DE102007059166A1

DE102007059166A1 - Vorrichtung zur Messung von Transportsystemen

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Publication number: DE102007059166A1
Application number: DE102007059166A
Authority: DE
Original assignee: SYNENTEC GmbH
Current assignee: SYNENTEC GmbH
Priority date: 2007-12-06
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2009-06-10
Also published as: US20100274496A1; WO2009071065A2; JP2011519017A; WO2009071065A3; EP2257788A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur optischen Messung von Eigenschaften von Tansportsystemen in Membranen, insbesondere von Carrier- oder Kanalproteinen. Um die Eigenschaften von biologischen Transportmolekülen mit hohem Durchsatz messen zu können, wird vorgeschlagen, dass die Vorrichtung eine optische Messeinrichtung und eine Datenverarbeitungselektronik mit einer Prozesssteuerung und einer Datenerfassung aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur optischen Messung von Eigenschaften einzelner Transportsysteme in Membranen, insbesondere von Carrier-, Kanalproteinen oder anderen Systemen zum Transport von Substanzen durch biologische Membranen wie Sekretionsmechanismen.
Biologische Membranen trennen Zellen vom äußeren Medium und die einzelnen Zellkompartimente der Zellen voneinander ab. Transportsysteme wie Transportproteine und Kanäle steuern selektiv den Stoffdurchlass durch diese Membranen. Funktionsstörungen dieser Transporter und Kanäle sind für zahlreiche verbreitete Krankheiten verantwortlich. Unter den 100 am meisten verkauften Arzneimitteln in den USA im Jahre 2004 waren die Membrantransporter die am häufigsten vorkommende Gruppe. Insgesamt werden zurzeit mehr als 100 Transporter-Targets bei den Pharmafirmen erforscht, was zeigt, welche immense wirtschaftliche Bedeutung diese haben.
Für die Entwicklung solcher Wirkstoffe werden Messmethoden benötigt, mit denen Eigenschaften wie die Transportraten von spezifischen Substraten durch das Transporter-Target und der Einfluss von Wirkstoffkandidaten evaluiert werden können. Hierbei werden insbesondere Methoden benötigt, die einzelne Targetmoleküle sogar automatisiert im Hochdurchsatz charakterisieren können.
Für die Analyse von Transportraten von Ionen und geladenen Teilchen können elektrische Messungen eingesetzt werden. Dieses Verfahren findet bereits eine Anwendung im Hochdurchsatz in der biotechnologischen und pharmazeutischen Forschung. Es ist jedoch auf geladene Transportsubstrate beschränkt und wird daher in der Regel für die Gruppe der Ionenkanäle eingesetzt.
Zum Transport von ungeladenen Molekülen wie Aminosäuren, Peptiden, Zuckerverbindungen und Fettsäuren, aber auch biologischen Makromolekülen wie RNA, DNA und Proteinen ist ein Fluoreszenzanalyse-Verfahren geeignet, das als Fluoreszenzanalyse einzelner Transporter (nanoFAST) bezeichnet wird. Hierbei wird auf eine mit Messkammern strukturierte Oberfläche eines Trägers eine Lipidmembran oder biologische Membran oder Zellen aufgebracht, die die Transportsysteme enthält. Als Transportsysteme kommen beispielsweise Membranproteine in Frage, die Kanäle oder Carrier sein können. Zu dem Transportsystem wird dann ein Substrat gegeben bzw. von den Zellen produziert, welches mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist oder intrinsische Fluoreszenz bereitstellt. Der Transport über die Membran kann dann mittels Fluoreszenz optisch gemessen werden. Die optische Messung kann beispielsweise durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie oder durch TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) erfolgen. Bei der TIRF-Mikroskopie wird Anregungslicht unter einem totalreflektierenden Winkel eingestrahlt, so dass Fluoreszenzfarbstoffe selektiv innerhalb der räumlichen Ausdehnung eines evaneszenten Feldes angeregt werden.
Da keine geeigneten Geräte existieren, können diese Messungen bisher lediglich im Labormaßstab durchgeführt werden. Es besteht jedoch ein großer Bedarf, das Verfahren auch im industriellen Rahmen einzusetzen, beispielsweise in der biotechnologischen Forschung und Arzneimittelentwicklung.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung vorzuschlagen, durch die die Eigenschaften von biologischen Transportermolekülen mit hohem Durchsatz gemessen werden können.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Vorrichtung zur optischen Messung von Eigenschaften einzelner Transportsysteme in Membranen, insbesondere von Carrier- oder Kanalproteinen, vorgeschlagen wird, welche eine optische Messeinrichtung und eine Datenverarbeitungselektronik mit einer Prozesssteuerung und einer Datenerfassung und -auswertung aufweist. Durch die Prozesssteuerung werden die Funktionen des Mikroskops angesteuert und die Messung wird automatisch durchgeführt. Nach der prozessgesteuerten Erfassung der Messdaten erfolgt deren automatische Auswertung. Durch diese Automatisierung ist vorteilhafterweise ein hoher Probendurchsatz möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist als optische Messeinrichtung ein TIRF-Mikroskop vorgesehen. Durch die TIRF-Messung werden bevorzugt diejenigen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt, die vom jeweiligen Transportsystem über die Membran in eine Messkammer transportiert wurden. Dagegen werden Fluoreszenzfarbstoffe außerhalb der Messkammer nicht angeregt. Hierdurch ist eine genauere Messung möglich.
Eine weitere Steigerung des Probendurchsatzes wird dadurch möglich, dass ein durch die Prozesssteuerung ansteuerbarer Probenmanipulator vorgesehen ist. Dieser kann mehrere Aufgaben übernehmen, u. a. die Vorbereitung des Biochips für die Messung, die Beschickung des Biochips mit Proben und Substraten und die Zuführung in die Messapparatur.
Vom Anmelder wurde bereits eine Patentanmeldung eingereicht, die als Probenträger einen Biochip, welcher im Wesentlichen als transparenter Träger mit mehreren Messkammern ausgebildet ist, vorschlägt. Der Biochip erlaubt genauere und besser reproduzierbare Messungen. Vorteilhafterweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Vermessung derartiger Biochips eingerichtet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Biochips ist auf dessen Oberseite eine Goldschicht mit kleineren Öffnungen als die der darunter liegenden Messkammern vorgesehen, so dass die Messkammern durch die Goldschicht zum Teil abgedeckt werden. Bei der Vermessung derartiger Biochips ist es vorteilhaft, wenn die optische Messeinrichtung eine Strahlführung aufweist, die nahe am TIRF-Winkel ist, diesen aber noch nicht erreicht. Dadurch wird das Anregungslicht nicht total an der Unterseite der Messkammern reflektiert sondern ein Teil des Lichtes durchdringt den Träger und die Messkammern direkt und ein anderer Teil reflektiert zusätzlich an der Goldschicht, um wiederum auch die Messkammer zu durchdringen. Hierdurch ergibt sich eine stärkere Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe. Da das Anregungslicht nahe am TIRF-Winkel, also schräg in den transparenten Träger eingekoppelt wird, tritt es im Bereich der Öffnungen der Goldschicht mit einem Winkel in die Öffnungen ein, mit dem es diese nicht verlassen kann. Hierdurch ergibt sich ein günstigeres Signal/Rauschverhältnis das die darüber liegende Substanz nicht mit dem Anregungslicht bestrahlt wird.
Durch die beschriebenen Merkmale der Vorrichtung können Messzyklen prozessgesteuert und automatisiert durchgeführt werden, wobei jeweils ein Messzyklus im Wesentlichen die Vorbereitung des Biochips für die Messung, eine darauf folgende optische Vermessung und eine sich daran anschließende Auswertung der Messdaten umfasst.
Der Probenmanipulator führt zur Vorbereitung der Messung an dem Biochip nacheinander folgende Schritte aus: Zunächst wird der Biochip mit einer Pufferlösung äquilibriert. Durch die Äquilibrierung wird der Biochip auf eine gewünschte Temperatur erwärmt, bei der die Fluidität der Lipidmembran sichergestellt ist. Nur bei ausreichender Membranfluidität sind die Lipide homogen in der Membran verteilt. Danach erfolgt eine Zugabe von Proteo-Liposomen.
Die Vorrichtung weist eine Inkubierstation für die zu vermessenden Biochips auf. Hierdurch werden die Biochips und Proteo-Liposomen für einen einstellbaren Zeitraum bei einer bestimmten Temperatur gelagert, damit sich über den Messkammern eine das Transportsystem enthaltende Membran ausbilden kann.
Durch das anschließende Waschen mit der Pufferlösung werden überschüssige Lipide entfernt. Im Falle von biologischen Membranen oder Zellen reicht eine Zugabe und Inkubation, damit deren Membranen die Messkammern verschließen können.
Daraufhin wird ein Wirkstoffkandidat hinzugegeben. Anschließend wird das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte oder intrinsisch fluoreszente Transport-Substrat hinzugegeben, welches spezifisch mittels des Transportsystems durch die Membran gelangt. Außerdem wird noch ein spektral trennbares, fluoreszenzmarkiertes Kontroll-Substrat hinzugegeben, welches nicht durch die Membran oder das Transportsystem gelangen kann. Zuletzt erfolgt die Zuführung des Biochips in den Messbereich des Mikroskops.
Nach der Vorbereitung des Biochips wird prozessgesteuert eine zeitaufgelöste Fluoreszenzvermessung des Substrates in den Messkammern des Biochips ausgeführt und die dabei erfassten Messdaten verarbeitet. Die Messung kann auch multispektral bei verschiedenen Wellenlängen erfolgen.
Nach der Fluoreszenzvermessung wird von der Datenverarbeitungseinheit jeweils die zeitaufgelöste Fluoreszenzintensität für die einzelnen Messkammern mittels Mustererkennung bestimmt. Den so bestimmten Messdaten wird mittels eines Unterprogramms eine mathematische Kurve angepasst. Die mathematische Kurve ermöglicht eine Klassifizierung der Messkammern in drei Kategorien, und zwar in dichte Messkammern mit Fluoreszenz-Signal, dichte Messkammern ohne Fluoreszenz-Signal und offene Messkammern. Die automatische Unterscheidung wird anhand der Parameter der mathematischen Kurve getroffen. Messdaten von dichten Messkammern ohne Fluoreszenz-Signal und von offenen Messkammern werden verworfen. Für die nicht verworfenen Messdaten, also für dichte Messkammern mit einem Fluoreszenz-Signal, wird die Geschwindigkeitskonstante für den Transport berechnet.
Von der Datenverarbeitungseinheit wird dann vorzugsweise ein Histogramm erstellt, in dem alle berechneten Geschwindigkeitskonstanten für den Transport gegen deren Häufigkeit aufgetragen werden. Aus dem Histogramm wird den jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten für den Transport eine entsprechende Anzahl von Transportsystemen pro Messkammer zugeordnet. Durch die Zuordnung ist es möglich, alle Geschwindigkeitskonstanten für den Transport auf ein Transportsystem pro Messkammer zu normieren. Das Maximum des Histogramms für einen Transporter wird durch eine mathematische Funktion bestimmt und gibt mit hoher Genauigkeit die für das Transportsystem spezifische Geschwindigkeit wieder, mit der es das gemessene Transport-Substrat über die Membran transportiert. Ist die Geschwindigkeitskonstante für den Transport in Anwesenheit eines Wirkstoffkandidaten erniedrigt oder erhöht, dann hat der Wirkstoffkandidat das Transportsystem jeweils gehemmt oder beschleunigt und kommt beispielsweise als potentielles Arzneimittel in Frage.
Die Erfindung wird in einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme auf eine Zeichnung beispielhaft beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Einzelheiten den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.
Funktionsmäßig gleiche Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen.
Die Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:
1 eine schematische Darstellung der Messvorrichtung 1,
2 ein Ablaufdiagramm der wichtigsten Schritte einer Messung,
3 Messkurven der zeitabhängigen Fluoreszenz, und
4 ein Histogramm mit verschiedenen Geschwindigkeitskonstanten für den Transport.
1 zeigt eine schematische Darstellung der Messvorrichtung 1. Als optische Messeinrichtung dient ein TIRF-Mikroskop 2 (Total Internal Reflection Fluorescence), in der Figur auch als FM bezeichnet. Es kann aber auch ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop verwendet werden. Die Funktionen des TIRF-Mikroskops 2 werden automatisiert durch eine Prozesssteuerung 7 (PS) angesteuert. Das Mikroskop 2 ist für multispektrale Messungen eingerichtet. Dadurch ist es möglich, gleichzeitig ein Transport-Substrat und ein Kontroll-Substrat parallel zu messen. Durch die Messung des Kontroll-Substrats wird ermittelt, ob die Messkammern mit der darüber gespannten Membran dicht sind.
Die Vorbereitung, Präparation und Zuführung einer Probe und eines Biochips (nicht gezeigt) findet ebenfalls automatisiert statt. Hierfür ist ein mechanischer Probenmanipulator 4 (PM) vorgesehen, der ebenfalls von der Prozesssteuerung 7 angesteuert wird. Der Probenmanipulator 4 verfügt über eine Aufnahmeeinrichtung 5 für den Biochip. Nach der Präparation und Vorbereitung der Probe wird der Biochip in einer Inkubierstation 8 inkubiert, die ebenfalls von der Prozesssteuerung 7 angesteuert wird. Nach einem einstellbaren Zeitraum fährt der Probenmanipulator 4 die Aufnahmeeinrichtung 5 mit dem Biochip in den Messstrahlengang des TIRF-Mikroskops 2 und die Messung wird gestartet. Die Fluoreszenzbilder werden von einer CCD-Kamera 3 aufgenommen, in der Datenverarbeitungseinheit 6 (DV) gespeichert und automatisch ausgewertet.
2 zeigt ein Ablaufdiagramm der wichtigsten Schritte einer Messung. Der gesamte Messvorgang läuft automatisiert ab und wird von einer Prozesssteuerung 7 (siehe 1) gesteuert. Die Prozesssteuerung 7 fragt zunächst eine Variable ab, ob ein neuer Messezyklus gestartet werden soll. Ist dies der Fall, wird ein Biochip für die Messung vorbereitet. Zunächst wird der Biochip dafür von dem Probenmanipulator 4 aus einem Vorratsbehälter in die dafür vorgesehene Aufnahmeeinrichtung geführt und diese dann in einen Präparationsbereich der Vorrichtung 1 gebracht. Der Biochip besteht aus einem Träger, der für das Anregungslicht beziehungsweise das Fluoreszenzlicht transparent ist. Auf seiner Oberseite ist eine Goldschicht aufgebracht, die durchgehende Vertiefungen aufweist, welche zusammen mit dem Träger nach oben geöffnete Messkammern bilden. Gold hat den Vorteil, dass es einerseits weitgehend chemisch inert ist, aber andererseits spezifisch Biomoleküle bindet, die reich an Thiolgruppen sind.
Der Biochip wird dann durch den Probenmanipulator mit einer Pufferlösung mit einem fest eingestellten pH-Wert äquilibriert. Außerdem pipettiert der Probenmanipulator 4 vorher vorbereitete Proteo-Liposomen auf den Biochip. Die künstlichen Proteo-Liposomen enthalten als Transportsystem Carrierproteine oder porenbildende Kanalproteine. Danach wird der Biochip für einen einstellbaren Zeitraum in einer Inkubierstation 8 gelagert. Durch die Inkubation bei einer bestimmten Temperatur werden die Lipide in den Proteo-Liposomen fluide und bilden Membranschichten aus, die die einzelnen Messkammern des Biochips dicht verschließen. Bei dem anschließenden Waschen mit Pufferlösung werden die überschüssigen Lipidvesikel und Transportsysteme entfernt.
Es lassen sich aber auch native Biomembranen oder Zellen verwenden, wodurch neben der Bestimmung von Transportgeschwindigkeiten auch die Messung von Sekretionsraten aus Zellen möglich ist. Für biologische Membranen oder Zellen reduzieren sich die Schritte auf eine Zugabe und anschließende Inkubation, um durch die biologischen Membranen die einzelnen Messkammern zu verschließen, und einen Waschschritt.
Anschließend pipettiert der Probenmanipulator 4 das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Transport-Substrat und das Kontroll-Substrat auf den Biochip. Damit beide Substrate in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen parallel gemessen werden können, sind sie mit verschiedenen, spektral trennbaren Fluoreszenzfarbstoffen markiert. In der Regel wird außerdem ein Wirkstoffkandidat hinzugegeben. Dies kann beispielsweise ein Inhibitor sein, der an das Transportsystem bindet.
Nach der Vorbereitungsphase führt der Probenmanipulator 4 den Biochip in den Messbereich des Fluoreszenzmikroskops 2 ein. Im Messbereich werden in einem Punkt des Biochips die Substratfarbstoffe mit einem Laser angeregt und die Fluoreszenzemission mit einer CCD-Kamera gemessen. Die aufgenommenen Fluoreszenzbilder werden mit einem Zeitstempel versehen und in der Datenverarbeitungseinheit 6 gespeichert. Auf diese Weise wird ein Bildstapel erzeugt, der Informationen über die Änderung der Fluoreszenz in der Zeit enthält.
Nachdem die Änderung der Fluoreszenz in einem definierten Zeitraum gemessen wurde, werden die Bilder mittels einer Mustererkennungsroutine ausgewertet und die Fluoreszenzsignale einzelnen Messkammern zugeordnet. Die Datenverarbeitungseinheit 6 berechnet dann aus dem Zeitstempel und der zeitabhängigen Fluoreszenzintensität jeder Messkammer, die in dem Bildstapel gespeichert ist, Messdatenpunkte, die den Fluoreszenzverlauf im Messzeitraum wiedergeben.
Danach passt die Datenverarbeitungseinheit 6 den Messdatenpunkten für jede Messkammer eine mathematische Kurve an.
Im Idealfall ist eine einzelne Messkammer dicht von einer Membran verschlossen, in der sich gerade ein Transportsystem befindet. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass eine Messkammer nicht dicht sondern offen ist und somit sowohl das Substrat als auch Kontroll-Substrat in die Messkammer eindringen kann. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass eine Messkammer zwar dicht ist, aber kein Transportsystem enthält und somit weder Substrat noch Kontrollsubstrat in die Messkammer eindringen. Eine Klassifizierung der Messkammern in die drei genannten Kategorien erfolgt dann anhand des Kurvenverlaufes durch ein Unterprogramm. Die Messdaten von offenen Messkammern oder von Messkammern ohne Fluoreszenzsignal werden verworfen (der Verlauf typischer Messkurven ist in 3 dargestellt).
Die verbleibenden Messkurven werden von der Datenverarbeitungseinheit 6 zur Bestimmung der spezifischen Geschwindigkeitskonstante weiter ausgewertet. Dabei wird durch ein Unterprogramm vorzugsweise ein Histogramm erstellt, bei dem alle berechneten Geschwindigkeitskonstanten für den Transport gegen deren Häufigkeit aufgetragen werden. Aus dem Histogramm wird jeder Geschwindigkeitskonstante für den Transport eine bestimmte Anzahl von Transportsystemen pro Messkammer zugeordnet und auf ein Transportsystem pro Messkammer normiert. Aus dem Maximum des Histogramms für ein Transportsystem ergibt sich die für dieses Transportsystem spezifische Geschwindigkeitskonstante für den Transport des vorgegebenen Substrates.
Damit ist ein kompletter Messzyklus abgeschlossen. Der vermessene Biochip wird vom Probenmanipulator 4 aus dem Messbereich des Fluoreszenzmikroskops 2 gefahren und gegebenenfalls ein weiterer Biochip für die Vermessung vorbereitet.
Die beschriebene Vorrichtung kann typischerweise für das Screening von potentiellen Wirkstoffen im Rahmen der Arzneimittelentwicklung verwendet werden. Ist die Geschwindigkeitskonstante für den Transport in Anwesenheit eines Wirkstoffkandidaten niedriger (höher) als ohne Wirkstoff, dann deutet dies darauf hin, dass der Wirkstoffkandidat das Transportsystem gehemmt (beschleunigt) hat und beispielsweise als potentielles Arzneimittel in Frage kommt. In solchen Fällen kann die Vorrichtung automatisch den Wirkstoff in mehreren Messzyklen bei verschiedenen Konzentrationen messen, um automatisch die Bindungskonstante und weitere Eigenschaften zu bestimmen.
3 zeigt typische, aber beispielhafte Messkurven der zeitabhängigen Fluoreszenz, die mit der Vorrichtung gemessen wurden. Es sind fünf Typen von unterschiedlichen Fluoreszenzkurven dargestellt, die bei der Vermessung eines Biochips typischerweise auftreten. Jede Messkurve ist jeweils einer bestimmten Messkammer auf dem Träger des Biochips zuzuordnen.
Kurve A zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz in einer Messkammer, die nicht oder nicht vollständig von einer Membran bedeckt ist. Die Messkammer ist deshalb nicht dicht und sowohl das Substrat als auch das Kontrollsubstrat mit den spektral trennbaren Fluoreszenzfarbstoffen kann ungehindert in sehr kurzer Zeit in die Messkammer diffundieren. Die Fluoreszenz im Wellenlängenbereich des Kontrollsubstrates hat deshalb nach sehr kurzer Zeit bereits ihre maximale Intensität erreicht.
Kurve B zeigt einen beispielhaften zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz in einer Messkammer, die kein Transportsystem oder kein aktives Transportsystem enthält. Die gemessene Fluoreszenzintensität des markierten Substrates ist sehr gering und zeigt nur eine geringe Änderung während der Messzeit. Die Kurven A und B enthalten keine verwertbaren Messdaten und werden deshalb automatisch von der Datenverarbeitungseinheit 6 verworfen.
Die Kurve C ist der Kurve B ähnlich, wird aber im spektral getrennten Wellenlängenbereich des markierten Kontrollsubstrates gemessen. Die Fluoreszenzintensität des markierten Kontrollsubstrates ist sehr gering und zeigt nur eine geringe Änderung während der gesamten Messzeit. Das Kontrollsubstrat wird also aus den Messkammern ausgeschlossen, somit sind diese dicht.
Kurve D zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz des Substrates in einer Messkammer, die dicht ist und außerdem ein aktives Transportsystem enthält.
Kurve E zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz des Substrates in einer dichten Messkammer wie bei Kurve D. Es ist aber erkennbar, dass die zeitabhängige Intensität der Fluoreszenz schneller zunimmt als in Kurve D. Dies beruht darauf, dass in dem Membranabschnitt über dieser Messkammer zwei oder mehr Transportsysteme vorhanden sind. Zur Berechnung der spezifischen Geschwindigkeitskonstante für den Transport muss deshalb die Anzahl der Transportsysteme berücksichtigt werden. Wie dieses geschieht zeigt 4.
4 zeigt ein Histogramm mit verschiedenen Geschwindigkeitskonstanten für den Transport. Hierbei sind auf der Abszisse alle gemessenen Werte der Geschwindigkeitskonstante für den Transport k aufgetragen. Auf der Ordinate ist die relative Anzahl aller gemessenen Geschwindigkeitskonstanten für den Transport k, also deren Häufigkeit, aufgetragen. Der erste Peak I gibt alle Geschwindigkeitskonstanten wieder, die in Messkammern mit einem Transportsystem gemessen wurden. Der zweite Peak II gibt dann alle Geschwindigkeitskonstanten wieder, die in Messkammern mit zwei Transportsystemen gemessen wurden und der dritte Peak III gibt dementsprechend alle Geschwindigkeitskonstanten wieder, die in Messkammern mit drei Transportsystemen gemessen wurden. Aus dem Histogramm kann also jeder Geschwindigkeitskonstante für den Transport die Anzahl von Transportsystemen pro Messkammer zugeordnet werden.
Durch das Histogramm ist es der Datenverarbeitungseinheit möglich, mit einer mathematischen Funktion die den Maxima der Peaks zugehörigen Geschwindigkeitskonstanten zu ermitteln und diese und somit alle gemessenen Geschwindigkeitskonstanten auf ein Transportsystem pro Messkammer zu normieren. Diese so bestimmte Geschwindigkeitskonstante für den Transport für ein Transportsystem entspricht mit hoher Genauigkeit der spezifischen Geschwindigkeitskonstante dieses Transportsystems für das Transportsubstrat unter den gewählten experimentellen Bedingungen.

1: Messvorrichtung
2: Fluoreszenz-Mikroskop
3: CCD-Kamera
4: Probenmanipulator
5: Aufnahmeeinrichtung für Biochip
6: Datenverarbeitungseinheit
7: Prozesssteuerung
8: Inkubierstation

Claims

Vorrichtung zur optischen Messung von Eigenschaften von Transportsystemen in Membranen, insbesondere von Carrier- oder Kanalproteinen sowie Sekretionsmechanismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine optische Messeinrichtung und eine Datenverarbeitungselektronik mit einer Prozesssteuerung sowie einer Datenerfassung aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Messeinrichtung ein TIRF-Mikroskop ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die Vorrichtung ein durch die Prozesssteuerung ansteuerbarer Probenmanipulator vorgesehen ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Vermessung von Biochips, welche im Wesentlichen als transparente Träger mit mehreren Messkammern ausgebildet sind, eingerichtet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Messeinrichtung eine Strahlführung aufweist, die nahe am TIRF-Winkel ist, diesen aber noch nicht erreicht.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine durch die Prozesssteuerung ansteuerbare Inkubierstation für die zu vermessenden Biochips aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ausgebildet ist, Messzyklen prozessgesteuert und automatisiert durchgeführt werden, wobei jeweils ein Messzyklus im Wesentlichen eine Vorbereitung des Biochips für die Messung, eine darauf folgende optische Vermessung und eine sich daran anschließende Auswertung der Messdaten umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenmanipulator ausgebildet ist, an dem Biochip folgende Schritte auszuführen: a) Äquilibrierung mit einer Pufferlösung, b) Zugabe von Proteo-Liposomen, biologischen Membranen oder Zellen c) Waschen mit Pufferlösung, d) Zugabe von Substraten und/oder Wirkstoffkandidaten d) Zuführung in den Messbereich.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ausgebildet ist, nach der Vorbereitung des Biochips eine zeitaufgelöste Fluoreszenzvermessung der Messkammern des Biochips auszuführen und die Messdaten zu erfassen und zu verarbeiten.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Datenverarbeitungseinheit eingerichtet ist, nach der Fluoreszenzvermessung folgende Schritte auszuführen: a) Bestimmung der zeitaufgelösten Fluoreszenzintensität jeweils für die einzelnen Messkammern mittels Mustererkennung, b) Anpassung einer mathematischen Kurve an die zeitaufgelöste Fluoreszenzintensität, c) Klassifizierung der Messkammern anhand der mathematischen Kurve in eine der drei folgenden Kategorien: i) dichte Messkammern mit Fluoreszenz-Signal, ii) dichte Messkammern ohne Fluoreszenz-Signal, iii) offene Messkammern, und d) Verwerfen der Messdaten von dichten Messkammern ohne Fluoreszenz-Signal und von offenen Messkammern, und e) Berechnung eines Parameters für die Geschwindigkeit des Transportes, vorzugsweise der Geschwindigkeitskonstanten für den Transport, für jede dichte Messkammer mit Fluoreszenz-Signal.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Datenverarbeitungseinheit eingerichtet ist, folgende Schritte auszuführen: a) Auftragung aller berechneten Geschwindigkeitskonstanten für den Transport gegen deren Häufigkeit in einem Histogramm, b) Zuordnung einer entsprechenden Anzahl von Transportsystemen pro Messkammer zu den jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten, c) Ermittlung einer spezifischen Geschwindigkeitskonstanten eines eingesetzten Transportsubstrates für ein Transportsystem pro Messkammer.
Verfahren zur optischen Messung von Eigenschaften von Transportsystemen in Membranen, insbesondere von Carrier- oder Kanalproteinen sowie Sekretionsmechanismen, welches folgende Schritte umfasst: a) Bestimmung der zeitaufgelösten Fluoreszenzintensität jeweils für einzelne Messkammern eines transparenten Trägers mittels Mustererkennung, b) Anpassung einer mathematischen Kurve an die zeitaufgelöste Fluoreszenzintensität, c) Klassifizierung der Messkammern anhand der mathematischen Kurve in eine der drei folgenden Kategorien: i) dichte Messkammern mit Fluoreszenz-Signal, ii) dichte Messkammern ohne Fluoreszenz-Signal, iii) offene Messkammern.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: d) Verwerfen der Messdaten von dichten Messkammern ohne Fluoreszenz-Signal und von offenen Messkammern, und e) Berechnung eines Parameters für die Geschwindigkeit des Transportes, vorzugsweise der Geschwindigkeitskonstanten für den Transport, für jede dichte Messkammer mit Fluoreszenz-Signal.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: f) Auftragung aller berechneten Geschwindigkeitskonstanten für den Transport gegen deren Häufigkeit in einem Histogramm, g) Zuordnung einer entsprechenden Anzahl von Transportsystemen pro Messkammer zu den jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten, h) Ermittlung einer spezifischen Geschwindigkeitskonstanten eines eingesetzten Transportsubstrates für ein Transportsystem pro Messkammer.