DE102011013326A1 - New fibrinolysis inhibitors and their medical use - Google Patents
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Abstract
Fibrinolyse-Inhibitoren und deren medizinische Verwendung zur antifibrinolytischen Therapie und Prophylaxe. Bekannte Fibrinolyse-Inhibitoren werden bei chirurgischen Eingriffen, die größere intraoperative oder perioperative Blutverluste zur Folge haben, oder bei Eingriffen mit extrakorporaler Zirkulation angewendet, um das Ausmaß der Blutverluste zu verringern. Nachteilig ist das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen. Um derartige Nachteile zu vermeiden, werden für die antifibrinolytische Therapie und Prophylaxe Proteine verwendet, die Aminosäuresequenzen aufweisen, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus SEQ ID NO: 1 (dBPS1 = duck Basic Protein Small 1), SEQ ID NO: 2 (dBPS2), SEQ ID NO: 3 (Meleagrin), SEQ ID NO: 4 (similar to meleagrin) besteht.Fibrinolysis inhibitors and their medical use for antifibrinolytic therapy and prophylaxis. Known fibrinolysis inhibitors are used in surgical procedures that result in greater intraoperative or perioperative blood loss or in procedures with extracorporeal circulation to reduce the extent of the blood loss. The disadvantage is the occurrence of undesirable side effects. To avoid such disadvantages, proteins are used for the antifibrinolytic therapy and prophylaxis which have amino acid sequences which are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 (dBPS1 = duck Basic Protein Small 1), SEQ ID NO: 2 ( dBPS2), SEQ ID NO: 3 (Meleagrin), SEQ ID NO: 4 (similar to meleagrin).
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Blutstillung und insbesondere neue Fibrinolyse-Inhibitoren (Antifibrinolytica), die zur therapeutischen oder prophylaktischen, antifibrinolytischen Behandlung verwendet werden können. Die Erfindung betrifft die therapeutische, auch prophylaktische, Verwendung der genannten Fibrinolyse-Inhibitoren sowie medizinische Behandlungsverfahren, bei denen die genannten Inhibitoren zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken an einen menschlichen oder tierischen Organismus verabreicht werden. Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der neuen Fibrinolyse-Inhibitoren auf dem Gebiet der Labormedizin.The present invention relates generally to the field of hemostasis, and more particularly to novel fibrinolysis inhibitors (antifibrinolytics) which may be used for therapeutic or prophylactic antifibrinolytic treatment. The invention relates to the therapeutic, even prophylactic, use of said fibrinolysis inhibitors and medical treatment methods in which said inhibitors are administered for therapeutic or prophylactic purposes to a human or animal organism. The invention further includes the use of the novel fibrinolysis inhibitors in the field of laboratory medicine.
Fibrin wird bei dem nach Gefäßverletzungen stattfindenden Prozess der Blutstillung während der sogenannten Fibrinbildungsphase gebildet. Durch die nachfolgende Polymerisation wird ein die Wunde verschließendes Gerinnsel (Thrombus) gebildet. Fibrin entsteht aus löslichem Fibrinogen unter Einwirkung des Enzyms Thrombin, nachdem dieses aktiviert wurde.Fibrin is formed in the post-vascular injury process of hemostasis during the so-called fibrin formation phase. The subsequent polymerization forms a wound-closing clot (thrombus). Fibrin is produced from soluble fibrinogen under the action of the enzyme thrombin, after it has been activated.
Während der Wundheilungsphase wird durch das fibrinolytische System bewirkt, dass Fibrin wieder aufgelöst wird, sobald es für die Wundheilung nicht mehr benötigt wird. Bei der Fibrinolyse wird das unlösliche Fibrin durch enzymatisch gesteuerte, proteolytische Reaktionen in lösliche Fibrinspaltprodukte überführt. Der zentrale Schritt hierbei ist die Aktivierung von Plasminogen zu dem proteolytischen Enzym Plasmin, welches die Spaltung von Fibrin bewirkt.During the wound healing phase, the fibrinolytic system causes fibrin to re-dissolve as soon as it is no longer needed for wound healing. In fibrinolysis, the insoluble fibrin is converted by enzymatically controlled, proteolytic reactions into soluble fibrin cleavage products. The central step here is the activation of plasminogen to the proteolytic enzyme plasmin, which causes the cleavage of fibrin.
Bei chirurgischen Eingriffen, die größere intraoperative oder perioperative Blutverluste zur Folge haben, oder bei Eingriffen mit extrakorporaler Zirkulation (mittels Herz-Lungen-Maschine) werden Antifibrinolytika angewendet, um das Ausmaß der Blutverluste zu verringern. Infolgedessen wird eine geringere Anzahl von Blutkonserven (Spenderblut) benötigt, als dies ohne Verabreichung von Antifibrinolytika der Fall wäre.For surgical procedures that result in greater intraoperative or perioperative blood loss or extracorporeal circulation (via the heart-lung machine), antifibrinolytics are used to reduce the level of blood loss. As a result, a lower number of blood donations (donor blood) is needed than would be the case without administration of antifibrinolytic agents.
Zu den genannten chirurgischen Eingriffen, bei denen Antifibrinolytika zur Verminderung von Blutverlusten eingesetzt werden, gehören insbesondere kardiochirurgische Eingriffe wie z. B. Bypass-Operationen, Herklappenchirurgie oder Herztransplantationen, oder chirurgische Eingriffe an der Leber.The aforementioned surgical procedures, in which antifibrinolytic agents are used to reduce blood loss, include in particular cardiac surgery such. As bypass surgery, Herklappen surgery or heart transplants, or surgery on the liver.
Des weiteren werden Antifibrinolytika bei lokaler oder generalisierter Fibrinolyse angewendet, beispielsweise bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde.Furthermore, antifibrinolytic agents are used in local or generalized fibrinolysis, for example, local bleeding in gynecology and obstetrics or in dentistry.
Der Protease-Inhibitor Aprotinin (Trasylol®; BAYER AG) wurde als Antifibrinolytikum z. B. bei Operationen am offenen Herzen oder in der Leberchirurgie verabreicht, um den Blutverlust und somit den Bedarf an Bluttransfusionen zu minimieren. Die antifibrinolytische Wirkung des Aprotinins beruht auf der Hemmung der Aktivierung von Plasminogen zum aktiven Plasmin.The protease inhibitor aprotinin (Trasylol ®, Bayer AG) was used as antifibrinolytic z. In open heart surgery or liver surgery to minimize blood loss and thus the need for blood transfusions. The antifibrinolytic action of aprotinin is due to the inhibition of the activation of plasminogen to the active plasmin.
Aufgrund von Hinweisen auf unerwünschte Nebenwirkungen (v. a. renale Komplikationen, cerebrovaskuläre Ereignisse) bzw. eine erhöhte Sterblichkeit wurde Aprotinin (Trasylol®) weltweit vom Markt genommen. Die Anwendung von Aprotinin ist nur noch unter strengen Voraussetzungen in Ausnahmefällen zulässig.Due to indications of unwanted side effects (especially renal complications, cerebrovascular events) or increased mortality, aprotinin (Trasylol ® ) was withdrawn from the market worldwide. The use of aprotinin is only permitted under strict conditions in exceptional cases.
Einige der unerwünschten Nebenwirkungen, wie z. B. das Risiko eines Nierenversagens, sind vermutlich darauf zurückzuführen, dass Aprotinin eine breite Substratspezifität aufweist und deshalb nicht nur antifibrinolytisch, sondern auch antithrombolytisch und antikoagulatorisch wirkt (durch Hemmung von Streptokinase, t-PA und Urokinase).Some of the unwanted side effects, such as As the risk of renal failure, are probably due to the fact that aprotinin has a broad substrate specificity and therefore not only antifibrinolytic, but also antithrombolytic and anticoagulatory acts (by inhibiting streptokinase, t-PA and urokinase).
Als Antifibrinolytika, die anstelle von Aprotinin verwendet werden können, sind die synthetischen ω-Aminocarbonsäuren Tranexamsäure (TA), ε-Aminocapronsäure (EACA) und p-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA) zu nennen. Diese Inhibitoren sind gegenüber Aprotinin vorteilhaft, da sie spezifisch die Fibrinolyse hemmen, ohne andere proteolytische Prozesse zu beeinflussen. Allerdings kann es nach Verabreichung von TA zu Sehstörungen (z. B. Visusverlust, Störung des Farbsinnes) kommen.Antifibrinolytic agents that can be used instead of aprotinin include the synthetic ω-aminocarboxylic acids tranexamic acid (TA), ε-aminocaproic acid (EACA) and p-aminomethylbenzoic acid (PAMBA). These inhibitors are advantageous over aprotinin because they specifically inhibit fibrinolysis without affecting other proteolytic processes. However, there may be some visual disturbances (eg loss of vision, color sensation) after administration of TA.
Ob die oben erwähnten Antifibrinolytika aus der Klasse der synthetischen ω-Aminocarbonsäuren dieselbe Wirksamkeit hinsichtlich der Verminderung von Blutverlusten bei chirurgischen Eingriffen, insbesondere bei Eingriffen mit extrakorporaler Zirkulation, erreichen wie Aprotinin, ist zu bezweifeln. Wie oben erwähnt, ist die Anwendung von Aprotinin unter strengen Voraussetzungen in Ausnahmefällen immer noch zulässig. Das Medikament steht in einigen Ländern, einschließlich der USA, für bestimmte Patientengruppen bei begründetem medizinischem Bedarf noch immer zur Verfügung, was ein Indiz dafür ist, dass hochwirksame Fibrinolyse-Inhibitoren dringend benötigt werden.Whether the antifibrinolytic agents of the class of synthetic ω-aminocarboxylic acids mentioned above achieve the same efficacy in reducing blood loss in surgical procedures, especially in surgeries with extracorporeal circulation, as aprotinin is to be doubted. As mentioned above, the use of aprotinin under strict conditions is still permissible in exceptional cases. The drug is still available in certain countries, including the United States, for certain groups of patients with a justified medical need, indicating that highly potent fibrinolysis inhibitors are urgently needed.
Bei der Suche nach neuen, besser verträglichen Fibrinolyse-Inhibitoren wurden beispielsweise Varianten oder Analoge des Aprotinins in Betracht gezogen (z. B.
Der vorliegenden Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, neue Wirkstoffe mit antifibrinolytischer Wirkung zur therapeutischen Verwendung, insbesondere bei chirurgischen Eingriffen, bereitzustellen, wobei die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Antifibrinolytika vermieden oder verringert werden. Des weiteren lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Methoden zur therapeutischen Behandlung bereitzustellen, mittels welcher die genannten Wirkstoffe zum Zwecke der antifibrinolytischen Behandlung, insbesondere zur Verminderung des Blutverlustes bei chirurgischen Eingriffen, an Menschen oder Tiere verabreicht werden.The present invention therefore an object of the invention to provide novel drugs with antifibrinolytic activity for therapeutic use, especially in surgical procedures, wherein the above-mentioned disadvantages of the known antifibrinolytic agents are avoided or reduced. A further object of the present invention is to provide methods of therapeutic treatment by means of which the active substances mentioned are administered to humans or animals for the purpose of antifibrinolytic treatment, in particular for the reduction of blood loss during surgical interventions.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Proteins oder einer Kombination aus mindestens zwei Proteinen, wie nachfolgend definiert, für die Verwendung zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur prophylaktischen antifibrinolytischen Behandlung, gelöst.The above object is achieved by providing a protein or a combination of at least two proteins, as defined below, for use in antifibrinolytic treatment or prophylactic antifibrinolytic treatment.
Ein erfindungsgemäßes Protein weist eine Aminosäuresequenz auf, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 (gemäß angefügtem Sequenzprotokoll) und Aminosäuresequenzen, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu einer der vorgenannten SEQ ID NOS: 1 bis 4 aufweisen, besteht. Die genannte Kombination umfaßt mindestens zwei Proteine, welche jeweils eine der vorstehend genannten Aminosäuresequenzen aufweisen.A protein of the invention has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 (according to the attached sequence listing) and amino acid sequences comprising a Sequence identity of at least 70% to one of the aforementioned SEQ ID NOS: 1 to 4, consists. Said combination comprises at least two proteins which each have one of the abovementioned amino acid sequences.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die oben genannten Proteine, einzeln oder in Kombination, antifibrinolytisch wirken (d. h. als Fibrinolyse-Inhibitoren), wobei keine antikoagulatorische Wirkung erzeugt wird oder eine solche allenfalls in sehr geringem Ausmaß zu beobachten ist. Aufgrund dieses Eigenschaften sind die oben genannten Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4, einzeln oder in Kombination, in vorteilhafter Weise für die Verwendung bei der antifibrinolytischen Therapie oder antifibrinolytischen Prophylaxe, insbesondere zur Verminderung des Blutverlustes bei chirurgischen Eingriffen, geeignet. Aufgrund des Fehlens einer antikoagulatorischen Wirkung ist das Risiko für das Auftreten von Nebenwirkungen vermindert.Surprisingly, it has been found that the above-mentioned proteins, individually or in combination, have antifibrinolytic activity (i.e., as fibrinolysis inhibitors), with no anticoagulant activity being produced, or at most being observed to a very limited extent. Because of these properties, the above-mentioned proteins having the amino acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, individually or in combination, are advantageously for use in antifibrinolytic therapy or antifibrinolytic prophylaxis, especially for reducing blood loss during surgical procedures. Due to the lack of anticoagulant activity, the risk of side effects is reduced.
Die gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Proteine (einschließlich ihrer Varianten) haben eine blutstillende Wirkung. Sie sind vorteilhaft, weil – anders als Aprotinin – keine Auswirkungen auf das Gerinnungssystem haben und frei von schwerwiegenden Nebenwirkungen sind, insbesondere keine nierenschädigende Wirkung haben. Des weiteren sind auch keine immunologischen Nebenwirkungen bekannt.The proteins used in the present invention (including their variants) have a hemostatic effect. They are advantageous because - unlike aprotinin - have no effects on the coagulation system and are free from serious side effects, in particular have no kidney-damaging effect. Furthermore, no immunological side effects are known.
Ohne sich damit in irgendeiner Weise festlegen zu wollen, wird derzeit vermutet, dass die antifibrinolytische Wirkung der oben genannten, erfindungsgemäß verwendeten Proteine auf eine spezifische oder selektive Hemmung der Plasminbildung zurückzuführen ist. Dies steht auch im Einklang mit der Beobachtung, dass die erfindungsgemäßen Proteine keine antikoagulatorische Wirkung ausüben.Without wishing to be bound by any means, it is presently believed that the antifibrinolytic activity of the above-mentioned proteins used in the invention is due to a specific or selective inhibition of plasmin formation. This is also in accordance with the observation that the proteins according to the invention do not exert an anticoagulant effect.
Die oben genannten Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 sind im Stand der Technik bekannt, wie im Sequenzprotokoll vermerkt.The above-mentioned proteins having the amino acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 are known in the art as noted in the Sequence Listing.
Die Isolierung, Sequenzierung und biochemische Charakterisierung der Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 wurde von NAKNUKOOL et al. beschrieben (
Die von
Die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 sind wie folgt:
SEQ ID NO: 1 (= dBPS1)
QKKGFCAGYC SYSCAKTDEW TFHQTCGKMY CCIPPPKKG (39 aa)
SEQ ID NO: 2 (= dBPS2)
QVRKYCPKVG YCSSKCSKAD VWSLSSDCKF YCCLPPGWK (39 aa)The amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are as follows:
SEQ ID NO: 1 (= dBPS1)
QKKGFCAGYC SYSCAKTDEW TFHQTCGKMY CCIPPPKKG (39 aa)
SEQ ID NO: 2 (= dBPS2)
QVRKYCPKVG YCSSKCSKAD VWSLSSDCKF YCCLPPGWK (39 aa)
Die biologische Funktion der Proteine dBPS1 und dBPS2 war bisher unbekannt. Die oben erwähnte Publikation von NAKNUKOOL et al. enthält keinerlei Hinweise bezüglich möglicher Funktionen von dBPS1 und dBPS2. The biological function of the proteins dBPS1 and dBPS2 was previously unknown. The above-mentioned publication by NAKNUKOOL et al. contains no indication of possible functions of dBPS1 and dBPS2.
Die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 entsprechen den im Stand der Technik bekannten Proteinen Meleagrin und ”Similar to meleagrin” (Accession-No. P21376 (Swiss-Prot), XP_429908 (NCBI)). Diese Proteine weisen eine Sequenzähnlichkeit zu dBPS1 und dBPS2 auf (
SEQ ID NO: 3 (Meleagrin)
QVLKYCPKIG YCSSKCSKAE VWAYSPDCKV HCCVPANQKW (40 aa)
SEQ ID NO: 4 (”similar to meleagrin”)
VLKYCPKIGY CSNTCSKTQI WATSHGCKMY CCLPASWKWK (40 aa)The amino acid sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 correspond to the proteins known in the art Meleagrin and "Similar to meleagrin" (Accession No. P21376 (Swiss-Prot), XP_429908 (NCBI)). These proteins have sequence similarity to dBPS1 and dBPS2 (
SEQ ID NO: 3 (meleagrin)
QVLKYCPKIG YCSSKCSKAE VWAYSPDCKV HCCVPANQKW (40 aa)
SEQ ID NO: 4 ("similar to meleagrin")
VLKYCPKIGY CSNTCSKTQI WATSHGCKMY CCLPASWKWK (40 aa)
Anmerkung: Die oben gezeigte Sequenz ist eine Teilsequenz der Sequenz ”similar to meleagrin” (Accession-Nr. XP_429908; Gesamtlänge 63 aa), wobei die Aminosäuren 1–40 den Aminosäuren 24–63 der Gesamtsequenz von ”similar to meleagrin” entsprechen.Note: The sequence shown above is a partial sequence of the sequence "similar to meleagrin" (accession number XP_429908, total length 63 aa), with amino acids 1-40 corresponding to amino acids 24-63 of the overall sequence of "similar to meleagrin".
Die genannten Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 weisen untereinander eine hohe Sequenzähnlichkeit auf. Ferner zeichnen sie sich durch das Vorhandensein von 6 Cysteinresten aus, welche die Ausbildung von drei intramolekularen Disulfidbrücken ermöglichen, wodurch eine sehr kompakte und stabile Proteinfaltung zustande kommt (vgl.
Gemäß vorliegender Erfindung wird entweder ein einziges Protein, das eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 aufweist, für den genannten therapeutischen Zweck verwendet, oder es wird eine Kombination aus mindestens zwei Proteinen, von welchen ein jedes eine der genannten Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 aufweist, verwendet.According to the present invention, either a single protein having one of the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 is used for said therapeutic purpose, or a combination of at least two proteins, each of which is one of Sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 has been used.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Proteine beschränkt, deren Sequenz mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 identisch ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass einige oder mehrere Aminosäuren in einer Polypeptidsequenz durch andere Aminosäuren ersetzt (oder hinzugefügt oder weggelassen) oder chemisch modifiziert werden können, ohne dass dadurch die biologische Funktion des Proteins beeinträchtigt wird. Deshalb umfaßt die vorliegende Erfindung ferner auch funktionelle Varianten (wie z. B. Derivate, allele Varianten, Fragmente, Homologe, Analoge, Fusionsproteine), die eine zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ähnliche Aminosäuresequenz haben und die erwähnte antifibrinolytische Wirkung aufweisen. Es ist zu erwarten, dass derartige Varianten (Homologe) beispielsweise aus dem Eiweiß von Eiern weiterer Vogelarten isoliert werden können.The present invention is not limited to those proteins whose sequence is identical to one of the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. It will be appreciated by those skilled in the art that some or more amino acids in a polypeptide sequence may be replaced (or added or deleted) with other amino acids or chemically modified without affecting the biological function of the protein. Therefore, the present invention also includes functional variants (such as derivatives, allelic variants, fragments, homologues, analogs, fusion proteins) which have a sequence to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 have similar amino acid sequence and have the mentioned antifibrinolytic activity. It is to be expected that such variants (homologs) can be isolated, for example, from the egg whites of eggs of other bird species.
Bevorzugte Varianten sind solche, die sich gegenüber SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Als konservative Substitution wird der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure, die ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist, verstanden. Derartige konservative Substitutionen sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der substituierten, inserierten oder deletierten Aminosäuren weniger als 15, insbesondere weniger als 10, besonders bevorzugt weniger als 5.Preferred variants are those which differ from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 by conservative amino acid substitutions. Conservative substitution is understood to mean the replacement of one amino acid with another amino acid having similar physicochemical properties. Such conservative substitutions are known to those skilled in the art. Preferably, the number of substituted, inserted or deleted amino acids is less than 15, in particular less than 10, particularly preferably less than 5.
Ferner ist für den Fachmann plausibel, dass auch Sequenzen, welche weniger als die vollständige Länge der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 aufweisen, die erwähnte antifibrinolytische Aktivität aufweisen können. Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung auch Proteine, welche eine aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 ausgewählte Sequenz enthalten, wobei diese Sequenz N-terminal oder/und C-terminal durch weitere Aminosäurereste verlängert ist.Furthermore, it is plausible to those skilled in the art that sequences which have less than the full length of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, may have the mentioned antifibrinolytic activity , Furthermore, the present invention also encompasses proteins which contain a sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, this sequence being N-terminal or / and C terminal is extended by further amino acid residues.
Insbesondere erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf funktionelle Varianten (wie Homologe oder allele Varianten), die Aminosäuresequenzen aufweisen, welche eine Ähnlichkeit zu einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 aufweisen, wobei die Sequenzidentität mindestens 70% beträgt, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%.In particular, the present invention extends to functional variants (such as homologues or allelic variants) having amino acid sequences which are similar to one of the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, wherein the sequence identity is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95%.
Die Bestimmung der Sequenzidentität oder -ähnlichkeit (in ”% Identität”) zweier Proteine kann mittels bekannter algorithmischer Verfahren wie z. B. unter Verwendung von Programmen wie ”FASTA”
- 1
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Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63–99 (1990)
- 2
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Smith und Waterman, J. Mol. Biol. 147, 195–197 (1981)
- 3
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Altschul S F et al., J. Mol. Biol. 215, 301–410 (1990), Nucleic Acids Res. 25, 389–3402 (1997)
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Pearson WR, Methods in Enzymology, 183, 63-99 (1990)
- 2
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Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147, 195-197 (1981)
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Old School SF et al., J. Mol. Biol. 215, 301-410 (1990), Nucleic Acids Res. 25, 389-3402 (1997).
Im allgemeinen handelt es sich bei den vorstehend genannten Proteinen, welche für die erfindungsgemäßen therapeutischen Zwecke verwendet werden, um basische Proteine mit niedriger Molekülmasse (insbesondere weniger als 10 kDA), die mindestens zwei Disulfidbrücken aufweisen und eine antifibrinolytische Wirkung haben.In general, the above-mentioned proteins used for the therapeutic purposes of the present invention are low molecular weight (especially less than 10 kDa) basic proteins having at least two disulfide bridges and having an antifibrinolytic activity.
Vorzugsweise liegt die Molekülmasse der gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Proteine jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere im Bereich von 4 bis 6 kDa. Die Bestimmung der Molekülmasse kann auf dem Fachmann bekannte Weise z. B. mittels SDS-PAGE (in Gegenwart eines reduzierenden Agens) ermittelt werden. Im Zweifelsfall gilt der massenspektrometrisch ermittelte Wert.The molecular mass of the proteins used according to the present invention is preferably in the range from 4 to 10 kDa, in particular in the range from 4 to 6 kDa. The determination of the molecular weight can be carried out in a manner known to those skilled in the art, for. B. by SDS-PAGE (in the presence of a reducing agent) can be determined. In case of doubt, the value determined by mass spectrometry applies.
Der isoelektrische Punkt (pI) liegt oberhalb von 7,0, insbesondere oberhalb von 8,0, vorzugsweise oberhalb von 9,0.The isoelectric point (pI) is above 7.0, in particular above 8.0, preferably above 9.0.
Vorzugsweise enthalten die Primärsequenzen der erfindungsgemäß verwendeten Proteine mindestens 4, insbesondere 6 Cysteinreste, welche die Ausbildung von zwei, vorzugsweise von drei Cysteinbrücken ermöglichen.The primary sequences of the proteins used according to the invention preferably contain at least 4, in particular 6, cysteine residues, which allow the formation of two, preferably of three, cysteine bridges.
Für die vorliegende Erfindung kommen ferner auch solche funktionellen Varianten der oben definierten Proteine in Betracht, die durch Glykosylierung, Acylierung, Pegylierung, usw. modifiziert sind.Also contemplated by the present invention are those functional variants of the above-defined proteins modified by glycosylation, acylation, pegylation, etc.
Verfahren zur Ermittlung der antifibrinolytischen Wirkung durch Bestimmung der Hemmung der Plasminbildung (siehe Beispiel) sind dem Fachmann bekannt. Da die Aktivierung von Plasminogen zu dem proteolytischen (fibrinspaltenden) Enzym Plasmin den zentralen Schritt bei der Fibrinolyse darstellt, kann die Plasminbildung als Maß für die Fibrinolyse dienen.Methods for determining the antifibrinolytic activity by determining the inhibition of plasmin formation (see example) are known to the person skilled in the art. Since the activation of plasminogen to the proteolytic (fibrin-splitting) enzyme plasmin is the central step in fibrinolysis, plasmin formation can serve as a measure of fibrinolysis.
Hierbei kann allgemein so vorgegangen werden, wie im nachfolgenden Ausführungsbeispiel beschrieben: Die Plasminbildung wird in Gegenwart von t-PA (gewebsspezifischer Plasminogenaktivator) untersucht. Nach Zusatz eines geeigneten Substrates wird die enzymatische Aktivität des Plasmins in dem Versuchsansatz bestimmt und mit einem entsprechenden Kontrollansatz (ohne Zusatz eines Inhibitors) verglichen. Als ”antifibrinolytische Wirkung” wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine jede Verminderung der Plasmin-Aktivität, relativ zu einem entsprechenden Kontroll-Experiment ohne Zusatz des zu untersuchenden Proteins (Inhibitor), verstanden.In this case, it is generally possible to proceed as described in the following exemplary embodiment: Plasmin formation is investigated in the presence of t-PA (tissue-specific plasminogen activator). After addition of a suitable substrate, the enzymatic activity of the plasmid is determined in the experimental batch and compared with a corresponding control batch (without addition of an inhibitor). In the context of the present invention, "antifibrinolytic action" is understood to mean any reduction in plasmin activity relative to a corresponding control experiment without the addition of the protein to be investigated (inhibitor).
Die Messung der Plasmin-Aktivität kann beispielsweise mittels Thrombelastometrie oder Thrombelastographie erfolgen (Rotationsthromboelastometrie, ROTEM®). Bei diesen im Stand der Technik bekannten Standardmethoden werden die Gerinnungseigenschaften des Blutes durch viskoelastische Messungen untersucht. Dabei kann die Gerinnselfestigkeit (maximum clot firmness, MCF) sowie die nachfolgende Auflösung (Lyse) des Gerinnsels bestimmt werden. Der Lyse-Index (LI) gibt die Abnahme innerhalb von 60 Minuten nach Gerinnselbildung an; er ist somit ein Maß für die fibrinolytische Wirkung (Fibrinolyse).The measurement of plasmin activity may, for example, by means of thromboelastography or thrombelastometry (Rotationsthromboelastometrie, RED ®). In these standard methods known in the art, the coagulation properties of the blood are examined by viscoelastic measurements. The clot firmness (MCF) and the subsequent dissolution (lysis) of the clot can be determined. The lysis index (LI) indicates the decrease within 60 minutes after clot formation; it is thus a measure of the fibrinolytic effect (fibrinolysis).
Insbesondere liegt eine antifibrinolytische Wirkung im Sinne der vorliegenden Erfindung dann vor, wenn die zur Auflösung eines Gerinnsels benötigte Zeit (unter sonst gleichen Bedingungen) mindestens das 1,1-Fache, vorzugsweise das 1,5-Fache der ohne Inhibitorzusatz benötigten Zeit beträgt, oder wenn die nach einer definierten Dauer der Lyse (z. B. 60 min) verbleibende Masse eines Gerinnsels mindestens der 1,1-fachen Masse, vorzugsweise der 1,5-fachen Masse, eines Gerinnsels entspricht, welches ohne Inhibitorzusatz während des genannten Lyse-Zeitraums unter ansonsten gleichen Bedingungen erhalten wurde.In particular, an antifibrinolytic effect in the context of the present invention is present when the time required for the dissolution of a clot (under otherwise identical conditions) is at least 1.1 times, preferably 1.5 times the time required without addition of inhibitor, or if the mass of a clot remaining after a defined period of lysis (eg 60 min) corresponds to at least 1.1 times the mass, preferably 1.5 times the mass, of a clot which, without added inhibitor, is present during said lysis Period under otherwise identical conditions.
Erfindungsgemäß verwendbare Proteine, welche die Sequenzen SEQ ID NO: 1 (dBPS1), SEQ ID NO: 2 (dBPS2), SEQ ID NO: 3 (Meleagrin) oder SEQ ID NO: 4 (similar to meleagrin) aufweisen, oder entsprechende Varianten mit einer Sequenzidentität von mindestens 70%, können beispielsweise folgendermaßen erhalten werden:
- – durch Extraktion bzw. Isolierung aus einem natürlich vorkommenden biologischen Material, insbesondere aus dem Eiweiß von Vogeleiern (vorzugsweise Enteneier). Hierbei kann beispielsweise nach der von NAKNUKOOL beschriebenen Methode vorgegangen werden (
NAKNUKOOL et al., a. a. O., S. 2083, ”Protein Purification” HCl auf pH 6,0 eingestellt und der nach Zentrifugation verbleibende Überstand über eine SP-Sepharosesäule aufgetrennt. Fraktionen mit Molekülmassen von weniger als 9,4 kDa werden gesammelt, dialysiert (3500 MWCO) und anschließend über Sephacryl S-300 gereinigt. Die Reinheit des gereinigten Proteins kann mittels SDS-PAGE kontrolliert werden. - – mittels gentechnischer Methoden (durch operative Verknüpfung einer für SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 kodierenden Nucleotidsequenz mit einer Expressionskontrollsequenz eines geeigneten Expressionsvektors, Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtszellen mit dem rekombinanten Vektor, Expression des Proteins in den Wirtszellen, Gewinnung des exprimierten Proteins aus den Wirtszellen bzw. dem Kulturmedium).
- – mittels chemischer Synthese.
- - By extraction or isolation of a naturally occurring biological material, in particular from the protein of bird eggs (preferably duck eggs). This can be done, for example, according to the method described by NAKNUKOOL (
NAKNUKOOL et al., Supra, p. 2083, "Protein Purification" - By means of genetic engineering methods (by operative linking of a nucleotide sequence coding for SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 with an expression control sequence of a suitable Expression vector, transformation or transfection of suitable host cells with the recombinant vector, expression of the protein in the host cells, recovery of the expressed protein from the host cells or the culture medium).
- - by chemical synthesis.
Gemäß vorliegender Erfindung können die oben erwähnten Proteine sowohl einzeln als auch in Kombination verwendet werden.According to the present invention, the above-mentioned proteins can be used both individually and in combination.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von Proteinen verwendet, die ein erstes Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 aufweist, sowie ein zweites Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 2 aufweist, umfaßt. Vorzugsweise liegt die Molekülmasse des ersten Proteins und des zweiten Proteins jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa.According to a preferred embodiment, a combination of proteins comprising a first protein comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having a sequence identity of at least 70% to SEQ ID NO: 1 and a second protein comprising the Amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having a sequence identity of at least 70% to SEQ ID NO: 2 comprises. Preferably, the molecular weight of the first protein and the second protein are each in the range of 4 to 10 kDa, in particular 4 to 6 kDa.
Hinsichtlich der relativen Anteile der beiden Proteine in der Kombination wird bevorzugt, dass der Massenanteil des zweiten Proteins mindestens der 1,5-fachen, vorzugweise mindestens der doppelten, besonders bevorzugt mindestens der dreifachen Masse des ersten Proteins entspricht.With regard to the relative proportions of the two proteins in the combination, it is preferred that the mass fraction of the second protein corresponds to at least 1.5 times, preferably at least twice, more preferably at least three times the mass of the first protein.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Kombination von Proteinen
- – dBPS1 (SEQ ID NO: 1) als das genannte erste Protein und
- – dBPS2 (SEQ ID NO: 2) als das genannte zweite Protein.
- DBPS1 (SEQ ID NO: 1) as said first protein and
- DBPS2 (SEQ ID NO: 2) as said second protein.
Die beiden Proteine dBPS1 und DBPS2 können in gleichen oder annähernd gleichen Anteilen in der Kombination enthalten sein (d. h. im Mengenverhältnis 1:1). Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Massenanteil des zweiten Proteins (dBPS2) mindestens das 1,5-Fache, vorzugweise mindestens das Doppelte, besonders bevorzugt mindestens das Dreifache der Masse des ersten Proteins (dBPS1).The two proteins dBPS1 and DBPS2 can be present in equal or approximately equal proportions in the combination (that is, in the ratio 1: 1). According to a further preferred embodiment, the mass fraction of the second protein (dBPS2) is at least 1.5 times, preferably at least twice, more preferably at least three times the mass of the first protein (dBPS1).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die vorstehend genannten Kombinationen mindestens dBPS1 und dBPS2, wobei diese beiden Proteine aus dem Eiweiß von Enteneiern isoliert wurden.According to a further preferred embodiment, the abovementioned combinations contain at least dBPS1 and dBPS2, these two proteins being isolated from the protein of duck eggs.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner die Möglichkeit ein, dass statt isolierter oder gereinigter Proteine Extrakte oder Mischungen verwendet werden, welche die genannten Proteine, einzeln oder in Kombination, enthalten.The present invention further includes the possibility of using, instead of isolated or purified proteins, extracts or mixtures containing said proteins, alone or in combination.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung auch proteinhaltige, antifibrinolytisch wirksame Zusammensetzungen (z. B. Mischungen, Extrakte, partiell gereinigte Fraktionen), welche aus dem Eiweiß von Vogeleiern, vorzugweise von Enteneiern, stammende Bestandteile enthalten, wobei diese Bestandteile zumindest ein basisches Protein mit einer Molekülmasse von höchstens 15 kDa, insbesondere von höchstens 10 kDA umfassen,
für die Anwendung in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe, vorzugsweise zur Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, besonders bevorzugt bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen.Furthermore, the present invention also encompasses proteinaceous, antifibrinolytically active compositions (eg mixtures, extracts, partially purified fractions) which contain constituents derived from the egg whites of avian eggs, preferably from duck eggs, which constituents contain at least one basic protein with a Molecular mass of at most 15 kDa, in particular of at most 10 kDa,
for use in a method for antifibrinolytic treatment or for antifibrinolytic prophylaxis, preferably for the treatment or prophylaxis of a blood loss occurring during or as a result of surgery, particularly preferred in open heart surgery and / or when using heart-lung machines.
Die genannten proteinhaltigen, aus dem Eiweiß von Vogeleiern herstellbaren Zusammensetzungen weisen eine antifibrinolytische Wirkung auf, die mittels bekannter Methode – wie oben beschrieben – festgestellt werden kann. Die Herstellung bzw. Isolation kann beispielsweise nach der von NAKNUKOOL beschriebenen Methode erfolgen (
Vorzugsweise weist das in den proteinhaltigen Zusammensetzungen enthaltene basische Protein, oder zumindest eines der basischen Proteine, mindestens 4, insbesondere 6 Cysteinreste auf.Preferably, the basic protein contained in the proteinaceous compositions, or at least one of the basic proteins, has at least 4, in particular 6 cysteine residues.
Des weiteren ist der isoelektrische Punkt des/der in den proteinhaltigen Zusammensetzungen enthaltene(n) Proteins/Proteine jeweils größer als 7,0, vorzugsweise größer als 8,0, besonders bevorzugt größer als 9,0.Furthermore, the isoelectric point of the protein (s) contained in the proteinaceous compositions is in each case greater than 7.0, preferably greater than 8.0, particularly preferably greater than 9.0.
Die Molekülmasse des/der in den proteinhaltigen Zusammensetzungen enthaltene(n) basischen Proteins bzw. der basischen Proteine liegt vorzugsweise im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa.The molecular weight of the basic protein (s) contained in the proteinaceous compositions is preferably in the range of 4 to 10 kDa, especially 4 to 6 kDa.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die vorstehend beschriebene proteinhaltige Zusammensetzung zwei der genannten basischen Proteine in Kombination, wobei die Molekülmasse jeweils 4 bis 6 kDa beträgt.In a particularly preferred embodiment, the proteinaceous composition described above contains two of said basic proteins in combination, the molecular weight being 4 to 6 kDa each.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das basische Protein oder die basischen Proteine eine Aminosäuresequenz auf, wie weiter oben mit Bezugnahme auf SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 definiert.According to a further preferred embodiment, the basic protein or proteins have an amino acid sequence as defined above with reference to SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
Die vorstehend beschriebenen proteinhaltigen Zusammensetzungen, welche aus dem Eiweiß von Vogeleiern erhältlich sind, können auf dem Fachmann bekannte Weise als pharmazeutische Formulierungen (Medikamente) formuliert werden.The proteinaceous compositions described above, which are obtainable from the egg white of bird eggs, can be formulated as pharmaceutical formulations (medicaments) in a manner known to those skilled in the art.
Die Anwendung des/der oben definierten Proteins/Proteine, bzw. der genannten proteinhaltigen Zusammensetzung, in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe erfolgt im allgemeinen in der Weise, dass ein erfindungsgemäßes Protein oder eine Kombination von Proteinen (wie oben beschrieben), oder die genannte proteinhaltige Zusammensetzung, mittels einer geeigneten pharmazeutischen Darreichungsform, d. h. als pharmazeutische Zubereitung (= Arzneimittel, Medikament), an einen zu behandelnden menschlichen oder tierischen Organismus verabreicht wird. The use of the above-defined protein (s), or protein-containing composition, in a method for antifibrinolytic treatment or for antifibrinolytic prophylaxis is generally carried out in such a way that a protein according to the invention or a combination of proteins (as described above), or said protein-containing composition, by means of a suitable pharmaceutical dosage form, ie as a pharmaceutical preparation (= drug, medicament), is administered to a human or animal organism to be treated.
Hierfür geeignete Formulierungen, pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe, Träger, Vehikel usw. sind dem auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen sachkundigen Fachmann allgemein bekannt. Die Verabreichung kann insbesondere auf oralem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, subkutanem oder topischem Verabreichungsweg erfolgen.Suitable formulations, pharmaceutically acceptable excipients, carriers, vehicles, etc., are well known to those skilled in the art of pharmaceutical formulations. In particular, administration may be by oral, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or topical route of administration.
Besonders bevorzugt sind Formulierungen zur parenteralen (z. B. intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen) Verabreichung, wie z. B. Injektions- und Infusionslösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisate, Pulver). Als Vehikel für flüssige Formulierungen können z. B. Wasser, isotonische Lösungen, Kochsalzlösungen, Dextroselösungen, etc. verwendet werden. Falls erforderlich, können Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer usw. zugefügt werden.Particularly preferred are formulations for parenteral (eg, intravenous, intramuscular, intraperitoneal) administration, such as, for example, As injection and infusion solutions, suspensions, emulsions, lyophilisates, powder). As a vehicle for liquid formulations may, for. As water, isotonic solutions, saline solutions, dextrose solutions, etc. can be used. If necessary, stabilizers, preservatives, buffers, etc. may be added.
Demzufolge werden durch die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zubereitungen (d. h. Medikamente) bereitgestellt, welche ein erfindungsgemäßes Protein oder eine Kombination von Proteinen, wie oben definiert, enthalten. Eine solche pharmazeutische Zubereitung enthält eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, wie oben beschrieben, zusammen mit einem Träger oder Vehikel. Für pharmazeutische Zubereitungen geeignete Träger oder Vehikel sind dem Fachmann bekannt.Accordingly, the present invention provides pharmaceutical compositions (i.e., medicaments) containing a protein of the invention or a combination of proteins as defined above. Such a pharmaceutical preparation contains a therapeutically effective amount of a protein or a combination of proteins as described above together with a carrier or vehicle. Carriers or vehicles suitable for pharmaceutical preparations are known to the person skilled in the art.
Der Wirkstoffgehalt eines erfindungsgemäßen Medikaments liegt vorzugsweise im Bereich von 1–95 Gew.-%, insbesondere 5–70 Gew.-%. Abhängig von der jeweiligen Darreichungsform, der beabsichtigten Dosierung und dem speziellen Behandlungszweck kann der jeweils geeignete Wirkstoffgehalt auch außerhalb der angegebenen Prozentbereiche liegen. Der Begriff ”Wirkstoff” bezieht sich auf die oben definierten, erfindungsgemäßen Proteine und Kombinationen von Proteinen.The active ingredient content of a medicament according to the invention is preferably in the range of 1-95% by weight, in particular 5-70% by weight. Depending on the particular dosage form, the intended dosage and the specific treatment purpose, the respective suitable active ingredient content may also be outside the stated percentage ranges. The term "active ingredient" refers to the above-defined proteins of the invention and combinations of proteins.
Die oben definierten Proteine, sowie die solche Proteine enthaltenden Zubereitungen (Arzneimittel), sind gemäß vorliegender Erfindung für die Anwendung in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe vorgesehen.The above-defined proteins, as well as the preparations containing such proteins (medicaments) are provided according to the present invention for use in a method for antifibrinolytic treatment or for antifibrinolytic prophylaxis.
Besonders bevorzugt ist die Anwendung zur antifibrinolytischen Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, insbesondere bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen (z. B. Bypass-Operationen, Herklappenchirurgie oder Herztransplantationen, oder chirurgische Eingriffe an der Leber). In diesen Fällen kann durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Proteine (wie oben definiert) eine Reduzierung der intraoperativen Blutverluste bewirkt werden, so dass eine geringere Anzahl von Blutkonserven benötigt wird oder auf diese völlig verzichtet werden kann.Particularly preferred is the use for the antifibrinolytic treatment or prophylaxis of a blood loss occurring during or as a result of an operation, in particular in open heart surgery and / or in the use of cardiopulmonary bypass machines (eg bypass surgery, heart valve surgery or heart transplantation) surgical interventions on the liver). In these cases, by administering the proteins according to the invention (as defined above) a reduction of the intraoperative blood losses can be effected, so that a smaller number of blood preserves is needed or can be completely dispensed with.
Die Höhe der zu verabreichenden Dosis hängt u. a. vom Gerinnungsstatus des zu behandelnden Patient, Art und Dauer der Operation, Operationsverlauf usw. ab und ist in jedem Einzelfall nach fachmännischem Ermessen individuell zu ermitteln. Falls erforderlich, können zwei oder mehrere Dosen in zeitlicher Abfolge verabreicht werden.The amount of the dose to be administered depends u. a. the coagulation status of the patient to be treated, the type and duration of the operation, the course of the surgery, etc., and must be determined individually in each individual case according to professional judgment. If necessary, two or more doses may be administered in chronological order.
Als ”therapeutisch wirksame Menge” des/der zu verabreichenden Proteins/Proteine wird eine Menge verstanden, die zu einer günstigen Wirkung (beispielsweise bezüglich des intraoperativen Blutverlustes) führt. Diese Menge kann – in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren, wie Geschlecht, Alter, Körpergewicht des Patienten usw., erheblich variieren. Die Auswahl und ggf. Anpassung der jeweils geeigneten Dosis gehört zu den Fähigkeiten der Fachleute. Als Orientierungswert für eine ”wirksame Dosis” kann von einem Bereich von 0,0001 bis 100 mg/kg oder 0,01 bis 10 mg/kg (Körpergewicht) ausgegangen werden.As the "therapeutically effective amount" of the protein (s) to be administered is meant an amount that results in a beneficial effect (for example, on intraoperative blood loss). This amount can vary considerably depending on a variety of factors, such as gender, age, body weight of the patient, and so on. The selection and, if necessary, adaptation of the appropriate dose is one of the abilities of the experts. As an orientation value for an "effective dose" may be assumed to range from 0.0001 to 100 mg / kg or 0.01 to 10 mg / kg (body weight).
Neben der erwähnten Verwendung zur antifibrinolytischen Behandlung oder Prophylaxe bei Operationen, insbesondere bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen, können die erfindungsgemäßen antifibrinolytischen Proteine oder proteinhaltigen Zusammensetzungen bei verschiedenen weiteren Indikationen zur Anwendung kommen, wie z. B. bei lokaler oder generalisierter Fibrinolyse, insbesondere bei lokaler oder generalisierter Hyperfibrinolyse, beispielsweise bei schweren Traumata mit größeren Blutverlusten, bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde, sowie bei traumatisch-hämorrhagischen Schockzuständen. Die vorstehend beschriebenen anti-fibrinolytischen Proteine und proteinhaltigen Zusammensetzungen können gemäß vorliegender Erfindung ferner zur Prophylaxe oder Therapie einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie (DIC; auch 'Verbrauchskoagulopathie' genannt) verwendet werden.In addition to the mentioned use for antifibrinolytic treatment or prophylaxis in operations, especially in open heart surgery and / or in the use of cardiopulmonary machines, the antifibrinolytic proteins or proteinaceous compositions according to the invention may be used in various other indications, such. As in local or generalized fibrinolysis, especially in local or generalized hyperfibrinolysis, for example, in severe trauma with major blood loss, in local bleeding in gynecology and obstetrics or in dentistry, as well as in traumatic hemorrhagic shock states. The above-described anti-fibrinolytic proteins and proteinaceous compositions according to the present invention may further be used for the prophylaxis or therapy of a disseminated intravascular coagulopathy (DIC; also called 'consumption coagulopathy').
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren Verfahren zur Hemmung der Fibrinolyse, welche zumindest einen Schritt aufweisen, bei welchem einer Person oder einem Tier, die/das einer antifibrinolytischen Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie weiter oben definiert, verabreicht wird. The present invention further relates to methods of inhibiting fibrinolysis comprising at least one step of administering to a subject or an animal in need of an antifibrinolytic treatment a therapeutically effective amount of a protein or a combination of proteins or a proteinaceous composition , each as defined above, is administered.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes, die/der mit Blutungen oder Blutverlusten verbunden ist, und die eine blutstillende Behandlung erfordern. Ein solches erfindungsgemäßes Verfahren weist einen Schritt auf, in welchem einer Person oder einem Tier, die/das einer blutstillenden Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie oben beschrieben, verabreicht wird.The present invention further relates to methods for the treatment or prophylaxis of a disease or condition associated with bleeding or blood loss and which require hemostatic treatment. Such a method according to the invention comprises a step of administering to a person or animal in need of hemostatic treatment a therapeutically effective amount of a protein or a combination of proteins, or a proteinaceous composition, each as described above.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem genannten Krankheitszustand um einen Blutverlust, der während oder infolge eines chirurgischen Eingriffs auftritt, insbesondere bei kardiochirurgischen Eingriffen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen.In a preferred embodiment, said condition is a blood loss that occurs during or as a result of surgery, particularly in cardiac surgery and / or in the use of heart-lung machines.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie oben definiert, oder einer pharmazeutischen Zubereitung, welche ein solches Protein oder eine solche Kombination enthält,
zur Hemmung oder zum Herunterregulieren der Plasminbildung ohne Beeinträchtigung des Gerinnungssystems, insbesondere ohne Beeinträchtigung der Thrombinbildung.According to another embodiment, the present invention relates to the use of a protein or a combination of proteins, or a proteinaceous composition, each as defined above, or a pharmaceutical preparation containing such a protein or combination,
for inhibiting or down-regulating plasmin formation without affecting the coagulation system, in particular without impairing thrombin formation.
Diese Verwendung ist für die therapeutische Behandlung verschiedener Krankheiten oder Krankheitszustände von Bedeutung, die mit einer erhöhten oder unerwünschten Fibrinolyse einhergehen und bei denen eine Hemmung oder das Herunterregulieren der Plasminbildung ohne Beeinträchtigung des Gerinnungssystems notwendig ist.This use is of importance for the therapeutic treatment of various diseases or disease states associated with increased or undesired fibrinolysis and which require inhibition or down-regulation of plasmin formation without affecting the coagulation system.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich vor allem auf die therapeutische bzw. prophylaktische Behandlung von Menschen, d. h. im Bereich der Humanmedizin. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung auch in vorteilhafter Weise in der Veterinärmedizin angewendet werden, beispielsweise zur Behandlung von Nutztieren oder Heimtieren, zur Behandlung derselben (oder entsprechender) Krankheiten oder Krankheitszustände wie oben beschrieben.The present invention relates primarily to the therapeutic or prophylactic treatment of humans, d. H. in the field of human medicine. Moreover, the present invention may also be advantageously used in veterinary medicine, for example for the treatment of farm animals or pets, for the treatment of the same (or corresponding) diseases or conditions as described above.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie oben definiert, für labormedizinische Zwecke, insbesondere zur Hemmung der Fibrinolyse in labormedizinischen Testverfahren.According to a further embodiment, the present invention relates to the use of a protein or a combination of proteins, or a proteinaceous composition, each as defined above, for laboratory medical purposes, in particular for the inhibition of fibrinolysis in laboratory medical test methods.
BeispieleExamples
Die Erfindung wird anhand der nachfolgend beschriebenen Beispiele näher erläutert:
In den nachfolgend beschriebenen Experimenten wurde eine Lösung verwendet, welche die Proteine ”dBPS1” und ”dBPS2” im Verhältnis (w/w) von ca. 1:3 enthielt. Diese Lösung wird nachfolgend als ”dBPS” bezeichnet.The invention will be explained in more detail with reference to the examples described below:
In the experiments described below, a solution containing the proteins "dBPS1" and "dBPS2" in the ratio (w / w) of about 1: 3 was used. This solution is hereinafter referred to as "dBPS".
1) Hemmung der Plasminbildung1) Inhibition of plasmin formation
Aus gesunden, freiwilligen Probanden gewonnenes normales Plasma (NP) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen (bis zu x μg (ml)) der erfindungsgemäßen Proteinkombination ”dBPS” behandelt.Normal plasma (NP) obtained from healthy, volunteer subjects was treated with different concentrations (up to x μg (ml)) of the protein combination "dBPS" according to the invention.
Zur Untersuchung des fibrinolytischen Systems wurde die Plasminbildung gemessen, welche als ein geeignetes Maß für die Fibrinolyse dient. Plasmin bewirkt die Spaltung von Fibrin, wie eingangs erwähnt.To study the fibrinolytic system, plasmin formation was measured which serves as a suitable measure of fibrinolysis. Plasmin causes the cleavage of fibrin, as mentioned above.
Die Plasminbildung wurde in Gegenwart von t-PA (gewebsspezifischer Plasminogenaktivator; 200 U/ml) untersucht. Das Enzym t-PA bewirkt die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin, welches die Fibrinolyse katalysiert. Die enzymatische Aktivität des Plasmins wurde nach Zusatz eines geeigneten Substrates bestimmt.Plasmin formation was assayed in the presence of t-PA (tissue-specific plasminogen activator, 200 U / ml). The enzyme t-PA causes the conversion of plasminogen into plasmin, which catalyzes the fibrinolysis. The enzymatic activity of the plasmid was determined after addition of a suitable substrate.
2) Keine Beeinträchtigung der Thrombinbildung2) No impairment of thrombin formation
Zur Untersuchung des Blutgerinnungssystems wurde die Thrombinbildung gemessen, welche als ein geeignetes Maß für die Gerinnung dient. Thrombin bewirkt die Bildung von Fibrin aus löslichem Fibrinogen, wie eingangs erwähnt.To study the blood coagulation system, thrombin formation was measured which serves as a convenient measure of coagulation. Thrombin causes the formation of fibrin from soluble fibrinogen, as mentioned above.
Die Thrombinbildung wurde in der Weise durchgeführt, dass zu dem vorher mit Citrat versetzten NP Calcium im Überschuss zugesetzt wurde, in Gegenwart von Faktor III (= tissue factor; Konzentration: 5 pm), koagulationsfördernden Phospholipiden (4 μm) und einem für Thrombin geeigneten Substrat.
Anmerkung: Faktor III ist ein Gerinnungsfaktor, der die Bildung von Thrombin aus Prothrombin initiiert.Thrombin formation was carried out by adding calcium in excess to the previously citrated NP, in the presence of Factor III (= 5 μm), coagulant phospholipids (4 μm), and a substrate suitable for thrombin ,
Note: Factor III is a coagulation factor that initiates the formation of thrombin from prothrombin.
In weiteren Versuchen wurde bestätigt, dass Trasylol (Aprotinin) in dem oben unter (2) beschriebenen Testsystem antikoagulatorisch wirkt, wie bereits bekannt. Diese unerwünschte Wirkung ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass Aprotinin auf die unterschiedlichsten Proteasen hemmend wirkt und deshalb auch auf verschiedene an der Blutgerinnung beteiligte Proteasen hemmend wirkt.In further experiments it was confirmed that trasylol (aprotinin) in the test system described above under (2) anticoagulatory acts, as already known. This undesirable effect is presumably due to the fact that aprotinin has an inhibitory effect on a wide variety of proteases and therefore also inhibits various proteases involved in blood coagulation.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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