DE102021134368B4

DE102021134368B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit

Info

Publication number: DE102021134368B4
Application number: DE102021134368.2A
Authority: DE
Inventors: Karsten König; Hans Georg Breunig; Marc Brecht; Anita Lorenz
Original assignee: Hochschule Reutlingen Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts; JenLab GmbH
Current assignee: Jenlab De GmbH
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-09-21
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: DE102021134368A1

Abstract

Vorrichtung zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit (1), umfassend
- einen mindestens abschnittsweise für ein Anregungslicht transparenten Absaugschlauch (2), durch den das Gewebe in der strömenden Flüssigkeit (1) geführt wird,
- einen Beleuchtungsstrahlengang (B) mit mindestens einer Anregungslichtquelle (3) zum Emittieren von Anregungslicht,
- einen Detektionsstrahlengang (D) mit mindestens einem ersten Fluoreszenzdetektor (4) zur Detektion einer ersten Intensität (I₁) eines vom Gewebe emittierten Fluoreszenzlichts und einem ersten Fluoreszenzfilter (41), das in einem zweiten Wellenlängenbereich transparent ist, der vom ersten Wellenlängenbereich verschieden ist und
- eine mit dem ersten Fluoreszenzdetektor (4) verbundene Auswerte- und Speichereinheit (5), dadurch gekennzeichnet, dass
- im Detektionsstrahlengang (D) ein zweiter Fluoreszenzdetektor (6) zur Detektion einer zweiten Intensität (I2) des vom Gewebe emittierten Fluoreszenzlichts und ein zweites Fluoreszenzfilter (61), das transparent ist in einem dritten Wellenlängenbereich, der von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich verschieden ist, vorhanden ist, wobei der zweite Fluoreszenzdetektor (6) mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbunden ist,
- die Auswerte- und Speichereinheit (5) dazu ausgelegt ist, ein erstes Verhältnis (V₁) der ersten Intensität (I₁) und der zweiten Intensität (I₂) zu bilden und
- eine mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbundene Anzeigeeinheit (7) vorhanden ist, um anzuzeigen, wenn das erste Verhältnis (V₁) einen ersten Schwellenwert (S₁) überschreitet oder unterschreitet.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit.
Bei der fluoreszenzgesteuerten Tumorresektion mittels Ultraschall soll bei abgesaugtem Gewebe zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe unterschieden werden. Üblicherweise wird dazu einem Patienten eine Substanz, wie zum Beispiel Aminolävulinsäure (ALA) appliziert, die nach mehreren Stunden die Synthese der rot fluoreszierenden Substanz Protoporphyrin IX (PPIX) hervorruft. PPIX kann besonders gut mit ultraviolettem Licht, beispielsweise Licht im Wellenlängenbereich von 320 nm bis 400 nm, oder violettem Licht um 405 nm zur Fluoreszenz angeregt werden. Ein Chirurg sieht das rote Fluoreszenzlicht mit dem bloßen Auge oder über einen Monitor und Kameras. Ziel des Chirurgen ist es, die rot fluoreszierenden Gewebeareale zu entfernen und nicht fluoreszierende oder nur sehr schwach fluoreszierende Areale im Körper des Patienten zu belassen.
So können beispielsweise Hirntumoren, insbesondere Gliome, durch Applikation von Substanzen und Fluoreszenzanregung mittels Anregungslicht detektiert bzw. sichtbar gemacht werden. Das Fluoreszenzlicht hilft dem Chirurgen bei der Entscheidung, welche Hirnareale operativ entfernt werden sollten und welche nicht.
Oftmals kommen auf Ultraschall basierende Therapiesysteme zum Einsatz, die ein Tumorareal bearbeiten. Dabei wird das zu bearbeitende Gewebe in Gewebestücke bzw. Gewebestücke zerlegt und mittels einer Absaugvorrichtung und einer Spülflüssigkeit aus dem Patienten entfernt. Die Spülflüssigkeit mit den Gewebestücken wird dann als Suspension über ein Schlauchsystem einem Auffangbehälter zugeführt und entsorgt. Bislang erfolgt keine weitere Untersuchung der abgesaugten Suspension.
Eine Vorrichtung zur Messung einer Konzentration von Partikeln in einer Flüssigkeit ist aus der WO 2005/026700 A1 bekannt. Die Vorrichtung beinhaltet eine Lichtquelle, die einen kollimierten Laserstrahl emittiert. Der Laserstrahl wird an den Partikeln, die sich in der Flüssigkeit in einem Gefäß befinden diffus gestreut bzw. reflektiert und eine Intensität eines reflektierten Anteils des Laserstrahls von einem Photodetektor detektiert. Aus einer reflektierten Lichtintensität wird im Anschluss eine Partikelkonzentration von einer Auswerteeinheit berechnet. Die Vorrichtung ist jedoch nur in der Lage die Konzentration von Partikeln zu bestimmen, wenn vorher bereits bekannt ist, welche Arten von Partikeln sich in der Flüssigkeit befinden. Um spezifische Partikel in einem Gewebe bzw. einer Ansammlung differenzierter Zellen zu detektieren, ist die Vorrichtung daher nicht geeignet.
Eine Vorrichtung zur optischen Messung der Eigenschaften von Partikeln ist aus der EP 3 521 807 B1 bekannt. Die Vorrichtung verfügt über zwei Lichtquellen bzw. Laser mit verschiedenen Wellenlängen, die auf einen Strom von einzelnen Partikeln, die mit einem Fluoreszenzmarker markiert sind, fokussiert werden. Es ist eine Detektionseinheit vorhanden, die dazu ausgelegt ist, von den Partikeln emittiertes Fluoreszenzlicht zu detektieren. Mit der Detektionseinheit verbunden ist eine Informationsverarbeitungseinheit, die auf Grundlage der Intensität eines emittierten Anregungslichts und der Intensität des detektierten Fluoreszenzlichts Eigenschaften der Partikel, wie zum Beispiel deren Größe, Form oder Struktur, berechnen kann. Ebenso beschreibt die DE 11 2015 005 826 B4 eine Mehrfarben-Fluoreszenzanalysevorrichtung zum Detektieren von Fluoreszenz, die von in einer Probe enthaltenen verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen durch Bestrahlung mit Anregungslicht emittiert wird.
Die EP 1 574 259 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Detektion von markierten Mikropartikeln in einem eine Leitung durchströmenden Medium. Dabei werden Mikropartikel eingesetzt, die einerseits magnetisch aktivierbare Markierungsanteile aufweisen und die andererseits zumindest eine weitere detektierbare Markierung besitzen. Die Mikropartikel werden mit Hilfe eines Magnetfeldes in dem strömenden Medium eingefangen und angesammelt sowie an der Sammelstelle als Ablagerung an der Innenwandung der Leitung auf Basis ihrer weiteren Markierung kontinuierlich detektiert. Weiter dient eine Leitung mit einer optisch durchlässigen Wandung zur Führung des Mediumstromes.
Die DE 691 08 027 T2 bezieht sich auf einen Apparat und auf ein Verfahren für die Analyse von Partikeln, die in einem flüssigen Medium oder in einer Flüssigkeit suspendiert sind. Die Partikel senden Strahlen aus, die für die Partikel charakteristisch sind, wenn sie einer Strahlung ausgesetzt sind. Es geht insbesondere um eine Analyse von biologischen Zellen mittels Flüssigzytometrie.
Die EP 0 774 112 B1 offenbart einen optischen Aufbau für ein durchflusszytometrisches Analysegerät für die Erfassung von Blutzellen, die in einem fließenden Medium suspendiert sind mit einer Durchflusszelle, durch die die Blutzellen einzeln nacheinander passieren. Es sind zudem eine Lichtquelle bzw. ein Laser und mehrere Detektoren vorhanden, die sowohl in einem Seitenwinkel-Sammelsystem, als auch in einem Vorwärtswinkel-Sammelsystem angeordnet sind, um die Intensität von an den Partikeln gebrochenem Licht und von den Partikeln emittiertem Fluoreszenzlicht zu detektieren. Aus den detektierten Intensitäten können Eigenschaften der Blutzellen, wie zum Beispiel deren Größe, abgeleitet werden.
Die beiden vorgenannten Vorrichtungen sind lediglich zur Analyse einzelner Zellen oder Partikel geeignet. Es werden nur wenige Eigenschaften der Zellen und Partikel, wie z.B. deren Größe, analysiert. Um abgesaugtes Gewebe in einer Spülflüssigkeit zu analysieren und darin spezifische Zellen oder Partikel zu detektieren, sind die Vorrichtungen ungeeignet.
Die EP 2 201 349 B1 offenbart ein durchflusszytometrisches optisches System mit einem Teilchenströmungspfad, einem Beleuchtungssystem mit mindestens einer Lichtquelle, einer Vielzahl von Detektoren und einem Auswertesystem. Die mindestens eine Lichtquelle sendet Licht zu mehreren verschiedenen Abfragepunkten des Teilchenströmungspfades und die dort befindlichen Detektoren detektieren jeweils Intensitäten von Licht, das von bzw. an einem oder mehreren Teilchen emittiert bzw. gestreut wurde. Aus den detektierten Signalen kann im Anschluss eine Laufzeit (Time of Flight) von einem oder mehreren Teilchen berechnet werden. Aus den detektierten Signalen können auch andere, nicht näher beschriebene, Parameter bzw. Eigenschaften der Teilchen bestimmt werden. Die offenbarte Vorrichtung eignet sich zwar dazu, einen Strom aus Gewebe und Spülflüssigkeit zu analysieren und darin spezifische Zellen oder Partikel zu detektieren, die beschriebenen Auswerteverfahren beschränken sich jedoch auf simple Berechnungsschritte zur Berechnung der Time of Flight der Partikel. Dadurch ist die Vorrichtung für anspruchsvolle Untersuchungen, die eine sehr hohe Genauigkeit erfordern, ungeeignet.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine neuartige Möglichkeit zu finden, bei der eine sehr hohe Präzision der Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit gewährleistet werden kann.
Diese Aufgabe wird für eine Vorrichtung zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit, umfassend einen mindestens abschnittsweise für ein Anregungslicht transparenten Absaugschlauch, durch den das Gewebe in der strömenden Flüssigkeit geführt ist, einen Beleuchtungsstrahlengang mit mindestens einer Anregungslichtquelle zum Emittieren von Anregungslicht einen Detektionsstrahlengang mit mindestens einem ersten Fluoreszenzdetektor zur Detektion einer ersten Intensität eines vom Gewebe emittierten Fluoreszenzlichts und einem ersten Fluoreszenzfilter, das in einem zweiten Wellenlängenbereich transparent ist, der vom ersten Wellenlängenbereich verschieden ist und eine mit dem ersten Fluoreszenzdetektor verbundene Auswerte- und Speichereinheit, dadurch gelöst, dass im Detektionsstrahlengang ein zweiter Fluoreszenzdetektor zur Detektion einer zweiten Intensität des vom Gewebe emittierten Fluoreszenzlichts und ein zweites Fluoreszenzfilter, das transparent ist in einem dritten Wellenlängenbereich, der von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich verschieden ist, vorhanden ist, wobei der zweite Fluoreszenzdetektor mit der Auswerte- und Speichereinheit verbunden ist, die Auswerte- und Speichereinheit dazu ausgelegt ist, ein erstes Verhältnis der ersten Intensität und der zweiten Intensität zu bilden und eine mit der Auswerte- und Speichereinheit verbundene Anzeigeeinheit vorhanden ist, um anzuzeigen, wenn das erste Verhältnis einen ersten Schwellenwert überschreitet oder unterschreitet.
Die Vorrichtung ist dazu ausgelegt, Tumorgewebe während des Absaugens entweder direkt innerhalb des Absaugschlauches oder nach Durchfließen einer geeigneten direkt angeschlossenen Durchflusszelle oder Durchflussküvette optisch detektieren und einem Chirurgen einen optischen, akustischen oder anderen Reiz als Signal übermitteln. Die Vorrichtung zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömende Flüssigkeit sollte sich vorteilhaft möglichst nah am Operationsgebiet befinden, um zeitnah Informationen zum abgesaugten Gewebematerial zu erhalten.
Vorteilhaft ist ein Anregungsfilter im Beleuchtungsstrahlengang der Anregungslichtquelle nachgeschaltet. Dadurch können die Anforderungen an die Anregungslichtquelle reduziert werden.
Zweckmäßig sind der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang in einem von 0° verschiedenen Winkel zueinander und zum Absaugschlauch angeordnet. Besonders vorteilhaft sind der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang im einem rechten Winkel zueinander angeordnet und befinden sich auf derselben Seite des zu untersuchenden Schlauchareals. Eine solche Anordnung hat den Vorteil, dass die Vorrichtung kompakter gestaltet werden kann.
Der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang können sich zumindest in einem Überlappungsbereich um den Absaugschlauch überlappen. In dem Überlappungsbereich kann ein Strahlteiler angeordnet sein, der dazu ausgelegt ist, Anregungslicht von Fluoreszenzlicht trennen. Auch dadurch kann die Vorrichtung kompakter gestaltet werden und der Detektionsstrahlengang vereinfacht werden.
Der erste Fluoreszenzdetektor, das erste Fluoreszenzfilter, der zweite Fluoreszenzdetektor und das zweite Fluoreszenzfilter können in einer gemeinsamen Detektoreinheit angeordnet sein. Auch dadurch kann die Vorrichtung kompakter gestaltet werden und der Detektionsstrahlengang vereinfacht werden.
Mit dem Absaugschlauch verbunden kann eine Durchflusszelle vorhanden sein, die eine verbesserte Transparenz für das Anregungslicht und das Fluoreszenzlicht gegenüber dem Absaugschlauch aufweist. Um eine Durchflussrate, einen Druck oder eine Fließgeschwindigkeit der strömende Flüssigkeit zu reduzieren, kann zudem ein Bypass am Absaugschlauch vorhanden sein, der mit der Durchflusszelle verbunden ist.
Im Detektionsstrahlengang kann zusätzlich dem zweiten Fluoreszenzdetektor oder anstatt dem zweiten Fluoreszenzdetektor ein Anregungsdetektor mit einem Anregungsfilter angeordnet sein, der mit der Auswerte- und Speichereinheit verbunden und dazu ausgelegt ist, von Gewebe und strömende Flüssigkeit gestreutes Anregungslicht als eine dritte Intensität zu detektieren, in der Auswerte- und Speichereinheit Mittel dazu vorhanden sind, ein zweites Verhältnis aus der ersten Intensität und der dritten Intensität zu bilden, und die Anzeigeeinheit dazu ausgelegt ist, eine Anzeige zu aktivieren, wenn das zweite Verhältnis einen zweiten Schwellenwert überschreitet oder unterschreitet.
Vorteilhaft ist im Detektionsstrahlengang eine Kamera angeordnet, die Gewebestücke im Absaugschlauch oder in der Durchflusszelle optisch abbildet und Informationen detektiert zu Größe, Form und Geschwindigkeit der Gewebestücke. Dazu kann einerseits die schwache grüne Eigenfluoreszenz der Suspension aus Gewebestücken und strömende Flüssigkeit, oder andererseits von einer mit der Kamera gekoppelten Weißlichtquelle, die Beispielsweise als LED-Modul ausgeführt sein kann, emittiertes Weißlicht verwendet werden. Bei Verwendung einer zusätzlichen Weißlichtquelle muss diese während der Detektion der Rotfluoreszenz ausgeschaltet werden. Alternativ können auch zwei Photodetektionssysteme oder Kameras eingesetzt werden. Die Kamera dient dann zur Detektion der Gewebestücke mittels transmittierter oder gestreuter Photonen der violetten Anregungsquelle oder des Weißlichts. Der erste Fluoreszenzdetektor dient ausschließlich Detektion des Fluoreszenzlichts.
Vorteilhaft kann eine mit der Auswerte- und Speichereinheit verbundene Analyseeinheit zum Bestimmen eines Blutanteils in der strömende Flüssigkeit vorhanden. Falls sich viel Blut im Absaugschlauch befindet, kann zusätzlich zum violetten Anregungslicht auch grünes, gelbes oder rotes Licht zur Anregung verwendet werden. Dazu können zusätzliche Anregungslichtquellen vorhanden sein. Blut absorbiert besonders im Bereich um 400 nm (Soret-Bande) und im Bereich 540 nm bis 580 nm. Protoporphyrin IX absorbiert dagegen um 405 nm, um 505 nm, um 540 nm, um 573 nm und um 635 nm (Soret-Bande sowie 4 Q-Banden).
Zudem können im Beleuchtungsstrahlengang weitere Anregungslichtquellen angeordnet sein, um Licht in einem Wellenlängenbereich zu emittieren, der von dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich verschieden ist.
Vorteilhaft erfolgt die Untersuchung der Suspension mittels einer Lichtquelle, die violettes Licht um 405 nm ausstrahlt und der Fluoreszenzaktivierung dient. Bevorzugt kommt eine Laserdiode zum Einsatz.
Vorteilhaft und ruft das Anregungslicht eine Fluoreszenz im roten Spektralbereich der strömenden Suspension im Inneren des Schlauchs hervor, bevorzugt ist im Bestrahlungsbereich PPIX vorhanden.
Vorteilhaft wird als Fluoreszenzdetektor oder als Anregungsdetektor eine Photodiode oder ein Photomultiplier oder eine Kamera in Kombination mit einem Anregungs- oder einem Fluoreszenzfilter eingesetzt. Das Filter dient zur Unterdrückung von Fluoreszenzstrahlung oder gestreuter violetter Anregungsstrahlung.
Vorteilhaft befinden sich die (Anregungs-)Lichtquellen, zu untersuchendes Schlauchareal des Absaugschlauchs und Fluoreszenzdetektor in einem nahezu lichtundurchlässigen Gehäuse. Dadurch kann ein hinreichender Strahlenschutz für einen Chirurgen zu jeder Zeit gewährleistet werden.
Die Messung der Änderung der Transmission bzw. die Abschwächung des Anregungs- oder Weißlichts beim Transmittieren durch den Absaugschlauch kann ähnlich dem Prinzip einer Lichtschranke verwendet werden, um zwischen Lösung und Gewebestücken zu unterscheiden. Dazu wird eine Intensität des Anregungs- oder Weißlichts gemessen, ohne dass Gewebestücke vorliegen, die im Anschluss mit einer während einer Absaugung gemessenen Intensität des Anregungs- oder Weißlichts verglichen wird.
Um höhere Eindringtiefen als bei der Anregung mit violettem Anregungslicht zu erhalten und gleichzeitig vorhandenes PPIX hinreichend anzuregen, können zusätzlich zu violettem Anregungslicht auch langwelligere Anregungslichtquellen eingesetzt werden, beispielsweise solche, die im Bereich um 505 nm (grün) und/oder um 633 nm (rot) emittieren.
Insbesondere eine Anregung um 633 nm kann geeignet sein, um PPIX auch in größeren Gewebestücken zu detektieren und dabei eine störende gleichzeitige Anregung von Blutbestandteilen in der abgesaugten Lösung zu vermeiden.
Des Weiteren wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömende Flüssigkeit, umfassend die Schritte: Transportieren von abgesaugtem Gewebe durch die strömende Flüssigkeit in einem mindestens abschnittsweise transparenten Absaugschlauch, Emittieren von Anregungslicht in einem definierten ersten Wellenlängenbereich mittels mindestens einer Anregungslichtquelle, ein Beleuchten des für das Anregungslicht transparenten Absaugschlauchs mit dem Anregungslicht, wobei durch das Anregungslicht in dem im Absaugschlauch transportierten Gewebe in den markierten Tumorzellen ein Fluoreszenzlicht angeregt wird, ein Detektieren einer ersten Intensität des Fluoreszenzlichts durch einen ersten Fluoreszenzdetektor mit einem ersten Fluoreszenzfilter, das in einem zweiten Wellenlängenbereich transparent ist, der von dem ersten Wellenlängenbereich verschieden ist, ein Detektieren einer zweiten Intensität des Fluoreszenzlichts mit einem zweiten Fluoreszenzdetektor mit einem zweiten Fluoreszenzfilter, das in einem dritten Wellenlängenbereich transparent ist, der von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich verschieden ist, Bilden eines ersten Verhältnisses von der ersten Intensität und der zweiten Intensität mittels einer Auswerte- und Speichereinheit, die mit dem ersten Fluoreszenzdetektor und dem zweiten Fluoreszenzdetektor verbunden ist, Vergleichen des ersten Verhältnisses mit einem ersten Schwellenwert und Aktivieren einer Anzeige, wenn das erste Verhältnis den ersten Schwellenwert überschreitet oder unterschreitet.
Vorteilhaft wird zusätzlich zu der zweiten Intensität oder anstatt der zweiten Intensität eine dritte Intensität des an dem Gewebe und der strömende Flüssigkeit gestreuten Anregungslichts von einem mit der Auswerte- und Speichereinheit verbundenen Anregungsdetektor mit einem Anregungsfilter detektiert, die Auswerte- und Speichereinheit bildet ein zweites Verhältnis aus der ersten Intensität und der dritten Intensität, das zweite Verhältnis wird mit einem zweiten Schwellenwert verglichen und es wird angezeigt, wenn das zweite Verhältnis den zweiten Schwellenwert überschreitet oder unterschreitet.
Eine Kamera kann Gewebestücke im Absaugschlauch optisch abbilden, ein Vorhandensein von Gewebestücken detektieren und bei Vorhandensein von Gewebestücken ein Signal zum Einschalten der Anregungslichtquelle an die Auswerte- und Speichereinheit senden. Dadurch wird die Anordnung, die zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömende Flüssigkeit dient, nur eingeschaltet, wenn sich Gewebestücke in einem zu untersuchenden Schlauchareal des Absaugschlauchs befinden.
Vorteilhaft kann die Kamera mindestens eine Information aufnehmen über eine Größe, eine Form und eine Geschwindigkeit der Gewebestücke.
Der Absaugschlauch kann mit Weißlicht mit einer Weißlichtquelle beleuchtet werden, wenn kein Anregungslicht emittiert wird. Bevor oder sobald Anregungslicht von der oder den Anregungslichtquellen emittiert wird, wird ein Signal zum Ausschalten der Weißlichtquelle an die Auswerte- und Speichereinheit gesendet.
Vorteilhaft wird vor dem Emittieren des Anregungslichts ein Blutanteil in der strömende Flüssigkeit mittels einer mit der Auswerte- und Speichereinheit verbundenen Analyseeinheit bestimmt. Der Blutanteil kann mit einem dritten Schwellenwert verglichen werden und ein Signal zum Einschalten weiterer Anregungslichtquellen, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren, der von dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich verschieden ist, an die Auswerte- und Speichereinheit gesendet werden, wenn der Blutanteil den dritten Schwellenwert überschreitet.
Ein Verfahren zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit sollte vorteilhaft möglichst in einem Operationsraum während einer Operation erfolgen und einem Chirurgen schnell Informationen zur Fluoreszenz des abgesaugten Gewebes bereitstellen. Dabei können die Gewebestücke in der strömenden Flüssigkeit (Suspension) auf dem Weg zum Auffangbehälter optisch, insbesondere hinsichtlich des Vorliegens einer Rotfluoreszenz, analysiert werden.
Vorteilhaft werden zwei Intensitäten des Fluoreszenzlichts erfasst. Eine Intensität soll den roten Spektralbereich ab 620 nm erfassen, die andere einen Bereich für Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge kleiner als 620 nm. Letzterer erfasst eine „Untergrundfluoreszenz“. Beispielsweise sollte die erste Intensität das Fluoreszenzlicht im Bereich 635 nm ±1 0 nm erfassen und die zweite Intensität die Untergrundfluoreszenz im Bereich 600 nm ±1 0 nm. Das kann durch entsprechende Bandpassfilter für das erste Fluoreszenzfilter im Bereich 635 nm ±1 0 nm und für das zweite Fluoreszenzfilter im Bereich 600 nm ±1 0 nm realisiert werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele anhand von Zeichnungen näher beschrieben werden. Hierzu zeigen:

1 eine schematische Darstellung einer Draufsicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
2 eine schematische Darstellung einer Draufsicht einer vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung,
3 eine schematische Darstellung einer Draufsicht einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung,
4A eine schematische Darstellung einer Seitenansicht einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung,
4B eine schematische Darstellung einer Seitenansicht einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung,
5 eine schematische Darstellung einer Draufsicht einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung,
6 eine schematische Darstellung einer Draufsicht einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung,
7 ein Flussdiagramm zur schematischen Darstellung der Verfahrensschritte eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
8 ein Flussdiagramm zur schematischen Darstellung der Verfahrensschritte eines modifizierten Verfahrens,
9 ein Flussdiagramm zur schematischen Darstellung der Verfahrensschritte einer vorteilhaften Gestaltung des Verfahrens nach 7,
10 ein Flussdiagramm zur schematischen Darstellung der Verfahrensschritte einer weiteren vorteilhaften Gestaltung des Verfahrens nach 7,
11 ein Flussdiagramm zur schematischen Darstellung der Verfahrensschritte einer weiteren vorteilhaften Gestaltung des Verfahrens nach 7.

In 1 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Detektion von mit Fluoreszenzmarkern markierten Tumorzellen in einem Gewebe in einer abgesaugten Spülflüssigkeit 1 dargestellt. Ein Absaugen des Gewebes erfolgt in der Regel unmittelbar nach einer Resektion des Gewebes, d.h. während einer Operation. Die Spülflüssigkeit 1 und das Gewebe werden nach dem Absaugen in einem transparenten Absaugschlauch 2 geführt bzw. transportiert. Die Vorrichtung ist dazu ausgelegt, markierte Tumorzellen in einem Gewebe während des Absaugens entweder innerhalb des Absaugschlauchs 2 oder beim Durchfließen einer an den Ansaugschlauch 2 angeschlossenen Durchflusszelle 21 optisch zu detektieren und einem Chirurgen ein Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer definierten Anzahl von Tumorzellen in einem Detektionsbereich anzuzeigen.
Die Detektion der mit den Fluoreszenzmarkern markierten Tumorzellen soll möglichst online im Operationsraum während der Operation erfolgen und dem Chirurgen möglichst schnell Informationen über ein Vorhandensein von Tumorzellen im abgesaugten Gewebe bereitstellen. Dabei sollen Gewebestücke in der Spülflüssigkeit 1 oder einer Suspension aus der Flüssigkeit, die eine Spülflüssigkeit 1 sein kann, und Gewebestücken und strömender Flüssigkeit, die hier - ohne Beschränkung der Allgemeinheit - als Spülflüssigkeit 1 bezeichnet wird, auf dem Weg zu einem Auffangbehälter hinsichtlich eines Vorhandenseins eines Fluoreszenzlichts in einem zweiten definierten Wellenlängenbereich optisch untersucht werden. Um eine Echtzeit-Detektion der Tumorzellen zu ermöglichen, sollte sich die Vorrichtung möglichst nah am Operationsort befinden, um Informationen über das abgesaugte Gewebe zeitnah zu erhalten.
Die Untersuchung der Spülflüssigkeit 1 (als Suspension mit Gewebestücken) erfolgt über einen Beleuchtungsstrahlengang B mittels einer in einem Beleuchtungsstrahlengang B angeordneten Anregungslichtquelle 3, die Anregungslicht in einem ersten Wellenlängenbereich ausstrahlt und zur Fluoreszenzanregung des Gewebes und der markierten Tumorzellen dient. Im Beleuchtungsstrahlengang B kann der Anregungslichtquelle 3 nachgeordnet ein Anregungsfilter 31 vorhanden sein, das die Anregungslichtquelle 3 transparent in einem dem auf den ersten Wellenlängenbereich beschränkt ist. Dadurch sinken die Anforderungen an die Anregungslichtquelle 3 bezüglich einer speziell zugeschnittenen Strahlungscharakteristik. Die Anregungslichtquelle 3 ist bevorzugt eine Laserdiode. Vorteilhaft umfasst der erste Wellenlängenbereich violettes Licht im Bereich von 380 nm bis 420 nm. Besonders vorteilhaft umfasst der erste Wellenlängenbereich Licht im Bereich von 400 nm bis 410 nm. Das Gewebe wird über den Beleuchtungsstrahlengang B und durch den transparenten Absaugschlauch 2 mit dem Anregungslicht beleuchtet. Dadurch wird ein Fluoreszenzlicht vom Gewebe und den markierten Tumorzellen im Inneren des Absaugschlauchs 2 emittiert. Die Tumorzellen sind mit Fluoreszenzfarbstoffen bzw. Fluoreszenzmarkern markiert, die im zweiten Wellenlängenbereich, der von dem ersten Wellenlängenbereich verschieden ist, ein Fluoreszenzlicht emittieren. Das Gewebe und/oder die Spülflüssigkeit 1 emittieren ein Fluoreszenzlicht in einem dritten Wellenlängenbereich, der von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich verschieden ist.
Der Absaugschlauch 2 ist zumindest teilweise transparent in dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich.
Eine erste Intensität I₁ des Fluoreszenzlichts, das durch den Absaugschlauch 2 transmittiert wird, wird über einen Detektionsstrahlengang D mit einem im Detektionsstrahlengang D angeordneten ersten Fluoreszenzdetektor 4 detektiert. Im Detektionsstrahlengang D ist dem ersten Fluoreszenzdetektor vorgeordnet ein erstes Fluoreszenzfilter 41, das transparent in dem zweiten Wellenlängenbereich ist, vorhanden. Vorteilhaft umfasst der zweite Wellenlängenbereich Licht im Bereich größer 620 nm, besonders vorteilhaft umfasst der zweite Wellenlängenbereich Licht im Bereich von 625 bis 645 nm.
Erfindungsgemäß ist im Detektionsstrahlengang D ein zweiter Fluoreszenzdetektor 6 zum Detektieren einer zweiten Intensität I₂ des vom Gewebe und/oder der Spülflüssigkeit 1 emittierten Fluoreszenzlichts vorhanden. Im Detektionsstrahlengang D ist dem zweiten Fluoreszenzdetektor vorgeordnet ein zweites Fluoreszenzfilter 61, das transparent in einem dritten Wellenlängenbereich ist, vorhanden. Vorteilhaft umfasst der dritte Wellenlängenbereich Licht im Bereich kleiner 620 nm, besonders vorteilhaft umfasst der dritte Wellenlängenbereich Licht im Bereich 590 bis 610 nm.
Vorteilhaft umfasst der erste Wellenlängenbereich des Anregungslichts kleinere Wellenlängen als der zweite Wellenlängenbereich und der dritte Wellenlängenbereich des Fluoreszenzlichts. Zweckmäßig sollten sich der erste Wellenlängenbereich, der zweite Wellenlängenbereich und der dritte Wellenlängenbereich nicht überlappen bzw. keine gemeinsamen Schnittmengen aufweisen.
Als Anregungsdetektoren oder Fluoreszenzdetektoren können beispielsweise eine Photodiode, ein Photomultiplier, ein CCD-Sensor oder ein CMOS-Sensor, in Kombination mit unterschiedlichen Linsen oder optischen Filtern verwendet werden. Die Filter können zum Filtern von Umgebungslicht, gestreuter bzw. reflektierter Anregungsstrahlung oder Fluoreszenzlicht dienen.
Es ist zudem eine mit dem ersten Fluoreszenzdetektor 4 und mit dem zweiten Fluoreszenzdetektor 6 verbundene Auswerte- und Speichereinheit 5 vorhanden, die dazu ausgelegt ist, ein erstes Verhältnis V₁ von der ersten Intensität I₁ und der zweiten Intensität I₂ zu bilden und das erste Verhältnis V₁ mit einem ersten Schwellenwert S₁ zu vergleichen. Eine mit der Auswerte- und Speichereinheit 5 verbundene Anzeigeeinheit 7 ist dazu ausgelegt, anzuzeigen, wenn das erste Verhältnis V₁ den ersten Schwellenwert S₁ überschreitet oder unterschreitet. Das Anzeigen kann beispielsweise durch das Übertragen eines optischen, akustischen oder taktilen Reizes an einen Nutzer bzw. den Chirurgen erfolgen.
In einer vorteilhaften Ausführung, wie in 2 dargestellt, ist im Detektionsstrahlengang D ein Anregungsfilter 31 und ein dem Anregungsfilter 31 nachgeordneter und mit der Auswerte- und Speichereinheit 5 verbundener Anregungsdetektor 8 angeordnet der an Gewebe und Spülflüssigkeit 1 gestreutes Anregungslicht als eine dritte Intensität I₃ detektiert. In der Auswerte- und Speichereinheit 5 sind dafür Mittel vorhanden, ein zweites Verhältnis V₂ aus der ersten Intensität I₁ und der dritten Intensität I₃ zu bilden, und die Anzeigeeinheit 7 ist dazu ausgelegt, eine Anzeige zu aktivieren, wenn das zweite Verhältnis V₂ einen zweiten Schwellenwert S₂ überschreitet oder unterschreitet. Die dritte Intensität I₃ wird in dieser Ausführung anstatt der zweiten Intensität verwendet, um ein zweites Verhältnis V₂ aus der ersten Intensität I₁ und der dritten Intensität I₃ zu bilden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung, wie in 3 dargestellt, ist ebenfalls im Detektionsstrahlengang D ein Anregungsfilter 31 und ein dem Anregungsfilter 31 nachgeordneter und mit der Auswerte- und Speichereinheit 5 verbundener Anregungsdetektor 8 angeordnet, der an Gewebe und Spülflüssigkeit 1 gestreutes Anregungslicht als eine dritte Intensität I₃ detektiert. In der Auswerte- und Speichereinheit 5 sind dafür Mittel vorhanden, um das zweite Verhältnis V₂ aus der ersten Intensität I₁ und der dritten Intensität I₃ zu bilden, und die Anzeigeeinheit 7 ist dazu ausgelegt, die Anzeige zu aktivieren, wenn das zweite Verhältnis V₂ einen zweiten Schwellenwert S₂ überschreitet oder unterschreitet. Durch das Bilden des zweiten Verhältnisses V₂, das zusätzlich die dritte Intensität I₃ des gestreuten Anregungslichts berücksichtigt, wird eine Genauigkeit oder eine Sensitivität der Detektion der Tumorzellen verbessert.
Der erste Fluoreszenzdetektor 4, das erste Fluoreszenzfilter 41, der zweite Fluoreszenzdetektor 6 und das zweite Fluoreszenzfilter 61 können vorteilhaft in einer gemeinsamen Detektoreinheit 10 angeordnet sein.
Vorteilhaft ist eine mit dem Absaugschlauch 2 verbundene Durchflusszelle 21 vorhanden. Die Durchflusszelle 21 besitzt für eine Anregung und Detektion von Fluoreszenzlicht optimierte optische Eigenschaften, insbesondere eine hohe optische Transmissivität im ersten Wellenlängenbereich, im zweiten Wellenlängenbereich und im dritten Wellenlängenbereich.
Bei der in 4A dargestellten vorteilhaften Ausführung sind der Beleuchtungsstrahlengang B und der Detektionsstrahlengang D in einem im Wesentlichen rechten Winkel zueinander angeordnet. Dadurch kann die Vorrichtung kompakter gestaltet sein, als wenn sich der Beleuchtungsstrahlengang B vor dem Absaugschlauch 2 und sich der Detektionsstrahlengang D hinter dem Absaugschlauch 2 befindet.
Der Beleuchtungsstrahlengang B und der Detektionsstrahlengang D können sich, wie in 4B dargestellt, zumindest in einem Überlappungsbereich U um den Absaugschlauch 2 überlappen. Um die Vorrichtung noch kompakter zu gestalten kann ein Strahlteiler 9, der insbesondere als dichroitischer Spiegel ausgeführt sein kann, in dem Überlappungsbereich U angeordnet sein, um das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht räumlich zu trennen. Das Vorhandensein des Strahlteilers 9 ist insbesondere dann sinnvoll, wenn sich der erste Fluoreszenzdetektor 4 und der zweite Fluoreszenzdetektor 6 auf derselben Seite des Ansaugschlauchs 2 wie die Anregungslichtquelle 3 befinden.
Eine weitere vorteilhafte Ausführung der Vorrichtung ist in 5 dargestellt. In dieser Ausführung ist eine Kamera 11 vorhanden, die die Gewebestücke im Absaugschlauch 2 oder in der Durchflusszelle 21 optisch abgebildet und Informationen zu Größe, Form und Geschwindigkeit der Gewebestücke detektiert. Dazu kann eine schwache Eigenfluoreszenz des Gewebes, beispielsweise eine grüne Eigenfluoreszenz, oder eine vorteilhaft vorhandene, mit der Kamera 11 gekoppelte Weißlichtquelle 32, die beispielsweise als LED-Modul ausgeführt ist, verwendet werden. Die Weißlichtquelle 32 emittiert Licht im gesamten sichtbaren Spektralbereich. Während der Verwendung der Weißlichtquelle 32 kann jedoch keines oder nur wenig Fluoreszenzlicht von dem ersten Fluoreszenzdetektor 4 und dem zweiten Fluoreszenzdetektor 6 detektiert werden. Die Kamera 11 kann ebenso dazu ausgelegt sein, eine Änderung einer Intensität der Eigenfluoreszenz oder einer Intensität des Weißlichts zu detektieren, um ein Vorhandensein von Gewebestücken zu detektieren.
Zur Verminderung von Durchflussrate, Druck oder Fließgeschwindigkeit der Spülflüssigkeit 1 kann auch nur ein Teil des abgesaugten Gewebes untersucht werden. Dazu wird dieser Teil über einen Bypass 22 aus dem Absaugschlauch 2 abgezweigt, wie in 6 dargestellt. Die Durchflusszelle 21 kann dann im Bypass 22 oder im Hauptstrang mit dem Absaugschlauch 2 verbunden sein.
Vorteilhaft kann zudem eine mit der Auswerte- und Speichereinheit 5 verbundene Analyseeinheit 12 zum Bestimmen eines Blutanteils B₁ in der Spülflüssigkeit 1 vorhanden sein. Die Analyseeinheit 12 kann mit dem Bypass 22, wie in 6 beispielhaft dargestellt, oder mit dem Absaugschlauch 2 verbunden sein oder neben dem Bypass 22 oder dem Absaugschlauch 2 angeordnet sein und weder mit dem Bypass 22 noch dem Absaugschlauch 2 verbunden sein.
Im Beleuchtungsstrahlengang B können weitere Anregungslichtquellen 33 angeordnet sein, um Licht in einem Wellenlängenbereich zu emittieren, der von dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich verschieden ist.
Ein Ablauf eines Verfahrens zur Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer Spülflüssigkeit ist in 7 schematisch dargestellt. Zunächst wird das abgesaugte Gewebe in der Spülflüssigkeit 1 durch den Absaugschlauch 2 transportiert. Mit oder kurz nach dem Beginn des Transportweges wird das Anregungslicht von der mindestens einen Anregungslichtquelle 3 emittiert und der Absaugsaugschlauch 2 mit dem Anregungslicht beleuchtet. Durch das Beleuchten des Gewebes wird vom Gewebe und den markierten Tumorzellen ein Fluoreszenzlicht emittiert. Die erste Intensität I₁ des Fluoreszenzlichts wird durch den ersten Fluoreszenzdetektor 4 mit dem ersten Fluoreszenzfilter 41, der in dem zweiten Wellenlängenbereich transparent und von dem ersten Wellenlängenbereich verschieden ist, detektiert. Die zweite Intensität I₂ des Fluoreszenzlichts wird mit durch den zweiten Fluoreszenzdetektor 6 mit dem zweiten Fluoreszenzfilter 61, der in einem dritten Wellenlängenbereich transparent ist und sich von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich unterscheidet, erfasst. Die erste Intensität I₁ und die zweite Intensität I₂ werden an die mit dem ersten Fluoreszenzdetektor 4 und mit dem zweiten Fluoreszenzdetektor 6 verbundene Auswerte- und Speichereinheit 5 übertragen. Die Auswerte- und Speichereinheit 5 bildet das erste Verhältnis V₁ von der ersten Intensität I₁ und der zweiten Intensität I₂ und vergleicht das erste Verhältnis V₁ mit dem ersten Schwellenwert S₁. Mit der Anzeigeeinheit 7 wird dem Chirurgen angezeigt, wenn das erste Verhältnis V₁ den ersten Schwellenwert S₁ überschreitet oder unterschreitet.
In 7 ist beispielhaft dargestellt, dass eine Anzeige nur erfolgt, wenn das erste Verhältnis V₁ kleiner als der erste Schwellenwert S₁ ist. Im Sinne der Erfindung ist es für die Anzeige nicht wesentlich, ob ein Schwellenwert zur Detektion der Tumorzellen unterschritten, überschritten oder erreicht wird, solange das entsprechende Kriterium mit dem Vorhandensein (Anzahl oder Dichte) von Tumorzellen im Gewebe in der Spülflüssigkeit korreliert.
In 8 ist ein zu 7 alternatives Verfahren dargestellt, bei dem alternativ zu der zweiten Intensität I₂ des Fluoreszenzlichts eine dritte Intensität I₃ zur Bildung eines zweiten Verhältnisses V₂ verwendet wird. Das zweite Verhältnis V₂ wird anschließend mit einem zweiten Schwellenwert S₂ verglichen und bei einer Überschreitung des zweiten Schwellenwerts S₂ wird diese angezeigt.
Des Weiteren kann alternativ zur zweiten Intensität I₂ oder zusätzlich zur zweiten Intensität I₂ eine dritte Intensität I₃ des an dem Gewebe und der Spülflüssigkeit 1 gestreuten Anregungslichts von dem mit der Auswerte- und Speichereinheit 5 verbundenen Anregungsdetektor 8 mit dem Anregungsfilter 31 detektiert werden, wie in 9 dargestellt. Die Auswerte- und Speichereinheit 5 bildet dann ein zweites Verhältnis V₂ aus der ersten Intensität I₁ und der dritten Intensität I₃ und vergleicht das zweite Verhältnis V₂ mit einem zweiten Schwellenwert S₂. Mit der Anzeigeeinheit 7 wird dem Chirurgen angezeigt, wenn das erste Verhältnis V₁ den ersten Schwellenwert überschreitet oder das zweite Verhältnis V₂ den zweiten Schwellenwert S₂ überschreitet. Die Anzeigeeinheit 7 kann, je nach Ausführung, dem Chirurgen beispielsweise anzeigen, wenn das erste Verhältnis V₁ den ersten Schwellenwert überschreitet und das zweite Verhältnis V₂ den zweiten Schwellenwert S₂ überschreitet. Auch hier ist es nicht wesentlich, ob ein Schwellenwert zur Detektion der Tumorzellen unterschritten, überschritten oder erreicht wird, solange das entsprechende Kriterium mit dem Vorhandensein von Tumorzellen in dem Gewebe korreliert.
Eine Kamera 11 kann Gewebestücke im Absaugschlauch 2 optisch abbilden und ein Vorhandensein von Gewebestücken detektieren. Bei einem Vorhandensein von Gewebestücken kann, wie in 10 dargestellt, von der Kamera 11 ein Signal zum Einschalten der Anregungslichtquelle 3 an die Auswerte- und Speichereinheit 5 gesendet werden.
Die Kamera 11 kann Informationen detektieren zu Größe, Form und Geschwindigkeit der Gewebestücke.
Vor dem Emittieren des Anregungslichts kann ein Weißlicht durch eine Weißlichtquelle 32 emittiert und der Absaugschlauch 2 mit dem Weißlicht beleuchtet werden. Es kann in diesem Fall ein Signal zum Ausschalten der Weißlichtquelle 32 an die Auswerte- und Speichereinheit 5 gesendet werden, sobald das Anregungslicht von der Anregungslichtquelle 3 emittiert wird. Das kann notwendig sein, da das Weißlicht spektrale Anteile im Bereich des ersten Wellenlängenbereichs, des zweiten Wellenlängenbereichs und des dritten Wellenlängenbereichs aufweist.
Vor dem Emittieren des Anregungslichts kann ein Blutanteil B₁ in der Spülflüssigkeit 1 mit einer mit der Auswerte- und Speichereinheit 5 verbundenen Analyseeinheit 12 bestimmt werden, wie in 11 dargestellt.
Der Blutanteil B₁ kann mit einem dritten Schwellenwert S₃ verglichen werden und ein Signal zum Einschalten weiterer Anregungslichtquellen 33, die Anregungslicht in einem Wellenlängenbereich emittieren, der von dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich verschieden ist, von der Analyseeinheit 12 an die Auswerte- und Speichereinheit 5 gesendet werden, wenn der Blutanteil B₁ den dritten Schwellenwert S₃ überschreitet. Blut absorbiert besonders stark im Bereich um 400 nm (Soret-Bande) und im Bereich 540 nm bis 580 nm. Protoporphyrin, welches als Fluoreszenzmarker an bzw. in den Tumorzellen vorhanden sein kann, absorbiert besonders stark um 405 nm, 505 nm, 540 nm, 573 nm und 635 nm (Soret-Bande sowie 4 Q-Banden). Das Emittieren von Anregungslicht in einem weiteren Wellenlängenbereich kann, je nachdem welche Wellenlängen der erste Wellenlängenbereich umfasst, aufgrund des Absorptionsverhaltens von Blut erforderlich sein. Wenn der Blutanteil B₁ kleiner oder gleich dem dritten Schwellenwert S₃ ist, wird nur die Anregungslichtquelle 3 eingeschaltet. Um höhere Eindringtiefen in das Gewebe als bei einer Anregung mit Anregungslicht im Bereich von beispielsweise 405 nm zu erhalten, kann zusätzlich auch langwelligeres Anregungslicht zur Fluoreszenzanregung eingesetzt werden, beispielsweise im Bereich um 505 nm und/oder um 633 nm. Das Verwenden von Anregungslicht mit einer Wellenlänge um 633 nm ist zur Fluoreszenzanregung von Protoporphyrin besonders geeignet, da eine störende gleichzeitige Fluoreszenzanregung von Blutbestandteilen und Tumorzellen in der abgesaugten Spülflüssigkeit 1 vermieden wird.
Bezugszeichenliste

1: Spülflüssigkeit
2: Absaugschlauch
21: Durchflusszelle
22: Bypass
3: Anregungslichtquelle
31: Anregungsfilter
32: Weißlichtquelle
33: weitere Anregungslichtquelle
4: erster Fluoreszenzdetektor
41: erstes Fluoreszenzfilter
5: Auswerte- und Speichereinheit
6: zweiter Fluoreszenzdetektor
61: zweites Fluoreszenzfilter
7: Anzeigeeinheit
8: Anregungsdetektor
9: Strahlteiler
10: Detektionseinheit
11: Kamera
12: Analyseeinheit
B: Beleuchtungsstrahlengang
D: Detektionsstrahlengang
B1: Blutanteil
I1: erste Intensität
I2: zweite Intensität
I3: dritte Intensität
S1: erster Schwellenwert
S2: zweiter Schwellenwert
S3: dritter Schwellenwert
V1: erstes Verhältnis
V2: zweites Verhältnis

Claims

Vorrichtung zur Fluoreszenz-Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit (1), umfassend - einen mindestens abschnittsweise für ein Anregungslicht transparenten Absaugschlauch (2), durch den das Gewebe in der strömenden Flüssigkeit (1) geführt wird, - einen Beleuchtungsstrahlengang (B) mit mindestens einer Anregungslichtquelle (3) zum Emittieren von Anregungslicht, - einen Detektionsstrahlengang (D) mit mindestens einem ersten Fluoreszenzdetektor (4) zur Detektion einer ersten Intensität (I₁) eines vom Gewebe emittierten Fluoreszenzlichts und einem ersten Fluoreszenzfilter (41), das in einem zweiten Wellenlängenbereich transparent ist, der vom ersten Wellenlängenbereich verschieden ist und - eine mit dem ersten Fluoreszenzdetektor (4) verbundene Auswerte- und Speichereinheit (5), dadurch gekennzeichnet, dass - im Detektionsstrahlengang (D) ein zweiter Fluoreszenzdetektor (6) zur Detektion einer zweiten Intensität (I2) des vom Gewebe emittierten Fluoreszenzlichts und ein zweites Fluoreszenzfilter (61), das transparent ist in einem dritten Wellenlängenbereich, der von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich verschieden ist, vorhanden ist, wobei der zweite Fluoreszenzdetektor (6) mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbunden ist, - die Auswerte- und Speichereinheit (5) dazu ausgelegt ist, ein erstes Verhältnis (V₁) der ersten Intensität (I₁) und der zweiten Intensität (I₂) zu bilden und - eine mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbundene Anzeigeeinheit (7) vorhanden ist, um anzuzeigen, wenn das erste Verhältnis (V₁) einen ersten Schwellenwert (S₁) überschreitet oder unterschreitet.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsstrahlengang (B) und der Detektionsstrahlengang (D) in einem von 0° verschiedenen Winkel zueinander und zum Absaugschlauch (2) angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsstrahlengang (B) und der Detektionsstrahlengang (D) sich zumindest in einem Überlappungsbereich (U) um den Absaugschlauch (2) überlappen.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Strahlteiler (9) im Überlappungsbereich (U) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Fluoreszenzdetektor (4), das erste Fluoreszenzfilter (41), der zweite Fluoreszenzdetektor (6) und das zweite Fluoreszenzfilter (61) in einer gemeinsamen Detektoreinheit (10) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine mit dem Absaugschlauch (2) verbundene Durchflusszelle (21) vorhanden ist, die eine bessere Transparenz für das Anregungslicht und das Fluoreszenzlicht als der Absaugschlauch (2) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verminderung von Durchflussrate, Druck oder Fließgeschwindigkeit der Spülflüssigkeit (1) ein Bypass (22) am Absaugschlauch (2) vorhanden ist, der mit der Durchflusszelle (21) verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (D) anstatt dem zweiten Fluoreszenzdetektor ein Anregungsdetektor (8) mit einem Anregungsfilter (31) angeordnet ist, der mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbunden und dazu ausgelegt ist, von Gewebe und strömender Flüssigkeit (1) gestreutes Anregungslicht als eine dritte Intensität (I₃) zu detektieren, und die Auswerte- und Speichereinheit (5) dazu ausgelegt ist, ein zweites Verhältnis (V₂) aus der ersten Intensität (I₁) und der dritten Intensität (I₃) zu bilden, und die Anzeigeeinheit (7) dazu ausgelegt ist, eine Anzeige zu aktivieren, wenn das zweite Verhältnis (V₂) einen zweiten Schwellenwert (S₂) überschreitet oder unterschreitet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (D) eine Kamera (11) angeordnet ist, die Gewebestücke im Absaugschlauch (2) oder in der Durchflusszelle (21) optisch abbildet und Informationen detektiert zu Größe, Form und Geschwindigkeit der Gewebestücke.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (B) mindestens eine weitere Lichtquelle angeordnet ist, die als Weißlichtquelle (32) ausgeführt und mit der Kamera (11) gekoppelt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbundene Analyseeinheit (12) zum Bestimmen eines Blutanteils (B₁) in der strömenden Flüssigkeit (1) vorhanden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (B) weitere Anregungslichtquellen (33) angeordnet sind, um Licht in einem Wellenlängenbereich zu emittieren, der von dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich verschieden ist.
Verfahren zur Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit (1) mit den Schritten: • Transportieren von abgesaugtem Gewebe durch die strömende Flüssigkeit (1) in einem mindestens abschnittsweise transparenten Absaugschlauch (2), • Emittieren von Anregungslicht in einem definierten ersten Wellenlängenbereich mittels mindestens einer Anregungslichtquelle (3), • Beleuchten des für das Anregungslicht transparenten Absaugschlauchs (2) mit dem Anregungslicht, wobei durch das Anregungslicht in dem im Absaugschlauch (2) transportierten Gewebe in den markierten Tumorzellen ein Fluoreszenzlicht angeregt wird, • Detektieren einer ersten Intensität (I₁) des Fluoreszenzlichts durch einen ersten Fluoreszenzdetektor (4) mit einem ersten Fluoreszenzfilter (41), das in einem zweiten Wellenlängenbereich transparent ist, der von dem ersten Wellenlängenbereich verschieden ist, • Detektieren einer zweiten Intensität (I₂) des Fluoreszenzlichts mit einem zweiten Fluoreszenzdetektor (6) mit einem zweiten Fluoreszenzfilter (61), das in einem dritten Wellenlängenbereich transparent ist, der von dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich verschieden ist, • Bilden eines ersten Verhältnisses (V₁) von der ersten Intensität (I₁) und der zweiten Intensität (I₂) mittels einer Auswerte- und Speichereinheit (5), die mit dem ersten Fluoreszenzdetektor (4) und dem zweiten Fluoreszenzdetektor (6) verbunden ist, • Vergleichen des ersten Verhältnisses (V₁) mit einem ersten Schwellenwert (S₁) und • Aktivieren einer Anzeige, wenn das erste Verhältnis (V₁) den ersten Schwellenwert (S₁) überschreitet oder unterschreitet.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass anstatt der zweiten Intensität (I₂) eine dritte Intensität (I₃) des an dem Gewebe und der strömenden Flüssigkeit (1) gestreuten Anregungslichts von einem mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbundenen Anregungsdetektor (8) mit einem Anregungsfilter (31) detektiert wird, die Auswerte- und Speichereinheit (5) ein zweites Verhältnis (V₂) aus der ersten Intensität (I₁) und der dritten Intensität (I₃) bildet, das zweite Verhältnis (V₂) mit einem zweiten Schwellenwert (S₂) verglichen wird und angezeigt wird, wenn das zweite Verhältnis (V₂) den zweiten Schwellenwert (S₂) überschreitet oder unterschreitet.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kamera (11) Gewebestücke im Absaugschlauch (2) optisch abbildet, ein Vorhandensein von Gewebestücken detektiert und bei Vorhandensein von Gewebestücken ein Signal zum Einschalten der Anregungslichtquelle (3) an die Auswerte- und Speichereinheit (5) sendet.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kamera (11) mindestens eine Information aufnimmt von Größe, Form und Geschwindigkeit der Gewebestücke.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Absaugschlauch (2) mit Weißlicht von einer Weißlichtquelle (32) beleuchtet wird, wenn kein Anregungslicht emittiert wird, und ein Signal zum Ausschalten der Weißlichtquelle (32) an die Auswerte- und Speichereinheit (5) gesendet wird, bevor das Anregungslicht emittiert wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Emittieren des Anregungslichts ein Blutanteil (B₁) in der strömenden Flüssigkeit (1) mittels einer mit der Auswerte- und Speichereinheit (5) verbundenen Analyseeinheit (12) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Blutanteil (B₁) mit einem dritten Schwellenwert (S₃) verglichen wird und ein Signal zum Einschalten weiterer Anregungslichtquellen (33), die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren, der von dem ersten Wellenlängenbereich, dem zweiten Wellenlängenbereich und dem dritten Wellenlängenbereich verschieden ist, an die Auswerte- und Speichereinheit (5) gesendet wird, wenn der Blutanteil (B₁) den dritten Schwellenwert (S₃) überschreitet.