DE10202887A1

DE10202887A1 - Zellanalyseverfahren und -vorrichtung

Info

Publication number: DE10202887A1
Application number: DE2002102887
Authority: DE
Inventors: Christoph Gauer
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2022-01-26
Also published as: DE10202887B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zellanalyseverfahren, bei dem einzelne Zellen bzw. eine geringe Anzahl von Zellen als Zellösungstropfen an einem definierten Meßpunkt auf der Oberfläche eines Substrates, vorzugsweise eines Festkörpers, deponiert werden, wobei der Meßpunkt derart funktionalisiert ist, daß sich ein Zellösungstropfen bevorzugt darauf aufhält, und am Meßpunkt ein erster elektrischer Kontakt vorhanden ist, eine Patch-Pipette mit einem zweiten elektrischen Kontakt derart in Richtung der Oberfläche bewegt wird, daß eine Zelle aus dem auf dem Meßpunkt befindlichen Zellösungstropfen von der Patch-Pipette gehalten wird und durch den zweiten elektrischen Kontakt elektrisch kontaktiert wird, und elektrische Eigenschaften zwischen erstem und zweiten elektronischen Kontakt gemessen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Zellanalysevorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Zellanalyseverfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Zellanalyseverfahren unter Einsatz einer Patch-Pipette zur Messung elektrischer Eigenschaften von Zellmaterial und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
In der pharmazeutischen und biologischen Forschung werden häufig Untersuchungen an Zellen durchgeführt. Ein Beispiel hierfür ist die sogenannte Patch-Clamp- Technik. Dabei werden Ströme durch die Ionenkanäle der Zellwand in Abhängigkeit von verschiedenen Wirkstoffen bzw. deren Konzentration getestet. Weiterhin untersucht man auch spezifische Wechselwirkungen zwischen einer Zelle und biologischen Makromolekülen, die sich z. B. in dem die Zelle umgebenden Nährmedium oder aber auf einer Festkörperoberfläche befinden können. Die konventionelle Patch-Clamp-Technik ist z. B. in "Patch-Clamp-Technik", M. Numberger und Andreas Draguhn, Spektrum Akad. Vlg., Hdg. 1996 beschrieben. In einer Petrischale befindet sich eine Vielzahl von Zellen, welche z. B. mit einem invertierten Mikroskop betrachtet werden. Mit einem Mikromanipulator wird nun eine Glaskapillare (Patch-Pipette) zur Zellwand bewegt und bei Berührung der Zellmembran in der Pipette Unterdruck erzeugt. Durch diesen Unterdruck wird die Zellwand gegen die Patch-Pipette gepreßt. In der die Zelle umgebenden Nährlösung befindet sich eine erste Elektrode und in der Patch-Pipette selbst eine zweite. Es wird nun eine Spannung von etwa 100 mV angelegt und der Strom durch die Ionenkanäle der Zellmembran gemessen. Diesen Vorgang wiederholt man ggf. für die ausgewählte Zelle in unterschiedlichen Medien bzw. unterschiedlichen Konzentrationen eines Wirkstoffes und erhält auf diese Weise Aufschluß über den Einfluß der Medien bzw. des Wirkstoffes auf die Aktivität der Ionenkanäle. Die Patch-Clamp-Technik, wie sie heute durchgeführt wird, ist im wesentlichen eine manuelle Tätigkeit. Andere Beispiele für bekannte Patch-Clamp-Techniken sind in US 6,063,260 bzw. US 6,117,291 beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Zellanalyseverfahren und eine Zellanalysevorrichtung anzugeben, die eine Automatisierung und die Reduzierung an benötigtem Material ermöglichen.
Diese Aufgabe wird mit einem Zellanalyseverfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 und einer Zellanalysevorrichtung mit den Merkmalen des Anspruches 21 gelöst.
Bei dem erfindungsgemäßen Zellanalyseverfahren werden einzelne Zellen bzw. eine geringe Anzahl von Zellen als Zellösungstropfen an einem definierten Meßpunkt auf der Oberfläche eines Substrates deponiert. Der Meßpunkt ist derart funktionalisiert, daß sich ein Zellösungstropfen bevorzugt darauf aufhält, und elektrisch kontaktiert. Das Substrat kann ein Festkörper sein, wobei dieser Begriff kristalline Substanzen, aber auch z. B. Kunststoffsubstrate umfaßt. Erfindungsgemäß wird eine Patch-Pipette, ähnlich wie sie auch beim Stand der Technik benutzt wird, mit einem zweiten elektrischen Kontakt derart in Richtung der Oberfläche bewegt, daß eine Zelle aus dem auf dem Meßpunkt befindlichen Zellösungstropfen von der Patch-Pipette gehalten wird und durch den zweiten elektrischen Kontakt in der Patch-Pipette elektrisch kontaktiert wird. Schließlich können über den ersten elektrischen Kontakt und den zweiten elektrischen Kontakt elektrische Eigenschaffen der Zellmembran gemessen werden, die von der Patch-Pipette gehalten wird.
So können z. B. elektrische Transporteigenschaften oder Potentiale gemessen werden.
Die Zelle kann an der Patch-Pipette z. B. einfach durch Anlegen von Unterdruck an die Patch-Pipette gehalten werden. Der Zellösungstropfen kann aber vorteilhaft auch so klein gewählt werden, daß eine Zelle in dem Tropfen bei Kontakt mit der Patch-Pipette nicht ausweichen kann. Dies kann durch entsprechende Dosierung der Tropfenmenge oder durch entsprechend kleine Meßpunkte erreicht werden, die z. B. durch Vorversuche ermittelt werden können. Die Verfahrensführung wird durch diese zudem noch materialsparende Methode noch weiter vereinfacht.
Durch die Funktionalisierung eines Meßpunktes derart, daß sich der Zellösungstropfen bevorzugt darauf aufhält, ist die Verwendung einer Petrischale nicht mehr notwendig. Das Verfahren eignet sich besonders zur Durchführung auf Chips, wie sie auch in der Halbleitertechnik Verwendung finden, und kann auf einem Element durchgeführt werden, das Teil eines sogenannten lab-on-the-chip (siehe z. B. O. Müller, Laborwelt 1/2000, Seiten 36-38) ist, auf dem sich mehrere Analyse- bzw. Synthesestationen befinden.
Der Zellösungstropfen wird aufgrund der erfindungsgemäßen Funktionalisierung des Meßpunktes und seiner Oberflächenspannung zusammengehalten, so daß keine sonstige laterale Eingrenzung notwendig ist. Das Substrat kann also im wesentlichen planar sein und ist entsprechend einfach zu handhaben und zu reinigen.
Es können sehr kleine Volumina in der Größenordnung von einigen Nanolitern bis Mikrolitern verarbeitet werden, wohingegen bei konventionellen Techniken unter Einsatz von Petrischalen mehrere Milliliter nötig sind. Der notwendige Materialaufwand ist also stark verringert.
Die Positionierung der Zellen auf der Substratoberfläche kann ohne jede Sichtkontrolle erfolgen, da sich die Zellen aufgrund der Funktionalisierung der Meßpunkte an definierten Orten befinden, wo sie auch durch die Oberflächenspannung gehalten werden. Außerdem ist der Zellösungstropfen mit der Zelle auf dem Meßpunkt lokalisiert, so daß keine manuelle Ansteuerung einer Zelle in einer Petrischale mit der Patch-Pipette nötig ist.
Mehrere Meßpunkte können z. B. in Form einer Matrix auf einem Chip angeordnet werden, um mehrere Untersuchungen parallel durchführen zu können. Dazu kann eine entsprechende Anzahl von Patch-Pipetten, die automatisiert bewegt werden und einen Rasterabstand aufweisen, der dem Rasterabstand der matrixförmig angeordneten Meßpunkte entspricht, eingesetzt werden. Ebenso können einzelne Meßpunkte auf einem Träger zusammengefaßt werden, z. B. einem Kunststoffträger, wobei auch hier vorteilhafterweise ein festes Rastermaß gewählt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem Zellösungströpfchen auf einem Meßpunkt verwendet werden, eignet sich also zudem sehr zur Parallelisierung.
Vorteilhafterweise wird das erfindungsgemäße Zellanalyseverfahren mit einer Anordnung durchgeführt, bei der der Meßpunkt derartige Benetzungseigenschaften aufweist, daß er mit der Zellflüssigkeit bevorzugter benetzt als die umgebende Substratoberfläche. Der Meßpunkt ist also vorzugsweise benetzungsfreundlich. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, daß die umgebende Festkörperoberfläche benetzungsfeindlich gemacht wird. Bei wäßrigen Lösungen kann dies z. B. durch eine Silanisierung der umgebenden Festkörperoberfläche geschehen.
Die Steuerung der bevorzugten Aufenthaltsorte von Zellösungstropfen durch eine Modulation der Benetzungseigenschaften der Substratoberfläche vermeidet die Notwendigkeit von Gräben oder Kanälen. Die Substratoberfläche bleibt im wesentlichen eben. Dies erleichtert die Reinigung und Handhabung einer entsprechenden Vorrichtung und des Verfahrens. Zur Herstellung einer entsprechend benetzungsmodulierten Oberfläche können gut handhabbare lithographische Techniken und Beschichtungstechnologien eingesetzt werden.
Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren einsetzen, wenn die Wirkung einer Wirkstoff- bzw. Nährlösung auf die Zellmembran untersucht werden soll. Ein Tropfen der entsprechenden Wirkstofflösung wird dazu mit dem Zellösungstropfen auf der Oberfläche des Substrates in Verbindung gebracht, während oder bevor die elektrischen Transporteigenschaften gemessen werden. Auf der ebenen Oberfläche des Substrates ist dieser Schritt sehr leicht durchzuführen und erfordert nur eine sehr geringe Menge an Wirkstofflösung, da nicht das große Volumen einer Petrischale eingesetzt wird.
Besonders vorteilhaft läßt sich die Wirkstofflösung mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle in Richtung des Meßpunktes bewegen. Wird an der Oberfläche eine Oberflächenschallwelle mit Ausbreitungsrichtung zwischen einem Wirkstofftropfen und dem Meßpunkt angeregt, so wird deren Impuls auf die Wirkstofflösung übertragen und bewirkt so eine Bewegung des Wirkstofftropfens in Richtung des Meßpunktes. Oberflächenschallwellen lassen sich auf einfache Weise mit Hilfe von Interdigitaltransducern, wie sie aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie bekannt sind, erzeugen. Die Bewegung kleiner Flüssigkeitsmengen auf Festkörperoberflächen mit Hilfe von Oberflächenschallwellen ist in DE-A-100 55 318 beschrieben.
Der Transport von Wirkstoff findet ebenfalls in der Substratebene statt, d. h. es sind keine weiteren Pipetten oder Dispenser erforderlich, um den Wirkstoff zuzugeben.
Der Wirkstofftropfen wird vorteilhafterweise aus einem Wirkstofflösungsreservoir abgezogen. Dieses Reservoir kann durch einen Oberflächenbereich gebildet werden, der von der Wirkstofflösung im Gegensatz zu der umgebenden Substratoberfläche bevorzugt benetzt wird. Auf diesem Oberflächenbereich kann sich ein durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltener Wirkstofftropfen befinden. Durch Einwirkung einer entsprechend gerichteten Oberflächenschallwelle geeigneter Intensität läßt sich von diesem Wirkstofftropfen ein Teil separieren und in Richtung des Meßpunktes bewegen. Die notwendige Benetzungsmodulation zur Darstellung eines Wirkstofflösungsreservoirs kann z. B. für den Fall einer wäßrigen Wirkstofflösung ebenfalls durch Hydrophobisierung der umgebenden Oberfläche erreicht werden.
Besonders genau und definiert läßt sich der abgetrennte Wirkstofftropfen auf der Substratoberfläche bewegen, wenn er sich entlang einer Bahn bewegt, die ebenfalls derartige Benetzungseigenschaften hat, daß sie von der Wirkstofflösung bevorzugt benetzt wird.
Ebenso wie die Wirkstofflösungstropfen können auch Spülflüssigkeitstropfen über die Substratoberfläche bewegt werden, um die Substratoberfläche zu reinigen und/oder die Wirkstofflösung zu entfernen. Auch hier können wie bei Wirkstofflösungen entsprechende Spülflüssigkeitsreservoirs und Bahnen für die Bewegung vorgesehen sein. Die Bewegung der Spülflüssigkeitstropfen kann ebenfalls durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle angeregt werden.
Mit einer entsprechend gewählten Spüllösung kann z. B. die Wirkstofflösung ganz oder teilweise entfernt werden, bevor eine neue Messung an der Zelle ggf. mit einer geringeren Wirkstofflösungsmenge oder einem neu hinzugefügten Wirkstoff durchgeführt wird.
Eine Spüllösung kann auch so gewählt werden, daß sie eine biologische Funktion ausübt. Zum Beispiel kann sie bei Kontakt mit der Zelle dazu dienen, diese nach ihrem Kontakt mit einer Wirkstofflösung und/oder der elektrischen Messung wieder in ihren vorherigen Zustand zu versetzen.
Die Zellösungstropfen können mit einer Pipette auf den bzw. die Meßpunkte aufgebracht werden. Besonders vorteilhaft ist es jedoch, wenn die Zellösungstropfen entlang der Oberfläche auf einer Bahn bewegt werden, die von der Zellösung bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates. Es ergeben sich die gleichen Vorteile wie bei der Bewegung einer Wirkstoff- bzw. Spülflüssigkeitslösung auf entsprechenden Bahnen. Einzelne Zellösungstropfen lassen sich auf diese Weise definiert und genau an die Meßpunkte steuern.
Ein Zellösungstropfen, der zu einem Meßpunkt bewegt werden soll, kann, ähnlich wie oben mit Bezug zur Wirkstofflösung beschrieben, aus einem Reservoir abgezogen werden, das ebenfalls durch einen benetzungsmodulierten Oberflächenbereich gebildet wird. Zur Separierung von Zellösungsvolumina mit einer oder nur wenigen Zellen kann ein Zellösungstropfen über eine Bahn geführt werden, die von der Zellösung bevorzugt gegenüber der umgebenden Substratoberfläche benetzt wird und eine Engstelle besitzt, die zu einem Zeitpunkt nur eine oder wenige Zellen passieren läßt.
Die Bewegung von Zellösungstropfen auf der Substratoberfläche kann ebenfalls mit Hilfe von Oberflächenschallwellen angeregt werden.
Im folgenden werden das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung anhand der anliegenden Figuren erläutert. Die Figuren sind schematischer Natur und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu. Dabei zeigt
Fig. 1 eine Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 2 eine seitliche Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, und
Fig. 3 eine Draufsicht auf eine andere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 1 zeigt die Oberfläche eines Festkörperchips 1 mit mehreren Meßpunkten 3. Auf den Meßpunkten befinden sich Zellen 5 in einer Zellösung, die in Fig. 1 nicht gezeigt ist. Die Meßpunkte weisen eine Beschichtung auf, die von der Lösungsflüssigkeit mit den Zellen 5 bevorzugt benetzt wird. Für eine wäßrige Zellösung wird dazu z. B. der die Meßpunkte 3 umgebende Bereich der Oberfläche des Substrates 1 durch Silanisierung hydrophob im Vergleich zu den Meßpunkten 3 gemacht. Die Größe eines Meßpunktes beträgt z. B. 100 µm im Durchmesser, wobei die Größe an die entsprechende Anwendung angepaßt ist. Zellösungstropfen mit einem Volumen in der Größenordnung von einigen Nanolitern bis einigen Mikrolitern lassen sich auf diese Weise auf den Meßpunkten lokalisieren. In Fig. 1 ist der Übersichtlichkeit halber nur ein Meßpunkt 3 mit einer Zelle 5 mit Bezugszeichen versehen worden.
Fig. 2 zeigt eine seitliche Schnittansicht des Substrates 1 mit einer Zelle 5 auf einem in der seitlichen Schnittansicht nicht sichtbaren Meßpunkt 3. Die Zelle 5 befindet sich in einem Zellösungsmitteltropfen 7, der durch seine Oberflächenspannung auf dem Meßpunkt 3 zusammengehalten wird. In Fig. 2 ist weiterhin eine Patch-Pipette 9 sichtbar, die wie eine bekannte Patch-Pipette aufgebaut ist und z. B. von einem Robotermanipulator gehalten wird. Nicht gezeigt ist eine Elektrode innerhalb der Patch-Pipette, die nach Ansaugen der Zelle mit der Zellmembran in Verbindung kommt. In der Fig. 2 ist der Übersichtlichkeit halber nur ein Zellösungstropfen 7 mit einer Zelle 5 und einer Patch-Pipette 9 gezeigt. Es ist jedoch bei einer Ausführungsform in einer matrixartigen Anordnung von Meßpunkten, wie sie in Draufsicht der Fig. 1 sichtbar ist, eine der Anzahl der Meßpunkte entsprechende Anzahl von Patch-Pipetten vorgesehen, die in einem entsprechenden Rasterabstand oberhalb des Substrates angeordnet sind.
Ebenfalls in den Fig. 1 und 2 nicht gezeigt ist der elektrische Anschluß der einzelnen Meßpunkte 3, der in konventioneller Weise z. B. mit lithographischen Techniken erzeugt werden kann.
Die Erzeugung von benetzungsfreundlichen Oberflächen zur Lokalisierung einzelner Flüssigkeitstropfen, die durch ihre Oberflächenspannung zusammengehalten werden, ist in DE-A-100 55 318 beschrieben.
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in Draufsicht. 1 bezeichnet wiederum einen Festkörperchip, auf dem sich beim gezeigten Beispiel ein einzelner Meßpunkt 3 befindet, der wiederum durch einen benetzungsfreundlichen Oberflächenbereich definiert ist. Auf dem Meßpunkt 3 ist wiederum eine Zelle 5 angedeutet. Der Meßpunkt 3 ist mit einer Elektrode 11 kontaktiert, die mit lithographischen Techniken in bekannter Weise derart auf der Oberfläche aufgebracht ist, daß sie mit dem Meßpunkt 3 in Kontakt ist. Bahnen 21 und 22 führen zu Reservoirs 13 und 15. Diese Reservoirs sind größerflächige Oberflächenbereiche z. B. einiger 100 µm bis Millimeter im Durchmesser, die z. B. von einer Wirkstoff- oder Nährlösung bevorzugt gegenüber dem umgebenden Festkörperbereich benetzt werden. In der Regel werden die Reservoirflächen größer als die Meßpunktflächen gewählt. Zum Beispiel kann der Oberflächenbereich 13 zur Lokalisierung eines Tropfens Wirkstofflösung dienen, der durch seine Oberflächenspannung auf dem Bereich 13 zusammengehalten wird. In ähnlicher Weise kann z. B. der Bereich 15 zur Lokalisierung eines Spülflüssigkeitstropfens dienen, der durch seine Oberflächenspannung auf dem Oberflächenbereich 15 zusammengehalten wird. Die Bahnen 21 und 22 sind ebenfalls mit derartigen Benetzungseigenschaften ausgestattet, daß sie von den jeweiligen Flüssigkeiten bevorzugt benetzt werden. Sind die Wirkstofflösung, die Spülflüssigkeitslösung und die Zellösung z. B. alle wäßrig, so werden die Oberflächen der Bereiche 13, 15, 21, 22 und 3 z. B. hydrophil gewählt.
17 und 19 bezeichnen Interdigitaltransducer, wie sie aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie bekannt sind. Interdigitaltransducer bestehen aus zwei Elektroden mit fingerartig ineinander greifenden Fortsätzen, wie sie in Fig. 3 nur schematisch dargestellt sind. Der Übersichtlichkeit halber sind in Fig. 3 nur wenig ineinander greifende Finger schematisch angedeutet. Anlegen einer Wechselfrequenz von z. B. einigen 100 MHz an die zwei Elektroden eines Interdigitaltransducers erzeugt auf einem piezoelektrischen Substrat 1 eine Oberflächenschallwelle, die sich senkrecht zu den Fingerelektroden ausbreitet. Entsprechende piezoelektrische Substrate sind z. B. Lithiumniobat oder Quarz. Zur Anregung von Oberflächenschall-Wellen ist es auch ausreichend, wenn sich im Bereich eines Interdigitaltransducers eine piezoelektrische Beschichtung z. B. aus Zinkoxid befindet.
Die Ausführungsform der Fig. 3 läßt sich bei geeigneter Geometrie und entsprechend paralleler Anordnung auch bei mehreren in einem Raster angeordneten Meßpunkten 3 verwenden.
Das erfindungsgemäße Verfahren mit den erfindungsgemäßen gezeigten Ausführungsformen wird wie folgt durchgeführt.
Zunächst werden auf die Meßpunkte 3 Zellösungstropfen 7 mit einer oder wenigen Zellen 5 je Meßpunkt 3 aufgebracht. Dies geschieht z. B. in konventioneller Weise mit einer Pipette oder aus einem Zellösungsreservoir heraus, ähnlich wie es mit Bezug zu Fig. 3 beschrieben Wirkstofflösungsreservoiroberflächen 13 bzw. Spülflüssigkeitsoberflächenbereichen 15 erläutert ist.
Es entsteht ein Zustand, wie er in Draufsicht in der Fig. 1 gezeigt ist. Eine entsprechende Anzahl von Patch-Pipetten 9, wie sie im Fall eines einzelnen Meßpunktes in Fig. 2 in seitlicher Ansicht gezeigt ist, wird auf die Oberfläche des Festkörpers 1 z. B. mit Hilfe eines entsprechenden Roboters abgesenkt. Je Meßpunkt wird eine Zelle durch Anlegen eines entsprechenden Unterdruckes an die entsprechende Patch-Pipette kontaktiert. Ähnlich wie bei konventionellen Patch-Clamp- Techniken wird auf diese Weise ein elektrischer Kontakt mit der Zellmembran hergestellt. Der Zellösungstropfen 7 mit der Zelle 5 ist jedoch auf dem Meßpunkt lokalisiert, so daß nicht - wie bei Verwendung einer Petrischale - erst eine Zelle angesteuert werden muß.
Über den elektrischen Kontakt mit dem einzelnen Meßpunkt 3 läßt sich jetzt eine Spannung zwischen der Elektrode in der Patch-Pipette und dem elektrisch kontaktierten Meßpunkt 3 anlegen und der Strom als deren Funktion messen. Als nächstes wird eine gewünschte Nährlösung zum Meßpunkt 3 bewegt und eine neue Messung vorgenommen. Dieser Vorgang kann sich mehrere Male wiederholen, bis man die gewünschten Wirkungskurven aufgenommen hat.
Eine bevorzugte Möglichkeit der Zuführung von Wirkstofflösung läßt sich mit der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform realisieren. Das dort gezeigte Beispiel weist nur einen Meßpunkt 3 auf. Bei entsprechender lateraler Anordnung können jedoch auch mehrere Meßpunkte 3 mit entsprechenden Wirkstofflösungen versorgt werden. Wiederum befindet sich ein nicht dargestellter Lösungsmitteltropfen 7 mit einer Zelle 5 auf dem Meßpunkt 3. Auf dem Oberflächenbereich 13 befindet sich eine Wirkstofflösung. Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes an den Interdigitaltransducer 17 bewirkt eine Oberflächenschallwelle senkrecht zu der Ausdehnung der Fingerelektroden. Diese Oberflächenschallwelle trifft auf die Flüssigkeit, die sich auf der Fläche 13 befindet. Impuls wird auf die Flüssigkeit übertragen, so daß die Flüssigkeit oder ein Teil davon entlang der benetzungsfreundlichen Bahn 21 in Richtung des Meßpunktes 3 bewegt wird. Durch die Einwirkung des Wirkstoffes auf die Zelle ändern sich ggf. die elektrischen Transporteigenschaften der Zellmembran, was wiederum durch Anlegen einer Spannung zwischen der Elektrode 11 und der Elektrode in der Patch-Pipette, die mit der Zelle 5 in Kontakt ist, und Messung des Stromes nachgewiesen werden kann. Nach Durchführung der gewünschten Messungen kann die Wirkstofflösung von dem Meßpunkt 3 mit einer Spüllösung ganz oder teilweise wieder entfernt werden. Ein Spüllösungstropfen befindet sich dazu auf dem Oberflächenbereich 15 und wird durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten. Anregen einer Oberflächenschallwelle durch Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes an den Interdigitaltransducer 19 bewirkt ebenso, wie oben für die Wirkstofflösung auf dem Oberflächenbereich 13 beschrieben, eine Bewegung von Spülflüssigkeit entlang der Bahn 22 in Richtung des Meßpunktes. Gegebenenfalls kann nach Entfernung einer Wirkstofflösung eine andere Wirkstofflösung auf die beschriebene Art und Weise aus einem weiteren (in Fig. 3 nicht dargestellten) Wirkstofflösungsreservoir zugeführt werden und wiederum die Wirkung auf die Zelle untersucht werden. So können mehrere Messungen sukzessiv auf einfache Art und Weise mit nur wenig Material durchgeführt werden.
Bei geeigneter Wahl der Spülflüssigkeit kann dies auch zur Reinigung des Meßpunktes eingesetzt werden. Bei entsprechender Wahl der Spüllösung wird die Zelle 5 nach einer Messung und/oder der Wechselwirkung mit einer Wirkstofflösung wieder in ihren vorherigen Zustand versetzt, um für weitere Messungen zur Verfügung zu stehen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nur sehr geringe Flüssigkeitsmengen sowohl der Zellösung als auch der Wirkstofflösung(en) notwendig. Typische Volumina können deutlich kleiner als 10 µl sein. Zum anderen findet der gesamte Transport von Wirkstoff und/oder der Spülflüssigkeit in der Chipebene statt, d. h. es sind keine weiteren Pipetten oder Dispenser erforderlich, um Wirkstoff oder Spülflüssigkeit zuzugeben. Die Positionierung der Zellen auf der Festkörperoberfläche kann ohne jede Sichtkontrolle erfolgen, da sich die Zellen aufgrund der Benetzungsmodulation der Meßpunkte 3 im Vergleich zur umgebenden Festkörperoberfläche an definierten Orten befinden, wo sie auch durch die Oberflächenspannung gehalten werden. Ebenso kann der Kontakt der Patch-Pipette mit den Zellen ohne Sichtkontrolle erfolgen, da die Zellen an den Meßpunkten lokalisiert sind.
Nicht gezeigt ist eine einfache Möglichkeit zur Separierung von Zellösungsflüssigkeitsmengen mit einer oder nur wenigen Zellen. Ein Zellösungsreservoir ähnlich den Reservoirbereichen 13 bzw. 15 für die Wirkstofflösung bzw. die Spülflüssigkeit ist über eine benetzungsfreundliche Bahn mit dem Meßpunkt 3 verbunden, ähnlich den benetzungsfreundlichen Bahnen 21 bzw. 22. In dieser benetzungsfreundlichen Bahn befindet sich eine Engstelle, die nur von einer oder einigen wenigen Zellen passiert werden kann. Wird z. B. durch Einwirkung des Impulses einer Oberflächenschallwelle ein Zellösungstropfen entlang einer solchen verengten Bahn über diese Engstelle getrieben, so werden die Zellen vereinzelt, bevor sie auf den entsprechenden Meßpunkt 3 gelangen.

Claims

1. Zellanalyseverfahren, bei dem
einzelne Zellen (5) bzw. eine geringe Anzahl von Zellen (5) in einem Zellösungstropfen (7) an einem definierten Meßpunkt (3) auf der Oberfläche eines Substrates (1), vorzugsweise eines Festkörpers, deponiert werden, wobei der Meßpunkt (3) derart funktionalisiert ist, daß sich ein Zellösungstropfen (7) bevorzugt darauf aufhält, und am Meßpunkt (3) ein erster elektrischer Kontakt (11) vorhanden ist,
eine Patch-Pipette (9) mit einem zweiten elektrischen Kontakt derart in Richtung der Oberfläche bewegt wird, daß eine Zelle (5) aus dem auf dem Meßpunkt (3) befindlichen Zellösungstropfen (7) von der Patch-Pipette (9) gehalten wird und durch den zweiten elektrischen Kontakt der Patch- Pipette elektrisch kontaktiert wird, und
elektrische Eigenschaften zwischen dem ersten und dem zweiten elektrischen Kontakt gemessen werden.

2. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 1, bei dem zum Halten der Zelle (5) an die Patch-Pipette (9) Unterdruck angelegt wird.

3. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 1, bei dem der Zellösungstropfen (7) derart klein gewählt wird, daß die Bewegung der Zelle (5) bzw. der wenigen Zellen in dem Zellösungstropfen (7) so begrenzt ist, daß die Zelle (5) der Patch-Pipette (9) nicht ausweichen kann und gehalten wird.

4. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Zellösungstropfen (7) auf einen Meßpunkt (3) gebracht wird, der derartige Benetzungseigenschaften aufweist, daß er von der Zellösungsflüssigkeit bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates (1).

5. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem während oder nach der Messung von elektrischen Eigenschaften eine Wirkstofflösung zu dem Meßpunkt (3) transportiert wird, um die Änderung der elektrischen Eigenschaften durch die Einwirkung der Wirkstofflösung auf die Zelle (5) festzustellen.

6. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 5, bei dem die Wirkstofflösung mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle in Richtung des Meßpunktes (3) bewegt wird.

7. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, bei dem die Wirkstofflösung von einem Wirkstofflösungsreservoir (13) abgezogen wird.

8. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 7, bei dem die Wirkstofflösung von einem Wirkstofflösungsreservoir abgezogen wird, das durch einen Oberflächenbereich (13) definiert ist, der derartige Benetzungseigenschaften aufweist, daß er von der Wirkstofflösung bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates (1).

9. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, bei dem die Wirkstofflösung entlang einer Bahn (21) auf der Oberfläche des Substrates (1) bewegt wird, die von der Wirkstofflösung bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates (1).

10. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, bei dem die Wirkstofflösung nach der Messung von dem Meßpunkt (3) mit Hilfe einer Spülflüssigkeit zumindest teilweise entfernt wird.

11. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 10, bei dem die Spülflüssigkeit mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle zu dem Meßpunkt (3) bewegt wird.

12. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, bei dem die Spülflüssigkeit von einem Spülflüssigkeitsreservoir (15) abgezogen wird.

13. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 12, bei dem die Spülflüssigkeit von einem Spülflüssigkeitsreservoir abgezogen wird, das durch einen Oberflächenbereich (15) definiert ist, der derartige Benetzungseigenschaften aufweist, daß er von der Spülflüssigkeit bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates (1).

14. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, bei dem die Spülflüssigkeit entlang einer Bahn (22) auf der Oberfläche des Substrates (1) bewegt wird, die von der Spülflüssigkeit bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates (1).

15. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem Zellösung entlang einer Bahn auf der Oberfläche des Substrates (1) zu einem Meßpunkt (3) bewegt wird, die von der Zellösung bevorzugter benetzt wird als die umgebende Oberfläche des Substrates (1).

16. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 15, bei dem Zellösung entlang einer bevorzugt benetzten Bahn mit einem lateral derart verengten Bereich geführt wird, daß ihn zu einem Zeitpunkt nur eine Zelle (5) passieren kann, um die Zellen zu vereinzeln und dann dem Meßpunkt (3) zuzuführen.

17. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem der Zellösungstropfen (7) mit Hilfe des Impulsübertrages von Oberflächenschallwellen auf der Oberfläche des Substrates (1) bewegt wird.

18. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 6, 11 oder 17, bei dem die Oberflächenschallwellen mit Hilfe eines oder mehrerer Interdigitaltransducer (17, 19) erzeugt werden.

19. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem mehrere Analysen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 parallel auf mehreren Meßpunkten (3) durchgeführt werden, die in regelmäßiger Anordnung vorgesehen sind.

20. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 19, bei dem mehrere Patch-Pipetten (9) eingesetzt werden, die in einer Anordnung vorgesehen sind, daß mehrere Zellen (5) auf mehreren Meßpunkten (3) simultan mit jeweils einer Patch- Pipette (9) in Kontakt gebracht werden können.

21. Zellanalyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, das in einer Klimakammer durchgeführt wird.

22. Zellanalysevorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21.