DE102006058575A1 - Multiplex-CE-Fluoreszenzsystem - Google Patents

Abstract

Ein Multiplex-Kapillarelektrophoreseverfahren (CE-Verfahren), das eine Fluoreszenzerfassung für mehrere Proben einsetzt, wird wirtschaftlich und in Bezug auf Gerätekomplexität verbessert, indem die mehreren Proben mit einer einzelnen, nicht kohärenten Lichtquelle als Erregungslichtquelle für alle Kanäle bestrahlt werden. Bei der bevorzugten Lichtquelle handelt es sich um eine lichtemittierende Diode (LED).

Description

• Diese Erfindung bezieht sich auf ein Multiplex-Kapillarelektrophorese-Fluoreszenzerfassungssystem oder Multiplex-CE-Fluoreszenzerfassungssystem (CE – Capillary Electrophoresis) und ein Verfahren, das zur Abtrennung und Erfassung von Substanzen verwendet werden kann, die fluoreszierende Eigenschaften besitzen, z.B. fluoreszenzmarkierte dsDNA, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fettsäuren, Proteine, usw.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Es gibt eine breite Palette von im Handel erhältlichen Geräten, die Elektrophorese anwenden, um DNA-Proben zu analysieren. Bei einer solchen Art handelt es sich um ein mehrspuriges Slab Gel- oder Gelplatten-Elektrophoresegerät, das, wie der Name schon vermuten lässt, eine Gelplatte verwendet, auf der DNA-Proben angeordnet sind. Spannung wird an die Gelplatte angelegt, was eine Migration in der beschickten DNA-Probe induziert. Das Gel wirkt als eine auf Größe beruhende Siebmatrix, was zu einer Aufteilung der DNA-Probe in DNA-Fragmente unterschiedlicher Massen führt.
• Bei einer anderen Art von Elektrophoresegerät handelt es sich um das Kapillarelektrophoresegerät oder CE-Elektrophoresegerät. CE bezieht sich auf eine Gruppe miteinander verwandter Analyseverfahren, die sehr starke elektrische Felder verwenden, um Moleküle mit Kapillaren engen Durchmessers (typischerweise 20–100 μm Innendurchmesser) abzutrennen. CE-Verfahren werden in zahlreichen Anwendungen sowohl in der Industrie als auch Wissenschaft eingesetzt. CE auf Gel- und Polymernetzwerkbasis hat die Nukleinsäurestudien revolutioniert; Anwendungen umfassen DNA-Sequenzierung, Nucleotidquantifizierung und Mutations-/Polymorphismusanalyse. Wenn Elektrophorese in einer Quarzglas-Kapillarsäule geringen Durchmessers angewendet wird, die eine Pufferlösung enthält, ist die erforderliche Probengrößer deutlich kleiner und die Abtrennungs- und Auflösungsgeschwindigkeit kann im Vergleich zum Gel-Elektrophoreseverfahren um ein Vielfaches erhöht werden. Durch CE analysierte DNA-Fragmente werden oftmals dadurch erfasst, dass Licht durch die Kapillarwand auf die sich von der Probe abtrennenden Bestandteile, die mit einem fluoreszierenden Stoff markiert worden sind, gelenkt wird und die Fluoreszenzemissionen erfasst werden, die durch das einfallende Licht induziert wurden. Die Stärken der Emission sind repräsentativ für Konzentration, Menge und/oder Größe der Bestandteile der Probe.
• Einige der Herausforderungen bei der Auslegung von Geräten auf CE-Basis und der Durchführung von CE-Analyseprotokollen beziehen sich auf die Probenerfassungsverfahren. Im Falle von Fluoreszenzerfassung, richteten sich erhebliche Konstruktionsüberlegungen beispielsweise auf die Strahlungsquelle, optische Erfassung, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der Erfassung, und Kosten und Zuverlässigkeit des Aufbaus der Erfassungsoptik.
• Die Verwendung von CE bei der Fluoreszenzerfassung bietet eine hohe Erfassungsempfindlichkeit zur DNA-Analyse. Fluoreszenzerfassung ist oftmals die Erfassungsmethode der Wahl auf den Gebieten der Gen- und Proteinbiochemie, und zwar wegen ihrer herausragenden Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen Erfassungsmethoden.
• Die meisten Multiplex-CE-Systeme, wobei mehrfache Kapillaren oder Kanäle verwendet wurden, um Abtrennungen parallel vorzunehmen, verwenden einen Laser (Kohärenzlichtquelle) als Erregungslichtquelle zur Fluoreszenzerfassung (siehe US-Patent Nr. 5,582,705). Ein Patent (US-Patent Nr. 6,828,567) stellt ein System dar, das eine, jedem Separationskanal zugeordnete lichtemittierende Diode (LED) umfasst. Andere Publikationen befassen sich mit Einzelsäulenerfassung und nicht mit Mehrfachsäulenerfassung.
• Die Verwendung von Lasern oder einer einzelnen, jedem Kanal und/oder jeder Kapillare zugeordneten, lichtemittierenden Diode macht das Gerät komplex und die damit verbundenen Kosten höher. In der Vergangenheit ging man davon aus, dass die Verwendung einer einzelnen LED für eine Anordnung von Kanälen und/oder Kapillaren sich deshalb nicht bewerkstelligen lässt, weil eine einzelne LED eine unzureichende Abgabe von Licht bieten würde und keine Leistung hätte, die hoch genug wäre, um die Erfassungsfenster einer ganzen Anordnung von Kapillaren und/oder Kanälen auf einmal auszuleuchten.
• Fluoreszenzerfassung in der Kapillarelektrophorese (CE) bietet eine herausragende Empfindlichkeit im Vergleich zur standardmäßigen UV-Absorptionserfassung. Die Signale von Fluoreszenzsensoren stehen in Zusammenhang mit dem Erregungsprobenvolumen und der Ausgangsleistung mit einer spezifischen Wellenlänge der Lichtquelle. CE verwendet Kapillaren engen Durchmessers (typischexweise 20–100 μm Innendurchmesser), was nL zu erfassende Probenvolumina ergibt. Deshalb ist die Ausgangsleistung der Lichtquellen ausschlaggebend, um eine niedrige Erfassungsgrenze (LOD - Limit of Detection) zu erzielen, und um den größten Teil der Probenmoleküle zu erregen, werden oftmals Lichtquellen mit hoher Leistung verwendet. Bei den Fluoxeszenzerregungslichtquellen kann es sich um eine (Quecksilber- oder Xenon-) Gasentladungslampe, einen (Gas-, Festkörper-, Farbstoff- oder Halbleiter-) Laser oder eine lichtemittierende Diode (LED) handeln. Wurde eine Gasentladungslampe als Fluoxeszenzexxegungsquelle verwendet, war die LOD nur 10 Mal niedriger als bei UV-Absorptionssensoren. Dex Durchbruch in der CE-Fluoreszenzerfassung war auf die Einführung des Lasers als Lichtquelle zurückzuführen. Die Kohärenzeigenschaft des Lasers macht es einfach, ihn auf die bei der CE vorhandenen kleinen Erfassungsfenster zu fokussieren. Ein Ergebnis dieser Fokussierfähigkeit und der hohen Leistungsabgabe mit einer spezifischen Wellenlänge besteht darin, dass die Lichtleistungsdichte viel höher als diejenige einer herkömmlichen Lampe mit einer bestimmten Wellenlänge ist.
• Einzelmolekülerfassung wurde unter Verwendung von Sensoren für laserinduzierte Fluoreszenz (LIF) mit CE nachgewiesen. Im Hinblick auf Multiplex-Kapillarsysteme wurden mehrere Fluoreszenzerfassungsarten entwickelt. Die meisten davon verwendeten einen Laser als Lichtquelle, einschließlich Fluoreszenz, die von einem konfokalen Abtastlaser induziert wird (z.B. US-Patent Nr. 6,270,644), Hüllenströmungssensoren (z.B. US-Patente Nr. 5,468,364 und 6,048,444) oder optische Seiteneinfallserregungsgeometrie (z.B. US Patente Nr. 5,582,705 und 5,741,411).
• Der Hauptnachteil des Hüllenströmungssensors ist das höchst ausgefeilte Strömungssystem, das gebraucht wird, um eine zuverlässige Hüllenströmung sicherzustellen. Es werden extreme Anforderungen an die Toleranzen der optischen und mechanischen Bauteile gestellt, um die Widerstandsfähigkeitsanforderungen von Endverbrauchern zu erfüllen.
• Der abtastende, konfokale Sensor baut auf einer Abtastung des optischen Systems auf. Der Einsatz beweglicher Teile ist nicht ideal, wenn man die Einfachheit, die Widerstandsfähigkeit und die niedrigeren Kosten des Geräts bedenkt. Das optische Abtastprinzip reduziert auch den Auslastungsgrad pro Kapillare, was die Empfindlichkeit beeinträchtigen kann, wenn das Gerät zu Zwecken sehr hohen Durchsatzes weiter vergrößert wird.
• Optische Seiteneinfallserregungsgeometrieverfahren beleuchten das Innere mehrerer Kapillaren gleichzeitig und fangen das Licht auf, das von ihnen abgegeben wird. Wie im US-Patent Nr. 5,790,727 bilden die Kapillaren in einer parallelen Anordnung einen optischen Wellenleiter, in dem eine Brechung an den zylindrischen Flächen das Beleuchtungslicht einschränkt, das in der Ebene der Anordnung zum Kern jeder angrenzenden Kapillare in der Anordnung geleitet wird. Um eine Lichtstreuung zu mindern, wurde ein optischer Wellenleiter verwendet. Darüber hinaus wurde eine Laserquelle mit hoher Leistung benötigt, weil der Laserstrahl ausgeweitet wurde, um mehrfache Kanäle auszuleuchten.
• LEDs wurden als Fluoreszenzerregungslichtquellen in der Einzelkanal-CE verwendet. Zusätzlich wurde Multiplex-CE mit Fluoreszenzerfassung unter Verwendung von LEDs als Lichtquellen im US-Patent Nr. 6,828,567 offenbart. Dieses System beruht auf dem Aufbau Multistrahlungsquelle/gemeinsamer Sensor, bei dem die Erfassung in einer zeitversetzten und/oder Zeitmultiplex-Erfassung für die Kanäle durchgeführt wurde. Jede Kapillare wuxde über optische Fasern von einer LED beleuchtet. Das aus den Lichtquellen einfallende Licht wird separat unter Verwendung von optischen Fasern auf die Multikanalerfassungsbereiche gelenkt. Das von den Multikanalerfassungsbereichen abgegebene Licht wird auch unter Verwendung optischer Fasern zu einem oder mehreren gemeinsamen Sensor/en geleitet. Es kann mehr als einen Sensor bei mehreren Lichtquellen im gesamten Erfassungssystem geben, wovon jeder mehrere Strahlungsquellen bedient. Die Einschränkungen dieses Schemas bestehen darin, dass die Anzahl der Multikanäle durch Zeitversatzstrategien und den Erfassungszyklus aufgrund der Abtastrateneinschränkungen eingeschränkt wurde. Deshalb wurde ein System im Handel eingefühlt, das nur über bis zu 12 Kanäle verfügt.
• LED-Verfahrenstechniken haben sich in den letzten Jahren rasant entwickelt. Hochleistungsfähige LED-Lichtquellen zu niedrigen Kosten sind von vielen Handelsquellen erhältlich. Die Eigenschaften des LED-Lichts unterscheiden sich von Lasern oder herkömmlichen Lampen. Die LED-Lichtabgabe ist nicht kohärent wie bei der Laserlichtquelle, LEDs haben aber ein enges Lichtspektrum und eine viel höhere Lichtleistung als herkömmliche Lampen mit einer bestimmten Wellenlänge.
• Es ist also zu sehen, dass in der andauernden Verbesserung von Multiplex-CE-Systemen deshalb ein Bedarf nach einem kostengünstigeren und von der Auslegung her weniger komplexen System besteht, das genaue Abtrennung, hohe Auflösung und empfindliche Erfassung zu niedrigen Betriebskosten an den Tag legt. Primäres Ziel dieser Erfindung ist es, diesen Bedarf zu stillen.
• KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung stellt ein vereinfachtes, kostengünstiges, hochempfindliches, für hohen Durchsatz ausgelegtes Multiplex-Kapillarelektrophoresefluoreszenzerfassungssystem bereit, das aus einer einzelnen nicht kohärenten Lichtquelle als Erregungslichtquelle für alle Kanäle besteht. Ein Bündel optischer Fasern lenkt das von der LED abgegebene Licht in einem Winkel von vorzugsweise ca. 45° in Bezug auf den Kapillaranordnungshalter zum Erfassungsfenster für die Kapillaranoxdnung. Die von den Proben am Erfassungsfenster abgegebene Emission wird von einer Kameralinse aufgenommen und mit einem zweidimensionalen bilderzeugenden Sensor wie einem ladungsgekoppelten (CCD-)Sensor aufgezeichnet.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 ist eine Schemadarstellung eines Multiplex-Elektrophoresesystems der vorliegenden Erfindung, das eine Fluoreszenzerfassung mit einer einzelnen LED-Lichtquelle nutzt, die in einem Winkel als Erregungslichtquelle für die Separationskanäle angeordnet ist.
• 2 stellt ein 2D-Bild dar, das vom CCD-Sensor ausgegeben wurde.
• 3 ist ein Elektropherogrammergebnis, das eine erfolgreiche Abtrennung und Erfassung unter Verwendung des Systems von 1 zeigt.
• AUSFÜHRICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
• Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung wird in Zusammenhang mit 1 beschrieben. Es sollte jedoch klar sein, dass 1 nur beispielhaft ist und auch andere reale Ausführungsformen des Systems eingesetzt werden können, ohne dass dabei vom Rahmen und Aussagegehalt der Erfindung abgewichen würde.
• Wie bereits vorher erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches, kostengünstiges, effizientes, hochempfindliches und für hohen Durchsatz ausgelegtes Erfassungssystem bereit, dass allgemein mit 10 angegeben ist, das auf einem Bündel 12 optischer Fasern beruht, das dazu verwendet wird, eine einzelne LED-Lichtquelle 14, anstelle eines kostspieligen Hochleistungslasers in einem Multikanalerfassungssystem, über ein Fenster 18 Licht mit vorzugsweise einem spitzen Winkel, wobei der Winkel am bevorzugtesten 45° beträgt, abgeben zu lassen. Der Winkel dieses Systems ist mit 16, das Fenster mit 18 und eine Kapillare mit 20 dargestellt. Eine optische Kameralinse 22 wird zum Auffangen des Fluoreszenzsignals verwendet, das auf einem zweidimensionalen bilderzeugenden Matrixsensor wie einem ladungsgekoppelten (CCD-)Sensor 24 aufgezeichnet wird. Zusätzlich wird eine Pixel-Klasseneinteilung vom Sensor über das Erfassungsfenstersignal verwendet, um den Rauschabstand des Signals zu verbessern, ohne dabei Trennungsauflösung zu verlieren. Wenn das Fluoreszenzsignal aus dem Erfassungsfenster der Kapillaranordnung oder -matrix zum CCD-Sensor abgebildet wird, deckt jedes Kapillaremissionssignal mehr als einen Bildpunkt auf dem CCD-Sensor ab. Beispielsweise stellt 2 ein 2D-Bild dar, das vom CCD-Sensor während der Überwachung des Erfassungsfensterfluoreszenzsignals abgegeben wurde. Das Fluoreszenzlicht aus dem Erfassungsfenster bestrahlt die mehrfachen Bildpunkte des CCD-Sensors. Indem die entsprechenden Signale (horizontal und vertikal) miteinander kombiniert werden, lässt sich ein höherer Rauschabstand des Erfassungssignals erzielen.
• Bestimmte Grenzen und Parameter des Systems sind einer Erwähnung wert. Der Strahlungsfluss der lichtemittierenden Diode (LED) kann im Allgemeinen 100 mW bis 1000 mW betragen und beträgt vorzugsweise 700 mW. Obwohl man auch einen höheren Strahlungsfluss zur Erregung verwenden könnte, um das Signal zu verstärken, würde höheres Hintergrundrauschen, das sich aus der verstärkten Lichtstreuung an der Kapillarerfassungsfläche ergibt, den Gewinn wieder wettmachen. Man könnte deshalb einen höheren Strahlungsfluss verwenden, wenn sich die stärkere Lichtstreuung senken ließe. Licht aus der Diode wird aufgefangen und mit einem Winkel von 20° bis 90°, bevorzugter von 30° bis 60°, und am bevorzugtesten mit einem Winkel von ca. 45° auf das Erfassungsfenster 18 abgestrahlt. Das LED-Licht kann parallel gerichtet und auf das ganze Erfassungsfenster fokussiert werden; oder es kann ein Bündel optischer Fasern verwendet werden, um das von der LED-Lichtquelle abgegebene Licht direkt am Erfassungsfenster zu sammeln. Die Verwendung des Bündels optischer Fasern ist bevorzugt, weil es schwierig ist, das von der LED abgegebene Licht so umzuformen, dass es sich der Form des Erfassungsfensters anpasst. Allerdings kann das Bündel optischer Fasern so hergestellt werden, dass das Eingangsende einen ähnlichen Auffangbereich hat wie die LED-Lichtquelle, um den Lichtauffangwirkungsgrad größtmöglich zu gestalten, und dass das Ausgangsende eine dem Erfassungsfenster ähnliche Form hat, um den Ausleuchtungswirkungsgrad größtmöglich auszulegen. Wird das Bündel optischer Fasern verwendet, können Linsen verwendet werden, um das vom Bündel optischer Fasern abgegebene Licht parallel auf das Erfassungsfenster zu richten. Im Falle, dass keine Linsen verwendet werden, wird das Ausgangsende des Bündels optischer Fasen so nah wie möglich am Erfassungsfenster positioniert, um divergentes abgegebenes Licht auf ein Mindestmaß zu reduzieren. Das letztere ist wegen seiner einfachen Auslegung das bevorzugte Verfahren.
• Bei den Separationskanälen kann es sich um eine wie in 1 dargestellte Kapillarmatrix 28 handeln, oder auch einfach nur um Kanäle, die in einem Block hergestellt wurden (nicht gezeigt). Ein System, das erfolgreich verwendet wurde, ist beispielsweise die im US-Patent Nr. 6,788,414 vom 7. September 2004 von Yeung aufgezeigte 96-Kapillarmatrix.
• Das System von 1 wurde für die Fluoreszenzerfassung einer abgetrennten dsDNA-Probe als Beispiel verwendet. Die Siebmatrix enthielt einen Farbstoff wie Ethidiumbromid, das sich an die dsDNA bindet und fluoresziert, wenn es durch die Lichtquelle erregt wird. Der CCD-Sensor zeichnete die aus dem Erfassungsfenster abgegebene Fluoreszenz auf. Es wurden Software-Algorithmen verwendet, um das abgegebene Signal zu extrahieren und als Elektropherogramme zu rekonstruieren. 3 stellt eine Leiterseparation einer dsDNA mit 100 Basispaaren dar. Das System wies eine mindestens 20 bis 100 Mal bessere Empfindlichkeit auf als ein von den Kosten her vergleichbares UV-Absorptionserfassungssystem.
• Es ist also zu sehen, dass die Erfindung zumindest alle ihrer genannten Ziele erreicht.

Claims (9)

1. Bei einem Multiplex-Kapillarelektrophoreseverfahren, das eine Fluoreszenzerfassung für mehrere Proben einsetzt, die sich in mehreren Separationskanälen befinden, umfasst die Verbesserung: Bestrahlen der mehreren Proben mit einer einzelnen, in einem Winkel angeordneten, nicht kohärenten Lichtquelle als Erregungslichtquelle für alle Kanäle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Lichtquelle um eine lichtemittierende Diode (LED) handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die LED-Leistungsabgabe höher als 100 mW ist.
4. Multiplex-Kapillarelektrophorese-Erfassungssystem, das Folgendes umfasst: mehrere Separationskanäle für separate Analyseproben; ein Erfassungssystem, das mit jedem der Separationskanäle verbunden ist; eine einzelne, nicht kohärente Erregungslichtquelle, um alle Proben gleichzeitig zu bestrahlen; einen Sensor zur Erfassung der Strahlungsabgabe aller Proben; wobei die Erfassung von Fluoreszenz durch die Proben in der planaren Anordnung der Separationskanäle das Vorhandensein einer Fluoreszenzart in den Proben anzeigt.
5. Erfassungssystem nach Anspruch 4, wobei es sich bei den Separationskanälen um Kapillaren handelt.
6. Erfassungssystem nach Anspruch 5, wobei es sich bei der einzelnen, nicht kohärenten Erregungslichtquelle um eine lichtemittierende Diode (LED) handelt.
7. Erfassungssystem nach Anspruch 4, mit einem lichtdurchlässigen Fenster zwischen der einzelnen, nicht kohärenten Erregungslichtquelle und den mehreren Separationskanälen.
8. System nach Anspruch 7, wobei die Lichtquelle durch ein Bündel optischer Fasern, das der LED zugeordnet ist, oder durch eine Kollimatorlinse, die der LED zugeordnet ist, Licht an das Erfassungsfenster abgibt.
9. System nach Anspruch 8, wobei das Bündel optischer Fasern so angeordnet ist, dass das Licht mit einem 45°-Winkel an das Erfassungsfenster abgegeben wird.