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Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft ein einfaches Mittel zur Extraktion hochmolekularer DNA.
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Stand der Technik
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Die Technologie Next Generation Sequencing (NGS) gewinnt immer stärker an Bedeutung in Naturwissenschaften, Medizin und anderen anliegenden Gebieten. Das Ziel der umfassenden Genom-Sequenzierung liegt dabei nicht nur in der Identifikation von bestimmten Zielsequenzen (Erregernachweis, Mutationsnachweis etc.), sondern auch in einer weitgehenden Aufklärung der Gesamtsequenz eines Organismus. Logischerweise steht bei solchen Fragestellungen unter Verwendung dieser neuen Sequenzierungstechnologien (z.B. Nanoporensequenzierung; Oxford Nanopore Technologies) die Länge der sequenzierten Genomabschnitte im Vordergrund: je größer die Sequenzierungs-Leseweiten sind, desto einfacher und ressourcensparender ist deren bioinformatische Analyse der erzeugten Sequenzen und deren Zuordnung zum Gesamtgenom.
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Auf dem Markt befinden sich z.Z. eine Reihe von Sequenzierplattformen mit einer unterschiedlichen Fähigkeit, längere DNA -Fragmente zu erfassen. So können z.B. mittels der Nanopore-Sequenzierplattform der Fa. Oxford Nanopore Technologies ohne eine Pre-Amplifizierung unter der Voraussetzung qualitativ hochwertiger hochmolekularer DNA, Sequenzierungen von Fragmenten in Megabasen-Länge erfolgen (Ultra-Long DNA Sequencing Kit SOK-ULK001).
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In diesem Kontext hat die Extraktion hochmolekularer DNA (HMW DNA) aus diversen biologischen Probenmaterialien (z.B. Blut, Eukaryotische Zellen, Pflanzen, Gewebe) in den letzten Jahren deutlich an Interesse gewonnen, da die HMW DNA die essenzielle Grundlage für Long-Read Sequenzierungen ist. Die langen reads ermöglichen eine Überbrückung repetitiver Sequenzen, die uniforme Abdeckung von GC-reichen Regionen und die vollständige Sequenzierung bestimmter Zielregionen. Im vorliegenden Artikel „Method of the year: long-read sequencing", publiziert im Nature am 12.01.2023, werden die Vorteile klar definiert.
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Dem Fachmann ist bekannt, dass eine Vielzahl von Technologien respektive darauf basierender Produkte zur Extraktion von DNA existieren. Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA guter Qualität dagegen gibt es kaum. Dies betrifft sowohl manuelle Extraktionen als auch automatisierte Verfahren.
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Mittels einer von der Firma Circulomics entwickelten Technologie ist es möglich, hochmolekulare DNA zu isolieren. Dieses Verfahren kann kommerziell von der Firma Pacbio erworben werden (Nanobind CBB kit (SKU 102-301-900).
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Kernstück dieser Technologie ist eine sogenannte „Nanodisc“. Bei der Nanaodisc handelt es sich um eine magnetische Nanomembran, welche der Bindung der zu isolierenden DNA dient. Die für die Bindung der DNA zugrunde liegende Chemie besteht in der Verwendung von Puffern, welche chaotrope Salze enthalten und entspricht damit dem Stand der Technik. Dies betrifft auch die weiteren Extraktionsreagenzien wie Waschpuffer und Elutionsmittel. Entscheidend für die Extraktion hochmolekularer DNA ist die Nanodisc.
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Die Produktion dieser Nanodisc folgt einem sehr aufwendigen mehrstufigen Prozess und ist in der Offenlegungsschrift (
US 2020/0331004 A1 ) beschrieben.
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Dieser mehrstufige Prozess setzt sich aus nachfolgenden einzelnen Prozessen zusammen: Ausgangsstoff ist ein Kunststoffkern einer Größe von 10-100 µm. Mittels eines Elektronenstrahlverdampfers werden abwechselnd in mehrstufigen Prozessen dünne Siliziumdioxid- und Eisenschichten (20-100 nm) aufgedampft. Im Anschluss muss dieses bereits mehrfach bedampfte Bauteil noch bei 300°C wärmegeschrumpft werden. Hierbei bilden sich dann erst Nanomembranen aus, welche für die bevorstehende Nukleinsäureextraktion genutzt werden. Diverse Kombinationen einzelner Zwischenschichten und auch die Größe dieser Schichten sollen die Ausbeuten und Reinheiten je nach Anwendungsgebiet erhöhen und beeinflussen. Bei der Eisenschicht liegt das Hauptaugenmerk auf einer ausreichenden magnetischen Kraft zur Überwindung von viskosen Kräften, Oberflächenspannung und Auftrieb. Sie ist zusätzlich biologisch und chemisch anfällig, wenn die äußere Siliziumdioxidschicht mechanischem Stress ausgesetzt wird. Hier kann es dann zum Abbau und Korrosion führen und somit nachteilig für die Extraktion sein.
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Die Beschreibung offenbart damit, dass die Herstellung einer solchen Nanomembran sehr aufwendig und komplex und damit letztlich auch sehr teuer ist.
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Der eigentliche Extraktionsprozess ist relativ einfach. Nach Probenlyse wird dem Lysat ein Bindepuffer zugegeben und der Ansatz mit einer Nanodisc in Kontakt gebracht. Die in den Puffern enthaltenen chaotropen Salze vermitteln die Bindung der DNA an die Oberfläche der Nanodisc. Dies erfolgt über die Inkubation des Probengefäßes in einem rotierenden Schüttler. Nach Bindung der DNA an die Oberfläche der Nanodisc folgen obligatorische Waschschritte. Final wird die Disc getrocknet und nach Zugabe eines Elutionsmittels erfolgt das Ablösen der DNA von der Nanodisc. Die Prozessierung der Nanodisc erfolgt mittels eines Magneten (Verwendung eines Magnetständers). Das Verfahren ermöglicht es, hochmolekulare DNA zu isolieren, da die Architektur dieser Nanodisc es erlaubt, die DNA sehr schonend zu behandeln und Scherkräfte prinzipiell nicht zuzulassen.
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Patentliteratur
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In der Europäischen Patentschrift
EP 3 286 325 B1 (auch im
US-Patent Nr. 10,934,540 B2 ) wurde offenbart, dass Kunststoff-Materialien mit rauen Oberflächen die Anbindung von Nukleinsäuren ermöglichen. Darin wurde auch beschrieben, dass die rauen Oberflächen durch 3D-Druckverfahren hergestellt werden können. Ebenfalls erwähnt dort wurde ein magnetisches Kompositmaterial, welches unter der Bezeichnung „TECACOMP
®“ kommerziell erhältlich ist. Ein 3D-Druck mit diesem magnetischen Kompositmaterial wurde nicht beschrieben. Ebenso wurden in diesen Patentschriften keine Angaben über die Länge der angebundenen Nukleinsäuren gemacht. Es wurden auch keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Effektivität der Anbindung der Nukleinsäuren mit den verschiedenen hergestellten rauen Kunststoffen festgestellt.
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Ein Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe wurde in der Druckschrift
DE 10 2022 115 445 A1 beschrieben. Die Anbindung der hochmolekularen DNA an eine feste Phase erfolgt dabei mittels einer Kombination aus einem Polyether (z.B. Polyethylenglycol) und einem Salz sowie in Abwesenheit einwertiger Alkohole. Die feste Phase kann dabei ein raue Oberfläche aufweisen und aus einem magnetischen Kunststoff bestehen. Ein 3D-Druckverfahren wurde dort nicht erwähnt.
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Aufgabe der Erfindung
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Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, eine Alternative zu der oben beschriebenen Nanaodisc in einem Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA bereitzustellen.
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Lösung der Aufgabe
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Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß ist es gelungen, ein Mittel bereitzustellen, welches die Vorzüge der Nanodisc besitzt, um es in einem einfachen Extraktionsprozess für die Extraktion hochmolekularer DNA einsetzen zu können - und dies sowohl in einem manuellen Verfahren als auch in einem automatisierten Prozess. Die Herstellung eines solchen Mittels ist einfach und preiswert realisierbar und unterscheidet sich damit deutlich von der Herstellung der im Stand der Technik beschriebenen Nanodisc.
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Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass eine alternative feste Phase (Scheibe), die in Analogie zur Nanodisc für eine schonende Extraktion hochmolekularer DNA verwendet wird, durch Nutzung von 3-D-Drucktechnik einfach, schnell und sehr preiswert bereitgestellt werden kann. Damit ist es möglich, einfach, schnell, flexibel und extrem preiswert eine alternative feste Phase zur Adsorption von hochmolekularer DNA herzustellen. Diese Technik erlaubt es, flexibel Scheiben zu drucken - flexibel in Bezug auf Größe, Architektur und Material. Für den 3-D-Druck kann dabei ein Material, vorzugsweise ein Kompositmaterial, aus einem Kunststoff und einer magnetischen (vorzugsweise paramagnetischen) Komponente verwendet werden. Ein solches Material ist kommerziell verfügbar, beispielsweise unter der Bezeichnung „TECACOMP PP“.
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Damit erlangt die 3D-gedruckte Kunststoffscheibe eine paramagnetische Eigenschaft - wie dies auch bei der Nanodisc der Fall ist. Auch kann die Herstellung ressourcensparend erfolgen, da das für den Druck eingesetzte Material auch aus Abfallkunststoff erzeugt werden kann. Die so gedruckte Scheibe benötigt auch keine Beschichtung mit einem DNAbindenden mineralischen Material. Es zeigt sich, dass die Kunststoffscheibe ausreichend ist, um hochmolekulare DNA einer Probe zu adsorbieren. Der Extraktionsprozess ist einfach und schnell in der Durchführung.
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Dies erfolgt der Art, dass nach Lyse der biologischen Probe in einem Reaktionsgefäß mit einem Lysepuffer (z.B. Lysis Solution CBV; IST Innuscreen GmbH) die Probe mit der erfindungsgemäßen Scheibe und einem Bindungspuffer (z.B. Buffer H1 und Buffer H2; IST Innuscreen GmbH) versetzt wird. Das Gefäß wird dann mehrmals um 180° vorsichtig invertiert. Dies führt dazu, dass die in der Probe enthaltene DNA an die erfindungsgemäße Scheibe adsorbiert. Das Gefäß wird in ein Magnetrack gestellt und die Scheibe wird durch den Magneten an der Wand des Gefäßes fixiert. Der Überstand wird abgegossen und die Scheibe zweimal mit einem Waschpuffer (z.B. Washing Solution MS oder 80%igem Ethanol) durch Schwenken des Gefäßes gespült. Nach jedem Waschschritt wird der Waschpuffer abgegossen. Nach Entfernung des Waschpuffers wird ddH2O (doppelt destilliertes Wasser) zum Gefäß gegeben und die DNA unter vorsichtigem Schütteln von der Scheibe abgelöst und in Lösung gebracht. Diese Verfahren erlaubt es, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mittels sehr schonend hochmolekulare DNA zu isolieren. Das Verfahren ist sehr einfach in der Durchführung und kann darüber hinaus auch in einer automatisierten Form eingesetzt werden. Dazu bedient man sich klassischer Geräte, die für die Handhabung von magnetischen Partikeln konzipiert sind (z.B. Geräteplattform KingFisher). Dabei wird auf der Basis des dem Fachmann bekannten „Walk-Away-Prozesses“ das erfindungsgemäße Mittel von der Kavität, die das Lysat und den Bindungspuffer enthält (dort erfolgt die Bindung der DNA an die Scheibe), über die Kavitäten mit Waschpuffern (dort erfolgt das Waschen der an der Scheibe befindlichen DNA) bis hin zur Kavität mit dem ddH2O (hier folgt das Ablösen der DNA) bewegt.
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Die Herstellung der paramagnetischen Scheibe mittels 3-D-Drucktechnik stellt einen überraschenden bedeutsamen Fortschritt gegenüber der Technik dar, die für die Nanodisc der Fa. Circulomics benötigt wird. Besonders überraschend war, dass gerade das 3D-Druckverfahren mit den magnetischen Materialien zu den gewünschten Eigenschaften führt, obwohl dies durch einfaches Aufrauen von den magnetischen Materialien bisher nicht festgestellt wurde. Offenbar hat das Herstellungsverfahren (3D-Druck) einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg und gibt dem magnetischen Material die überraschenden Eigenschaften.
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Damit steht ein einfaches Mittel zur Verfügung, welches in exzellenter Weise für die Extraktion von hochmolekularer DNA eingesetzt werden kann. Besonders vorteilhaft ist auch, dass die erfindungsgemäße Scheibe in beliebigen Dimensionen hergestellt werden kann. Auch ist des erfindungsgemäße Mittel nicht nur an das Format einer Scheibe gebunden. Prinzipiell kann jede geometrische Figur hergestellt und eingesetzt werden.
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Die Erfindung ist nachfolgend anhand von zwei Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
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Ausführungsbeispiel 1:
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Herstellung einer Scheibe mit den Maßen 1 mm x 0.8 mm und deren Verwendung zur Extraktion hochmolekularer DNA aus 5 ml Blut
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Für die Herstellung der Scheibe wurde ein paramagnetisches Plastikmaterial (TECACOMP PP) verwendet. Die Herstellung erfolgte auf dem 3D-Drucker (Kobra Plus; Anycubic). Die Maße der Scheibe betrugen 1 mm x 0.8 mm.
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Für die Extraktion hochmolekularer DNA wurden 5 ml einer Vollblutprobe eingesetzt. Diese wurden in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Lyse der Erythrocyten erfolgten mittels der Verwendung der Lösungen Ery Lysis Solution A und Ery Lysis Solution B (IST Innuscreen GmbH). Nach Lyse der Erythrozyten wurde das resultierende Zellpellet der kernhaltigen Blutzellen, welches sich am Boden des 15 ml Reaktionsgefäßes befand, mit einem Lysepuffer und Proteinase K (Lysis Solution CBV; IST Innsucreen GmbH) versetzt und in einem Thermomixer für 20 min bei 55°C inkubiert. Nach Lyse der Zellen erfolgte die Zugabe der erfindungsgemäßen Scheibe zum 15 ml Reaktionsgefäß. Danach erfolgte die Zugabe der Bindungspuffer (Buffer H1 und Buffer H2; IST Innuscreen GmbH). Das Gefäß wurde dann 30-mal vorsichtig um 180° invertiert. Bei diesem Schritt adsorbiert die hochmolekulare DNA an die Oberfläche der Scheibe. Das Gefäß wurde anschließend zur Fixierung der Scheibe in ein Magnet-Rack gestellt und der Lyseansatz wurde ausgegossen. Danach erfolgte die Zugabe eines Waschpuffers (Washing Solution MS; IST Innuscreen GmbH). Dass Gefäß wurde am Magnet-Rack belassen und 3mal invertiert und der Waschpuffer abgegossen. Der Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Danach erfolgte die Zugabe von 800 µl einer weiteren Waschlösung (Washing Solution ER; IST Innuscreen GmbH). Das Gefäß wurde zweimal invertiert und die Lösung wurde abgegossen. Die an der Scheibe befindliche DNA wurde nach Zugabe von 1000 µl ddH2O gelöst, wobei dazu das Gefäß für ca. 30 min bei 300 rpm und einer Temperatur von 37°C inkubiert wurde. Die hochmolekulare DNA wurde mittels einer Wide-Bore-Pipettenspitze in ein neues Gefäß überführt und dabei mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert. Die DNA wurde danach auf dem Gerät Tapestation (Agilent) analysiert. Wie die Daten zeigen, ist die DNA hochmolekular bei einer sehr hohen Ausbeute. Das Verfahren ist einfach und sehr schnell in der Durchführung. Die Verwendung notwendiger Reaktionsplastik ist sehr gering. Sowohl die Lyse der Erythrozyten als auch die nachfolgende Lyse der kernhaltigen Blutzellen und die Bindung der freigesetzten DNA an die erfindungsgemäße Scheibe und die finale Lösung der DNA erfolgen im selben 15 ml Reaktionsgefäß. Dies bedeutet einen Vorteil gegenüber klassischen Methoden der Extraktion von hochmolekularer DNA aus Blutproben.
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1 zeigt die Analyse der genomischen DNA. Deutlich zu erkennen ist der Peak bei > 60.000 bp. Die Ausbeute betrug 135 µg.
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Ausführungsbeispiel 2:
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Herstellung einer Scheibe mit den Maßen 6 mm x 0.8 mm und deren Verwendung zur Extraktion hochmolekularer DNA aus 2.5 ml Blut
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Für die Herstellung der Scheiben wurde ein paramagnetisches Plastikmaterial (TECACOMP PP) verwendet. Die Herstellung erfolgte auf dem 3D-Drucker (Kobra Plus; Anycubic). Die Maße der Scheibe betrugen 7 mm x 0.8 mm.
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Für die Extraktion hochmolekularer DNA wurden 2.5 ml einer Vollblutprobe eingesetzt. Nach Lyse der Erythrocyten wurden die resultierenden kernhaltigen Zellen in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß überführt und mit einem Lysepuffer und Proteinase K (Lysis Solution CBV; IST Innsucreen GmbH) versetzt und in einem Thermomixer für 20 min bei 55°C inkubiert. Nach Lyse der Zellen erfolgte die Zugabe der erfindungsgemäßen Scheibe zum 15 ml Reaktionsgefäß. Danach erfolgte die Zugabe der Bindungspuffer (Buffer H1 und Buffer H2; IST Innuscreen GmbH). Das Gefäß wurde dann 30-mal vorsichtig um 180° invertiert. Bei diesem Schritt adsorbiert die hochmolekulare DNA an die Oberfläche der Scheibe. Das Gefäß wurde anschließend zur Fixierung der Scheibe in ein Magnet-Rack gestellt und der Lyseansatz wurde ausgegossen. Danach erfolgte die Zugabe eines Waschpuffers (Washing Solution MS; IST Innuscreen GmbH). Dass Gefäß wurde am Magnet-Rack belassen und 3mal invertiert und der Waschpuffer abgegossen. Der Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Danach erfolgte die Zugabe von 800 µl einer weiteren Waschlösung (Washing Solution ER; IST Innuscreen GmbH). Das Gefäß wurde zweimal invertiert und die Lösung wurde abgegossen. Die an der Scheibe befindliche DNA wurde nach Zugabe von 500 µl ddH2O gelöst, wobei dazu das Gefäß für ca. 30 min bei 300 rpm und einer Temperatur von 37°C inkubiert wurde. Die hochmolekulare DNA wurde mittels einer Wide-Bore-Pipettenspitze in ein neues Gefäß überführt und dabei mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert. Die DNA wurde danach auf dem Gerät Tapestation (Agilent) analysiert. Wie die Daten zeigen, ist die DNA hochmolekular bei einer sehr hohen Ausbeute.
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2 zeigt die Analyse der genomischen DNA. Deutlich zu erkennen ist der Peak bei > 60.000 bp. Die Ausbeute betrug 66 µg.
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Definition
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Hochmolekulare DNA:
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DNA mit größer gleich 50.000 bp, insbesondere größer gleich 60.000 bp.