutoMACS magnetischen Trennungssystems (Miltenyi Biotec) angereichert. Die verschiedenen regulatorischen Subpopulationen wurden wie folgt getrennt: nach Färben von CD4⁺ T-Zellen mit biotinyliertem anti-α_E, PEmarkiertem SA und anti-PE MicroBeads, wurden die α_E ⁺ Zellen unter der Verwendung von AutoMACS Technologie (Miltenyi Biotec) isoliert. Danach wurden diese α_E-angereicherten Zellen mit APC-markiertem anti-CD25 gefärbt, und die α_E ⁺CD25⁺ und α_E ⁺CD25^– Subsets wurden mit dem Vantage^TM FACS Sortierer (BD, Heidelberg, FRG) getrennt. α_E ^–CD4⁺ wurden mit biotinylierten anti-CD25 und anti-Biotin MicroBeads gefärbt und die α_E ^–CD25⁺ sowie die α_E ^–CD25^– Subsets wurden mit dem AutoMACS isoliert. Naive CD4⁺CD62L⁺ Zellen wurden positiv von der α_E ^–CD25^– Fraktion auf einem AutoMACS durch Verwendung von anti-CD62L Microbeads selektiert. Die Antigen-präsentierenden Zellen (APC) wurden durch Depletion von CD90⁺ Zellen von Balb/c Milzzellen unter der Verwendung von anti-CD90 Microbeads hergestellt und vor der Kultur bestrahlt (30 Gy). CD45RB^high und CD45RB^low CD4⁺ 7 Zellen wurden durch FACS sortiert. Alle sortierten Subsets waren nach Re-Analyse > 95–99% rein (Daten für die untersuchten Subsets. siehe 7). Die Zellkulturen wurden mit RPMI1640 (Gibco BRL, Eggenstein, FRG) plus 10% FCS (Linaris, Wertheim-Bettingen, FRG) durchgeführt.

Durchflußzytometrie

Die Duchfluß-zytometrische Analyse wurde wie vorher beschrieben (Assenmacher, M., et al. (1994) Eur J Immunol 24, 1097–1101) unter der Verwendung eines FACS Calibur^TM (BD Biosciences) und der CellQuest^TM Software durchgeführt. Zum CTLA-4 Nachweis wurden die Zellen auf die Oberflächenexpressionen von CD4, α_E und CD25 gefärbt, fixiert und permeabilisiert. Die intrazelläre Expression von CTLA-4 wurde mit Hamster anti-Maus CTLA-4 und Cy5-markiertem anti-Hamster IgG nachgewiesen. Um die Expression von Zytokinen der bestimmten Subpopulationen zu analysieren, wurden im MACS sortierte CD25⁺ und CD25^– Zellen für 4 Stunden mit PMA (10 ng/ml) plus Ionomycin (250 ng/ml) stimuliert oder alternativ für 5 Stunden mit Platten-gebundenem anti-CD3 plus anti CD28 (jeweils 5 μg/ml) mit Zugabe von Brefeldin A (10 μg/ml) nach 2 Stunden stimuliert. Vor Fixierung und intrazellulärer Färbung wurden die CD25⁺ und CD25^– Zellen auf Oberflächenexpression von CD4 und α_E gefärbt; während CD25^– Zellen zusätzlich mit anti-CD45RB gefärbt wurden. PMA/Ionomycin Stimulierung veränderte die Expression von α_E und CD45RB nicht (Daten nicht gezeigt). Die unspezifische Bindung wurde durch die Zugabe von Gesamt-Ratten IgG (Jackson ImmunoResearch, Dianova, Hamburg, FRG) blockiert.

In vitro Zellteilungstest

Unmarkierte CD4⁺ T-Zellsubpopulationen wurden mit CSFE-markierten naiven T-Zellen in verschiedenen Regulator/Target-Verhältnissen gemischt (5-Carboxyfluoreszeindiacetatsuccinimidylester; Molecular Probes, Leiden, NL; Färben wie vorher beschrieben, Lyons, A. B. & Parish, C. R. (1994) J Immunol Methods 171, 131–7) und mit APC in einem Verhältnis von 1:2 im Rundboden Mikrotiterplatten ohne Zugabe von anti CD3 (1 μg/ml) für 80h in 2-fachen Ansätzen kultiviert. Blockierende Antikörper wurden bei finalen Konzentrationen von 20 μg/ml verwendet. Die Transwell-Kammern (0,4μm Porengröße) wurden von Costar (Cambridge, MA, USA) bezogen. Nach der Inkubation wurden die Zellen gesammelt, auf CD4 gefärbt und durch FACS analysiert; um tote Zellen auszuschließen, wurde Propidiumjodid hinzugefügt. Die Proliferationsanalyse basiert auf CFSE⁺CD4⁺T-Zellen. Die mittlere Zahl von Zellteilungen (d) wurde mit der Formel: d = Σ(n_i/n_txg_i) berechnet, wobei g; = Generationszahl, ausgehend von 0 für nicht-geteilte Zellen, n_i = Zahl von Zellen innerhalb jeder Generation und n_t = Gesamtzellzahl ist.

T-Zell Rekonstitution

C.B-17 SCID-Mäuse wurden i.p. injiziert mit sortierten CD4⁺ T-Zellsubpopulationen in PBS. Die Mäuse erhielten CD45RB^highCD4⁺T-Zellen alleine oder in Kombination mit CD4⁺ T-Zellsubpopulationen (CD45RB^low, α_E ⁺CD25⁺, α_E ^–CD25⁺ oder α_E ⁺CD25^–) bei Verhältnissen und Zellzahlen, wie angegeben.

Klinische und histologische Untersuchung

Gewichtsveränderungen von rekonstituierten C.B-17 SCID-Mäusen wurden wöchentlich bewertet und mit klinischen Symptomen überwacht (0: kein Anzeichen von klinischem Fortschreiten; 1: gekrümmter Hinterleib, beeinträchtigte Bewegung oder struppiges Fell; 2: flüssiger Stuhl; 4: rektaler Prolaps). Zur Histologie wurden Darmgewebeproben ungefähr 10 Wochen nach T-Zellrekonstitution genommen und in 10 % Phosphat-gepuffertem Formalin fixiert. Paraffin-eingebettete Schnitte wurden mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt. Das Ausmaß an Entzündung des Darms wurde „auf eine blinde Weise" semiquantitativ von 0 bis 4 eingestuft (0: keine Anzeichen von Entzündung; 1: sehr geringe Spiegel von und nur wenig fokale infiltrierende mononukleare Zellen; 2: niedrige Spiegel und nur fokale Infiltration von mononuklearen Zellen; 3: hohe Spiegel von mononuklearer Zellinfiltration, hohe vaskuläre Dichte, Verdickung der Darmwand; 4: transmurale entzündliche Infiltration, Verlust der Kelch-Zellen, hohe vaskuläre Dichte, Vaskulitis, Verdickung der Darmwand). Die Schwere der Kolitis wurde durch beide Werte zusammen mit den Körpergewichtsveränderungen ermittelt. Ein Gesamtwert ≥ 3 wurde als mittlere oder schwere Kolitis betrachtet. Alle Tiere zeigten keine entzündlichen Anzeichen im Dünndarm (Daten nicht gezeigt).

Statistik

Die Daten wurden als Mittel ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Signifikanz wurde durch den Student's t-Test (CTLA-4), den Wilcoxon-Test (Zellteilungstest), wiederholte Messanalysen (Körpergewicht) und den Mann-Whitney-Test (Schwere von Kolitis) bestimmt. Die Unterschiede wurden als statistisch signifikant betrachtet mit p ≤ 0,05 und hoch signifikant mit p ≤ 0,01.

Ergebnisse:

Die α_Eβ₇ Expression auf CD4⁺ T-Zellen in Lymphoidgeweben ist mit CD25 und CD45RB^low Expressionen korreliert.

Die Anwesenheit einer kleinen Population von α_E-exprimierenden CD4⁺ T-Zellen war für eine lange Zeit hinweg bekannt, jedoch verblieb deren funktionelle Rolle unklar. Die Erfinder charakterisierten daher α_E ⁺CD4⁺ T-Zellen von vereinigten Lymphoidgeweben, die zwischen 2 und 6% von den gesamten CD4⁺ Zellen in Milz, pLN und mLN umfassen und fast ausschließlich αβTCR⁺ Zellen sind (> 98%; Daten nicht gezeigt). Die Durchflußzytometrie-Analyse zeigte, daß ungefähr 75% von α_E-exprimierenden CD4⁺ T-Zellen CD25⁺ sind ( 1a). Weiterhin wurden α_E+CD4⁺ T-Zellen hauptsächlich innerhalb des Memory (CD45RB^low) Kompartiments (1b) gefunden, unabhängig von deren CD25 Expression und exprimierten CD38 und hohe Spiegel von CD44 (Daten nicht gezeigt). Konsistent mit seiner inhibitorischen Funktion wurde in früheren Arbeiten CTLA-4 auf regulatorischen CD4⁺-Zellen gefunden und als an ihrer Funktion beteiligt vermutet (Read, S., et al. (2000) J Exp Med 192, 295-302.; Salomon, B., et al. (2000) Immunity 12, 431–40; Takahashi, T., et al. (2000) J Exp Med 192, 303–10). Die Erfinder untersuchten daher die Koexpressionen von CTLA-4 mit α_E und CD25 auf CD4⁺ T-Zellen (8). Ungefähr 18% von Zellen innerhalb der α_E ⁺CD25⁺ und der α_E ⁺CD25^– Fraktion von CD4⁺ T-Zellen exprimierten hohe Spiegel von intrazellulärem CTLA-4 (18,8 ± 5,7% und 17,6 ± 5,7%), wohingegen nur 6,8 ± 3,2% und 0,5 ± 0,3% dieses innerhalb der α_E ^–CD25⁺ bzw. α_E ^–CD25^– Subpopulation taten (p < 0,01, n = 5). Daher korreliert die Expressison von CTLA-4 mit der von α_Eβ₇ Integrin auf CD4⁺ T-Zellen.

Verschiedene Zytokin-Profile von α_E ⁺ Subsets.

Es wurde früher berichtet, daß regulatorische CD25⁺CD4⁺ T-Zellen niedrige Mengen von proinflammatorischen Zytokinen produzieren, verglichen mit anderen Antigen-erfahrenen CD4⁺ T-Zellen (Thornton, A. M. & Shevach, E. M. (1998) J Exp Med 188, 287–96; Takahashi, T., et al. (1998) Int Immunol 10, 1969–80; Asano, M., et al. (1996) J Exp Med 184, 387- 96; Papiernik, M. & Banz, A. (2001) Microbes Infect 3, 937–45). Innerhalb der α_E ^–CD25⁺ Fraktion waren die Frequenzen von TNFα, IFNγ oder IL-2 produzierenden Zellen nach Restimulierung niedriger, verglichen zu den Frequenzen unter CD45RB^low Memory-Zellen. Th2 Zytokine, wie z.B. IL-4, IL-5 oder IL-13 waren weniger verringert oder sogar leicht höher (2). Im Gegensatz dazu zeigte die α_E ⁺CD25⁺ Population fast kein IL-4, IL-5 und IL-13 und sehr geringe Zahlen von Zellen produzierten TNFα, IFNγ oder IL-2. Das einzige immer noch vorhandene Zytokin unter α_E ⁺CD25⁺ Zellen war IL-10.

Die α_E ⁺CD25^– Zellen zeigen ein einmaliges Zytokin-Expressionsmuster auf.

Während die Frequenzen von IL-2 und IFNγ-positiven Zellen fast dieselben wie in Memory CD4⁺ T-Zellen waren, waren die Frequenzen für TNFα und IL-10 niedriger, leicht erhöht für IL-10 und sehr viel höher für IL-5 und IL-13 (2). Die verschiedenen Zytokinproduzenten unter dem α_E ⁺CD25^– Subset zeigten ähnliche Spiegel von α_E Expression.

α_E Expression charakterisiert die am potentesten regulatorischen CD25⁺CD4⁺ T-Zellen.

Um die regulatorische Kapazität von CD4⁺ T-Zell-Subsets, charakterisiert durch α_E und CD25 Expression, zu analysieren, trennten die Erfinder vier Populationen (α_E ⁺CD25⁺, α_E ^– CD25⁺, α_E ⁺CD25^– und α_E ^–CD25^–, siehe 7) und untersuchten deren suppressive Aktivität im in vitro Proliferationstest. Naive CD4⁺T-Zellen wurden mit CFSE markiert und für 80h mit anti-CD3 und APC stimuliert. Während dieser Zeit hatte sich die Hauptzahl von naiven T-Zellen mehrfach geteilt, was durch den Verlust von CFSE Gehalt angezeigt wurde (positive Kontrolle; 3a). Die Zugabe von α_E ⁺CD25⁺ Zellen bei einem Regulator/Targetverhältnis von 1:9 zeigte eine fast vollständige Inhibierung der naiven T-Zell-Proliferation, wohingegen α_E ^–CD25⁺ Zellen die Proliferation nur zu einem geringeren Ausmaß inhibierten. Bemerkenswerterweise wiesen sogar α_E ⁺CD25^– Zellen eine signifikante regulatorische Kapazität auf, die zu einer merklichen Inhibierung der naiven T-Zell-Proliferation führt. α_E ^–CD25^– Zellen wurden als eine Kontrollpopulation ohne jegliche suppressive Aktivität verwendet.

Die relativen Fähigkeiten der Subsets wurden genauer durch Titration der Regulator/Targetverhältnisse untersucht (3b). Bei einem 1:19 Verhältnis zeigten nur α_E ⁺CD25⁺ einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf naive T-Zell-Proliferation. Sowohl α_E ^–CD25⁺ und α_E ⁺CD25^– Zellen zeigten inhibitorische Effekte bei höheren Verhältnissen (1:9 und 1:3) blieben jedoch hinter der α_E ⁺CD25⁺ Population zurück (p < 0,005). Bei einem Verhältnis von 1:1 wurde die Proliferation von naiven T-Zellen vollständig durch alle 3 Subsets und CD45RB^low Zellen inhibiert (3b und nicht gezeigte Daten). Die α_E exprimierenden Subsets verblieben positiv während der Kulturzeit, wohingegen im Subset von α_E ^–CD25⁺ eine Fraktion von Zellen innerhalb von 80 Stunden auftrat, die niedrige Spiegel vom α_E exprimieren. Im Gegensatz dazu war CD25 auf allen T-Zellen, regulatorischen Subsets sowie naiven Target-Zellen nach 80 Stunden Stimulierung vorhanden (9). Daher besitzen α_E+CD4⁺T-Zellen von Lymphoidgeweben regulatorische Kapazität und das α_E ⁺CD25^– Subset stellt eine neue regulatorische CD4⁺ T-Zell-Population außerhalb des CD25⁺ Kompartiments dar.

Um zu untersuchen, ob der inhibitorische Effekt des regulatorischen Subsets durch lösliche immunsuppressive Zytokine vermittelt wird wurde IL-10 und TGFβ in den in vitro Proliferationstests blockiert. Die Zugabe von neutralisierenden Antikörpern gegen IL-10 oder TGFß hatte keinen starken Effekt auf die Inhibierung der naiven T-Zell-Proliferationen durch alle regulatorischen Subsets. Nur die α_E ⁺CD25^– Zellen zeigten eine leicht verringerte inhibitorische Kapazität, wenn TGFβ blockiert wurde (4a). Darüber hinaus wurde gefunden, daß die inhibitorische Funktion aller regulatorischen Subsets abhängig von Zellkontakt ist, da keine Suppression von naiver T-Zell-Proliferation beobachtet wurde, wenn die regulatorischen Zellen und die Zielzellen in Kultur durch Transwell-Kammern (4b) getrennt wurden.

α_E+CD4⁺ T-Zellen inhibieren die Entwicklung von induzierter SCID Kolitis.

Um die Funktion und das Potential der untersuchten CD4⁺ T-Zell-Subpopulationen in vivo zu analysieren, wurde ihre Fähigkeit, die Entwicklung von Kolitis nach Transfer von naiven (CD45RB^high) CD4⁺ T-Zellen in SCID Mäuse getestet. In einer ersten Serie von Experimenten entwickelten Mäuse, die allein mit CD45RB^high CD4⁺ T-Zellen rekonstituiert waren, in 88% der Fälle Kolitis (n = 17), wohingegen keine der mit naiven Zellen plus entweder α_E ⁺CD25⁺, α_E ^–CD25⁺, α_E ⁺CD25^– oder CD45RB^lowCD4⁺ T-Zellen (Verhältnis von 3:1) rekonstituierten Mäuse Kolitis entwickelten. Die Körpergewichte von allen Mäusen, die zusätzlich zu naiven Zellen protektive CD4⁺T-Zellen (α_E ⁺CD25⁺, α_E ^–CD25⁺, α_E ⁺CD25^– oder CD45RB^low) erhielten, stieg in einem ähnlichen Ausmaß an, wohingegen dasjenige von Mäusen, die mit naiven Zellen alleine rekonstituiert waren, abnahm (p = 0.005, 5a). Die histologische Untersuchung von Kolongewebeproben von Mäusen, die mit allein naiven Zellen rekonstituiert waren, zeigte transmurale und in einigen Fällen lediglich fokale mononukleare Infiltrate und den Verlust von Kelchzellen (6a). Im Unterschied dazu zeigten Kolone, die mit einem Gemisch von naiven Zellen plus entweder α_E ⁺CD25⁺, α_E ^–CD25⁺, α_E ⁺CD25^– wieder hergestellt waren keine nachweisbaren pathologischen Veränderungen (6b–e). Diese Ergebnisse zeigen, daß α_E ⁺ Subsets sowohl innerhalb als auch außerhalb des CD25⁺CD4⁺ Kompartiments effektive Regulatoren der intestinalen Entzündung in vivo sind.

Um zu ermitteln, ob die untersuchten regulatorischen Populationen sich in ihrer suppressiven Kapazität auch in vivo unterscheiden, wie in vitro gefunden wurde, wurden SCID Mäuse in einer zweiten experimentellen Serie unter der Verwendung von niedrigeren Regulator/Targetverhältnissen rekonstituiert. Die Analysen der Körpergewichte von Mäusen, die mit naiven plus protektiven CD4⁺ T-Zellen bei einem Verhältnis von 6:1 rekonstituiert wurden, zeigten, daß α_E ⁺CD25⁺ Zellen das höchste regulatorische Potential auch in vivo aufwiesen (5b). Nur eine Maus dieser Gruppe (n = 8) entwickelte Kolitis. Im Unterschied dazu schützten Rekonstitutionen mit α_E ⁺CD25^– oder α_E ^–CD25⁺ Zellen zusätzlich zu naiven CD4⁺ T-Zellen nur 50% der Mäuse (n = 8) vor Ausbruch der Kolitis (Tabelle 1). Der Vergleich der Körpergewichte von Mäusen, die entweder α_E ⁺CD25⁺ oder α_E ^–CD25⁺ Zellen in Kombination mit naiven CD4⁺ T-Zellen erhielten, zeigte einen nahezu signifikanten Unterschied (p = 0,056), der durch die gesamte statistische Analyse von Körpergewicht plus klinischen und histologischen Parametern bestätigt wurde (Tabelle 1). Diese Daten zeigen klar, ob das α_E+CD25⁺ auch in vivo die höchste regulatorische Kapazität unter den bisher beschriebenen Subsets hat. Interessanterweise zeigte auch das α_E ⁺CD25^– Subset einen bemerkenswerten protektiven Effekt in vivo, trotz dessen relativ geringer Effizienz in den in vitro Tests.

Claims

Verwendung einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25-CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Entzündungsreaktionen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulation von Entzündungsreaktionen die Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Autoimmunerkrankung, insbesondere rheumatische Entzündung, und/oder tumorale Erkrankung umfaßt.
Regulatorische α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Behandlung von Erkrankungen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kombination mit Entzündungsmodulierenden Faktoren.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Entzündungsmodulierende Faktoren Antikörper, insbesondere gegen Integrin α_Έ, CD4 und/oder CD25 oder Zytokine, insbesondere IL-2, IL-4, IL-5, IL-10; IL-13, TGFß, TNF? und/oder IFN? verwendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend eine ex vivo Expansion und/oder Prä-Aktivierung oder Prä-Inaktivierung der regulatorischen T-Zellen.
Säugetier regulatorische α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle.
Verfahren zur Auffindung von modulatorischen Substanzen der Aktivität einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers, umfassend a) in Kontakt bringen einer potentiell modulatorischen Substanz mit einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers, und b) Messen der Aktivität der Säugetier-regulatorischen α_Έ ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle.
Verwendung eines Aktivators der Aktivität einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, insbesondere der Abstoßung nach Transplantation oder Autoimmunerkrankungen.
Verwendung eines Inhibitors der Aktivität einer regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle eines Säugetiers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, insbesondere tuμoralen Erkrankungen.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Entzündungsreaktionen, umfassend das Verfahren nach Anspruch 8 und Mischen der modulatorischen Substanz der Aktivität einer Säugetier-regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zelle mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Entzündungsreaktionen, umfassend – Isolieren von regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^– CD4⁺ T-Zellen, – in vitro-Expansion der isolierten T-Zellen, – gegebenenfalls Aktivieren oder Inhibieren der isolierten T-Zellen, und – Mischen der isolierten T-Zellen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen in einem Säugetiers, umfassend die Verabreichung von Säugetier-regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Entzündungsreaktion eine Abstoßung nach Transplantation und/oder eine Autoimmunerkrankung, insbesondere rheumatische Entzündung, umfaßt.
Verfahren zur Modulation von Immunreaktionen in einem Säuger, umfassend die Verabreichung von inaktivierten und/oder die Blockierung der Aktivität von Säugetierregulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺, α_E ⁺CD25⁺CD4⁺und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunreaktion eine tumorale Erkrankung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Blockierung eine Entfernung der Säugetier-regulatorischen α_E ^–CD25⁺CD4⁺; α_E ⁺CD25⁺CD4⁺ und/oder α_E ⁺CD25^–CD4⁺ T-Zellen aus dem Patienten umfaßt.