DE10203627A1

DE10203627A1 - Identifizierung von merkmalspezifischen Genen pflanzlicher Organismen

Info

Publication number: DE10203627A1
Application number: DE10203627A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Zimmermann; Ralf Kaldenhoff; Rainer Hedrich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2003-07-31
Also published as: EP1470230A1; WO2003064661A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Identifizierung von merkmalspezifischen Genen beschrieben, die in einer Donor-Pflanze (D) das Auftreten mindestens eines vorbestimmten Merkmals bewirken, wobei aus genetischem Material der Donor-Pflanze (D) und einer Rezeptor-Pflanze (R), die das vorbestimmte Merkmal nicht aufweist und durch heterologe Fusion und Kultivierung mindestens eine Modell-Pflanze erzeugt wird, die das vorbestimmte Merkmal aufweist und aus dem genetischen Material der Modell-Pflanze die gesuchten merkmalsspezifischen Gene ermittelt werden, die Teil des genetischen Materials der Donor-Pflanze (D) sind.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von merkmalspezifischen Genen pflanzlicher Organismen, insbesondere Verfahren zur Identifizierung von einzelnen Genen oder von Gen- Gruppen (Gen-Cluster), die das Auftreten eines bestimmten Merkmals des pflanzlichen Organismus bewirken, und Anwendungen derartiger Verfahren, insbesondere zur genetischen Modifizierung von Pflanzenarten mit merkmalspezifischen Genen anderer Pflanzenarten. Die Erfindung betrifft auch Anwendungen biochemischer und gentechnischer Verfahren, wie z. B. Anwendungen heterologer Fusionsverfahren, Markierungsverfahren und Segregationsverfahren, bei der Durchführung der o. g. Identifizierungsverfahren. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Identifizierung merkmalspezifischer Gene pflanzlicher Organismen.
Im Lauf der Evolution hat sich eine Vielzahl von Pflanzen entwickelt, die sich jeweils durch Merkmale auszeichnen, die einen Fortbestand unter den physikalischen und chemischen Standortbedingungen gewährleisten. Das artspezifische Genmaterial einer Pflanze bewirkt einerseits die Ausprägung der Merkmale unci andererseits die Weitergabe der Merkmale an Folgegenerationen. Merkmale, deren Auftreten durch einzelne Gene oder Gengruppen bewirkt werden, umfassen bspw. die Resistenz einer Pflanze gegen physikalische Bedingungen (z. B. Hitzeresistenz, Dürreresistenz), die Anpassung an chemische Bedingungen (z. B. Fähigkeit zur Symbiose) oder die Resistenz gegen fremde, tierische oder pflanzliche Organismen (z. B. Resistenz gegen Pflanzenviren oder toxisch wirkende Pflanzen). Aus den folgenden Gründen besteht ein Interesse an der Identifizierung von Genen oder Gengruppen im genetischen Material einer Pflanze, die für die Ausprägung bestimmter Merkmale charakteristisch sind.
Seit Beginn der gezielten Landwirtschaft haben sich Nutzpflanzen (Kulturpflanzen) gebildet, die durch Züchtung oder Selektion insbesondere in Richtung auf Ertrag und Architektur verbessert wurden. Dabei sind jedoch Gene verloren gegangen, die für die Überlebensfähigkeit wichtig sind. Zahlreiche heute angebaute Kulturpflanzen sind außerhalb der Landwirtschaft nicht überlebensfähig und werden durch den Einsatz von Herbiziden und/oder künstlichem Stickstoff-Dünger in Wachstum und Ertrag gefördert. Viele dieser Pflanzen sind anfällig gegenüber Schädlingen und können keinen Luft-Stickstoff durch Symbiosen binden. Der Einsatz von künstlichem Dünger und Pflanzenschutzmitteln stellt jedoch ein erhebliches Umweltproblem dar. Die bisherigen Versuche, Kulturpflanzen mit bestimmten Resistenzmerkmalen auszustatten, hatten jedoch nur beschränkten Erfolg. Es ist bspw. bekannt, insektenresistente Pflanzen zu entwickeln, indem Pflanzen Gene zugefügt werden, die in bestimmten Bakterienarten die Produktion von Insektengiften bewirken. Dieses Konzept besitzt jedoch die Nachteile einer geringen Akzeptanz bei den Verbrauchern, da hier mit gentechnischen Methoden Lebensmittel- oder Futterpflanzen verändert werden. Die Übertragung von nicht-pflanzlichen Gene für Insektengifte ist auch problematisch, weil diese Gifte nicht spezifisch wirken und auch Nützlinge schädigen können. Der Einbau dieser und anderer einzelner Gene erfordert ferner langwierige und aufwendige gentechnische Prozeduren.
Die Erzeugung transgener Pflanzen mit bestimmten Merkmalen durch Übertragung von Genen aus anderen Pflanzen, die diese Merkmale aufweisen, besitzt bisher ebenfalls nur einen beschränkten Erfolg. Dies liegt insbesondere daran, dass bisher die Funktionen von Genen in Bezug auf die Ausprägung bestimmter Merkmale nur in wenigen Spezialfällen ermittelt wurden. Des Weiteren konnte bisher nicht das Zusammenwirken von Gengruppen, die ggf. auf verschiedene Chromosomen verteilt sind, bei der Ausprägung von Merkmalen erfasst werden.
Der Wunsch nach einer Identifizierung von merkmalspezifischen Genen erstreckt sich ferner auf Versuche, bestimmte Merkmale von Wildpflanzen in Kulturpflanzen auszuprägen und damit besser nutzen zu können. So setzt die Übertragung der Fähigkeit zur Wirkstoffproduktion von Wild- auf Kulturpflanzen oder von Meerespflanzen in Landpflanzen die Kenntnis der Gene voraus, die in der jeweiligen Pflanze die Wirkstoffproduktion auslösen. Systematische Verfahren zur Identifizierung mer kmalspezifischer Gene in Pflanzen sind jedoch bisher nicht verfügbar.
Es besteht allgemein ein Interesse, die Prinzipien der Merkmalsausprägung an Pflanzen durch Identifizierung von merkmalspezifischen Genen zu erkennen und bei der Entwicklung von Nutzpflanzen zu verwenden.
Ein wichtiges Merkmal, das einigen Produktionspflanzen der Landwirtschaft fehlt und enorme Vorteile für die Wasser- und Mineralstoffversorgung der Pflanze bringt, ist die Fähigkeit zur Symbiose mit Mykorrhiza-Bodenpilzen. Bei der Mykorrhizierung besiedelt ein Bodenpilz das Wurzelgewebe einer Pflanze. Der Bodenpilz liefert an die Pflanze Nährstoffe, Spurenelemente und Wasser. Im Gegenzug wird der Bodenpilz von der Pflanze mit Photosyntheseprodukten versorgt. Zur Entwicklung von Symbiosen werden von den Pflanzen Signalstoffe produziert. Der Stoffaustausch in der entwickelten Symbiose ist durch komplexe Transport- und Stoffwechselprozesse im Pilz und in der Pflanze charakterisiert. Schließlich wird durch die Mykorrhizierung auch die Resistenz der Pflanze gegen Fremdstoffe, z. B. Schwermetalle verbessert. Es besteht ein Interesse an der Ermittlung und Sequenzierung von symbioserelevanten Genen.
Aus der Biologie sind verschiedene Verfahren zur Fusion von biologischen Zellen bekannt. Je nach dem Wirkungsprinzip werden bspw. elektrische, chemische oder virale Fusionen unterschieden. Von U. Zimmermann werden in "Biochemie et Biophysica Acta", Bd. 694, 1982, S. 227-277 Anwendungen der elektrischen Fusion biologischer Zellen beschrieben. Es ist insbesondere die heterologe Fusion biologischer Zellen bekannt, bei der Zellen verschiedener Arten fusioniert werden. Die heterologe Fusion war bisher jedoch ohne weitere Anwendungen auf Grundlagenexperimente beschränkt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur Identifizierung von merkmalspezifischen Genen bereitzustellen, die in einer Pflanze das Auftreten mindestens eines vorbestimmten Merkmals bewirken. Die erfindungsgemäßen Verfahren sollen sich insbesondere durch einen breiten Anwendungsbereich bei einer Vielzahl verschiedener Merkmale auszeichnen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Anwendungen der Identifizierungsverfahren bereitzustellen. Eine Aufgabe der Erfindung ist es insbesondere, pflanzliche Organismen mit merkmalspezifischen Genen zu modifizieren, wobei dies mit einer erhöhten Wirksamkeit und verbesserten Ausprägung des jeweils gewünschten Merkmals erfolgen soll als bei herkömmlichen transgenen Pflanzen. Die Aufgabe der Erfindung ist es ferner, Vorrichtungen zur Umsetzung cler genannten Verfahren bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden mit Verfahren und Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß einem oder mehreren der Patentansprüche 1, 9, 10 bis 13 oder 15 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Ein wichtiger Gesichtspunkt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Identifizierung von Genen, die in einer untersuchten Pflanze (im Folgenden: Donor-Pflanze) das Auftreten mindestens eines vorbestimmten Merkmals bewirken, wobei genetisches Material (DNA) der Donor-Pflanze und einer Rezeptor-Pflanze, die das vorbestimmte Merkmal nicht aufweist, durch heterologe Fusion verbunden und aus dem dabei gebildeten genetischen Hybridmaterial mindestens eine Hybridpflanze erzeugt wird, die das vorbestimmte Merkmal der Donor-Pflanze zeigt. Aus dem genetischen Material dieser mindestens einen ausgesuchten Hybridpflanze werden die gesuchten Gene ermittelt, die Teil des genetischen Materials der Donor-Pflanze sind. Diese Technik besitzt den Vorteil, dass durch die heterologe Fusion und Kultivierung des Hybridmaterials ein Modellsystem geschaffen wird, bei dem merkmalspezifische Gene der Donor- Pflanze in die Gene der Rezeptor-Pflanze integriert sind, die nicht für das gesuchte Merkmal spezifisch sind, so dass durch einen einfachen genetischen Vergleich des genetischen Materials der mindestens einen Hybridpflanze mit dem genetischen Material der Rezeptor-Pflanze die merkmalspezifischen Gene der Donor- Pflanze gefunden werden können. Dieses Verfahren ist vorteilhafterweise universell mit Paaren von Donor- und Rezeptor- Pflanzen ausführbar, die sich in Bezug auf ein bestimmtes Pflanzenmerkmal unterscheiden.
Unter den erfindungsgemäß identifizierten Genen in pflanzlichen Organismen werden mindestens ein Gen oder mehrere Gene verstanden, die auf einem oder mehreren Chromosomen einer Pflanze verteilt sind und einen natürlichen, synthetischen, pflanzlichen oder nicht-pflanzlichen Ursprung besitzen. Merkmalspezifische Gene sind das einzelne Gen oder das Gen-Cluster, die für die Ausprägung eines bestimmten Merkmals des pflanzlichen Organismus wirksam sind. Die merkmalspezifischen Gene kodieren die für die Merkmalsausprägung erforderlichen Stoffe. Die erfindungsgemäß untersuchten Merkmale umfassen alle Arten phänotypisch und/oder molekular-stoffanalytisch feststellbarer Eigenschaften pflanzlicher Organismen, durch die sich der jeweilige Organismus von anderen Pflanzen unterscheidet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine selektive Kultivierung des durch die heterologe Fusion gebildeten Hybridmaterials. Bei der selektiven Kultivierung erfolgen Zellteilung und -wachstum unter selektiv wirkenden Bedingungen derart, dass nur bestimmte Teile des genetischen Donor-Materials erhalten bleiben. Die selektive Kultivierung besitzt den Vorteil, dass die gesuchten merkmalspezifischen Gene der Donor-Pflanze mit erhöhter Geschwindigkeit, Wirksamkeit und Zielgenauigkeit identifiziert werden können. Die selektive Kultivierung erfolgt bspw. in einem Milieu mit physikalischen oder chemischen Bedingungen, gegen die ausschließlich die Donor- Pflanze, nicht jedoch die Rezeptor-Pflanze resistent ist. Entsprechend kann Hybridmaterial, das im Wesentlichen aus dem genetischen Material der Rezeptor-Pflanze besteht, von der weiteren Kultivierung ausgeschlossen werden. Eine höhere Selektivität wird erfindungsgemäß erzielt, indem das genetische Material der Donor-Pflanze einer genetischen Modifizierung unterzogen wird, bei der vorbekannte Resistenz-Gene in mindestens ein Chromosom oder Chromosomenabschnitt der Donor-Pflanze eingeschleust werden. Bei Auffindung selektiv kultivierter, überlebender Hybrid-Pflanzen mit dem gesuchten Merkmal kann dadurch ermittelt werden, auf welchem Chromosom oder Chromosomenabschnitt der Donor-Pflanze die gesuchten, merkmalspezifischen Gene lokalisiert waren.
Alternativ ist eine Lokalisierung der merkmalspezifischen Gene auch durch eine Markierung von Chromosomen oder Chromosomenabschnitten mit spezifischen Markersubstanzen (z. B. fluoreszierenden Stoffen) möglich. Erfindungsgemäß kann die Selektion auch unter Verwendung von Promotor-Reporter-Genen erfolgen.
Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass merkmalspezifische Gen-Cluster ermittelt werden können, die ggf. auf mehrere Donor-Chromosomen verteilt, sind.
Eine wichtige Anwendung der Erfindung besteht in der Isolierung und Übertragung der gefundenen merkmalspezifischen Gene auf Nutzpflanzen, so dass diese das gewünschte Merkmal ausprägen. Da mit dem erfindungsgemäßen Verfahren merkmalspezifischen Gen- Cluster ermittelt werden können, besitzt die Erzeugung transgener Nutzpflanzen erfindungsgemäß eine erheblich höhere Wirksamkeit als herkömmliche Klonierungstechniken, bei denen man sich auf einzelne Gene konzentriert hat.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet ist und eine Einrichtung zur Bereitstellung genetischen Donor- und Rezeptormaterials, eine Fusionierungseinrichtung, eine Kultivierungseinrichtung und eine Einrichtung zur genetischen Analyse umfasst. Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung vollständig automatisierbar ist. Die einzelnen Komponenten können mit an sich verfügbaren Einrichtungen aus der Biotechnologie und insbesondere der fluidischen Mikrosystemtechnik gebildet werden.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
Fig. 1 eine Übersichtsdarstellung der erfindungsgemäß verwendeten Hybridbildung, und
Fig. 2 eine schematische Illustration verschiedener Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung merkmalspezifischer Gene.
Fig. 1 zeigt schematisch die ersten Schritte 100, 200 des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich die Bereitstellung von genetischen Donor- und Rezeptormaterialien und deren heterologe Fusion 300. Die Bereitstellung von genetischem Material umfasst die an sich bekannten Schritte der Gewinnung und ggf. Modifizierung von Zellmaterial aus der Donor-Pflanze D und der Rezeptor-Pflanze R. Einzelheiten der Bereitstellung werden unten unter Bezug auf Fig. 2 beschrieben.
Die schematisch illustrierte Donor-Pflanze D stellt den pflanzlichen Organismus dar, in dessen genetischem Material (Donor- Material) merkmalspezifische Gene identifiziert werden sollen. Das Donor-Material umfasst bspw. die im rechten Teilbild schematisch illustrierten fünf Chromosomen CD. Auf den Donor- Chromosomen sind beispielhaft einzelne Gene oder Genabschnitte geigt, die für die Ausprägung vorbestimmter Merkmale der Donor- Pflanze D wirksam sind. Die verschiedenen Muster der hervorgehobenen Gene oder Genabschnitte beziehen sich auf verschiedene Merkmale. Für ein bestimmtes Merkmal ist bspw. ein einzelnes Gen T₃ (auf dem Chromosom C_D,3), ein Genabschnitt T₁, T₄ (z. B. auf C_D,1 oder C_D,4), zwei Genabschnitte T₂, T₅ auf verschiedenen Chromosomen (z. B. auf C_D,2 und C_D,5) oder mindestens ein ganzes Chromosom verantwortlich. Zum Beispiel kodieren die Genabschnitte T₂ und T₅ gemeinsam ein Merkmal der Pflanze D. Je nach Anwendungsfall können erfindungsgemäß merkmalspezifische Gene in Bezug auf ein Merkmal oder parallel in Bezug auf mehrere Merkmale identifiziert werden. Im letzteren Fall setzt dies allerdings eine genügend große Unterscheidbarkeit der Merkmale bei der Kultivierung voraus.
Interessierende Merkmale der Donor-Pflanze D sind bspw. die Symbiosefähigkeit (Mykorrhizierbarkeit, Knöllchenbildung), die Fähigkeit zur Produktion bestimmter Stoffe, wie z. B. Aromastoffe, Öle, Wirkstoffe, Polymerverbindungen (z. B. Alginate) und Stoffe, die für Stoffwechsel oder Transportvorgänge wichtig sind, oder eine Resistenz gegen Umweltbedingungen, wie z. B. Dürreresistenz, Wasserresistenz, Hitzeresistenz, Kälteresistenz, mechanische Stabilität der Pflanzenarchitektur, Salzresistenz, Resistenz gegen Fremdorganismen oder dgl.. Unter cer Vielzahl der aus der Botanik bekannten Pflanzen, die jeweils die gewünschten Merkmale aufweisen, werden vorzugsweise solche Pflanzen als Donor-Pflanzen verwendet, die relativ wenige Chromosomen (z. B. weniger als sieben verschiedene Chromosomen) aufweisen. Dies besitzt den Vorteil einer höheren Zielgenauigkeit und Effektivität des Verfahrens. Beispielsweise wird zur Identifizierung der Symbiosefähigkeit die Luzerne (mit vier verschiedenen Chromosomen) oder zur Untersuchung der Produktion des Wirkstoffs Nikotin Tabak (mit sechs verschiedenen Chromosomen) als Donor-Pflanze verwendet.
Als Rezeptor-Pflanze R kann allgemein jeder pflanzliche Organismus verwendet werden, der die interessierende Eigenschaft der Donor-Pflanze nicht besitzt. Es werden vorzugsweise Pflanzen verwendet, deren Genom bereits bekannt ist. Dies besitzt Vorteile bei der Analyse des Genmaterials von kultivierten Hybriden (siehe unten) und der Identifizierung von Donor-Genen. Des Weiteren werden vorzugsweise solche Rezeptor-Pflanzen verwendet, deren gentechnische und biotechnologische Handhabung bereits entwickelt und bekannt sind.
Gemäß der schematischen Illustration in Fig. 1. zeigt das genetische Material der Rezeptor-Pflanze (Rezeptor-Material) keine Gene oder Gen-Cluster auf den Chromosomen C_R, die mit den merkmalspezifischen Genen der Donor-Pflanze D identisch sind. Als Rezeptor-Pflanze R wird bspw. Arabidopsis mit 10 Chromosomen verwendet.
Durch heterologe Fusion 300 von Zellen der Donor- und Rezeptor- Pflanzen D, R werden viele Hybride H₁, H₂, H₃. . . gebildet, deren genetisches Material schematisch im unteren Teil von Fig. 1 illustriert ist. Die Fusionsergebnisse unterscheiden sich zunächst in der Verteilung von Teilen der Donor- und Rezeptor- Chromosomen oder der kompletten Chromosomen in den fusionierten Hybrid-Chromosomen C_H. Unmittelbar nach der Fusion sind alle Chromosomen der Fusionspartner in den Zellen des Hybridmaterials enthalten. Allerdings ist im allgemeinen die Position merkmalspezifischer Donor-Gene in Chromosomen des Hybridmaterials verändert.
Nach der heterologen Fusion liegen je nach Verfahrensführung einige tausend Hybridzellen vor, die allerdings nicht sämtlich stabil lebensfähig und insbesondere teilungsfähig sind. Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht in der nachfolgenden Kultivierung der Hybridzellen, ggf. unter Ausübung eines Selektionsdruckes, die mit weiteren Einzelheiten unten unter Bezug auf Fig. 2 beschrieben wird. Während der Kultivierung werden bei jeder Zellteilung Teile des genetischen Materials verworfen. Die zuerst breite Verteilung von genetischem Material wird im Lauf der Kultivierung immer enger. Stabile Organismen bilden zwei Gruppen, die einerseits immer mehr der Donor-Pflanze und andererseits immer mehr der Rezeptor-Pflanze ähneln. Jede Gruppe umfasst zwei Untergruppen, die jeweils durch Organismen gebildet werden, die einem der Fusionspartner ähnlich sind und Merkmale des anderen Fusionspartners besitzen. Von diesen Untergruppen besteht beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Interesse an den kultivierten Hybriden, die zu der Untergruppe der rezeptor-ähnlichen Organismen gehören, die das gesuchte Donor- Merkmal besitzen. Diese Hybride werden im Folgenden auch als Modell-Pflanzen bezeichnet.
Im idealen Fall enthalten Modell-Pflanzen das genetische Rezeptor-Material und vom Donor-Material ausschließlich das einzelne Gen oder den Gen-Cluster, der für das gesuchte Merkmal charakteristisch ist. Im Ergebnis der Kultivierung können sich auch mehrere Modell-Pflanzen ergeben, deren genetischen Eigenschaften zur endgültigen Identifizierung der merkmalspezifischen Gene miteinander verglichen werden.
In Fig. 2 sind erfindungsgemäße Identifizierungsverfahren mit verschiedenen Ausführungsbeispielen schematisch illustriert. Die einzelnen Boxen bezeichnen Verfahrensschritte, die zwingend erforderlich (durchgezogene Linien) oder fakultativ (gestrichelte Linien) sind.
Die Bereitstellung 100, 200 von genetischen Donor- und Rezeptormaterialien umfasst zunächst in jedem Fall die Auswahl 110 eines geeigneten Donors D und Rezeptors R. Diese Auswahl erfolgt nach den oben unter Bezug auf Fig. 1 erläuterten Prinzipien. Aus den Donor- und Rezeptor-Pflanzen wird bei Schritt 130 nach an sich bekannten Methoden Zellmaterial gewonnen.
Je nach Anwendungsfall werden bestimmte Pflanzenteile zur Gewinnung von Zellmaterial verwendet, so z. B. Blatt- oder Wurzelmaterial. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden von der Donor-Pflanze Teile (Organe) verwendet, die das gesuchte Merkmal überhaupt oder besonders stark ausprägen. Bei diesen Teilen kann erwartet werden, dass die gesuchten Gene exprimiert werden. Zur Feststellung von Genen, die bspw. für die Knöllchenbildung wirksam sind, werden vorzugsweise Wurzelteile verwendet.
Das Zellmaterial der Donor- und Rezeptor-Pflanzen wird jeweils einer Protoplastierung 140 unterzogen. Mit der Protoplastierung werden jeweils Donor- und Rezeptor-Protoplasten gewonnen. Die Protoplastierung 140 erfolgt ebenfalls nach an sich bekannten Verfahren. Anschließend werden die Protoplasten isoliert. Dies erfolgt vorzugsweise nach bekannten Protokollen unter Verwendung von Wasch- und Enzymlösungen. Im Ergebnis der Protoplastierung liegen jeweils eine Vielzahl (z. B. mehrere 1000) von Donor- und Rezeptor-Protoplasten vor, die anschließend der heterologen Fusion 300 unterzogen werden.
Die Verwendung einer heterologen Fusion zur Hybridbildung besitzt den besonderen Vorteil, dass bei der Vermischung von genetischem Material die Artengrenze überschritten wird. Das gesuchte Merkmal kann auf einen Organismus übertragen werden, der im Wesentlichen der Rezeptor-Pflanze R ähnelt und damit mit hoher Selektivität erfasst werden. Erfindungsgemäß können alle an sich bekannten Verfahren zur heterologen Fusion, insbesondere elektrisch, chemisch oder viral ausgelöste Fusionen, verwendet werden. Ein weiteres Teilen und Regenerieren von Protoplasten, die nicht fusioniert wurden, kann durch eine Iodacetatbehandlung verhindert werden. Es kann ferner eine physikalische oder chemische Abtrennung (Filterung) nicht fusionierter Protoplasten vorgesehen sein. Im Ergebnis der heterologen Fusion 300 liegen bspw. einige 1000 Hybridzellen vor, die nachfolgend der Kultivierung 400 unterzogen werden.
Im Rahmen der Kultivierung 400 erfolgt zuerst ein Hybridwachstum 410. Bereits im Rahmen des Hybridwachstums 410 werden nicht bei allen Hybriden alle Chromosomen gleichmäßig weiter vererbt. Es erfolgt eine natürliche Chromosomen-Segregation. Das Hybridwachstum 410 erfolgt bspw. unter an sich üblichen Wachstumsbedingungen.
Dem Hybridwachstum 410 folgt ein Vitalitätstest 420, der gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ohne einen Selektionsdruck durchgeführt wird. Beim Vitalitätstest 420 wird geprüft, ob die gewachsenen Hybride noch lebensfähig sind und bspw. Stoffwechsel zeigen.
Je nach der Art des gesuchten Merkmals folgt ein stoffanalytischer Test 430 von Hybridzellen oder nach einer Regeneration 440 von Hybridpflanzen ein Phänotyp-Test 450. Der stoffanalytische Test 430 umfasst bspw. eine Metabolismusanalyse und/oder eine Proteomanalyse der gewachsenen Hybride. Bei der Metabolismusanalyse wird festgestellt, ob die betrachtete Hybrid-Zelle Sekundärstoffe produziert, die dem gesuchten Merkmal entsprechen. Bei einer Proteomanalyse wird entsprechend erfasst, ob von der betrachteten Hybrid-Zelle Proteine erzeugt werden, die für das gesuchte Merkmal charakteristisch sind. Hybrid-Zellen, die den molekulargenetischen Test 430 nicht bestehen, werden entfernt. Für die Hybrid-Zellen, die den molekulargenetischen Test 430 bestehen, folgt eine Regeneration 460 zur vollständigen Hybrid-Pflanze, gefolgt vom Phänotyp-Test 450. Bei diesem Verfahrensgang wird beim Phänotyp-Test 450 geprüft, ob die regenerierten Hybrid-Pflanzen den Rezeptor-Pflanzen ähneln und damit die gesuchten Modell-Pflanzen darstellen. Die Regeneration erfolgt nach an sich bekannten Protokollen zur Gewebe- und Pflanzenentwicklung aus einer Zellkultur. Des weiteren kann geprüft werden, ob das beim Test 430 festgestellte Merkmal auch im Phänotyp ausgeprägt ist.
Alternativ folgt nach dem Vitalitätstest 420 zuerst eine Regeneration 440 vollständiger Hybrid-Pflanzen, von denen die überlebenden Pflanzen dem Phänotyp-Test 450 zur Feststellung des gesuchten Merkmals unterzogen werden. In diesem Fall werden beim Phänotyp-Test 450 erstmalig die gesuchten Merkmale geprüft. Es wird bspw. die Resistenz gegen Umgebungsbedingungen oder die Produktion von Wirkstoffen getestet. Die positiv das Merkmal zeigenden Pflanzen werden ferner geprüft, ob sie den Rezeptor-Pflanzen ähneln und damit die gesuchten Modell- Pflanzen darstellen.
Beim Phänotyp-Test 450 erfolgt je nach dem betrachteten Merkmal eine Interaktionsprüfung jeder überlebenden Hybrid-Pflanze. Vorteilhafterweise kann der Test bspw. mit verfügbaren Methoden der Bildverarbeitung automatisiert ablaufen.
Im abschließenden Schritt 500 der Analyse und Chromosomen- Identifizierung wird das genetische Material der mindestens einen Modell-Pflanze analysiert, die die Kultivierung 400 auf dem Weg des stoffanalytischen Tests 430 mit nachfolgender Regeneration 460 oder der Regeneration 440, jeweils mit nachfolgendem Phänotyp-Test 450 erfolgreich positiv durchlaufen hat. Bei Schritt 500 werden die Gene der Modell-Pflanzen ermittelt, die im genetischen Material des Rezeptors nicht enthalten sind und als merkmalspezifische Gene identifiziert. Die Identifizierung basiert auf dem Vergleich der Genkarten der Rezeptor- und der Modell-Pflanzen. Falls mehrere Modell-Pflanzen gefunden werden, können deren Genkarten miteinander verglichen und aus der Korrelation die gesuchten merkmalspezifischen Gene identifiziert werden. In weiteren Folgeschritten 600 können eine bioinformatische Auswertung der identifizierten Gene, eine Verwertung der herangezogenen Modell-Pflanzen, eine Sequenzierung der identifizierten Gene mit einer Übertragung auf andere Pflanzen und/oder weitere Analysen der gefundenen Hybrid-Pflanzen erfolgen.
Obwohl die hier beschriebene Verfahrenweise bereits in vielen Fällen zu positiven Ergebnissen führt, wird die erfindungsgemäße Genidentifizierung gemäß abgewandelten Ausführungsformen unter Verwendung einer Markierungstechnik und/oder unter Ausübung eines Selektionsdruckes wie folgt ausgeführt.
Zur vereinfachten Lokalisierung der interessierenden Donor-Gene in den Modell-Pflanzen erfolgt bei der Bereitstellung des genetischen Donor-Materials eine genetische Modifizierung 120 der Donor-Pflanzen oder eine Markierung 160 der Chromosomen oder Chromosomenabschnitte in den Protoplasten. Es erfolgt der Einbau von an sich üblichen Fluoreszenzmarkern. Mit der sogenannten FISH-Technik können nach Ermittlung der Modell-Pflanze bei der Analyse 500 die Positionen der identifizierten Gene auf den ursprünglichen Donor-Chromosomen ermittelt werden.
Wird bspw. gemäß dem oben genannten Beispiel Tabak als Donor- Pflanze verwendet, erfolgt eine spezifische Fluoreszenzmarkierung von allen sechs Chromosomen der Tabak-Pflanze. Im Rahmen der Analyse und Chromosomen-Identifizierung 500 kann die Position der identifizierten Gene durch eine Fluoreszenzmessung einfach ermittelt werden.
Zur Kultivierung 400 unter Ausübung eines Seiektionsdruckes wird das genetische Donor-Material im Rahmen der genetischen Modifizierung 120 spezifisch verändert. In das genetische Donor-Material wird bspw. mindestens ein bekanntes Gen eingebracht, das eine Antibiotika- oder Herbizid-Resistenz des modifizierten Donors bewirkt. Es wird beispielsweise eine Basta- oder Kanamycin-Resistenz eingeführt. Bei einer Donor-Pflanze mit z. B. sechs Chromosomen erfolgt vorzugsweise eine spezifische Modifizierung jedes Chromosoms derart, dass die auf verschiedenen Chromosomen zugefügten Resistenz-Gene verschiedene Resistenzen bewirken. Damit wird ein zusätzlicher Filter geschaffen, der im Rahmen des Vitalitätstests 470 mit Selektionsdruck allein aus der Erfassung der überlebenden Hybridzellen eine Aussage ermöglicht, dass die Hybrid-Zellen genetisches Donor-Material enthalten und welche Chromosomen der Donor-Pflanze in den Hybrid-Zellen enthalten sind. Die Hybrid-Zellen, die das Donor-Chromosom mit der passenden Resistenz enthalten, überleben den Vitalitätstest 470.
Der Vitalitätstest 470 umfasst eine Kultivierung unter Ausübung eines Selektionsdruckes, indem bspw. in Anwesenheit mindestens eines Antibiotikums oder eines Herbizids eine Kultivierung erfolgt. Bei Verwendung mehrerer Chromosomen-spezifischer Resistenzgene können im Ergebnis die Hybrid-Zellen in eine Anzahl von Resistenzgruppen unterteilt werden, die der Anzahl von Chromosomen oder Chromosom-Abschnitten entspricht, die im genetischen Donor-Material enthalten waren. Die Zellen in jeder Resistenzgruppen enthalten genetisches Donor-Material von einem gemeinsamen Donor-Chromosom. Für jede dieser Gruppen folgen dann die genannten Tests 430 und 450, jeweils verbunden mit den Regenerationen 460 und 440. Bei der folgenden Analyse und Chromosomen-Identifizierung 500 kann ohne weitete Messung allein aus Zuordnung von überlebenden Modell-Pflanzen zu einer der Resistenzgruppen die Lokalisierung der identifizierten Gene auf ein oder mehrere Donor-Chromosomen oder -Chromosomenabschnitte angegeben werden.
Gemäß einer weiteren Abwandlung wird das erfindungsgemäße Verfahren mit transgenen Rezeptor-Pflanzen durchgeführt. Im Rahmen der genetischen Modifizierung 170 der Rezeptor-Pflanze R werden in deren genetisches Material Promotor-Gene in Kombination mit Resistenz-Genen eingefügt. Die Promotor-Gene sind so gewählt, dass sie auf die Ausprägung eines bestimmten Pflanzenmerkxnals die zugehörigen Resistenz-Gene aktivieren. Es sind beispielsweise Gene bekannt, die nach Mykorrhizierung eine Pflanze aktiviert werden. Damit wird eine Selektion auf der Basis von Promotor-Reporter-Genen ermöglicht, die den Vorteil einer schnellen Identifizierung der merkmalspezifischen Gene besitzt. In der Hybridzelle wird bei den Tests 470 oder 450 mit dem Promotor-Gen ein spezifisches Resistenz-Gen unter der Voraussetzung aktiviert, dass das gesuchte Merkmal von der Zelle gebildet wird. Die Tests werden entsprechend unter Bedingungen durchgeführt, die nur die Zellen oder Pflanzen mit dem aktivierten Resistenz-Gen überleben.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung kann eine Chromosomen-Segregation 150 des genetischen Donor-Materials vorgesehen sein. Das Donor-Material kann einer Unterteilung der Chromosomen in Chromosomenabschnitte unterzogen werden, um die Selektivität der Genidentifizierung zu erhöhen. Die Chromosomen-Segregation 150 erfolgt mit an sich bekannten Techniken, z. B. unter Verwendung einer UV- oder Röntgen-Bestrahlung oder einer chemischen Fragmentierung.
Im Rahmen der Folgeschritten 600 kann eine Sequenzierung der identifizierten Gene mit einer Übertragung auf andere Pflanzen vorgesehen sein. Anwendungen bestehen generell bei der Übertragung von Merkmalen von Wild- oder Kulturpflanzen auf Kulturpflanzen, von Meerespflanzen auf Landpflanzen und/oder zwischen Pflanzen in verschiedenen geographischen Regionen oder aus verschiedenen Standortbedingungen. Beispiele bestehen in der Übertragung der Wirkstoffproduktion von wilden Heilpflanzen auf Nutzpflanzen oder der Alginatproduktion von Algen auf Landpflanzen oder in der Übertragung eines schnellen Pflanzenwachstums von wirtschaftlich minderwertigen Hölzern auf Edelhölzer. Alternativ können die ermittelten Modell-Pflanzen selbst als Nutzpflanzen weiter verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von merkmalspezifischen Genen, die in einer Donor-Pflanze (D) das Auftreten mindestens eines vorbestimmten Merkmals bewirken, gekennzeichnet durch die Schritte:

- Bereitstellung von genetischem Donor-Material (200), das aus dem genetischen Material der Donor-Pflanze (D) besteht,

- Bereitstellung von genetischem Rezeptor-Material (200), das aus dem genetischen Material einer Rezeptor-Pflanze (R) besteht, die das vorbestimmte Merkmal nicht aufweist,

- heterologe Fusion (300) des Donor-Materials und des Rezeptor-Materials zu genetischem Hybridmaterial (H), das als genetisches Material Donor- und Rezeptor-Material enthält,

- Kultivierung (400) des Hybrid-Materials (H) und Ermittlung mindestens einer Modell-Pflanze, die das vorbestimmte Merkmal aufweist, und

- genetische Analyse (500) der Modell-Pflanze und Ermittlung der Gene im Hybrid-Material (H) der Modell-Pflanze, die Teile des Donor-Materials (D) sind, als merkmalspezifische Gene.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem bei der Kultivierung (400) eine Selektion vorgesehen ist, unter deren Wirkung Hybridmaterial (H), das die gesuchten merkmalspezifischen Gene enthält, besseren Überlebensbedingungen ausgeseazt ist, als das übrige Hybridmaterial (H).

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Selektion eine Kultivierung in einem physikalischen oder chemischen Milieu umfasst, gegen das ausschließlich die Donor-Pflanze resistent ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem das Donor-Material einer genetischen Modifizierung (120) unterzogen wird, die den Einbau von vorbekannten Resistenz-Genen auf mindestens einem Chromosom oder Chromosomenabschnitt der Donor-Pflanze umfasst.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Selektion unter Verwendung von Promotor-Reporter-Genen erfolgt.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Donor-Material einer Chromosom-Segregation zur Erzeugung von Chromosomabschnitten unterzogen wird.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Donor-Material einer Chromosom-Markierung zur Bindung spezifischer Markersubstanzen an Chromosomen oder Chromosomenabschnitte unterzogen wird.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Ermittlung der merkmalspezifischen Gene eine Lokalisierung der merkmalspezifischen Gene auf vorbestimmten Chromosomen oder Chromosomenabschnitten des Donor-Materials umfasst.

9. Verfahren zur genetischen Manipulation eines pflanzlichen Organismus, bei dem mindestens ein merkmalspezifisches Gen oder Gen-Cluster, das mit einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche identifiziert worden ist, aus der Donor-Pflanze in den pflanzlichen Organismus übertragen wird.

10. Verfahren zur Identifizierung von merkmalspezifischen Genen, die in einer Donor-Pflanze (D) das Auftreten mindestens eines vorbestimmten Merkmals bewirken, dadurch gekennzeichnet, dass
aus genetischem Material der Donor-Pflanze (D) und einer Rezeptor-Pflanze (R), die das vorbestimmte Merkmal nicht aufweist, durch heterologe Fusion und Kultivierung mindestens eine Modell-Pflanze erzeugt wird, die das vorbestimmte Merkmal aufweist, und
aus dem genetischen Material der Modell-Pflanze die gesuchten merkmalspezifischen Gene ermittelt werden, die Teil des genetischen Materials der Donor-Pflanze (D) sind.

11. Hybrid-Pflanze, die mit einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellt worden ist.

12. Transgene Pflanze, die mindestens ein merkmalspezifisches Gen enthält, das nach einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche identifiziert worden ist.

13. Vorrichtung zur Identifizierung von Genen, die in einer Donor-Pflanze (D) das Auftreten mindestens eines vorbestimmten Merkmals bewirken, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, die eine Einrichtung zur Bereitstellung genetischen Donor- und Rezeptormaterials, eine Fusionierungseinrichtung, eine Kultivierungseinrichtung und eine Einrichtung zur genetischen Analyse umfasst.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, bei der die Kultivierungseinrichtung mit einer Selektionseinheit ausgestattet ist.

15. Verwendung eines Verfahren oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
zur Identifizierung merkmalspezifischer Gene,
zur Erzeugung von transgenen oder chimären Pflanzen mit vorbestimmten Merkmalen, insbesondere für die Land- und Forstwirtschaft, Umwelttechnik, Pharmazie und Wirkstoffproduktion.