DE102006059881A1

DE102006059881A1 - Ein Hochdurchsatzassay zur Identifizierung von Kinaseinhibitoren und Kinaseaktivatoren basierend auf der Messung der ATP-Hydrolyse

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Publication number: DE102006059881A1
Application number: DE200610059881
Authority: DE
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2008-07-03
Also published as: TW200848515A; WO2008074425A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen High-Throughput-Assay zum Messen der Kinaseaktivität und zum Identifizieren eines Kinaseinhibitors durch Bestimmen der Hydrolyse von ATP.

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen High-Throughput-Assay zum Messen der Kinaseaktivität und zum identifizieren eines Kinase-Inhibitors durch Bestimmen der Hydrolyse von ATP.
Eine Kinase ist ein enzymatisches Protein, welches die Übertragung einer Phosphorylgruppe von ATP auf ein Substrat katalysiert. Das Substrat kann beispielsweise die Kinase selbst, ein anderes Protein, ein Peptid, ein Zucker oder ein Lipid sein. Phosphorylierung eines Proteinsubstrats kann dessen Funktion modulieren, z. B. seine Aktivität inhibieren. Wenn das Protein src beispielsweise an einem speziellen Tyrosin phosphoryliert wird, schützt es seine eigene Kinase-Domäne davor, mit einem Substrat in Wechselwirkung zu treten. Die Phosphorylierung eines Proteins kann in anderen Fällen zur Bindung des phosphorylierten Proteins durch andere Proteine führen, die eine Erkennungsdomäne für ein spezielles phosphoryliertes Proteinmotiv haben. Die größte Gruppe der Proteinkinasen wirkt auf spezifische Proteine und modifiziert diese, um Signale zu übertragen und komplexe Prozesse in Zellen zu steuern. Derartige phosphorylierte Proteine ändern üblicherweise ihre funktionale Aktivität. Das Genom des Menschen enthält etwa 500 Proteinkinasegene.
Die Detektierung einer Kinase-Aktivität wird unter Laborbedingungen üblicherweise durchgeführt, indem eine Kinase unter definierten Bedingungen mit einem speziellen Substrat inkubiert wird. Die Phosphorylierung des Substrats wird nach Abschluss der Inkubierung bestimmt, indem z. B. die eingebaute Radioaktivität gemessen wird oder ein Antikörper verwendet wird, der das phosphorylierte Produkt spezifisch erkennt. Es war aus dem Stand der Technik bekannt, dass Proteinkinase A in der Lage sein würde, ATP direkt zu hydrolysieren (Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976). Es war jedoch nicht möglich, diesen Effekt zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase auszunutzen. Es wurde insbesondere nie untersucht, ob die ATP hydrolysierende Aktivität als Maß für die Proteinphosphorylierungsaktivität verwendet werden kann, und ob bekannte Kinase-Inhibitoren die ATP-Hydrolyse in einer ähnlichen Weise inhibieren, wie sie die Phosphorylierung von Protein- oder Peptidsubstraten blockieren. Es konnte zudem nicht gefolgert werden und wurde nicht untersucht, ob die ATP hydrolysierende Aktivität ein gemeinsames Merkmal vieler Kinasen sein könnte.
Durch die Erfindung konnte gezeigt werden, dass direkte Hydrolyse von ATP durch unterschiedliche Kinasen eine effiziente Weise zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase liefert, ohne dass eine Phosphorylgruppe auf ein Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsustrat übertragen werden muss. Es konnte ferner gezeigt werden, dass eine derartige Aktivität zum Arzneimittelscreening verwendet werden kann, insbesondere unter den Bedingungen des HTS (High-Throughput-Screening) in Bezug auf alle Typen von Kinasen. Der große Vorteil eines derartigen Verfahrens wäre das effektive Screening von Verbindungen auf ihre Kinase modulierende Aktivität, ohne dass ein spezifisches Substrat in ausreichend großen Mengen zur Verfügung stehen muss.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP (Adenosintriphosphat). Die Proteinkinase kann jegliches Kinaseprotein oder ein Fragment davon sein. Die Aktivität bezieht sich auf den biologisch aktiven Zustand der Proteine, die insbesondere andere Proteine, Proteinfragmente oder Peptide, Zucker oder Lipide phosphorylieren, die entweder aus natürlichen Quellen isoliert oder chemisch synthetisiert wurden. Das Verfahren zum Detektieren dieser Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP wird jedoch erfindungsgemäß ohne Zugabe eines Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsubstrats der entsprechenden Kinase durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung und b) das Bestimmen der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Menge an ATP mittels des Materials Luciferase bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung und b) das Bestimmen der Menge an ADP (Adenosindiphosphat) und/oder Pi (anorganischem Phosphat), die durch die Hydrolyse von ATP freigesetzt worden ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase:

a) das Inkubieren eines Kinaseproteins zusammen mit ATP und einem Detektierungssystem (z. B. Luciferin/Luciferase),
b) das Bestimmen der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, mittels des Detektierungssystems von a).

Ein derartiges Detektierungssystem, das mit dem Kinaseprotein und ATP inkubiert werden soll, wäre Luciferin/Luciferase, wie bereits genannt, oder ein Detektierungssystem, das für die Erkennung von ADP und/oder Pi spezifisch ist (z. B. spezifische Antikörper; kleine organische Moleküle).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase ausgewählt aus einer Tyrosinkinase oder einer Serin/Threonin-Kinase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase aus der folgenden Gruppe EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK ausgewählt.
In einer weiteren speziellen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kinase aus TAK1, ABL oder PDK4 ausgewählt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst in irgendeiner der zuvor genannten Ausführungsformen die wässrige Lösung mehr als ein Kinaseprotein.
Die wässrige Lösung könnte z. B. zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn und mehr Kinaseproteine von unterschiedlichem Typ, unterschiedlicher Spezifizität, der Herkunft aus unterschiedlichen Spezies, unterschiedlicher Reinigungsweise, unterschiedlicher Modifikation des Proteingrundgerüsts, unterschiedlicher Größe, unterschiedlichem Molekulargewicht, unterschiedlichem Zuckergehalt oder anderen Charakterisierungen enthalten.
Das Verfahren zur Bestimmung der Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, und/oder an ADP und/oder Pi, die aus der ATP-Hydrolyse freigesetzt worden ist bzw. sind, kann unter Verwendung eines Kalibrierungsverfahrens, das unter Berücksichtigung der entsprechenden relevanten experimentellen Bedingungen durchgeführt worden ist (z. B. Puffer, pH-Wert, Temperatur, Protein, Lösungsmittel, Ionen, Cofaktoren, Konzentrationen von ATP und/oder ADP und/oder Pi) und/oder unter Verwendung eines internen oder externen, fixierten oder flexiblen Referenzsystems erfolgen (z. B. Nullpunkt und/oder Basisniveau des spektroskopischen Systems).
Im Kontext des Verfahrens zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren Ausführungsformen wie beschrieben sollten zuvor experimentelle Aufbauten zu Kontroll- oder Vergleichszwecken durchgeführt werden, insbesondere zu Zwecken der verbesserten Genauigkeit und Wiederholbarkeit oder aus anderen Gründen. Ein Kontrollexperiment könnte beispielsweise aus einem weiteren experimentellen Aufbau (zur Kontrolle) bestehen, wobei im Unterschied zu dem vollständigen experimentellen Aufbau, der einen vollständigen Satz der Komponenten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufweist, mindestens eine der Komponenten (insbesondere das Protein und/oder ATP) weggelassen wurde.
Das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren der Ausführungsformen wie bereits erwähnt kann in einer diskreten (einem oder mehreren, zeitlich getrennten Bestimmungspunkten) oder in einer kontinuierlichen Weise (aufeinanderfolgende Bestimmung) durchgeführt werden.
Das Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP in einer oder mehreren der zuvor beschriebenen Ausführungsformen kann zur Identifizierung oder Profilierung einer chemischen Verbindung verwendet werden, die in der Lage ist, die Aktivität eines Kinaseproteins zu inhibieren oder zu stimulieren, oder kann zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase in einer biologischen Probe verwendet werden. Eine biologische Probe besteht aus lebenden oder toten Zellen von eukariontischen (einschließlich Wirbeltieren, insbesondere Säugern, speziell Hund, Ratte, Maus, Rind, Schwein sowie Menschen) oder prokariontischen Organismen (einschließlich Bakterien, Hefe) Organismen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer Kinase, wobei

a) eine Kinase (z. B. Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 oder andere) in wässriger Lösung bereitgestellt wird,
b) eine Lösung, die ATP enthält, bereitgestellt wird,
c) eine Lösung, die Luciferin und Luciferase enthält, bereitgestellt wird,
d) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
e) die Kinase in wässriger Lösung aus a) und die chemische Verbindung aus d) inkubiert werden,
f) die Aktivität der Proteinkinase z. B. mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird. Dies kann durchgeführt werden, indem entweder Kinase, Verbindung und ATP für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert werden und danach Luciferin/Luciferase zur Bestimmung des restlichen ATP zugefügt werden, oder indem Kinase, Verbindung, ATP und Luciferin/Luciferase zusammen inkubiert werden und das Abklingen der ATP-Konzentration überwacht wird,
g) das Ergebnis von d) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß c) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Kinase weggelassen wird,
h) das Ergebnis von d) und/oder e) möglicherweise durch die Ergebnisse aus einem Kontrollexperiment abgewogen wird, wobei die Verbindung gemäß b) ein bekannter Kinaseantagonist ist.

Da ein Antagonist eine Verbindung ist, die die Aktivität einer Kinase inhibiert, wird ein positives Ergebnis zum Identifizieren eines Antagonisten durch diesen Assay durch verringerte Aktivität der Kinase gezeigt, die dazu führt, dass weniger ATP hydrolysiert wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten einer Kinase, wobei

a) eine Kinase (z. B. Tyrosinkinase, Serin/Threonin-Kinase, EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDk2, MKK1, ROCK, MCK, TAK1, ABL, PDK4 oder andere) in wässriger Lösung, die ferner ATP, Luciferin, Luciferase und möglicherweise zusätzliche Verbindungen, jedoch kein Peptid-, Protein-, Zucker- oder Lipidsubstrat der Kinase umfasst, bereitgestellt wird,
b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten umfasst,
c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten umfasst,
d) ein Inhibitor der Kinase bereitgestellt wird,
e) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
f) die Kinase in wässriger Lösung gemäß a), der Inhibitor gemäß b) und die chemische Verbindung gemäß c) inkubiert werden,
g) die Aktivität der Kinase z. B. mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird,
h) das Ergebnis von e) möglicherweise durch die Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubation gemäß d) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Kinase weggelassen wird; dies kann erfolgen, indem entweder Kinase, Inhibitor, Verbindung und ATP für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert werden und danach zur Bestimmung des restlichen ATP Luciferin/Luciferase zugegeben wird, oder indem Kinase, Inhibitor, Verbindung, ATP und Luciferin/Luciferase zusammen inkubiert werden und das Abklingen der ATP-Konzentration aufgezeichnet wird,
i) das Ergebnis von e) und/oder f) möglicherweise durch die Ergebnisse aus einem Kontrollexperiment abgewogen wird, wobei die Verbindung gemäß b) ein bekannter Kinaseagonist ist.

Da ein Agonist eine Verbindung ist, die die Aktivität einer Kinase stimuliert, wird ein positives Ergebnis zum Identifizieren eines Agonisten durch diesen Assay durch erhöhte Aktivität der Kinase gezeigt, die dazu führt, dass mehr ATP hydrolysiert wird.
Das Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten wie zuvor beschrieben kann in einer Ausführungsform der Erfindung als High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend genauer definiert, ohne den Schutzumfang der Ansprüche auf eine einzige Definition zu begrenzen.
Eine Proteinkinase ist ein Enzym, das andere Proteine oder sich selbst (Autophosphorylierung) phosphoryliert. Proteinphosphorylierung ist ein Regulierungsmechanismus einer lebenden Zelle, der eine Rolle bei der Steuerung von Zellfunktionen spielt (z. B. Differenzierung, Entwicklung, Signalgebung, Metabolismus, Zellzyklus, Fortpflanzung und anderen). Die Phosphorylierung eines Proteins ändert üblicherweise die funktionale Aktivität des Proteins. Deregulierte Kinasen können zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen, wie z. B. Krebs, metabolischen Erkrankungen (z. B. Diabetes), verringerter Fähigkeit zur Bekämpfung von viralen oder bakteriellen Infektionen, Erkrankungen der Atemwege, Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Erkrankungen vitaler Organfunktionen (z. B. Herz, Lunge) und dergleichen.
Der Begriff Proteinkinase soll sich auf die Enzymklasse als solche beziehen, um die Proteinkinasegruppe von anderen Enzymen oder Rezeptoren (z. B. Phosphatasen, GPCR) zu differenzieren. Der Begriff Proteinkinaseprotein oder Kinaseprotein wird zur Bezeichnung des Proteins oder eines Fragments eines Proteins einer Proteinkinase verwendet. Tyrosinkinasen (EC 2.7.10.1) phosphorylieren Tyrosin-Aminosäurereste.
Tyrosinkinasen sind an der Signalweiterleitung beteiligt. Sie spielen eine bedeutende Rolle als Wachstumsfaktorrezeptoren (z. B. Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor – EGFR; Insulinrezeptor – IR und andere) sowie in der nachgeordneten Signalgebung von Wachstumsfaktoren. Serin/Threonin-Kinasen (EC 2.7.11.1) phosphorylieren die OH-Gruppe von Serin oder Threonin. Diese Kinasen werden oft durch chemische Signale reguliert, wie z. B. cAMP, cGMP, Diacylglycerin, Ca²⁺ oder andere. Serin/Threonin-Kinasen sind beispielsweise Phosphorylasekinase, Proteinkinase A, Proteinkinase B oder Proteinkinase C. Phosphorylasekinase (EC 2.7.11.19) ist ein hexadecameres Enzym, das aus vier unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist. Proteinkinase A (EC 2.7.11.1) besteht aus zwei Domänen. Die Bindungsstellen für ATP und Substrat sind zwischen den beiden Domänen angeordnet. Proteinkinase B (auch als Akt-Kinase bekannt) ist ein Schlüsselenzym von zahlreichen intrazellulären Signalgebungswegen. Die Aktivierung von Proteinkinase B stört die apoptotische Signalweiterleitung. Gleichzeitig führt sie zur Proliferation von Zellen. Proteinkinase C (EC 2.7.11.1) besteht aus einer Familie von etwa 10 Isozymen.
Andere wichtige Kinasen sind die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK; EC 2.7.11.1). Die MAPKs werden durch extrazelluläre Signalmoleküle (Mitogene) getriggert. Sie sind an der Regulierung zahlreicher zellulärer Aktivitäten beteiligt, z. B. Differenzierung, Genexpression, Mitose und Apoptose. Extrazelluläre Stimuli führen die Aktivierung einer MAPK über eine Signalgebungskaskade herbei, die MAPK, MAPK-Kinase (MAPKK) und MAPKK-Kinase (MAPKKK) umfasst.
Bei Säugern sind unterschiedliche Gruppen von MAPKs bekannt: ERK (extrazelluläre signalregulierte Kinase), JNK (c-Jun N-terminale Kinase), p38-Isoformen und andere. MEK (= MAP/ERK-Kinase) ist eine gemischte Serin/Threonin- und Tyrosinkinase. MEK spielt die Rolle einer MAPKK.
Andere wichtige Kinasen sind z. B.
EGFR (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor),
VEGFR (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor),
NGFR (Nervenwachstumsfaktorrezeptor),
CDK2 (Cyclin-abhängige Kinase 2),
Rock (Rho-assozierte Kinase),
MLK (Myosin-Leichtkettenkinase),
ABL (Abelson-Kinase) oder PDK4 (Phosphoinositid-abhängige Kinase 4) oder andere.
TGF-β-assoziierte Kinase 1 (TAK1) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die ein Mitglied der Mitogen-aktivierten Kinase Kinase Kinase-(MAPKKK)-Familie ist. Sie gehört zu dem entzündungsfördernden zellulären Signalgebungsweg, indem die JNK, p38- und NF-_KB-Wege aktiviert werden. In der Zelle ist TAK1 Teil eines Proteinkomplexes, der Adapterproteine wie TAB1, TAB2 oder TAB3 enthält. Dieser Komplex wird wiederum durch TRAF6 aktiviert, eine RING-Domänen-Ubiquitinligase, die die Synthese von Lys63-verlinkten Polyubiquitinketten erleichtert.
Es ist gezeigt worden, dass TAK1 im Myokard nach Drucküberlastung aktiviert wird. Ihre Inhibierung könnte für die Behandlung der koronaren Herzerkrankung und der Prävention von Herzversagen vorteilhaft sein.
Die wässrige Lösung einer Kinase enthält die Kinase in einer Menge von üblicherweise 1 ng bis zu 100 μg pro ml. Die wässrige Lösung kann neben der Kinase eine Puffersubstanz (z. B. Tris oder Hepes bei einem definierten pH-Wert, z. B. zwischen 6,5 bis zu 7,5), zweiwertige oder einwertige Kationen oder Anionen (z. B. Na⁺, K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Cl^–), Stabilisierungsmittel (z. B. Glykol oder Glycerin), Konservierungsmittel (z. B. Alkohole, Antibiotika) oder andere Substanzen enthalten. Lyophilisierte Proteine (wie z. B. Proteinkinasen) sind einem Dehydratisierungsprozess (Lyophilisierung, auch als Gefriertrocknen bekannt) unterzogen worden, wobei das gefrorene Material unter reduziertem Umgebungsdruck angeordnet wird, damit das gefrorene Wasser in dem Material direkt aus der festen Phase in die Gasphase sublimieren kann.
Ein Antagonist ist eine Substanz (z. B. chemische Verbindung, kleines organisches Molekül, Peptid, Protein oder andere), die die normale physiologische Funktion eines Proteins inhibiert, wie z. B. eines Enzyms oder Rezeptors oder anderer.
Antagonisten können mit einem Agonisten um die Bindungsstelle eines Proteins konkurrieren (= kompetitiver Antagonist) oder können durch andere Mittel antagonisieren (= nicht-kompetitive Antagonisten). Ein Agonist ist eine Substanz (z. B. chemische Verbindung, kleines organisches Molekül, Peptid, Protein oder andere), die an ein Protein (z. B. ein Enzym, einen Rezeptor oder andere) bindet, um die jeweilige Aktivität in einer Zelle zu triggern. Sowohl Antagonisten als auch Agonisten können als aktive Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit beitragen.
Eine chemische Verbindung wird insbesondere durch chemische Synthese oder durch Reinigung aus einer biologischen Quelle bereitgestellt.
Der Fachmann verwendet Routineverfahren zur chemischen Synthese einer Verbindung oder zur Reinigung aus einer biologischen Quelle. Derartige Verfahren stehen dem Fachmann in Lehrbüchern wie "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9, "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0, oder "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001, Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8 zur Verfügung.
Die durch Synthese oder Reinigung erhaltenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden. Geeignete Lösungsmittel können Wasser, Puffersubstanzen (z. B. Tris, HEPES, MOPS, usw.), einwertige und/oder zweiwertige Ionen (z. B. K⁺, Na⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, usw.), Säuren (z. B. HCl, H₂SO₄, Ameisensäure, Essigsäure, usw.), Basen (z. B. NaOH, usw.), Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Glycerin), Detergentien (z. B. Na-Dodecylsulfat), organische Lösungsmittel (z. B. Formamid, Aceton, Dimethylsulfoxid, usw.) und andere Komponenten (z. B. Solubilisierungsmittel oder Stabilisatoren) enthalten.
Das Inkubieren von z. B. einer Proteinkinase und einer chemischen Verbindung wird durchgeführt, indem diese Komponenten in Kontakt gebracht werden und für eine bestimmte Zeit (z. B. 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 Minuten oder mehr) auf einer vorgewählten Temperatur (zwischen 20°C und 40°C, z. B. 37°C) gehalten werden.
Der Fachmann kann die Komponenten des erfindungsgemäßen Assays unter Verwendung von Routinelaborverfahren in Kontakt miteinander bringen. Das Kontaktieren kann beispielsweise in Erlenmeyer-Kolben, Röhrchen, Eppendorf-Gefäßen oder in Mikrotiterplatten stattfinden. Für das Kontaktieren können temperaturgeregelte Inkubatoren verwendet werden, bei denen eine konstante Temperatur von beispielsweise 30°C oder 37°C und feste CO₂- oder Feuchtigkeitsbedingungen eingestellt werden können. Das Kontaktieren kann insbesondere auch in Laborrobotervorrichtungen durchgeführt werden. Es kann für unterschiedliche Zeitspannen von wenigen Sekunden bis Minuten und bis zu mehrere Stunden kontaktiert werden. Die in jedem Fall zu wählenden Bedingungen hängen von der Identität und Konzentration der Kinase, der Zusammensetzung des Lösungsmittels und der chemischen Verbindung ab.
ATP ist Adenosin-5'-triphosphat.
Luciferin ist ein Licht emittierendes Pigment, das sich in Organismen wie Glühwürmchen, Bakterien oder Dinoflagelaten findet. Luciferase ist ein Enzym, das Luciferin unter Erzeugung von Oxyluciferin und Licht oxidieren kann.
Screening bedeutet das Untersuchen einer großen Anzahl von Verbindungen, um pharmakologisch aktive Substanzen bei der Arzneimittelforschung zu identifizieren.
Beim High-Throughput-Screening (HTS) werden große Bibliotheken, die aus chemischen Verbindungen bestehen, auf ihre Fähigkeit zum Aktivieren oder Inhibieren eines Ziels (Targets) (z. B. Proteinkinase) getestet. Eine weitere Anwendung von HTS ist das Testen der Selektivität einer Verbindung.

Das Testen wird bei HTS üblicherweise auf Platten (Platten mit 24, 96, 384, 1536 (und mehr) Mulden) in einem automatisierten Verfahren mittels Laborrobotern durchgeführt. 3. Materialien und Verfahren 3.1. Materialien

Material	Molekulargewicht oder	Anbieter, Katalog Nr.
Mikroplatte, 384K, PS, weiß, kleines Volumen		Greiner 784075
Mikroplatte, 384 Mulden, schwarz, nicht bindend		Corning, 3654
TAK1-TAB1 Fusion, human	42,8 kDa	Biomol, 14-600
Adenosin-5'-triphosphat (ATP)	551,1 g/Mol	Sigma, A-2383
ATP-Monitoringlösung (ViaLight HS)		Cambrex, LT07111
Staurosporin	466,5 g/Mol	Calbiochem, 569397
Tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid	157,6 g/Mol	Merck 108219
Rinderserum-Albumin (BSA)		Sigma, A-7030
Magnesiumchlorid	95,21 g/Mol	Merck, 814733
Dithiothreitol (DTT)	154,2 g/Mol	Sigma, D 5545
DMSO		Merck, 102931
Pluronic F-68	10% Lösung	Sigma, P5556
Salzsäure	1 M	Merck, 109057
Milli-Q-H₂O

Charakteristika des Enzyms:

1) TAK1-TAB1 Fusion, aktiv
2) humanes rekombinantes Enzym, exprimiert in Sf21-Zellen, N-terminal His-markiert
3) enthält TAK1-Aminosäuren 1-303, fusioniert an TAB1-Aminosäuren 437-Ende
4) MW = 42,8 kD
5) gereinigt unter Verwendung von Ni² ⁺/NTA-Agarose, Reinheit > 90% gemäß Coomassie SDS PAGE
6) geliefert als 0,92 mg/ml Lösung in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 30 mM NaCl, 0,1 mM EGTA, 0,03% Brij-35, 0,2 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 0,1% 2-Mercaptoethanol
7) aliquotiert und gelagert bei –70°C.

3.2. Herstellung der Reagentien 3.2.1. Vorratslösungen

Name	Zusammensetzung	Herstellung	Lagerung
Tris-Puffer	25 mM, pH 7,4	3 g Tris wurden in H₂O gelöst, der pH-Wert mit HCl eingestellt, mit H₂O auf 1 L aufgefüllt	RT
BSA	10%	100 g BSA wurden in 1 L H₂O gelöst	–20°C
ATP	1 mM	551 mg ATP wurden in 1 L H₂O gelöst	–20°C
MgCl₂	1 M	95,2 g MgCl₂ wurden zu 1 L H₂O gegeben	RT
TAK1	0,92 mg/ml	wurde wie von Upstate erhalten verwendet	–70°C
Luciferin/Luciferase		20 ml Tris-Ac (aus dem VialightKit)-Puffer wurden zu einer lyophilisierten Ampulle gegeben	–20°C
DTT	1 M	1,5 g wurden in 10 ml H₂O gelöst	–20°C
Staurosporin	1 mM	250 μg Staurosporin wurden in 536 μl DMSO gelöst	–20°C

3.2.2. Puffer und Reagentien

Name	Herstellung	Zusammensetzung	Stabilität
Reaktionspuffer	1 ml: 986 μl Tris-Puffer, 10 μl MgCl₂, 2 μl BSA, 2 μl DTT	25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,02% BSA	6 h
Enzymlösung	1 ml: 997,2 μl Reaktionspuffer, 2,5 μl TAK1	Reaktionspuffer 2,3 μg/ml TAK1	6 h
ATP-Lösung	1 ml: 994 μl Reaktionspuffer, 6 μl ATP	Reaktionspuffer, 6 μM ATP	6 h
Testverbindungen	1 μl (10 mM in DMSO) wurden mit 20 μl Reaktionspuffer verdünnt, der 20% DMSO enthielt, 10 μl wurden weiter mit 70 μl Reaktionspuffer verdünnt	60 μM Verbindung in Reaktionspuffer, 3% DMSO	6 h
Detektierungslösung	1 ml: 323 μl Luciferin/Luciferase 667 μl Tris-Puffer, 2 μl Staurosporinvorrat (1 mM)	1:3 in Tris-Puffer, 2 μM Staurosporin	8 h

3.3. Experimentelles Verfahren:
3.3.1. Pipettierstufen

1) 2 μl Verbindung (60 μM in Reaktionspuffer, 3% DMSO, Kotrollen: Reaktionspuffer, 3% DMSO)
2) +2 μl Enzymlösung (2,3 μg/ml TAK1 in Reaktionspuffer, niedrige Kontrolle: Reaktionspuffer)
3) 30 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur
4) +2 μl ATP-Lösung (6 μM in Reaktionspuffer)
5) 60 Minuten Inkubieren bei 32°C
6) +6 μl Detektierungslösung
7) Zentrifugieren, 10 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur
8) Ablesen der Lumineszenz mit Tecan Ultra

3.3.2. Kontrollen und Standards:

1) hohe Kontrolle: Tris-Puffer, 4% DMSO anstelle von Verbindungslösung
2) niedrige Kontrolle: Tris-Puffer, 4% DMSO anstelle von Verbindung, Reaktionspuffer anstelle von Enzymlösung
3) Standard: 5Z-7-Oxozeaenol, 200 nM in Tris-Puffer, 4% DMSO

3.3.3. Reagenzkonzentrationen in dem Assay

Komponente	Konzentration während der Reaktion	Konzentration während des Detektierens
Puffer	25 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,02% BSA, pH 7,4	37,5 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% BSA, pH 7,4
DMSO	1%	0,5%
TAK1	770 ng/ml (18 nM)	385 ng/ml
ATP	2 μM	1 μM
Staurosporin	-	1 μM

3.3.4. Anmerkungen:

1) Die Pipettierstufen wurden mit einem CyBio Cybi-Well 384-Spitzensystem durchgeführt.
2) Die Luciferin/Luciferase-Lösung ist lichtempfindlich. Sie wird durch Verwendung von schwarzen Urplatten und Abdecken der Testplatten nach dem Pipettieren vor Licht geschützt.
3) Die Spitzen wurden während des Verbindungstransfers zwischen den Verbindungstransferstufen mit 10% Isopropanol, 0,001% Pluronic F-68 in H₂O und bei allen anderen Abgabestufen mit 10% Isopropanol in Tris-Puffer gewaschen.

3.3.5. Dosis-Reaktions-Messungen
Verbindungen:

1) 3 μl 10 mM in DMSO, es wurden 24 μl Reaktionspuffer zugeben, 3% DMSO, ergab 1,1 mM Verbindung in Reaktionspuffer, 13,8% DMSO
2) 19,5 μl wurden auf Tochterplatte überführt, 70 μl Reaktionspuffer ohne DMSO wurden zugegeben, ergab 240 μM Verbindung in Reaktionspuffer, 3% DMSO (80 μM Verbindung, 1% DMSO in Kinasereaktion)
3) Serielle Verdünnung: 1 + 1 (25 + 25 μl) in Reaktionspuffer, 3% DMSO
4) Testkonzentrationen: 80, 40, ..., 0,625 μl, [DMSO] = 1%

Reaktion:

• Protokoll wie für primäres Screening beschrieben

3.4. Datenanalyse
3.4.1. Berechnung der prozentualen Inhibierungswerte
Die Daten sind als relative Zählwerte angegeben:
wobei RLU relative Lumineszenzeinheiten sind.
Die prozentualen Inhibierungswerte wurden wie folgt berechnet:
3.4.2. Berechnung der IC₅₀-Werte
IC₅₀-Werte wurden bestimmt, indem die Datenpunkte an die nachfolgend gezeigte Gleichung (Parameter C) angepasst wurden. Parameter A wurde auf Null gesetzt. Wenn durch die Daten kein klares Maximum definiert war, wurde Parameter B auf 100 gesetzt.
3.4.3. Berechnung der Assay-Qualitätsparameter
Die Assay-Qualitätsparameter wurden auf Basis von hohen und niedrigen Kontrollen bestimmt, die als interne Standard auf jeder Assay-Platte laufen gelassen wurden. Die folgenden Qualitätsparameter gemäß Referenz 4 wurden als Maß zur Beurteilung der Eignung eines Assays für High-Throughput-Screening verwendet. Signal zu Hintergrund (S/B)
Z-Faktor
Z'-Faktor (Ref. 4)
4. Ergebnisse
4.1. TAK1-Assay-Entwicklung
Die Abhängigkeit der TAK1-katalysierten ATP-Hydrolyse von der Mg² ⁺-Konzentration wurde getestet. Die Maximalgeschwindigkeit wurde bei einer Konzentration von 10 mM beobachtet. Die Abnahme bei höherer Mg² ⁺-Konzentration könnte auf die Bindung eines zweiten Mg²⁺ an die aktive Stelle zurückzuführen sein (1).
Der Km-Wert von ATP in Bezug auf TAK1 ist 32 μM (2).
Der IC₅₀-Wert von 5Z-7-Oxozeaenol (resorcyclisches Lacton aus einem Pilz) war gemäß Bestimmung 50 nM. TAK1 war mit 1 μM ATP (3) inkubiert worden.
TAK1 erwies sich unter Reaktionsbedingungen für mehr als 6 Stunden als stabil (4).
Die DMSO-Toleranz für TAK1 war akzeptabel (5).
4.2. TAK1-Validierungs-Screening
Eine Validierungsbibliothek, die aus 1540 Testverbindungen bestand, wurde einem Screening auf TAK1-Inhibitoren unterzogen.

Die Screening-Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

[Verbindung]/μM	20
Anzahl der Platten	6
Anzahl der Verbindungen	1540
Mittelwert % Inhibierung ± Standardabweichung (SD)^*	9,1 ± 14,5
Schwellenwert für Positivwerte (% Inhibierung)	33
Anzahl der Positivwerte	344
Z'-Faktor (Durchschnitt pro Platte ± SD)	0,74 ± 0,06

*Für Verbindungen mit zwischen –50 und 50% Inhibierung. Der hohe mittlere % Inhibierungswert und die vergleichsweise hohe SD sind das Ergebnis der hohen Trefferrate.

4.3. Test von TBK1
Protokoll TBK1
Reaktionspuffer:

1) 50 mM Hepes-NaOH, pH 7,5
2) 5 mM DTT
3) 0,1% Tween 20
4) 10 mM MgCl₂

Konzentrationen während der enzymatischen Reaktion:

1) [Enzym] = 60 nM
2) [ATP] = 1 μM

Pipettierstufen:

1) Vorwärmen aller Reagentien auf 30°C
2) 2 μl Reaktionspuffer, 16% DMSO (oder Verbindung in Reaktionspuffer, 16% DMSO)
3) + 3 μl Enzym in Reaktionspuffer
4) + 3 μl ATP in Reaktionspuffer
5) Inkubieren bei 30°C
6) + 8 μl ATP Monitoringlösung (Cambrex, LT07-111) 1:3 in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4
7) Ablesen der Lumineszenz mit Tecan Ultra

Ergebnis
Die Aktivität von TBK1 und Inhibierung der Aktivität von TBK1 konnten erfolgreich bestimmt werden, indem die Veränderung der ATP-Konzentration gemessen wurde. Es war kein Proteinkinasesubstrat, z. B. Peptid oder Protein, vorhanden (6).
4.4. Anwendung des Assays auf die Kinasen PKA und Abl
Die Inhibierung von PKA und Abl konnte genau bestimmt werden, indem die Assaybedingungen wie bereits genannt verwendet wurden (7, 8).
Es konnte gezeigt werden, dass die PKA-Inhibierung durch PKA-Inhiitor zu einem IC₅₀-Wert von 105 nm führte (9). Der entsprechende Literaturwert für die Inhibierung der durch PKA katalysierten Phosphorylierung eines Peptidsubstrats ist 135 nM (Davies et al., Biochem. J. 351, 95–105 (2000)).
4.5. Dosis-Reaktions-Messungen für TAK1

1) Beispiele für Dosis-Reaktions-Kurven, die für Verbindungen erhalten wurden, die TAK1 inhibieren, sind in 10 gezeigt.

4.6. Detektierung der TAK1-Aktivität durch Bestimmung des erzeugten ADP
Beschreibung der Figuren
1: Mg² ⁺-Abhängigkeit von TAK1-katalysierter ATP-Hydrolyse. Die Maximalgeschwindigkeit wurde bei einer Konzentration von 10 nM beobachtet. Die Abnahme bei höheren Mg² ⁺-Konzentrationen könnte auf die Bindung eines zweiten Mg²⁺-Ions an die aktive Stelle zurückzuführen sein.
2: ATP-Abhängigkeit von TAK1-ATPase-Aktivität. Die Km für ATP wurde mit 32 μM bestimmt.
3: IC₅₀ von 5Z-7-Oxozeaenol, einem resorcyclischen Lacton aus einer Pilzquelle, wurde mit 50 nM bestimmt, was in guter Übereinstimmung mit dem Wert von 26 nM ist (beobachtet bei 1 μM ATP nach verlängertem Inkubieren mit TAK1), der in der Literatur angegeben ist (Ninomiya-Tsuji et al., JBC 278, 18485–18490, 2003).
4: Stabilität von TAK1 bei Raumtemperatur. Es wurde gefunden, dass das Enzym > 6 Stunden in dem Reaktionspuffer stabil war.
5: DMSO-Toleranz des Assays
6: Inhibierung von TBK1
7: Hydrolyse von ATP durch Abl
8: Hydrolyse von ATP durch PKA
9: Inhibierung von PKA durch PKA-Inhibitor H89
10: Inhibierung von TAK1 durch Testverbindungen. Die IC₅₀-Werte der Verbindungen A (Kreuzsymbole), B (x Kreuzsymbole) C (Kreise), D (Dreiecke) und E (Quadrate) wurden mit 64,2, 16,5, 5,4, 1,7 beziehungsweise < 0,6 μM bestimmt.
11: Bestimmung der TAK1-Aktivität durch Messen der Menge an erzeugtem ADP. Messung der TAK1-Aktivität bei 2 μM ATP in Abwesenheit eines Protein-, Peptid-, Zucker- oder Lipidsubstrats. Die ATP-Hydrolyse wurde detektiert, indem die Konzentration des erzeugten ADPs unter Verwendung der Transcreener-Technologie gemessen wurde (Bell Brook Labs, Madison, Wisconsin, USA).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Armstrong et al., PNAS 76, 722, 1976 [0003]
- "Organic Synthesis Workbook", 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9 [0037]
- "The Organic Chemistry of Drug Synthesis", 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0 [0037]
- "Bioactive Compounds from Natural Sources", 2001, Taylor & Francis, ISBN 0-7484-0890-8 [0037]
- Davies et al., Biochem. J. 351, 95–105 (2000) [0061]
- Ninomiya-Tsuji et al., JBC 278, 18485–18490, 2003 [0064]

Claims

Verfahren zum Detektieren der Aktivität einer Kinase durch Quantifizieren der Hydrolyse von ATP.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a) ein Kinaseprotein zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung inkubiert wird, b) die Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Menge an ATP, die hydrolysiert worden ist, mittels Luciferin/Luciferase bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a) ein Kinaseprotein zusammen mit ATP in einer wässrigen Lösung inkubiert wird, b) die Menge an ADP und/oder Pi, die freigesetzt worden ist, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a) ein Kinaseprotein zusammen mit ATP und einem Detektierungssystem inkubiert wird, b) die Menge an ATP, die hydrolysiert wird, mittels des Detektierungssystems von a) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Detektierungssystem Luciferin/Luciferase ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Detektierungssystem für ADP und/oder Pi spezifisch ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kinase aus einer Tyrosinkinase oder einem Serin/Threonin-Kinasetyp von Kinasen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Proteinkinase aus der folgenden Gruppe EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK ausgewählt ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Proteinkinase aus TAK1, ABL, PDK4 ausgewählt ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, wobei die wässrige Lösung mehr als ein Proteinkinaseprotein umfasst.
Verwendung eines Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 zur Identifizierung oder Profilierung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Aktivität eines Kinaseproteins zu inhibieren oder zu stimulieren.
Verwendung eines Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 zur Bestimmung der Aktivität einer Kinase in einer biologischen Probe.
Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer Kinase, wobei a) eine Kinase in wässriger Lösung bereitgestellt wird, die mögliche zusätzliche Komponenten umfasst, b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, d) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, e) die Kinase in wässriger Lösung aus a) und die chemische Verbindung aus b) inkubiert werden, f) die Aktivität der Kinase mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird, g) das Ergebnis von d) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß c) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder das Proteinkinaseprotein weggelassen wird bzw. werden.
Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten einer Proteinkinase, wobei a) eine Kinase in wässriger Lösung bereitgestellt wird, die mögliche zusätzliche Verbindungen umfasst, b) eine Lösung bereitgestellt wird, die ATP und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, c) eine Lösung bereitgestellt wird, die Luciferin, Luciferase und mögliche zusätzliche Komponenten enthält, d) ein Inhibitor der Proteinkinase bereitgestellt wird, e) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, f) die Kinase in wässriger Lösung gemäß a), der Inhibitor gemäß b) und die chemische Verbindung gemäß c) inkubiert werden, g) die Aktivität der Proteinkinase mittels ATP, Luciferin und Luciferase bestimmt wird, h) das Ergebnis von e) möglicherweise durch Ergebnisse von einem oder mehreren Kontrollexperimenten abgewogen wird, wobei die Inkubierung gemäß d) durchgeführt wird, indem die chemische Verbindung und/oder die Proteinkinase weggelassen wird bzw. werden.
Verfahren zum Identifizieren eines Agonisten nach Anspruch 15, wobei kein Inhibitor enthalten ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach den Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Kinaseprotein aus einer Tyrosinkinase oder einem Serin/Threonin-Kinasetyp der Proteinkinasen ausgewählt wird.
Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach den Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinkinaseprotein aus der Gruppe von EGFR, VEGFR, NGFR, PKC, CDK2, MKK1, ROCK, MCK ausgewählt ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinkinaseprotein aus TAK1, ABL oder PDK4 ausgewählt wird.
Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten oder Agonisten nach einem oder mehreren der Ansprüche 14 bis 19, wobei ein derartiges Verfahren als High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt wird.