DE102006035600B3

DE102006035600B3 - Verfahren zum Nachweis eines Methylierungsmusters

Info

Publication number: DE102006035600B3
Application number: DE102006035600A
Authority: DE
Inventors: Kurt Dr. Berlin; Jürgen Dr. Distler; Reimo Tetzner
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2006-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2026-07-28
Also published as: US20080064043A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines oder mehrerer Methylierungsmuster. Es umfasst die Umsetzung von Nukleinsäure und eine katalytische Nukleinsäureaktivität. Hierbei ist die Umsetzung von Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Methylierungsmusters in einer Nukleinsäure.
In dieser Anmeldung werden verschiedene Veröffentlichungen zitiert. Die Offenbarung dieser Veröffentlichungen wird hierdurch in die Beschreibung aufgenommen, um den relevanten Stand der Technik umfassender zu beschreiben.
Hintergrund der Erfindung
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt eine wichtige biologische Rolle, u. a. bei der Transkriptionsregulation, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese (zur Übersicht: Millar et al.: Five not four: History and significance of the fifth base. In: The Epigenome, S. Beck and A. Olek (eds.), Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3–20). Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von großem Interesse.
Ein Nachweis der Methylierung ist allerdings schwierig, da Cytosin und 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweisen. Viele der herkömmlichen, auf Hybridisierung beruhenden Nachweisverfahren vermögen daher nicht zwischen Cytosin und Methylcytosin zu unterscheiden. Zudem geht die Methylierungsinformation bei einer Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) vollständig verloren.
Die herkömmlichen Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im Wesentlichen nach zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung, siehe etwa: DE 101 54 317 A1 ; DE 100 29 915 A1 ). Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise analysiert werden (zur Übersicht: WO 02/072880 S. 1 ff).
Beim Bisulfit-Verfahren werden Cytosinbasen in Uracil umgewandelt, wohingegen 5-methylcytosine unverändert bleibt (Shapiro et al. (1970) Nature 227: 1047)) Uracil verhält sich in Bezug auf Basenpaarung wie Thymin, bildet also eine Basenpaarung mit Adenin. 5-Methylcytosin hybridisiert auch nach einer Bisulfit-Behandlung nach wie vor mit Guanin. Durch diese Basenkonvertierung ist es also möglich, methylierte Cytosinbasen von unmethylierten Cytosinbasen zu unterscheiden.
Da die Verwendung methylierungsspezifischer Restriktionsenzyme entsprechende Erkennungssequenzen voraussetzt, basieren die meisten Nachweismethoden für methylierte DNA auf der Bisulfit-Behandlung, die vor einer Detektion oder Amplifikation durchgeführt wird (z. B.: DE 100 29 915 A1 , Seite 2, Zeilen 35–46; siehe auch WO 2004/067545). Der Begriff Bisulfit-Behandlung umfasst die Behandlung mit einer Bisulfit-, einer Disulfit- oder einer Hydrogensulfit-Lösung. Wie dem Fachmann bekannt ist, wird der Begriff „Bisulfit" synonym mit dem Begriff „Hydrogensulfit" verwendet.
Im Stand der Technik sind diverse Laborprotokolle bekannt, die alle die folgenden Schritte umfassen: Genomische DNA wird isoliert, denaturiert, mehrere Stunden durch Reaktion mit einer konzentrierten Bisulfit-Lösung umgesetzt, desulfoniert und entsalzt (z.B.: Frommer et al. (1992) A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U. S. A.; 89(5): 1827–1831).
Von großem Interesse sind Verfahren, die in der Lage sind, Methylierung sensitiv und quantitativ zu detektieren. Dies gilt aufgrund der wichtigen Rolle der Cytosin-Methylierung in der Krebsentstehung insbesondere in Hinblick auf diagnostische Anwendungen. Von besonderer Bedeutung sind dabei Methoden, die es erlauben, abweichende Methylierungsmuster in Körperflüssigkeiten, etwa in Serum, nachzuweisen. Denn anders als die instabile RNA, ist DNA oft in Körperflüssigkeiten anzutreffen.
Bei destruktiven pathologischen Prozessen wie Krebserkrankungen ist die DNA-Konzentration im Blut erhöht. Eine Krebsdiagnostik über eine Methylierungsanalyse von in Körperflüssigkeiten befindlicher Tumor-DNA ist also möglich und schon mehrfach beschrieben (siehe etwa: Palmisano et al.: Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res. 2000 Nov 1; 60(21): 5954–8).
Ein Problem besteht dabei darin, dass sich in den Körperflüssigkeiten neben der DNA mit dem krankheitstypischen Methylierungsmuster eine große Menge an DNA der gleichen Sequenz, aber eines anderen Methylierungsmusters befindet. Die Diagnoseverfahren müssen daher in der Lage sein, nur in geringen Mengen vorhandene DNA mit abweichendem Methylierungsmuster vor dem Hintergrund der überwiegenden DNA der selben Sequenz mit normaler Methylierung nachzuweisen.
Die gängigen Verfahren zur sensitiven Detektion erfolgen über eine PCR-Amplifikation. Eine Methode ist dabei die sogenannte methylierungssensitive PCR („MSP"; Herman et al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3; 93(18): 9821–6). Dabei werden Primer verwendet, die spezifisch nur an Positionen der Bisulfitbehandelten Sequenz binden, die vorher entweder methyliert (oder bei umgekehrtem Ansatz unmethyliert) waren.
Ein Verfahren mit ähnlicher Sensitivität ist die sogenannte „Heavy Methyl"-Methode. Dabei wird eine spezifische Amplifizierung nur der ursprünglich methylierten (bzw. unmethylierten) DNA durch Einsatz von methylierungsspezifischen Blocker-Oligomeren erreicht (zur Übersicht: WO 02/072880).
Sowohl die MSP Methode wie die Heavy Methyl Methode sind als quantifizierbare Real-Time-Varianten anwendbar. Diese ermöglichen es, den Methylierungsstatus weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, ohne dass eine nachfolgende Analyse der Produkte erforderlich wäre („MethyLight" – WO 00/70090; US 6,331,393 ).
Eine Ausführungsform des genannten Real-Time-Verfahrens ist das „Tagman"-Verfahren. Dieses verwendet Sondenmoleküle, die ein Fluoreszenzfarbstoff-Quencher-Paar tragen. Die Sonden hybridisieren sequenzspezifisch an die Amplifikate und werden im Zuge des nächsten Amplifikationszyklus durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase abgebaut. Durch die Trennung von Quencher und Farbstoff entsteht ein detektierbares Fluoreszenz-Signal (siehe etwa Eads et al.: MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res. 2000 Apr 15; 28(8): E32).
Eine weitere MethyLight-Ausführungsform ist das sogenannte Lightcycler-Verfahren. Dabei werden zwei unterschiedliche Sonden eingesetzt, die in unmittelbarer Nähe zueinander an das Amplifikat hybridisieren, und die dann über Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ein detektierbares Signal erzeugen.
Die Anwendbarkeit dieser Real-Time-Verfahren auf die Methylierungsanalyse ist allerdings beschränkt. Dies gilt insbesondere in Bezug auf Spezifität, Sensitivität und Reaktionsgeschwindigkeit. Aufgrund der besonderen biologischen und medizinischen Bedeutung der Cytosin-Methylierung besteht aber ein starkes technisches Bedürfnis an der Entwicklung leistungsfähiger Methoden zur Methylierungsanalyse. Im Folgenden ist ein solches Verfahren beschrieben. Hierin wird eine katalytisch aktive Nukleinsäure, die durch die Amplifikation erst entsteht, zum Nachweis des Amplifikats herangezogen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit eine effektive und schnelle Detektion und ermöglicht somit eine sehr sensitive und sehr spezifische Methylierungsanalyse.
Eine zum erfindungsgemäßen Verfahren ähnliche Methode zur Mutationsanalyse ist in der US-Patentschrift US 6,140,055 offenbart. Dieses Verfahren ist in unterschiedlichen Ausführungsformen anwendbar. Allen Varianten ist gemeinsam, dass eine katalytisch aktive Nukleinsäure während einer PCR Amplifikation erzeugt wird. Diese enzymatische Aktivität wird zum Nachweis des Amplifikats herangezogen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst ein Primer die reverse komplemtäre Sequenz der katalytisch aktiven Nukleinsäure. Gegenüber den herkömmlichen Real-Time-PCR-Methoden, die zur Mutationsanalyse herangezogen werden, besitzt dieses Verfahren jedoch keine Vorteile.
Die Verwendung dieses Verfahrens zur Mutationsanalyse für die Methylierungsanalyse liegt für den Fachmann nicht nahe, da für die Methylierungsanalyse im Unterschied zur Mutationsanalyse ein zusätzlicher Schritt, insbesondere eine Bisulfit-Behandlung der DNA notwendig ist. Die Übertragung von aus der Mutationsanalyse bekannten Verfahren auf die Methylierungsanalyse ist daher nicht ohne weiteres möglich, denn die bisulfitierte DNA unterscheidet sich chemisch und physikalisch in vielfältiger Weise von genomischer DNA. Dies betrifft u. a. die Länge, die Komplexität, die Basenzusammensetzung und die räumliche Struktur:

– Die DNA wird durch die Bisulfitumwandlung stark fragmentiert. Der Fragmentierungsgrad hängt dabei von den Reaktionsbedingungen ab. Je länger die Reaktion und je höher die Temperatur, desto größer ist die Abbaurate der DNA. Auf der anderen Seite sind allerdings für eine vollständige Umwandlung entsprechend lange Reaktionszeiten erforderlich. Die bisulfitierte DNA liegt daher in einer komplexen Mischung aus unterschiedlich langen und eventuell nicht vollständig umgewandelten Fragmenten vor (zur Übersicht: Grunau et al 2001: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1; 29(13): E65-5). Da die unvollständig umgewandelte DNA eine Fehlerquelle für falsch-positive Signale darstellt, muss bei der Analyse sichergestellt werden, dass nur die umgewandelte DNA nachgewiesen wird.
– Die bisulfitierte DNA enthält andere Basen als genomische DNA. Durch die Bisulfitumwandlung werden alle nicht-methylierten Cytosin-Basen in Uracil umgewandelt, das in genomischer DNA nicht enthalten ist. Die genomische DNA enthält vier Basen. Die bisulfitierte DNA aber in sehr weiten Bereichen nur noch drei, da alle nicht-methylierten Cytosine umgewandelt werden. Dies sind in jedem Fall alle Cytosine, die außerhalb des Sequenzkontextes CpG vorkommen. Allerdings, gibt es eine Vielzahl von Enzymen, die in der Lage sind zwischen Uracil und Thymin zu unterscheiden.
– Durch das 3-Basen-Alphabet ist die bisulfitierte DNA weniger komplex als die genomische DNA. Sequenzwiederholungen treten häufiger auf. Das Design spezifischer Primer oder Sonden für bisulfitierte DNA ist daher weitaus schwieriger als für genomische DNA.
– Charakteristikum genomischer DNA ist die Doppelhelixtruktur. Die bisulfitierte DNA liegt jedoch nicht doppelsträngig, sondern einzelsträngig vor. Dies hat seine Ursache darin, dass durch die Bisulfitumwandlung zwei nicht komplementäre DNA-Stränge entstehen, die nicht mehr aneinander hybridisieren (Wird auf dem einen Strang C in U umgewandelt, so bleibt auf dem Gegenstrang das komplementäre G unverändert. Dieses kann mit U keine Basenpaarung mehr bilden). Die einzelsträngige DNA bildet jedoch u. U. kurze intramolekulare doppelsträngige Abschnitte, was insbesondere durch die geringere Komplexität der Bisulfit-DNA (s. o.) begünstigt wird.

Genomische DNA und bisulfit-umgewandelte DNA unterscheiden sich daher chemisch und physikalisch in vielfältiger Weise. Verfahren zur Analyse genomischer DNA sind daher nicht ohne weiteres auf die Analyse bisulfitierter DNA anzuwenden.
Daneben ist auch aus biologischen Gründen das Verfahren zur Mutationsanalyse gemäß US 6,140,055 nicht ohne weiteres auf die Methylierungsanalyse übertragbar. Denn Muta tionen oder „single nucleotide polymorphisms" (SNPs) treten als einzelner, isolierter Basenaustausch auf. Um diese Veränderungen nachzuweisen, ist es erforderlich, eine einzige Fehlpaarung zwischen Sonde und DNA aufzulösen.
Die Situation in der Methylierungsanalyse ist hingegen eine andere. CpG-Positionen treten oft in CpG-reichen Bereichen auf (sogenannte CpG-Islands). Hier zeigen benachbarte CpG-Positionen häufig einen identischen Methylierungsstatus („Co-methylierung"). Insbesondere zeigt DNA aus Krebszellen, die aus Körperflüssigkeiten gewonnen wird, oft über einen Bereich von mehreren hundert Basenpaaren uniforme Methylierungsmuster. Diese Co-methylierung kann zur Methylierungsanalyse ausgenutzt werden. Denn durch eine gleichzeitige Analyse mehrerer benachbarter Cytosinpositionen kann die Spezifität des Nachweises erhöht werden.
Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen einer Mutation und Cytosinmethylierungen besteht darin, dass es sich bei einer Mutation um eine stabile, irreversible Veränderungen in der DNA handelt. Für sie gibt es nur zwei mögliche Zustände: mutiert und nicht mutiert. Eine exakte Quantifizierung einer Mutation ist oft nicht notwendig, da die Mutation in der DNA aller Zellen einer Proben gleichzeitig auftritt.
Im Gegensatz dazu sind Cytosinmethylierungen flexible Veränderungen der DNA. Die DNA in unterschiedlichen Geweben ist unterschiedlich methyliert. Tumore zeigen in verschiedenen Entwicklungsstufen oder verschiedenen Aggressivitätsstufen unterschiedlichen Methylierungsgrade (z. B.: Jeronimo et al, J Natl Cancer Inst 2001 Nov 21; 93(22): 1747–52). Eine exakte Quantifizierung der Methylierung ist daher für viele wichtige Anwendungen erforderlich, etwa für die Klassifizierung von Tumoren, für prognostische Aussagen und für die Vorhersage, ob ein Patient auf ein bestimmtes Medikament anspricht oder nicht.
Darüber hinaus besteht bei der Analyse von Cytosinmethylierungen insbesondere aus Körperflüssigkeiten, das folgende Problem: Zwar befindet sich in den Körperflüssigkeiten DNA, die vom Tumor abgegeben wurde, und die daher ein spezifisches Methylierungsmuster besitzt. Daneben enthalten die Körperflüssigkeiten aber auch eine große Menge an DNA, die aus natürlichen Abbau- und Alterungsprozessen stammt. Diese nicht-pathologische DNA hat die gleiche Basensequenz wie die Tumor-DNA und unterscheidet sich von dieser nur im Methylierungsmuster. Diagnostische Analyseverfahren müssen in der Lage sein, spezifisch geringe Menge der Tumor-DNA vor diesem Hintergrund zu detektieren. Vergleichbare Situationen gibt es in der SNP-Analyse nicht.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, den Nachweis methylierter bzw. nicht-methylierte Cytosinbasen in einem DNA-Molekül zu verbessern, insbesondere in Hinblick auf die Spezifität und die Sensitivität.
Beschreibung
Vorteile
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich überraschend gut zur Methylierungsanalyse. Dies ist darin begründet, dass die Sonde zur Detektion nicht an bisulfitbehandelte DNA bzw. an einen davon amplifizierten Bereich bindet. Überraschender Weise ermöglicht dies sowohl eine höhere Sondenspezifität und -sensitvität als auch eine generell erhöhte Sensitivität der Analyse im Vergleich zu den herkömmlich verwendeten Methoden zur Methylierungsanalyse. Bei diesen Verfahren hybridisiert die Sonde an die bisul fitbehandelte DNA oder an einen davon amplifizierten Bereich. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt also im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren wie sie für die Methylierungsanalyse eingesetzt werden eine deutlich erhöhte Spezifität und Sensitivität.
Die höhere Spezifität und Sensitivität einer Sonde des erfindungsgemäßen Verfahren ist darin begründet, dass sie vier Basen umfassen. Im Vergleich dazu umfassen Sonden der herkömmlichen Methoden zur Methylierungsanalyse im Wesentlichen nur drei Basen. Die vierte Basen in diesen Sonden kann nur auftreten, um die Methylierung einer Position zu bestimmen. Dadurch dass alle vier Basen beliebig in einer Sonde des erfindungsgemäßen Verfahrens auftreten, lassen sich Sonden erzeugen, die bei einer höheren Temperatur an die Ziel-DNA binden. Dies ist gleichbedeutend mit einer höhere Sensitivität. Des Weiteren ermöglicht das beliebige Auftreten aller vier Basen in einer Sonde auch eine höhere Spezifität. Dies ist darin begründet, dass sich mit vier Basen ein komplexeres und damit eindeutigeres Muster erzeugen lässt als mit drei Basen.
Die bisher verwendeten Methoden zur Methylierungsanalyse sind auf Sonden festgelegt, die im Wesentlichen nur drei Basen enthalten, da Sie an bisfultbehandelte DNA binden, welche selbst sozusagen nur noch aus drei Basen besteht. Durch die Bisulfitbehandlung wird unmethyliertes Cytosin umgewandelt zu Uracil, was das gleiche Basenpaarungsverhalten wie Thymin aufweist. Dabei handelt es sich um Cytosine außerhalb von CpG Positionen und unmethylierte Cytosine innerhalb von CpG Positionen. Methyliertes Cytosin liegt zwar nach der Bisulfitbehandlung weiterhin als Cytosin vor, tritt jedoch vergleichsweise selten auf.
Amplifizierte bisulfitbehandelte DNA besteht also im Wesentlichen nur noch aus drei Basen A, T, und G oder im Fall des Gegenstrangs A, T, und C. Die vierte Base tritt nur noch auf, im seltenen Fall einer Methylierung.
Darüberhinaus besitzt das erfindungsgemäßen Verfahrens noch eine weiterhin erhöhte Sensitivität im Vergleich zu den herkömmlich verwendeten Methoden zur Methylierungsanalyse, da auch kleine Fragmente berücksichtigt werden. Da eine Sonde des erfindungsgemäßen Verfahrens außerhalb der Primerbindungsstellen an das Amplifikat bindet, kann der Abstand der Primer zu einander nahezu beliebig klein gewählt werden. Dies ist jedoch nicht möglich bei den herkömmlichen Verfahren. Der Abstand der Primer muss hier so gewählt werden, dass die Bindung von einer bzw. zwei Sonden und gegebenenfalls von Blockern noch ermöglicht ist.
Bisher werden überwiegend zwei Real-Time-Verfahren zur Methylierungsanalyse eingesetzt, die oben bereits erwähnt wurden. 1) Bei dem sogenannten Taqman-Verfahren werden Sondenmoleküle eingesetzt, die ein Fluoreszenzfarbstoff-Quencher-Paar aufweisen. Sie binden an die zu amplifizierende DNA und werden während des Amplifikationszyklusses durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase abgebaut. 2) Bei dem Lightcycler-Verfahren werden zwei unterschiedliche Sonden eingesetzt, die in unmittelbarer Nähe zueinander an das Amplifikat hybridisieren, und die dann über Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ein detektierbares Signal erzeugen.
Auf Grund folgender Nachteile ist die Anwendbarkeit des Taqman-Verfahrens zur Methylierungsanalyse eingeschränkt: Wie bereits erläutert zeichnet sich bisulfitierte DNA durch eine reduzierte Komplexität aus. Sie besitzt im wesentlichen nur noch aus einen 3-Buchstaben-Code. Dadurch sind Sonden mit einer durchschnittlichen Länge von 21–26 Nukleotiden erforderlich, um eine spezifische Bindung der Sonde an die bisulfitierte DNA zu gewährleisten. CG Sonden zum Nachweis methylierter DNA besitzen in der Regel etwa 21 Nukleotide, während TG-Sonden zum Nachweis unmethylierter DNA in der Regel 26 Nukleotide aufweisen. Überlicherweise umfasst jeder der beiden Primer 20–25 Nukleotide. Damit können rein rechnerisch nur DNA-Fragmente ab einer Größe von etwa 70 Nukleotiden analysiert werden. In der Praxis, liegt jedoch diese Zahl wesentlich höher, da sowohl die beiden Primer als auch die Sonde so zu wählen sind, dass sie spezifisch sind.
Das Lightcyler-Verfahren ist noch weniger einsetzbar, da hier die spezifische Hybridisierung von zwei Sonden an die erzeugten Amplifikate gewährleistet sein muss. Die rein rechnerische untere Grenze der zu untersuchende Fragmente beträgt also in etwa 95 Nukleotide. In der Praxis liegt auch diese Zahl deutlich höher, aus den oben genannten Grund. Für kurze DNA-Fragmente kann das Lightcyler-Verfahren daher nicht eingesetzt werden.
Die Möglichkeit des erfindungsgemäße Verfahren auch kleinere Fragmente, auch unter einer Größe von 70 Nukleotiden in die Analyse mit einzubeziehen, ist daher besonders vorteilhaft. Sie ist außerdem besonders vorteilhaft, da durch die Bisulfitbehandlung DNA fragmentiert wird. Diese Fragmentierung limitiert eine Methylierungsanalyse insbesondere dann, wenn die zu untersuchende DNA bereits stark fragmentiert ist. Dies ist zum Beispiel der Fall in der Tumordiagnostik aus Körperflüssigkeiten. DNA von Tumoren kann dort leicht durch DNasen abgebaut werden. Ein anderes Beispiel ist die Methylierungsanalyse von DNA aus paraffin-eingebeteten formalin-fixierten Gewebe. Durch die Formalinbehandlung wird die DNA stark fragmentiert. DNA aus paraffin-eingebeteten formalin-fixierten Gewebe wird insbesondere verwendet für das Auffinden und die Identifizierung von neuen methylierungsspezifischen Markern.
Leistungsfähige Verfahren müssen daher in der Lage sein, auch kurze bisulfitbehandelte DNA-Stücke zu analysieren.
Die höhere Sensitivität und die höhere Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahren sind für den Fachmann überraschend, denn für die Mutationsanalyse spielt es keine Rolle, ob die Sonde innerhalb des zu amplifizierenden Bereiches hybridisiert oder außerhalb. Dies ist insbesondere der Fall, da eine Bisulfitbehandlung nicht notwendig ist und nicht stattfindet. Damit kommt es auch zu keiner Komplexitätsreduktion der zu analysierenden DNA bzw. zu keiner weiteren DNA-Fragmentierung wie in der Methylierungsanalyse.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet darüberhinaus den Vorteil, dass es sowohl als normale PCR als auch als real-time PCR durchführbar ist. Beide Varianten erlauben eine Quantifizierung der Amplifikate bzw. der bisulfitumgewandelten zu amplifizierenden DNA.
Weiterhin besitzt das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass mehrere verschiedene DNA-Moleküle gleichzeitig analysiert und quantifiziert werden können. Hierbei ist es möglich sowohl nur eine als auch eine Vielzahl von Positionen hinsichtlich Ihrer Methylierung gleichzeitig zu analysieren und zu quantifizieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit in der Lage den Nachweis von methylierten bzw. nicht-methylierten Cytosinbasen in einem DNA-Molekül in Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zu verbessern. Dies ist insbesondere der Fall mit Hinblick auf eine erhöhte Spezifität und eine erhöhte Sensitivität.
Aspekte der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines oder mehrerer Methylierungsmuster, umfassend a) die Umsetzung von Nukleinsäure, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, und b) eine katalytischen Nukleinsäureaktivität. Das Verfahren ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von einem oder mehreren methylierten oder nicht-methylierten Cytosinbasen. Die zu analysierenden Cytosine können hierbei co-methyliert sein oder nicht. Dem Fachmann sind einzelne oder mehrere Cytosine, die co-methyliert sind oder nicht als sogenanntes Methylierungsmuster bekannt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt nicht nur ein Methylierungsmuster mit Hinblick auf ein DNA-Molekül zu analysieren sondern auch über eine Vielzahl von Molekülen. Hierbei kann das Methylierungsmuster sowohl detektiert als auch quantifiziert werden. Somit kann der Grad der Methylierung bzw. der Anteil der Moleküle bestimmt werden, die ein bestimmtes Methylierunsmuster aufweisen. Dies ist beispielsweise angezeigt für die Analyse von Gewebeproben, die nicht nur Tumorzellen enthalten sondern auch benigne Zellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dann in der Lage ein Methylierungsmuster der DNA der Tumorzellen im DNA Gemisch von Tumorzellen und benignen Zellen zu detektieren und zu quantifizieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters in der Nukleinsäure einer Probe, umfassend

a) die Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure einer Probe, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine an dere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
b) das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit einem Zymogen, welches eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert und damit dessen revers komplementäre Sequenz darstellt, wobei ein Nukleinsäuremolekül generiert wird, welches die katalytische Nukleinsäureaktivität umfasst; und
c) den Nachweis der katalytischen Nukleinsäureaktivität, wodurch auf das Vorliegen eines Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen wird.

Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu untersuchende Nukleinsäure mit einer Chemikalie oder mit einem Enzym so umgesetzt, dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich im Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet.
Im Folgenden wird die mit einer Chemikalie oder mit einem Enzym umgesetzte zu untersuchende Nukleinsäure auch als „umgesetzte", "umgewandelte" oder „behandelte" Nukleinsäure bezeichnet.
Dabei kann die zu untersuchende Nukleinsäure je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische Fragestellungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben und Körperflüssigkeiten. Gewebeproben sind beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, Biopsien insbesondere paraffin-eingebettete formalin-fixierte Biospien. Körperflüssigkeiten sind beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, Blut insbesondere Serum oder Plasma. Möglich ist es auch, die Nukleinsäure aus Sputum, Stuhl, Urin, Liquor, Saliva, Sperma, der Flüssigkeit der pleural Höhle, der Flüssigkeit der peritoneal Höhle, cerebrospinaler Flüssigkeit, Abstrich einer epithelialen Oberfläche, Lymphflüssigkeit, meningale Flüssigkeit, glandulare Flüssigkeit oder allen andern bekannten Körperflüssigkeiten zu verwenden.
Vorzugsweise wird die Nukleinsäure zunächst aus der biologischen Probe isoliert. Die Extraktion erfolgt nach Standardmethoden, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise erfolgt die Extraktion unter Verwendung eines dem Fachmann bekannten Kits. Beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, erfolgt die DNA-Extraktion aus Plasma etwa unter Verwendung des QIAamp UltraSens Virus Kit (Qiagen). Beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, erfolgt die RNA-Extraktion aus paraffin-eingebetteten formalin-fixiertem Biopsien etwa unter Verwendung des QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Die isolierte Nukleinsäure kann dann gegebenenfalls fragmentiert werden. Dies kann durch physikalische, chemische oder biologische Hilfsmittel entweder vor oder nach der Bisulfit-Umwandlung erfolgen. Beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, erfolgt die Fragmentierung von DNA durch Umsatz mit Restriktionsenzymen. Die Reaktionsbedingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen.
Anschließend wird die DNA chemisch oder enzymatisch umgewandelt. Bevorzugt erfolgt eine chemische Umsetzung mittels Bisulfit. Die Bisulfitumwandlung ist dem Fachmann in unterschiedlichen Variationen bekannt (siehe etwa: Frommer et al.: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1; 89(5): 1827–1831; Olek, A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064–5066.; DE 100 29 915 ). Besonders bevorzugt erfolgt die Bisulfitumwandlung in Gegenwart von denaturierenden Lösemitteln, etwa Polyethylenglykoldialkylethern oder Dioxan, und eines Radikalfängers („scavangers") (vgl.: DE 100 29 915 ).
Ebenso wird die Bisulfit-Umwandlung bevorzugt in Gegenwart von "scavengers", wie beispielsweise Chroman-Derivate, wie 6-Hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carboxyl-Säure oder Trihydroxybenzoesäure, bzw. dessen Derivate wie Gallsäure (siehe: PCT/EP2004/011715) durchgeführt.
Die Bisulfit-Umwandlung wird bevorzugter Weise bei einer Reaktionstemperatur von 30 °C bis 70 °C durchgeführt, wobei die Temperatur für kurze Zeitabschnitte auf bis zu über 85 °C angehoben wird (siehe: PCT/EP2004/011715). Die mit Bisulfit umgesetzte DNA wird bevorzugt vor der Quantifizierung gereinigt. Dies kann nach einer aus dem Stand der Technik bekannten Methode erfolgen, wie Ultrafiltration, bevorzugt mittels Microcon^TM Säulen (Millipore^TM). Die Reinigung wird nach dem vom Hersteller mitgelieferten Protokoll durchgeführt (siehe: PCT/EP2004/011715).
Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Bisulfit umgesetzte DNA ohne vorherige Desulfonierung direkt zur Quantifizierung eingesetzt wird (siehe PCT/EP2005/011133).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die DNA nicht chemisch, sondern enzymatisch umgewandelt. Dies ist etwa durch Einsatz von Cytidin-Deaminasen möglich, die unmethylierte Cytidine schneller umsetzen als methylierte Cytidine. Ein entsprechendes Enzym ist beschrieben in Bransteitter et al.: Activation-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 1; 100(7): 4102–4107; WO 2005/005660.
Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die vorbehandelte, also umgesetzte zu untersuchende Nukleinsäure in Kontakt gebracht mit einer Nukleinsäure. Diese kodiert eine katalytische Nukleinsäureaktivität, weist also selbst die revers-komplementäre Sequenz der katalytischen Nukleinsäureaktivität auf. Sie wird deshalb im Folgenden als Zymogen bezeichnet.
Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die katalytische Nukleinsäureaktivität detektiert. Dadurch kann auf das Vorhandensein eines Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zusätzlich im zweiten Schritt des Verfahrens das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit einem Oligonukleotid, das einen Bereich umfasst, der als Primer dient. Dieser Primer ermöglicht die Amplifikation der Nukleinsäure. Die Reaktionsbedingungen im zweiten Schritt des Verfahrens werden so gewählt, dass sie eine Primer-initiierte Nukleinsäureamplifikation sowie eine Aktivität einer katalytischen Nukleinsäure erlauben.
Das Oligonukleotid (bzw. der Primer) und das Zymogen sind so zueinander orientiert, dass in Gegenwart der umgesetzten zu untersuchenden Nukleinsäure, eine Nukleinsäure generiert wird. Diese Nukleinsäure zeichnet sich dadurch aus, dass sie einen Bereich umfasst, der entweder eine Sequenz oder eine revers-komplementäre Sequenz der zu untersuchenden Nukleinsäure enthält. Zusätzlich umfasst sie einen Bereich, der revers-komplimentär zur Sequenz des Zymogens ist, der also die katalytische Nukleinsäureaktivität darstellt.
Die Nukleinsäureamplifikation wird vorzugsweise mittels einer Polymerase, besonders bevorzugt mittels einer thermostabilen Polymerase katalysiert. Dabei kann es vorteilhaft sein, dass die verwendete Polymerase nicht über eine Exonuklease-Aktivität verfügt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters in der Nukleinsäure einer Probe, umfassend

a) die Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure einer Probe, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet;
b) das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit i) einem Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation, und ii) einem Zymogen, welches eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert und damit dessen revers komplementäre Sequenz darstellt, unter Bedingungen, die eine Primer-initiierte Nukleinsäureamplifikation und eine Aktivität einer katalytischen Nukleinsäureaktivität erlauben, wobei das Oligonukleotid und das Zymogen so zueinander orientiert sind in Gegenwart der zu untersuchenden Nukleinsäure, dass ein Nukleinsäure generiert wird, welches eine Sequenz oder eine revers komplementäre Sequenz der zu untersuchenden Nukleinsäure umfasst sowie die katalytische Nukleinsäureaktivität; und
c) den Nachweis der katalytischen Nukleinsäureaktivität, wodurch auf das Vorliegen eines Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt als vierten Schritt die quantitative Bestimmung der katalytischen Nukleinsäureaktivität. Dazu ist die Verwendung eines Substrats bevorzugt, dass durch die katalytische Nukleinsäureaktivität umgesetzt wird. Die Quantifizierung der katalytischen Nukleinsäure erfolgt dann durch Quantifizierung des umgesetzten Substrats. Dem Fachmann sind zahlreiche Methoden bekannt um eine katalytische Nukleinsäureaktivität bzw. umgesetzte Substrate zu quantifizieren. Dies kann beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, durch die Verwendung eines oder mehrerer Standards erfolgen. Eine andere Möglichkeit und ebenfalls bevorzugt, ist die Quantifizierung durch real time Verfahren (eine Übersicht über geeignete Quantifizierungsverfahren kann erhalten werden durch PCT/EP2005/003793; Real-Time PCR: An Essential Guide, Horizon Bioscience, Kirstin Edwards, Julie Logan and Nick Saunders, May 2004 ISBN: 0-9545232-7X; Real-time PCR, M. Tevfik Dorak, Taylor & Francis, April 2006), ISBN: 041537734X; Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002 Mar 15; 30(6): 1292–305; Bernard PS, Wittwer CT. Real-time PCR technology for cancer diagnostics. Clin Chem. 2002 Aug; 48(8): 1178–85). Die Quantifizierung mehrerer katalytische Nukleinsäureaktivitäten kann außerdem relativ zu einander erfolgen. Also beispielsweise, die katalytische Nukleinsäureaktivität der Probe A entspricht dem X-fachem der katalytischen Nukleinsäureaktivität der Probe B.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die zu untersuchende Nukleinsäure eine DNA, eine genomische DNA, eine RNA, eine ribosomale RNA, eine Transfer-RNA oder mRNA. Ganz besonders bevorzugt ist die zu untersuchende Nukleinsäure eine genomische DNA, eine ribosomale RNA oder Transfer-RNA. In einer bevorzugten Ausführungsvariante umfasst das Oligonukleotide (bzw. der Primer), das mit der zu untersuchenden umgesetzten Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird, eine DNA, eine RNA, eine PNA oder Derivate dieser drei Nukleinsäuren. In einer bevorzugten Ausführungsvariante umfasst die Nukleinsäure, die mit der zu untersuchenden umgesetzten Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird und das Zymogen umfasst, eine DNA, eine RNA, eine PNA oder Derivate dieser drei Nukleinsäuren. In einer bevorzugten Ausführungsvariante umfasst die Amplifikation der umgesetzten Nukleinsäure die Verwendung von Nukleotiden, von Ribonukleotiden oder Derivaten hiervon.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis eines Methylierungsmusters über Amplifikationsverfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Diese basieren auf a) RNA-RNA Amplifikation, b) RNA-DNA reverse Transcription, c) RNA-DNA Amplifikation, d) DNA-RNA Amplifikation, e) DNA-RNA Transcription, sowie f) DNA-DNA Amplifikation.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäureamplifikation mindestens eines der folgenden: Nukleotid, Ribonukleotid, PNA-monomer, oder ein entsprechendes Derivat.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eines oder mehrere der Oligonukleotide, die als Primer für die Initiierung der Nukleinsäureamplifikation dienen, mindestens eines der folgenden: Nukleotid, Ribonukleotid, PNA-monomer, oder ein entsprechendes Derivat.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eines oder mehrere der Oligonukleotide zur Nukleinsäureamplifikation, einen Bereich, der methylierungsspezifisch als Primer dient. Exakte technische Angaben zu methylierungsspezifischen Primern bzw. zur Durchführung eines entsprechenden Amplifikationsverfahrens sind dem Fachmann bekannt (vgl.: Herman et al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3; 93(18): 9821–6; US 5,786,146 ; US 6,017,704 ; US 6,200,756 ).
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Nukleinsäureamplifikation in Gegenwart von Blockermolekülen. Exakte technische Angaben zu methylierungsspezifischen Blockermolekülen bzw. zur Durchführung eines entsprechenden Amplifikationsverfahrens sind dem Fachmann bekannt (vgl.: WO 02/072880)
Erfindungsgemäß sind Amplifikationsverfahren bevorzugt der Gruppe umfassend: PCR, SDA (single strand displacement amplification) wie beispielsweise isothermale Amplifikation, TMA (transcription mediated amplification) wie beispielsweie NASBA, LCR, Verfahren zur methylierungsspezifischen Amplifikation, MSP (Methylierungsspezifische PCR), nested MSP, HeavyMethyl^TM, Methylierungssensitive Primerextension, oder Ms-SNuPE (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension). Dem Fachmann sind die genannten Verfahren bekannt. Ein Überblick kann beispielsweise auch durch PCT/US2006/014667 erhalten werden. Aber auch verwandte Verfahren der Nukleinsäureamplifikation wie sie dem Fachmann bekannt sind, sind nutzbar gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In einer bevorzugten Ausführunsform wird das Amplifikationsverfahren als real time Variante durchgeführt. Hierbei ist insbesondere die Kombination mit methylierungsspezi fischen Primern (MSP, nested MSP) und/oder mit methylierungsspezifischen Blockermolekülen (HeavyMethyl^TM) bevorzugt. Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform umfasst die Amplifikation mittels real time PCR unter Verwendung von methylierungsspezifischen Primern. Eine andere ganz besonders bevorzugte Ausführungsform umfasst die Amplifikation mittels real time PCR unter Verwendung von methylierungsspezifischen Blockermolekülen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich in sechs verschiedenen Varianten ausgeführt werden, die sich in zwei Gruppen unterteilen lassen: Bei der ersten Gruppe sind das als Primer dienende Oligonukleotid und das Zymogen auf unterschiedlichen Molekülen angeordnet. Bei der zweiten Gruppe sind das als Primer dienende Oligonukleotid und das Zymogen auf demselben Molekül angeordnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform, interagiert die mit Bisulfit umgesetzte zu untersuchende Nukleinsäure mit einer linearen ligierbaren einzelsträngigen Nukleinsäure, das das Zymogen umfasst. Diese lineare ligierbare einzelsträngige Nukleinsäure weist an ihren jeweiligen Enden Sequenzen auf, die mit der umgesetzten zu untersuchenden Nukleinsäure auf spezifische Art hybridisieren können. Ein derartige Sonde ist dem Fachmann auch unter dem Begriff „padlock-probe" bekannt. Dabei ist entweder eines der beiden Enden oder beide spezifisch für das zu detektierende Methylierungsmuster. Sofern eine Hybridisierung erfolgt, also kein Mismatch an einer zu analysierenden Methylierungs-Position auftritt, erfolgt eine Ligation. Dadurch entsteht ein sogenannter "Minicircle", der das Zymogen umfasst.
Mit Hilfe eines Oligonukleotides, das für die Initiierung der Amplifikation geeignet ist, erfolgt eine "rolling circle" Amplifizierung (RCA). Hierbei bindet das besagte Oligonukleotid ganz oder teilweise an die ligierten Endbereiche oder an irgendeine andere Position des Minicircles. Das Amplikon der RCA besteht aus einem Concatamer der revers-komplementären Sequenz des als Templat dienenden Minicircles. Es weist somit auch die katalytische Nukleinsäureaktivität in vielfacher Kopie auf. Diese katalytische Nukleinsäureaktivität erzeugt durch Umsetzung eines Substrats dann ein detektierbares Signal, mittels dessen ein Methylierungsmuster in einer Nukleinsäure nachgewiesen wird. Die Zunahme dieses Signal mit der Zeit erfolgt linear. Seine Detektion erlaubt Rückschlüsse auf das Vorhandensein des Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure. Für eine detailliertere Beschreibung dieser Ausführungsform wird auf 2 verwiesen.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Fragmentierung der zu untersuchende Nukleinsäure. Dies erfolgt entweder vor oder nach der Bisulfit-Umwandlung mit Hilfe von physikalischen, chemischen oder biologischen Hilfsmitteln. Beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, durch Ultraschallbehandlung, Scheeren oder Verdau mit Restriktionsenzymen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere methylierungsunspezifische Restriktionsenzyme verwendet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere methylierungsunspezifische Restriktionsenzyme mit ein oder mehreren methylierungsspezfischen Restriktionsenzymen verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden methylierungsspezifsche Restriktionsenzyme verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens zwei unterschiedliche Restriktionsenzyme verwendet. Diese erlauben im Folgenden eine gerichtet Ligation.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Ligation der Bisulfit umgewandelten fragmentierten Nukleinsäure mit mindestens einer Nukleinsäure, die ein Zymogen umfasst. Hierbei entsteht entweder ein zirkuläres oder ein lineares Molekül, das sich durch ein konstantes Verhältnis zwischen Zymogen und fragmentierter umgewandelter Nukleinsäure auszeichnet. Die Amplifikation erfolgt dann unter Verwendung mindestens eines Primers, der spezifisch an das Ligationsprodukt hybridisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Primer spezifisch für ein Methylierungsmuster. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Spezifität für ein Methylierungsmuster durch geeignete Wahl eines oder mehrerer methylierungsspezifischer Restritkionsenzyme erreicht. In jedem Fall folgt durch die Amplifikation eine Amplifikation des Zymogen-umfassenden Abschnitts, wodurch die katalytische Nukleinsäureaktivität entsteht. Unter Verwendung eines Substrats, entsteht ein Signal, das Rückschlüsse auf das Vorhandensein des Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure erlaubt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Ligation von Adaptern an die Bisulfit umgewandelte fragmentierte Nukleinsäure. Alternativ können auch Adapter erzeugt werden, unter Verwendung einer Terminale Transferase. Dieses Enzym fügt Nukleotide an die Enden der Bisulfit umgewandelten fragmentierten Nukleinsäure an. Die Amplifikation erfolgt durch mindestens einen Primer, der ganz oder teilweise an einen oder beiden Linker bzw. die umgewandelte Nukleinsäure hybridisiert. Mindestens einer der Primer der Amplifikation umfasst außdem das Zymogen, so dass durch die Amplifikation die katalytische Nukleinsäureaktivität entsteht. Durch Umsetzung eines Substrats durch die katalytische Nukleinsäureaktivität, entsteht ein Signal, das Rückschlüsse auf das Vorhandensein eines Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure erlaubt. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Spezifität für ein Methylierungsmuster durch geeignete Wahl eines oder mehrerer methylierungsspezifischer Restriktionsenzyme erreicht.
In einer besonders bevorzugten und vorteilhaften Ausführungsform wird die umgewandelte zu untersuchende Nukleinsäure mit mindestens zwei als Primern dienenden Oligonukleotiden in Kontakt gebracht. Dabei weist mindestens eines der mindestens zwei Oligonukleotide gleichzeitig ein Zymogen auf. Bevorzugt befindet sich dieses Zymogen 5' von der als Primer fungierenden Sequenz. Vorzugsweise umfassen beide Oligonukleotide jeweils ein Zymogen. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis der durch die Amplifikation generierten katalytischen Nukleinsäureaktivität durch Modifikation eines Substrats, dass selbst nicht Bestandteil des Amplifkats ist. Der Nachweis eines zu detektierenden Methylierungsmusters erfolgt dann durch Nachweis des modifizierten Substrats. Bevorzugterweise erfolgt eine Quantifizierung des Substrats, wodurch das Vorliegen des Methylierungsmusters quantifiziert wird. In einer anderen ganz besonders bevorzugten Ausführungsform modifiziert die durch die Amplifikation generierte katalytischen Nukleinsäureaktivität ein Substrat, dass selbst Bestandteil des Amplifikats ist. Bevorzugterweise wird dieses Substrat durch einen der Primer in das Amplifikat eingeführt. Weiterhin ist bevorzugt, dass die katalytische Nukleinsäureaktivität von mindestens einem methylierungsspezifischen Bereich flankiert ist. Dieser Bereich oder diese Bereiche sind entweder 5' und/oder 3' von der katalytischen Nukleinsäureaktivität auf dem Amplikon lokalisiert. Dieser Bereich oder diese Bereiche sind spezifisch für ein Methylierungsmuster, dessen Vorliegen nicht nachgewiesen werden soll. Es erfolgt also eine Abreicherung von Hintergrundamplifikaten d.h. die Amplifikation wird nahezu vollständig unterdrückt (jeder Amplifikationsprimer umfasst ein Zymogen) oder erfolgt nur noch linear (nur ein Primer umfasst ein Zymogen). Der eigentliche Nachweis des Vorliegens eines gesuchten Methylierungsmusters erfolgt durch geeignete Markierung der Amplifikate, die nicht abgereichert werden. Dies erfolgt beispielsweise durch Fluoreszenzmarkierung der als Primer verwendeten Oligonukleotide. Diese Ausführungsform wird vorzugsweise verwendet zum Nachweis eines Methylierungsmusters in einem Gemisch unterschiedlicher Nukleinsäuren.
In einer besonders bevorzugten und vorteilhaften Ausführungsform wird die umgewandelte zu untersuchende Nukleinsäure mit mindestens zwei als Primern dienenden Oligonukleotiden in Kontakt gebracht, die kein Zymogen oder eine katalytische Nukleinsäureaktivität umfassen. Vorzugsweise handelt es sich bei der umgewandelten zu untersuchenden Nukleinsäure um ein Gemisch verschiedener umgewandelter Nukleinsäuren. Vorzugsweise umfasst mindestens eines der Oligonukleotide in seinem 3' terminalen Bereich ein Substrat der katalytischen Nukleinsäureaktivität. Die Amplifikation erfolgt in Gegenwart einer katalytischen Nukleinsäureaktivität, dessen 3' Ende vorzugsweise nicht für die Initiierung der Amplifikation geeignet ist. Die katalytische Nukleinsäureaktivität erkennt eine Sequenz eines der Oligonukleotide, die einen Primer umfassen. Außerdem erkennt es methylierungsspezifisch einen amplifizierten Abschnitt einer umgewandelten Nukleinsäure. Das erfolgreiche Erkennen beider Bereiche in einem Amplifikat oder einer umgewandelten Nukleinsäure, führt zu dessen Restriktion. Die Restriktion erfolgt vorzugsweise zwischen den Positionen n und n+1, n-1 und n, n-2 und n-3, n-3 und n-4, n-5 und n-6 sowie n-6 und n-7, wobei n die letzte 3' terminale Base des zur Amplifikation verwendeten Primers bzw. die entsprechende Position der umgewandelten Nukleinsäure repäsentiert. Durch die Restriktion der Amplifikate erfolgt nur noch eine lineare Amplifikation der entsprechenden, umgewandelten Nukleinsäure. Er folgt die Restriktion der umgewandelten Nukleinsäure, so unterbleibt die Amplifikation weitestgehend. Auch in dieser Ausführungsform erfolgt der Nachweis eines Methylierungsmusters durch Abreichung von Hintergrundamplifikaten. Der eigentliche Nachweis des Vorliegen eines gesuchten Methylierungsmusters erfolgt durch geeignete Markierung der Amplifikate, die nicht abgereichert werden. Dies erfolgt beispielsweise durch Fluoreszenzmarkierung der als Primer verwendeten Oligonukleotide.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eines der genannten sechs Hauptausführungsformen mit methylierungsspezifischen Primern und/oder mit methylierungsspezifischen Blockern durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die katalytische Nukleinsäureaktivität ein Ribozym oder ein DNAzym. Erfindungsgemäß ist es möglich, dass das Ribozym oder das DNAzym Nukleotidderivate umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die katalytische Nukleinsäureaktivität ein 10-23 DNRzym wie es beispielsweise in US 6,140, 005 beschrieben ist. Die Anforderungen an die Sequenz der katalytischen Domäne dieses 10-23 DNAzyms erlaubt verschiedene Sequenzen für die Ausführung der Sequenz des 10-23 DNAzyms. Diese möglichen Sequenzen sind ebenfalls bevorzugt und mit 3 beschrieben. Sie sind dem Fachmann außerdem auch bekannt (Zaborowska et al., 2002, Sequence Requirements in the Catalytic Core of the 10-23 DNA Enzyme, 277: 40617–40622).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Nachweis der katalytischen Nukleinsäureaktivität bzw. die Abreichung von Hintergrundamplifikaten durch die katalytische Nukleinsäureaktivität die detektierbare Modifikation min destens eines Substrats. Vorzugsweise wird die detektierbare Modifikation ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Bildung und Spaltung einer Phosphodiesterbindung, Nukleinsäure-Ligation und -Spaltung, Porphyrin Metallation, Bildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Ester- und Amid-Bindung. Bevorzugter Weise umfasst die detektierbare Modifikation die Spaltung eines fluoreszenz-markierten Nukleinsäure-Moleküls, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat eine DNA-RNA-Chimäre. Dies ist insbesondere bevorzugt, wenn die katalytische Nukleinsäureaktivität ein DNAzym oder ein Ribozym ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat DNA. Dies ist insbesondere bevorzugt, wenn die katalytische Nukleinsäureaktivität ein Ribozym ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat RNA. Dies ist insbesondere bevorzugt, wenn die katalytische Nukleinsäureaktivität ein DNAzym ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat Teil des Amplifikats. Die katalytische Nukleinsäureaktivität setzt, insbesondere spaltet, das Substrat bzw. Amplifikat um. Dadurch wird eine Verminderung von unerwünschten Amplifikaten erzielt, die selbst nicht mehr weiter amplifiziert werden können. Die gewünschten Amplifikate können dann besser amplifiziert und detektiert werden, gemäß den hierin beschriebenen Ausführungsformen bzw. den herkömmlichen Verfahren. Vorzugsweise erfolgt der Einbau des Substrats in das Amplifikat durch einen Primer der Amplifikation.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat an seinen 3' Ende so modifiziert, dass es selbst nicht für die Initiation der Amplifikation eignet. Dem Fachmann sind geeignete Modifikationen bekannt. Beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, handelt es sich bei dieser Modifikation um ein 3' terminales Dideoxynukleotid. Vorzugsweise wird ebenfalls eine Enyzm zur Amplifikation verwendet, die keine 3'-5' Exonukleaseaktivität besitzt.
Das Substrat wird in einer bevorzugten Ausführungsform von der katalytischen Nukleinsäureaktivität umgesetzt, insbesondere gespalten. Bei der Spaltung wird ein detektierbares Signal generiert, dass die Quantifizierung der katalytischen Nukleinsäurektivität und damit den Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters erlaubt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat markiert. Dem Fachmann sind geeignete Markierungen bekannt. Vorzugsweise erfolgt die Markierung durch Radioaktivität oder fluoreszierende Farbstoffe. Beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, kann in nicht real time basierenden Amplifkationsverfahren der Nachweis der umgesetzten bzw. nichtumgesetzten Substrate dadurch erfolgen, dass das Substrat immobilisiert ist und die katalytische Nukleinsäureaktivität zu einer Abtrennung der radioaktiven Markierung führt. Noch gebundene Radioaktivität entspricht dann nichtumgesetzten Substrat, abgetrennte Radioaktivität dem umgesetzen Substrat.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Substrats mit einem Fluorophor-Quencher-Paar markiert. Vorzugsweise ist an einem Ende des Substrats ein Fluorophor, am anderen Ende ein Quencher angeordnet. Geeignete Fluorophore und Quencher sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft, jedoch nicht darauf beschränkt, sind in Tabelle 1 geeignete Fluorophore und Quencher genannt. Vorzugsweise werden als Fluorophore FAM, HEX, ROX und Tamra, und als Quencher BHQ1 und Dabcyl verwendet. Durch diese Art der Markierung entsteht erst bei der Umsetzung des Substrats durch die katalytische Nukleinsäureaktivität ein detektierbares Signal. Diese Art der Markierung ist insbesondere bevorzugt in real time basierenden Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahren. Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt einen Überblick über bevorzugte Ausführungsformen, in denen ein Substrat mit einem Fluorophor und einem Quencher markiert ist. Die Tabelle zeigt bevorzugte Kombinationen von Fluorophoren und Quenchern. Dabcyl wirkt als Quencher im Bereich von 380–530 nm; QSY-35 wirkt als Quencher im Bereich von 410–500 nm; BHQ1 (Black Hole Quencher 1) wirkt als Quencher im Bereich von 480–580 nm; TAMRA wirkt als Quencher im Bereich von 500 nm–550 nm; QSY-7 wirkt als Quencher im Bereich von 500–600 nm; QSY-9 wirkt als Quencher im Bereich von 500–600 nm; BHQ-2 (Black Hole Quencher 2) wirkt als Quencher im Bereich von 550–650 nm; DDQII (Deep Dark Quencher II) wirkt als Quencher im Bereich von 590 nm–700 nm; QSY-21 wirkt als Quencher im Bereich von 590 nm–720 nm; und BHQ-3 (Black Hole Quencher 3) wirkt als Quencher im Bereich von 620 nm–730 nm. Weitere dem Fachmann bekannte Fluorophore oder Quencher sind ebenso verwendbar und hiermit ebenfalls bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine methylierungsunspezifische Amplifikation der zu untersuchenden Nukleinsäure nach der Bisulfitumwandlung. Erst danach erfolgt die methylierungsspezifische Amplifikation umfassend ein Zymogen und/oder eine katalytische Nukleinsäureaktivität. Vorzugsweise handelt es sich bei der methylierungsunspezifischen Amplifikation um ortsunspezifische Amplifikation. Diese ist auch als "whole genome" Amplifizierung bekannt. Dem Fachmann sind geeignete Methoden be kannt. Besonders bevorzugt sind Methoden, die sich besonders gut für die whole genome Amplifizierung von Bisulfit umgewandelter DNA eignen. Bevorzugter Weise erfolgt die whole genome Amplifizierung wie in PCT/US2006/014667 offenbart. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt, die methylierungsunspezifische Amplifkation ortspezifisch. Die Amplifkation erfolgt hier durch die Wahl geeigneter Primer. Je nach Fragestellung ist es vorteilhaft sowohl nur eine Ort als auch eine Vielzahl von Orten der umgewandelten Nukleinsäure zu amplifizieren.
In weiteren Ausführungsformen erfolgt eine Anreichung der zu untersuchenden Nukleinsäure. Dies kann sowohl vor der Bisulfitumwandlung erfolgen als auch danach. Dem Fachmann sind geeignete Methoden bekannt. Vorzugsweise erfolgt eine Anreicherung methylierter und/oder unmethylierte Nukleinsäure vor der Bisulfit-Behandlung im Wesentlichem wie in PCT/US2006/005379 beschrieben. Vorzugsweise erfolgt eine Anreicherung bisulfitierter Nukleinsäure durch genspezifische oder durch Gen unspezifische Amplifkation, insbesondere durch genspezifische PCR Amplifikation oder durch eine sogenannte „Whole Genome Amplification" (WGA; beispielsweise analog PCT/US2006/014667).
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis mehrerer Methylierungsmuster. Diese Ausführungsform umfasst die Umsetzung einer zu untersuchende Nukleinsäure, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Sie umfasst außerdem mehrere Zymogene. Hierbei ist mindestens ein Zymogen einem Methylierungsmuster zugeordnet. Dieses mindestens eine Zymogen zeichnet sich dadurch aus, dass die von ihm kodierte katalytische Nukleinsäureaktivität sich eindeutig im Vergleich zu anderen katalytischen Nukleinsäureaktivitäten unterscheiden läßt, die andere Methylierungsmustern zugeordnet sind. Weiterhin umfasst diese Ausführungsform das Nachweisen der unterschiedlichen katalytischen Nukleinsäureaktivitäten, die durch eine Amplifikation der umgesetzten Nukleinsäure in Gegenwart der Zymogene entstanden sind.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform umfasst mehrere Oligonukleotide. Hierbei ist mindestens ein Oligonukleotid spezifisch für ein Methylierungsmuster. Die besagten Oligonukleotide sind geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation. Während der Amplifkation ist ein Oligonukleotid zu seinem entsprechenden Zymogen so orientiert, dass ein Amplifikat generiert wird, das sowohl eine Sequenz oder eine revers komplilmentäre Sequenz der umgesetzten zu untersuchenden Nukleinsäure als auch die durch das Zymogen kodierte katalytische Nukleinsäureaktivität umfasst.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform umfasst die Quantifizierung mehrerer Methylierungsmuster. Dies erfolgt durch die Quantifizierung der durch Amplifikation generierten katalytischen Nukleinsäureaktivitäten.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis mehrerer Methylierungsmuster in Gegenwart verschiedener Nukleinsäuren. Diese Ausführungsform umfasst die Umsetzung der verschiedenen Nukleinsäuren, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Sie umfasst außerdem mindestens ein Oligonukleotid geeignet für die Initiierung der Nukleinsäureamplifikation. Weiterhin umfasst sie, mindestens eine katalytische Nukleinsäureaktivität, die in der Lage ist einen Teil der Amplifikate so zu modifizieren, dass diese für eine weitere Amplifikation nicht mehr zur Verfügung stehen. Diese katalytischen Nukleinsäureaktivitäten sind also spezifisch für nicht zu detektierende Methylierungsmuster. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Methylierunsmuster, die dieselbe Cytosinposition, dieselben Cytosinpositionen oder nur einen Teil davon mit unterschiedlicher Methylierung umfassen. Auf diese Art und Weise kommt es zu einer Unterdrückung der Amplifikation von Amplifikaten, die Indikativ für unerwünschte Methylierungsmuster sind. Das Vorliegen der gesuchten Methylierungsmuster erfolgt durch Detektion der Amplifkate, deren Amplifkation nicht unterdrückt wurde. Dieser Nachweis erfolgt gemäß Standardverfahren wie sie dem Fachmann bekannt sind. Die vorliegenden Methylierungsmuster sind auch quantifizierbar. Dem Fachmann sind geeignete Methoden hierfür bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die katalytischen Nukleinsäureaktivitäten durch Zymogene kodiert, die sich auf den Oligonukleotiden befinden, die ebenfalls einen als Primer dienenden Bereich umfassen. Dadurch bedingt ist eine katalytische Nukleinsäureaktivität Teil eines Amplifikats. Eine katalytische Nukleinsäureaktivität ist in der Lage methylierungsspezifisch an Amplifikate zu binden und diese zu modifizieren. Vorzugsweise erfolgt dies in cis d.h. eine katalytische Nukleinsäureaktivität modifiziert das Amplifikat das es selbst umfasst.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform entstehen die katalytischen Nukleinsäureaktivitäten nicht bei der Amplifikation umgesetzter Nukleinsäure. Vorzugsweise werden sie der Amplifikation zugesetzt. Die katalytische Nukleinsäureaktivität ist in dieser Ausführungsform nicht nur in der Lage einen Teil der Amplifikate so zu modifizieren, sondern auch einen Teil der umgesetzten zu untersuchenden Nukleinsäure. Dadurch steht nur ein Teil der umgesetzten zu untersuchenden Nukleinsäure bzw. nur ein Teil der Amplifikate für eine weitere Amplifikation zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eines oder mehrere der nachgewiesenen oder quantifizierten Methylierungsmuster indikativ für eine Erkrankung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, das es den Nachweis eines oder mehrerer Methylierungsmuster in einer Nukleinsäure oder einem Gemisch von unterschiedlichen Nukleinsäuren mit höherer Sensitivität und Spezifität erlaubt als die bisher bekannten Verfahren. Hierbei umfasst ein Methylierungsmuster eine oder mehrere Positionen einer Nukleinsäure, die jeweils methyliert oder nicht methyliert vorliegen. Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahren zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine Analyse von zu untersuchenden bzw. zu untersuchenden und umgesetzten Nukleinsäuren erlauben, die als kleiner als 200 Nukleotide (nt) sind. Bevorzugte Ausführungsformern zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine Analyse von zu untersuchenden bzw. zu untersuchenden und umgesetzten Nukleinsäuren erlauben, die kleiner als 150 nt sind. Besonders bevorzugte Ausführungsformern zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine Analyse von zu untersuchenden bzw. zu untersuchenden und umgesetzten Nukleinsäuren erlauben, die als kleiner als 100 nt sind. Überraschender Weise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch Ausführungsformen, die sich dadurch auszeichnen, dass sie eine Analyse von zu untersuchenden bzw. zu untersuchenden und umgesetzten Nukleinsäuren erlauben, die als kleiner als 50 nt sind.
Teil der Erfindung ist ebenso ein Oligonukleotid, was sich dadurch auszeichnet, dass es den Nachweis eines oder mehrerer Methylierungsmuster in einer Nukleinsäure oder einem Gemisch von unterschiedlichen Nukleinsäuren mit höherer Sensitivität und Spezifität erlaubt als die bisher bekannten Oligonukleotide. Hierbei umfasst ein Methylierungsmuster eine oder mehrere Positionen einer Nukleinsäure, die jeweils methyliert oder nicht methyliert vorliegen. Das erfindungsgemäße Oligonukleotid umfasst einen Bereich, der die Basen A, C, T, G oder Derivate hiervon an Positionen umfasst, die geeignet sind, einzelne Methylierungsmuster spezifisch zu erkennen. Diese Positionen haben sowohl eine Methylierungsspezifität als auch eine Sequenzspezifität. Außerdem umfasst dieser Bereich nur die Basen A, C, T oder Derivate hiervon, oder die Basen A, G, T oder Derivate hiervon an allen übrigen Positionen. Diese besitzen eine Sequenzspezifität besitzen. Vorzugsweise befindet sich dieser Bereich am 3' Ende des erfindungsgemäßen Oligonukleotids. Das erfindungsgemäße Oligonukleotid umfasst ferner eine katalytische Nukleinsäureaktivität oder eine Sequenz die für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert.
Ein bevorzugtes Oligonukleotid zeichnet sich dadurch aus, dass es geeignet ist für die Initiierung einer Verlängerung oder Amplifikation. Vorzugsweise wird ein solches Oligonukleotid in Ausführungsformen der Erfindung verwendet, in denen die katalytische Nukleinsäureaktivität während der Amplifikation entsteht.
Ein anderes bevorzugtes Oligonukleotid zeichnet sich dadurch aus, dass es nicht verlängerbar ist, also selbst nicht amplifizierbar ist. Vorzugsweise wird ein solches Oligonukleotid in Ausführungsformen der Erfindung verwendet, in denen die Amplifizierung von Nukleinsäuren erfolgt, deren Amplifizierungs indikativ ist für ein nicht zu detektierendes Methylierungsmuster.
Ein bevorzugtes Oligonukleotid umfasst ferner mindestens einen Bereich, der spezifisch ist für ein Substrat oder der für die revers komplementäre Sequenz eines Substrats. Dieser Bereich bzw. diese Bereiche befinden sich vorzugsweise 5' und/oder 3' von der katalytischen Nukleinsäureaktivität oder 5' und/oder 3' von der Sequenz, die für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert.
Die Erfindung umfasst ferner eine Kit umfassend ein Reagenz oder Enzym für die Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Der erfindungsgemäße Kit umfasst ferner eine katalytische Nukleinsäureaktivität oder eine Sequenz, die für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert. Eine bevorzugte Ausführungsform des Kits umfasst außerdem ein Behältnis in dem alle Komponenten des Kits Platz finden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Kits umfasst einen Bereich eines Oligonukleotids, der geeignet ist für die Initiierung der Nukleinsäureamplifikation. Vorzugsweise ist dieser Bereich geeignet, als methylierungsspezifischer Primer zu fungieren.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Kits umfasst ein methylierungsspezifisches Blockermolekül.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Kits umfasst ein Substrat, das durch die katalytische Nukleinsäureaktivität in detektierbarer Weise modifizierbar ist. Vorzugsweise ist das Substrat eine Nukleinsäure. Vorzugsweise ist das Substrat markiert. Vorzugsweise ist das Substrat mit einen Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere be vorzugt mit einen Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher.
Ein besonders bevorzugter Kit umfasst ein oder mehrere erfindungsgemäße Oligonukleotide. Ein besonders bevorzugter Kit umfasst ein oder mehrere methylierungsspezifisch Primer. Ein besonders bevorzugter Kit umfasst ein oder mehrere Oligonukleotide, die einen Bereich umfassen, der als methylierungsspezifische Primer fungiert.
Ein besonders bevorzugter Kit ist ein Kit zur Nukleinsäureamplifikation. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um ein Verfahren wie es dem Fachmann bekannt ist. Besonder bevorzugt handelt es sich hierbei um ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe umfassend: PCR, SDA (single strand displacement amplification) wie beispielsweise isothermale Amplifikation, TMA (transcription mediated amplification) wie beispielsweie NASBA, LCR, Verfahren zur methylierungsspezifischen Amplifikation, MSP (Methylierungsspezifische PCR), nested MSP, HeavyMethyl^TM, Methylierungssensitive Primerextension, oder Ms-SNuPE (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension).
Vorzugsweise, umfasst die Erfindung ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und/oder des erfindunggemäßen Kits zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen. Ein nachteiliges Ereignis ist hierbei ein Ereignis, dass einem oder mehreren der folgenden Kategorien angehört: Unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; ZNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Gastrointestinaltraktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abnormalität im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Der hier verwendete Begriff der Diagnose umfasst die Diagnose eines nachteiligen Ereignisses, eine Prädisposition für ein nachteiliges Ereignis und/oder eine Progression eines nachteiligen Ereignisses.
Vorzugsweise, umfasst die Erfindung ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und/oder des erfindunggemäßen Kits zur Unterscheidung von Zell- oder Gewebe-Typen oder zur Untersuchung der Zell-Differenzierung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines oder mehrerer Methylierungsmuster, umfassend

a) die Umsetzung von Nukleinsäure, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, und
b) eine katalytische Nukleinsäureaktivität.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters in der Nukleinsäure einer Probe, umfassend

a) die Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure einer Probe, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
b) das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit
i) einem Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation, und
ii) einem Zymogen, welches eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert und damit dessen revers komplementäre Sequenz darstellt, unter Bedingungen, die eine Primer-initiierte Nukleinsäureamplifikation und eine Aktivität einer katalytischen Nukleinsäureaktivität erlauben, wobei das Oligonukleotid und das Zymogen so zueinander orientiert sind in Gegenwart der zu untersuchenden Nukleinsäure, dass ein Amplifikat generiert wird, welches eine Sequenz oder eine revers komplementäre Sequenz der zu untersuchenden Nukleinsäure umfasst sowie die katalytische Nukleinsäureaktivität; und
c) den Nachweis der katalytischen Nukleinsäureaktivität, wodurch auf das Vorliegen eines Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst weiterhin die quantitative Bestimmung der katalytischen Nukleinsäureaktivität generiert in Schritt b), wodurch das Auftreten eines Methylierungsmusters in der Nukleinsäure einer Probe quantifiziert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters in einem Gemisch verschiedener Nukleinsäuren, umfassend

a) die Umsetzung der verschiedenen zu untersuchenden Nukleinsäuren, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
b) das In-Kontakt-Bringen der umgesetzten Nukleinsäuren mit mindestens einem Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation;
c) das In-Kontakt-Bringen einer katalytischen Nukleinsäureaktivität mit Amplifikaten während der Nukleinsäureamplifikation, wobei ein Teil der Amplifikate durch die katalytische Nukleinsäureaktivität modifiziert wird.
d) der Nachweis der nicht-modifizierten Amplifikate, wodurch auf das Vorliegen eines Methylierungsmusters in dem Gemisch der verschiedener zu untersuchenden Nukleinsäuren geschlossen wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst weiterhin die quantitative Bestimmung der nicht-modifizierte Amplifikate, wodurch das Auftreten eines Methylierungsmusters in der Nukleinsäure einer Probe quantifiziert wird.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die quantitative Bestimmung der katalytischen Nukleinsäureaktivität umfasst

a) den Vergleich der katalytischen Nukleinsäureaktivität mit einem Standard,
b) real time Quantifizierung, oder
c) die Quantifizierung mehrerer katalytischer Nukleinsäureaktivitäten relativ zueinander

Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei das Oligonukleotid, das eine Primersequenz umfasst, und das Zymogen auf unterschiedlichen Molekülen oder auf demselben Molekül angeordnet sind.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die Nukleinsäureamplifikation eine „rolling circle" Amplifikation ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst die Fragmentierung der zu untersuchenden DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zusätzlich die Ligation von Adaptern an die erzeugten Fragmente.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zusätzlich die Ligation von Zymogenen an die erzeugten Fragmente.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die umgesetzte Nukleinsäure mit mindestens zwei Oligonukleotiden in Kontakt gebracht wird, die jeweils eine Primersequenz umfassen, und wobei mindestens eines der Oligonukleotide das Zymogen umfasst.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die katalytische Nukleinsäureaktivität eines Amplifikats in cis eine Sequenz des Amplifikats erkennt und das Amplifikat schneidet.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die zu untersuchende Nukleinsäure mit mindestens zwei Oligonukleotiden in Kontakt gebracht wird und die besagten Oligonukleotide jeweils eine Primersequenz und ein Zymogen umfassen.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die zu untersuchende Nukleinsäure genomische DNA, DNA, oder RNA ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst die reverse Transkription zu untersuchender RNA.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst die Transkription zu untersuchender DNA.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei eines oder mehrere der Oligonukleotide mindestens ein Nukleotid, ein Ribonukleotid, ein PNA-monomer, oder ein Derivat davon umfasst.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die Nukleinsäureamplifikation die Verwendung von mindestens einem Nukleotid, einem Ribonukleotid, einem PNA-monomer, oder einem Derivat davon umfasst.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die katalytische Nukleinsäureaktivität ein Ribozym oder ein DNAzym ist.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die katalytische Nukleinsäureaktivität die detektierbare Modifikation mindestens eines Substrats umfasst.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die detektierbare Modifikation ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend: Bildung und Spaltung einer Phosphodiesterbindung; Nukleinsäure-Ligation und -Spaltung; Porphyrin Metallation; Bildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Ester- und Amid-Bindung.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die detektierbare Modifikation die Spaltung eines fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure-Moleküls umfasst.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei das fluoreszenzmarkierte Nukleinsäure-Molekül eine DNA-RNA-Chimäre ist.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei mindestens ein Oligonukleotid einen Bereich umfasst, der als methylierungsspezifischen Primer fungiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zusätzlich zu allen hierin genannten Ausführungsformen methylierungsspezifische Blockermoleküle.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst eine zusätzliche methylierungsspezifische oder methylierungsunspezifische Amplifizierung der umgesetzten DNA.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens mehrerer Methylierungsmuster in der Nukleinsäure einer Probe, umfassend

a) die Umsetzung einer zu untersuchende Nukleinsäure einer Probe, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
b) das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit
i) mehreren Oligonukleotiden, wobei es für jedes Methylierungsmuster zumindest ein Oligonukleotid gibt, welches die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation geeignet ist, und
ii) mehreren Zymogenen, wobei es für jedes Methylierungsmuster zumindest ein Zymogen gibt, welches eine katalytische Nukleinsäureaktivität, deren Aktivität einzeln meßbar ist, kodiert und damit dessen revers komplementäre Sequenz darstellt,

c) den gleichzeitigen Nachweis jeder katalytischen Nukleinsäureaktivität, wodurch auf das Vorliegen von Methylierungsmustern in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst weiterhin die quantitative Bestimmung jeder katalytischen Nukleinsäureaktivität generiert in Schritt b), wodurch das Auftreten von Methylierunsmustern in der Nukleinsäure einer Probe quantifiziert wird.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens mehrerer Methylierungsmuster in einem Gemisch verschiedener Nukleinsäuren, umfassend

a) die Umsetzung der verschiedenen zu untersuchenden Nukleinsäuren, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
b) das In-Kontakt-Bringen der umgesetzten Nukleinsäuren mit mindestens einem Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation;
c) das In-Kontakt-Bringen mindestens einer katalytischen Nukleinsäureaktivität mit Amplifikaten während der Nukleinsäureamplifikation, wobei ein Teil der Amplifikate durch die katalytische Nukleinsäureaktivität modifiziert wird.
d) der Nachweis der nicht-modifizierten Amplifikate, wodurch auf das Vorliegen mehrerer Methylierungsmuster in dem Gemisch der verschiedenen zu untersuchenden Nukleinsäuren geschlossen wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst weiterhin die quantitative Bestimmung der nicht-modifizierten Amplifikate, wodurch das Auftreten von Methylierunsmustern in der Nukleinsäure einer Probe quantifiziert wird.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die Umsetzung von Nukleinsäure Bisulfit umfasst.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die Nukleinsäureamplifikation durchgeführt wird gemäß einer Methode der Gruppe umfassend PCR, SDA und TMA.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei das Vorliegen eines Methylierungsmusters in einer Probe eine Erkrankung indiziert.
Bevorzugt ist ferner ein Oligonukleotid, umfassend

a) einen Sequenzabschnitt, umfassend eine katalytische Nukleinsäureaktivität oder eine Sequenz, die für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert, und
b) einen Sequenzabschnitt, der
i) die Basen A, C, T, oder G an Positionen umfasst, die geeignet sind, um zwischen umgesetzten methylierten und zwischen umgesetzte nicht-methylierte Positionen des zu untersuchenden Nukleinsäure zu unterscheiden; und
ii) nur die Basen A, T, C oder nur die Basen A, T, G an allen weiteren Positionen umfasst.

Ein besonders bevorzugtes Oligonukleotid umfasst zusätzlich einen oder mehrere Sequenzabschnitte, die selbst oder ihre revers komplimentäre Sequenz die Bindung an ein Substrat vermitteln.
Bevorzugt ist ferner ein Kit für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend:

a) ein Reagenz oder Enzym, welches eine Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure ermöglicht, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
b) eine katalytische Nukleinsäureaktivität oder ein Zymogen, welches für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert.

Ein besonders bevorzugter Kit umfasst

a) ein Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation, und/oder
b) ein methylierungsspezifisches Blockermolekül.

Ein besonders bevorzugter Kit umfasst ein Substrat, das durch die katalytische Nukleinsäureaktivität in detektierbarer Weise modifizierbar ist.
Besonders bevorzugt ist ein Kit, wobei der Bereich des Oligonukleotids, der die Initiierung der Nukleinsäure ermöglicht,

a) die Basen A, C, T, oder G an Positionen umfasst, die geeignet sind, um zwischen umgesetzten methylierten und zwischen umgesetzte nicht-methylierte Positionen eines zu untersuchenden Nukleinsäure zu unterscheiden; und
b) nur die Basen A, T, C oder nur die Basen A, T, G an allen weiteren Positionen umfasst.

Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder des erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder des erfindungsgemäßen Kits ist die Verwendung zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder. Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: Unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; ZNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Gastrointestinaltraktes; Fehlfunktion, Schädigung oder. Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abnormalität im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder des, erfindungsgemäßen. Oligonukleotids. oder. des erfindungsgemäßen Kits ist die Verwendung zur Unterscheidung von Zell- oder Gewebe-Typen oder zur Untersuchung der Zell-Differenzierung.
Alle hierin zitierten Dokumente sind hiermit zitiert mit Referenz in Hinblick auf Ihre Gesamtheit.
Die Abk. "mM" und "μM" stehen im Folgenden für die Einheiten mmol/l bzw. μmol/l; die Abk. "U" steht für Einheit.
Beispiel 1: Quantifizierung der Methylierung des Exon1 im GSTp1-Gens mittels real time Duplex-PCR.
Einleitung:
In diesem Beispiel wird die Methylierung des Exon1 im GSTp1-Gens mit Hilfe einer real time Duplex-PCR untersucht. Die erfindungsgemäße Methode erlaubt die exakte quantitative Analyse des Methylierungsstatus von 5 CpG-Positionen, die innerhalb einer nur 28 nt langen Sequenz lokalisiert sind. Die dazu verwendeten methylierungsspezifischen Primer überspannen ein nur 46nt langen Bereich, welcher mit herkömmlichen TaqMan- oder LightCycler-Sonden nicht detektiert werden kann. Im Gegensatz dazu ist die Detektion mittels Zymogen-Primer unabhängig von der Länge des Amplifikats und kann in einer real time PCR realisiert werden. Neben der Quantifizierung der methylierten DNA erfolgt gleichzeitig die Quantifizierung der Gesamt-DNA mit Hilfe einer Referenz-PCR. Dazu wird ein weiteres Fragment innerhalb des GSTp1-Gens amplifiziert. Die Referenz-PCR erfolgt methylierungsunspezifisch und wird ebenfalls mittels Zymogen-Primer realisiert. Die Reporter-Substrate von methylierungsspezifischer PCR und Referenz-PCR sind mit unterschiedlichen Fluoreszensfarbstoffen versehen und können in der real time PCR getrennt voneinander analysiert werden. Aus dem Signal für methylierte DNA und Gesamt-DNA errechnet sich die relative Methylierung des Exon1.
Experimentelle Durchführung:
DNA wird aus Gewebeproben wird mit Hilfe einer DNA-Extraktion gewonnen (DNeasy^® Tissue-Kit, Qiagen). Anschließend erfolgt eine Bisulfit-Umwandlung der DNA nach dem Stand der Technik (z.B. WO2005038051). 10 μl der bisulfitumgewandelten und aufgereinigten DNA werden in die hier beschriebene real time Duplex-PCR eingesetzt oder bei maximal 4°C gelagert.
1μg CpGenome^TM Universal Methylated DNA (Chemicon International, Temecula USA) wird ebenfalls einer Bisulfit- Umwandlung unterzogen und dient als Standard-DNA zur Quantifizierung methylierter DNA aus Tumorgewebe.
Für die methylierungsspezifische real time PCR wird ein Abschnitt des Exon 1 des GSTp1 Gens (GeneBank AY324387 nt 1877–1923) nach Bisulfitumwandlung analysiert (GSTp1 Abschnitt A; SEQ ID NO: 4). Die Verwendung des vorwärts Primers 1 (SEQ ID NO: 1) und des Zymogen-Primers 1 (SEQ ID NO: 2) führen zur Amplifikation des GSTp1-Amplifikats 1 (SEQ ID NO: 11). Die katalytische Nukleinsäureaktivität (SEQ ID NO: 5), ein DNAzym, ist Teil des Amplifkats und auf dem revers komplimentären Strang der dargestellten Amplifikatssequenz (SEQ ID NO: 11) lokalisiert. Es spaltet das Reparter Substrat 1 an den Ribonukleiden „gu", wodurch Fluorophar und Quencher räumlich getrennt werden.
Für die methylierungsunspezifische real time. PCR. wird ein Abschnitt unterhalb von Exon 1 des GSTp1 Gens nach Bisulfitumwandlung analysiert (SEQ ID NO: 9). Die Verwendung des vorwärts Primers 2. (SEQ ID NO: 6) und des Zymogen-Primers 2 (SEQ ID NO: 7) führen zur Amplifikation des GSTp1-Amplifikats 2 (SEQ ID. NO: 12). Die katalytische Nukleinsäureaktivität (SEQ ID NO: 10), ein DNAzym, ist Teil des Amplifkats und auf dem revers komplimentären Strang der dargestellten Amplifikatssequenz (SEQ ID NO: 12) lokalisiert. Es spaltet das Reporter Substrat 2 an den Ribonukleiden „gu", wodurch Fluorophor und Quencher räumlich getrennt werden.
Ein Überblick über die Sequenzen ist in Tabelle 2 gegeben. Die Orientierung der Sequenzen zueinander ist in 4 dargestellt. Die Primer sind jeweils spezifisch für die bisulfitumgewandelten Sequenzen.
Der Reaktionsansatz (20 μl) enthält folgende Komponenten:
10 μl Templat-DNA
2 μl of FastStart LightCycler Mix for Hybridization Proben (Roche Diagnostics)
3.5 mM MgCl₂ (Roche Diagnostics)
0.4 μM vorwärts Primer 1 (SEQ ID NO: 1)
0.1 μM Zymogen-Primer 1 (SEQ ID NO: 2)
0.2 μM Reporter Substrat 1 (SEQ ID NO: 3)
0.4 μM vorwärts Primer 2 (SEQ ID NO: 6)
0.1 μM Zymogen-Primer 2 (SEQ ID NO: 7)
0.2 μM Reporter Substrat 2 (SEQ ID NO: 8)
1 U HotGoldStar Polymerase (Eurogentec)
Die Duplex real time PCR besitzt folgendes Temperatur-Zeit-Profil: Denaturierung 10 min 95 °C; Amplifikation: 45 Zyklen a 10 s 95 °C, 20 s 56 °C; Kühlung: 10 s bei 40 °C. Die Amplifikation erfolgt in einem real time PCR-Gerät (LightCycler 2.0, Roche Diagnaostics). Die Fluoreszenssignale resultierend von umgesetzten Reporter Substraten werden bei 530 nm und bei 610 nm in jedem Zyklus beim Schritt 20 s 56 °C detektiert.
Datenanalyse: Die Fluoreszensdaten werden mit Hilfe der vom Hersteller vorgesehenen Software analysiert und die „threshold cycle" (CT) ermittelt. Dies ist Stand der Technik und dem Experten bekannt (z.B. Real-time PCR, M. Tevfik Dorak, Taylor & Francis, April 2006, ISBN: 041537734X). Es bestehen grundsätzlich 2 Möglichkeiten der Datenanalyse.
Möglichkeit 1:
Eine externe Standard-DNA-Verdünnungsreihe wird dazu genutzt, die Menge methylierter DNA des Exon-1 zu bestimmen. Dazu werden die „threshold cycle" (CT) aus dem Kanal 530 nm herangezogen. Die Bestimmung der Gesamt-DNA des GSTp1-Gens erfolgt ebenfalls mit Hilfe der externen Standard-DNA-Verdünnungsreihe mittels CT des Kanals 610 nm. Der Methylierungsgrad der CpG-Positionen des Exon-1 berechnet sich dann aus dem Verhältnis der Menge methylierter DNA zur Menge der Gesamt-DNA (Eads CA, Lord RV, Wickramasinghe K, Long TI, Kurumboor SK, Bernstein L, Peters JH, DeMeester SR, DeMeester TR, Skinner KA, Laird PW. Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res. 2001 Apr 15; 61(8): 3410–8).
Möglichkeit 2:
Der Grad der Methylierung errechnet sich auch aus der Differenz der CT (Delta-CT) des Kanals 530 nm (methylierte DNA) zum Kanal 610 nm (Gesamt-DNA). Der Delta-CT Wert beträgt annähernd Null, wenn die untersuchte DNA vollständig methlyiert vorliegt. Das Delta-CT Wert wird umso größer, je weniger methylierte DNA nachgewiesen wird. Diese Art der relativen Berechnung des Methylierungsgrades benötigt keine externe Standard-DNA-Verdünnungsreihe. Die Methodik ist Stand der Technik und ist dem Experten bekannt (beispielsweise durch WO 2005/098035). Tabelle 2: Übersicht über die Sequenzen
Kursiv sind genspezifische Sequenzen der Primer dargestellt. Einfach unterstrichen sind die Zymogen-Bereiche, die den katalytischen Teil des jeweiligen DNAzyms kodieren. Doppelt unterstrichen ist katalytischer Teil des jeweiligen DNAzyms. Große Buchstaben stellen Desoxyribonukleotide dar, kleine Buchstaben stellen Ribonukleotide dar. Fett dargestellt sind Bereiche in den Amplifikaten, an denen die jeweiligen Reporter Substrate spezifisch binden. Die Abkürzungen der Modifikationen bedeuten: FAM = 6-Carboxyfluoresceine, HEX = 6-Hexachlorofluoresceine, BHQ1 = B1ackHoleQuencher1. (Die Orientierung der Sequenzen zueinander ist in 4 dargestellt.)
Detailierte Beschreibung der Methode:
Der methylierungsspezifische vorwärts Primer 1 (SEQ ID NO: 1) bindet an den bisulfitumgewandelten sense Strang der methylierten Sequenz. Der ebenfalls methylierungsspezifische Zymogen-Primer 1 (SEQ ID NO: 2) bindet an die Sequenz, welche nach dem ersten PCR-Zyklus synthetisiert wurde und enthält am 5'-Ende neben der genspezifischen Sequenz (kursiver Teil von SEQ ID NO: 2) ein Zymogen (nicht kursiver Teil von SEQ ID NO: 2). Vorwärts Primer 1 und Zymogen-Primer 1 überspannen je zwei CpG-Positionen und amplifizieren nur methylierte DNA. Damit ist das durch den Zymogenprimer kodierte DNAzym methylierungsspezifisch. Ab dem 3. PCR-Zyklus wird das aktive methylierungsspezifische DNAzym (SEQ ID NO: 5) generiert. Das im PCR-Reaktionsansatz enthaltene Reporter Substrat 1 ist ein DNA/RNA-Chimer (SEQ ID NO: 3) und trägt am 5'-Ende einen Fluorezenzfarbstoff (FAM) und am 3'-Ende einen Quencher (BHQ1). Das Reporter Substrat 1 besitzt Abschnitte, die komplementär zur Sequenz des DNAzym sind (fett dargestellt in SEQ ID NO: 11). Die katalytische Aktivität des DNAzyms (doppelt unterstrichen in SEQ ID NO: 11) führt zu einer Hydrolyse des Reporter Substrats 1, wodurch der Fluoreszenzfarbstoff FAM vom Quencher BHQ1 räumlich getrennt wird. Damit erhöhte sich die Fluoreszenz im Wellenlängenbereich 530 nm.
Der vorwärts Primer 2 (SEQ ID NO: 6) bindet an den bisulfitumgewandelten sense-Strang unterhalb von Exon1 des GSTp1 Gens. Der Zymogen-Primer 2 (SEQ ID NO: 7) bindet an die Sequenz, welche nach dem ersten PCR-Zyklus synthetisiert wurde und besitzt am 5'-Ende neben der genspezifischem Sequenz (kursiver Teil von SEQ ID NO: 7) ein Zymogen (nicht kursiver Teil von SEQ ID NO: 7). Vorwärts Primer 2 und Zymogen-Primer 2 überspannen keine CpG-Positionen und amplifizieren sowohl methylierte als auch nicht methylierte DNA. Damit ist das durch den Zymogenprimer kodierte DNAzym methylierungsunspezifisch. Ab dem 3. PCR-Zyklus werden Sequenzen des aktiven methylierungsunspezifischen DNAzyms (SEQ ID NO: 10) generiert. Das im PCR-Reaktionsansatz enthaltene Reporter Substrat 2 ist ein DNA/RNA-Chimer (SEQ ID NO: 8) und trägt am 5'-Ende den Fluorezenzfarbstoff HEX und am 3'-Ende den Quencher BHQ1. Das Reporter Substrat 2 besitzt Abschnitte die komplementär zur Sequenz des methylierungsunspezifischen DNAzyms sind (fett dargestellt in SEQ ID NO: 12). Die katalytische Aktivität des methylierungsunspezifischen DNAzyms (doppelt unterstrichen in SEQ ID NO: 12) führt zu einer Hydrolyse des Reporter Substrats 2, wodurch der Fluoreszenzfarbstoff HEX räumlich getrennt wird vom Quencher BHQ1. Damit erhöht sich die Fluoreszens im Wellenlängenbereich 610 nm.
Diese real time Duplex-PCR stellt ein diagnosatisches Mittel zur Detektion von Prostatakrebs dar, da sie CpG Positionen des Exon1 umfasst, die methyliert bei Prostatakrebs vorliegen, während gesundes Gewebe keine Methylierung aufweist (Song JZ, Stirzaker C, Harrison J, Melki JR, Clark SJ. Hypermethylation trigger of the glutathione-S-transferase gene (GSTP1) in prostate cancer cells. Oncogene. 2002 Feb 7; 21(7): 1048–61); Nakayama M, Gonzalgo ML, Yegnasubramanian S, Lin X, De Marzo AM, Nelson WG. GSTP1 CpG island hypermethylation as a molecular biomarker for prostate cancer. J Cell Biochem. 2004 Feb 15; 91(3): 540–52).
Die beschriebene real time Duplex-PCR bietet folgende Vorteile gegenüber bisherigen Verfahren zur Methylierungsanalyse von GSTp1:

1. Analyse der Co-Methylierung von ausschließlich 5 CpG-Positionen des Exon 1.
2. Schnelle hochdurchsatzfähige Methylierungsanalyse ohne externen Standard, durch Duplex-Reaktion mit einer Referenz-PCR.
3. Erhöhung sowohl der Sensitivität als auch der Spezifität, dadurch dass auch kleine Fragmente detektiert werden können. Dies ist darin begründet, dass genspezifische Bereiche von nur jeweils 46 nt (methylierungsspezifische bzw. methylierungsunspezifische PCR) nachgewiesen werden.
4. Ermöglichung der Analyse von hochgradig fragmentierter DNA, wie beispielsweise DNA aus formalin-fixiterten paraffin-eingebetteten Proben oder Tumor-DNA aus Körperflüssigkeiten wie Serum. Da auch kleine Fragmente detektiert werden können. Dies ist darin begründet, dass genspezifische Bereiche von nur jeweils 46 nt (methylierungsspezifische bzw. methylierungsunspezifische PCR) nachgewiesen werden.

Die Sensitivität und auch die Spezifität eines auf Methylierung basierenden diagnostischen Tests kann durch Anwendung der beschriebenen Methode erheblich verbessert werden.
Beispiel 2: Quantifizierung der Methylierung des Exon1 im GSTp1-Gens mittels real time PCR.
Die in Beispiel 1 beschriebenen PCR Reaktion werden nicht in einer real time Duplex-Reaktion sondern in einzelenen real time PCR Reaktionen für methylierte DNA und Gesamt-DNA durchgeführt.
Beispiel 3: Quantifizierung der Methylierung des Exon1 im GSTp1-Gens mittels PCR.
Die in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen PCR Reaktionen werden in einem konventionellem PCR-Gerät durchgeführt. Die Auswertung erfolgt mittels Endpunktbestimmung der Fluoreszenssignale wie in WO 2005/098035 erläutert.
Beschreibung der Figuren
1:
1 zeigt die vollständige Umsetzung von unmethyliertem Cytosin in Uracil (Bisulfit-Umwandlung).
Im ersten Schritt der Reaktion reagieren unmethylierte Cytosinbasen mit Hydrogensulfit bei einem pH von etwa 5 und werden in Position C6 sulfoniert. Der zweite Schritt der Deaminierung findet in wässriger Lösung spontan statt. Dadurch wird Cytosinsulfonat in Uracilsulfonat umgewandelt. Der dritte Schritt ist die Desulfonierung, die im Alkalischen stattfindet. Dabei entsteht Uracil.
2:
2 zeigt eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem das als Primer dienende Oligonukleotid und das Zymogen auf unterschiedlichen Molekülen angeordnet sind, wobei die Nukleinsäureamplifikation als „rolling circle" Amplifikation (RCA) ausgeführt wird.
In Teil A der 2 ist ein mit Bisulfit umgesetztes einzelsträngiges DNA-Molekül (1) gezeigt, das ein bestimmtes Methylierungsmuster hin analysiert werden soll. Alle in der unbehandelten zu untersuchenden DNA unmethylierten Cytosinbasen sind nun zu Uracil umgewandelt. Sie sind durch ein „u" dargestellt.
Das umgesetzte zu untersuchende DNA-Molekül tritt mit einem linearen ligierbaren einzelsträngigen DNA-Molekül (2) in Wechselwirkung.
Dieses lineare ligierbare einzelsträngige DNA-Molekül (2) weist

– einen methylierungsspezifischen oder einen gen- und methylierungsspezifische Ligationsbereich (3),
– einen beispielhaft ausgewählten ersten Sequenzabschnitt (4), an dem ein als Primer wirkendes Oligonukleotid für die Initiierung einer methylierungsspezifischen Nukleinsäureamplifikation binden kann, und
– einen zweiten Sequenzabschnitt in Form eines Zymogens, welches für eine katalytische Nukleinsäureaktivität, z. B. ein 10-23 DNAzym, kodiert.

Der Ligationsbereich (3) des linearen ligierbaren einzelsträngigen DNA-Moleküls (2) weist in dem hier gezeigten Beispiel an den Positionen, die den zu untersuchenden Positionen des ligierbaren einzelsträngigen DNA-Moleküls (1) entsprechen, Guaninbasen auf (siehe Hervorhebung). Eine vollständige Hybridisierung mit der Sequenz des Ligationsbereichs (3), also ohne mismatches, ist in diesem Beispiel nur möglich, wenn diese Positionen in dem ursprünglichen, also unbehandelten DNA-Molekül methyliert waren und damit nach Bisulfitbehandlung als Cytosin und nicht als Uracil vorliegen. Selbstverständlich ist es auch möglich, einen Ligationsbereich bereitzustellen, der an einer oder beiden dieser Positionen ein A aufweist, um ein Signal bei einer Nicht-Methylierung zu erhalten.
Durch die Bisulfitumwandlung doppelsträngiger DNA entstehen zwei unterschiedliche nicht mehr zueinander komplimentäre DNA Einzelstränge. Um den zweiten Strang nach Bisulfitumwandlung zu detektieren, ist ein entsprechendes lineares ligierbares einzelsträngiges DNA-Moleküls (2) zu wählen. Liegt eine zu untersuchende Position methyliert vor, so umfasst der Ligationsbereich entsprechenderweise ein Cytosin; liegt sie unmethyliert vor, so umfasst der Bereich entsprechenderweise ein Thymin, um jeweils eine vollständige Hybridisierung zu erzielen.
Bei vollständiger Hybridisierung wird durch eine im Reaktionsansatz enthaltene Ligase, ein ringförmiges DNA-Molekül (Minicircle) hergestellt.
In Teil B der 2 ist die eigentliche rolling circle Amplifikation (RCA) dargestellt. Ein als Primer fungierendes Oligonukleotid initiiert die Amplifikation des generierten Minicircles. Dabei wird ein Molekül amplifiziert, das ein Concatamer des Minicircles darstellt. Es weist die katalytische Nukleinsäureaktivität (7) mehrfach auf. Die katalytische Nukleinsäureaktivität ist die revers komplimentäre Sequenz des Zymogens (5). Die katalytische Nukleinsäureaktivität (7) ist bevorzugt ein 10-23 DNAzym.
An die katalytischen Nukleinsäureaktivität (7) bindet ein Substrat (8) durch Hybridisierung. Die katalytische Nukleinsäureaktivität (7) modifiziert daraufhin das Substrat (8), so dass es detektiert werden kann. Das Substrat (8) ist bevorzugt ein Oligonukleotid, insbesondere ein fluoreszenz-markiertes Nukleinsäure-Molekül in Form einer DNA-RNA-Chimäre, das an einem Ende markiert ist durch einen Fluoreszenzfarbstoff und an seinem anderen Ende durch einen Quencher.
Das hier dargestellte Substrat (8) weist an einem Ende einen Fluoreszenzfarbstoff und am anderen Ende einen Quencher auf. Durch die von der katalytische Nukleinsäureaktivität (7) katalysierte Spaltung des Substrats (8) werden Fluoreszenzfarbstoff und Quencher voneinander getrennt. Dadurch wird die Fluoreszenz des Farbstoffes als Signal detektierbar.
Das Produkt der Nukleinsäureamplifikation weist mit zunehmender Reaktionszeit eine zunehmende Anzahl katalytisch aktiver Nukleinsäureabschnitte und damit zunehmende katalytische Nukleinsäureaktivität auf. Wird nur ein Oligonukleotid zur Amplifikation verwendet, so nimmt der Umsatz eines Substrats durch die katalytische Nukleinsäureaktivität mit der Zeit linear zu. Werden hingegen zwei als Primer fungierende Oligonukleotide verwendet, so wird eine exponentielle Amplifkation der katalytischen Nukleinsäureaktivität erzielt. Entsprechend erfolgt der Umsatz des Substrates. Hierbei bindet ein Oligonukleotid spezifisch an einen Hereich des Minicircles und der andere spezifisch an Bereiche des Concatamers. Im beiden Fällen erlaubt die Detektion des Signals Rückschlüsse auf das Vorhandensein eines Methylierungsmusters in dem zu untersuchenden DNA-Molekül.
In 2 steht "active" für "aktiv"
3:
3 zeigt das 10-23 DNAzym als katalytische Nukleinsäureaktivstät. Das 10-23 DNAzym weist eine katalytische Domäne und zwei flankierende Arme auf, die jeweils revers-komplementär zum Substrat sind, das im oberen Strang dargestellt ist. Die Sequenz beider Arme kann beliebig gewählt werden. Die Schnittstelle des DNAzyms ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
In der Teilabbildung A ist eine besonders als katalytische Nukleinsäureaktivität bevorzugte Variante des 10-23 DNAzyms dargestellt.
Teilabbildung B zeigt ein allgemeines Modell der Sekundärstruktur des 10-23 DNAzyms, indem unterschiedliche Varianten des 10-23 DNAzyms zusammengefaßt sind. Verschiedene Nukleotide in der hier gezeigten Sekundärstruktur sind stark konserviert. Nicht-essentielle Nukleotide, die ohne einen Verlust von über 80 % der katalytischen Aktivität durch ein anderes Nukleotid ersetzt werden können, sind durch ein N, für jedes andere Nukleotid, gekenn zeichnet. Die Region, die wahrscheinlich die katalytische Domäne ausbildet, ist durch eine gepunktete Linie markiert. Exocyclische funktionelle Gruppen, die für die Aktivität benötigt werden, sind markiert.

N': jedes andere Nukleotid, das komplementär ist zu N
R: Purin-Präferenz
Y: Pyrimidin-Präferenz
R': komplementär zu Y oder W
M : A oder C
H: A, C oder T
D: G, A oder T
V: Ribonukleotid entweder G, A oder T
W: C oder G

4:
4 zeigt die Orientierung der Sequenzen der Duplex real time PCR des Beispiels 1. Kursiv sind genspezifische Sequenzen der Primer dargestellt. Einfach unterstrichen sind die Zymogen-Bereiche, die den katalytischen Teil des jeweiligen DNAzyms kodieren. Doppelt unterstrichen ist katalytischer Teil des jeweiligen DNAzyms. Große Buchstaben stellen Desoxyribonukleotide dar, kleine Buchstaben stellen Ribonukleotide dar. Fett dargestellt sind Bereiche in den Amplifikaten, an denen die jeweiligen Reporter Substrate spezifisch binden. Die Abkürzungen der Modifikationen bedeuten: FAM = 6-Carboxyfluoresceine, HEX = 6-Hexachlorofluoresceine, BHQ1 = B1ackHoleQuencherl. (Die Orientierung der Sequenzen zueinander ist in 4 dargestellt.)
Definitionen
Der Begriff "Methylierungsmuster" bezieht sich insbesondere, ist aber nicht darauf beschränkt, auf die An- oder Abwesenheit einer Methylierung eines oder einer Reihe von Nukleotiden. Hierbei befinden sich besagtes eines oder mehrere Nukleotide auf einem einzigen DNA-Molekül und sind in der Lage methyliert zu sein oder nicht-methyliert zu sein. Wird nur ein einziges Nukleotid betrachtet, so kann auch der Begriff "Methylierungsstatus" verwendet werden. Wird ein "Methylierungsmuster" über mehr als ein DNA-Moleküle betrachtet, so spricht man auch vom "Methylierungsgrad" oder vom "Methylierungsmustergrad". Die genannten Begriffen "Methylierungsstatus", "Methylierungsgrad" und "Methylierungsmustergrad" beziehen sich insbesondere auf das Gesagte, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Begriff "methylierungsspezifische Restriktionsenzyme" bezieht sich insbesondere, ist aber nicht darauf beschränkt, auf Enzyme, welche eine Nukleinsäuresequenz nur schneiden, wenn die Erkennungsstelle entweder nicht methyliert oder hemimethyliert oder nur dann schneiden wenn diese methyliert ist. Bei Restriktionsenzymen die spezifisch dann schneiden, wenn die Erkennungsstelle nicht oder hemimethyliert ist, erfolgt der Schnitt nicht oder mit verringerter Effizienz wenn die Erkennungsstelle methyliert ist. Bei Restriktionsenzymen die spezifisch dann schneiden, wenn die Erkennungsstelle methyliert ist, erfolgt der Schnitt nicht oder mit verringerter Effizienz wenn die Erkennungsstelle nicht methyliert ist. Bevorzugt sind methylierungsspezifische Restriktionsenzyme, deren Erkennungssequenz ein CG-Dinukleotid enthält (beispielsweise cgcg oder cccggg). Weiterhin bevorzugt für einige Ausführungsformen sind Restriktionsenzyme, die nicht schneiden, wenn das Cytosin in diesem Dinukleotid am Koh lenstoffatom C5 methyliert ist. Jegliches Enzym was eines dieser Kriterien erfüllt, ist erfindungsgemäß einsetzbar.
Der Begriff "methylierungsunspezifische Restriktionsenzyme" bezieht sich insbesondere, ist aber nicht darauf beschränkt, auf Enzyme, welche eine Nukleinsäuresequenz unabhängig von dem Methylierungsstatus mit nahezu gleicher Effizienz schneiden. Jegliches Enzym was dieses Kriterium erfüllt, ist erfindungsgemäß einsetzbar.
Der Begriff "Zymogen" bezieht sich insbesondere, ist aber nicht darauf beschränkt, auf eine Nukleinsäure, die für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert. Diese Nukleinsäure umfasst also selbst die revers komplimentäre Sequenz der katalytischen Nukleinsäureaktivität.
Der Begriff "katalytische Nukleinsäureaktivität" bezieht sich insbesondere, ist aber nicht darauf beschränkt, auf eine Nukleinsäure, die an einer chemischen Reaktion beteiligt ist, ohne sich dabei zu verbrauchen. Eine solche Nukleinsäure beschleunigt eine Reaktion, in dem sie die notwendige Aktivierungsenergie der Reaktion herabsetzt.
Der Begriff "Concatamer" (auch Concatemer) bezieht sich insbesondere, ist aber nicht darauf beschränkt, auf ein Nukleinsäuremolekül, das sich wiederholende Einheiten umfasst.
Der Begriff „Fluorophor" wird hierin synonym verwendet mit dem Begriff „Fluoreszenzfarbstoff". Hierbei handelt es sich um einen Stoff, der zur Fluoreszenz fähig ist. Er absorbiert Energie einer Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereichs und re-emittiert Energie einer anderen Wellenlänge oder eines anderen Wellenlängenbereichs.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines oder mehrerer Methylierungsmuster, umfassend a) die Umsetzung von Nukleinsäure, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, und b) eine katalytische Nukleinsäureaktivität.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters in der Nukleinsäure einer Probe, umfassend a) die Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure einer Probe, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, b) das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit i) einem Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation, und ii) einem Zymogen, welches eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert und damit dessen revers komplementäre Sequenz darstellt, unter Bedingungen, die eine Primer-initiierte Nukleinsäureamplifikation und eine Aktivität einer katalytischen Nukleinsäureaktivität erlauben, wobei das Oligonukleotid und das Zymogen so zueinander orientiert sind in Gegenwart der zu untersuchenden Nukleinsäure, dass ein Amplifikat generiert wird, welches eine Sequenz oder eine revers komplementäre Sequenz der zu untersuchenden Nukleinsäure umfasst sowie die katalytische Nukleinsäureaktivität; und c) den Nachweis der katalytischen Nukleinsäureaktivität, wodurch auf das Vorliegen eines Methylierungsmusters in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis des Vorliegens eines Methylierungsmusters in einem Gemisch verschiedener Nukleinsäuren, umfassend a) die Umsetzung der verschiedenen zu untersuchenden Nukleinsäuren, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich in ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, b) das In-Kontakt-Bringen der umgesetzten Nukleinsäuren mit mindestens einem Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation, c) das In-Kontakt-Bringen einer katalytischen Nukleinsäureaktivität mit Amplifikaten während der Nukleinsäureamplifikation, wobei ein Teil der Amplifikate durch die katalytische Nukleinsäureaktivität modifiziert wird, d) der Nachweis der nicht-modifizierten Amplifikate, wodurch auf das Vorliegen eines Methylierungsmusters in dem Gemisch der verschiedener zu untersuchenden Nukleinsäuren geschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, weiterhin umfassend die quantitative Bestimmung der katalytischen Nukleinsäureaktivität generiert in Schritt b), wodurch das Auftreten eines Methylierunsmusters in der Nukleinsäure einer Probe quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die quantitative Bestimmung der katalytischen Nukleinsäureaktivität umfasst a) den Vergleich der katalytischen Nukleinsäureaktivität mit einem Standard, b) real time Quantifizierung, oder c) die Quantifizierung mehrerer katalytischer Nukleinsäureaktivitäten relativ zu einander.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Oligonukleotid, das eine Primersequenz umfasst, und das Zymogen auf unterschiedlichen Molekülen oder auf demselben Molekül angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Nukleinsäureamplifikation eine „rolling circle" Amplifikation ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Fragmentierung der zu untersuchenden DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen.
Verfahren nach Anspruch 8, zusätzlich umfassend die Ligation von Adaptern an die erzeugten Fragmente.
Verfahren nach Anspruch 8, zusätzlich umfassend die Ligation von Zymogenen an die erzeugten Fragmente.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei die umgesetzt Nukleinsäure mit mindestens zwei Oligonukleotiden in Kontakt gebracht wird, die jeweils eine Primersequenz umfassen, und wobei mindestens eines der Oligonukleotide das Zymogen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die katalytische Nukleinsäureaktivität eines Amplifikats in cis eine Sequenz des Amplifikats erkennt und das Amplifikat schneidet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zu untersuchende Nukleinsäure mit mindestens zwei Oligonukleotiden in Kontakt gebracht wird und die besagten Oligonukleotide jeweils eine Primersequenz und ein Zymogen umfassen.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die zu untersuchende Nukleinsäure genomische DNA, DNA, oder RNA ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die katalytische Nukleinsäureaktivität ein Ribozym oder ein DNAzym ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die katalytische Nukleinsäureaktivität die detektierbare Modifikation mindestens eines Substrats umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die detektierbare Modifikation ausgewählt wird aus der Gruppe umfas send: Bildung und Spaltung einer Phosphodiesterbindung; Nukleinsäure-Ligation und -Spaltung; Porphyrin Metallation; Bildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Ester- und Amid-Bindung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei die detektierbare Modifikation die Spaltung eines fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure-Moleküls umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das fluoreszenzmarkierte Nukleinsäure-Molekül eine DNA-RNA-Chimäre ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Oligonukleotid einen Bereich umfasst, der als methylierungsspezifischen Primer fungiert.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zusätzlich umfassend methylierungsspezifische Blockermoleküle.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend eine zusätzlich methylierungsunspezifische oder eine methylierungsspezifische Amplifizierung der umgesetzten DNA.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis des Vorliegens mehrerer Methylierungsmuster in der Nukleinsäure einer Probe, umfassend a) die Umsetzung einer zu untersuchende Nukleinsäure einer Probe, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, b) das In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Nukleinsäure mit i) mehreren Oligonukleotiden, wobei es für jedes Methylierungsmuster zumindest ein Oligonukleotid gibt, welches die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation geeignet ist, und ii) mehreren Zymogenen, wobei es für jedes Methylierungsmuster zumindest ein Zymogen gibt, welches eine katalytische Nukleinsäureaktivität, deren Aktivität einzeln messbar ist, kodiert und damit dessen revers komplementäre Sequenz darstellt, unter Bedingungen, die eine Primer-initiierte Nukleinsäureamplifikation und eine Aktivität einer katalytischen Nukleinsäureaktivität erlauben, wobei das einem Methylierungsmuster zugeordnete Oligonukleotid und das einem Methylierungsmuster zugeordnete Zymogen so zueinander orientiert sind in Gegenwart der zu untersuchenden Nukleinsäure, dass ein Nukleinsäuremolekül generiert wird, welches eine Sequenz oder eine revers komplementäre Sequenz der zu untersuchenden Nukleinsäure umfasst sowie die katalytische Nukleinsäureaktivität; und c) den gleichzeitigen Nachweis jeder katalytischen Nukleinsäureaktivität, wodurch auf das Vorliegen von Methylierungsmustern in der zu untersuchenden Nukleinsäure geschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 21, weiterhin umfassend die quantitative Bestimmung jeder katalytischen Nukleinsäureaktivität generiert in Schritt b), wodurch das Auftreten von Methylierunsmustern in der Nukleinsäure einer Probe quantifiziert wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Umsetzung von Nukleinsäure Bisulfit umfasst.
Verfahren nach mindestens einen der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Nukleinsäureamplifikation durchgeführt wird gemäß einer Methode der Gruppe umfassend PCR, SDA und TMA.
Verfahren nach mindestens einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Vorliegen eines Methylierungsmusters in einer Probe eine Erkrankung indiziert.
Oligonukleotid, umfassend a) einen Sequenzabschnitt, umfassend eine katalytische Nukleinsäureaktivität oder eine Sequenz, die für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert, und b) einen Sequenzabschnitt, der i) die Basen A, C, T, oder G an Positionen umfasst, die geeignet sind, um zwischen umgesetzten methylierten und zwischen umgesetzten nicht-methylierten Positionen des zu untersuchenden Nukleinsäure zu unterscheiden; und ii) nur die Basen A, T, C oder nur die Basen A, T, G an allen weiteren Positionen umfasst.
Oligonukleotid nach Anspruch 26, zusätzlich umfassend einen oder mehrere Sequenzabschnitte, die selbst oder ihre revers komplimentäre Sequenz die Bindung an ein Substrat vermitteln.
Kit für die Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend: a) ein Reagenz oder Enzym, welches eine Umsetzung einer zu untersuchenden Nukleinsäure ermöglicht, so dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich ihrem Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, b) eine katalytische Nukleinsäureaktivität oder ein Zymogen, welches für eine katalytische Nukleinsäureaktivität kodiert.
Kit nach Anspruch 28, zusätzlich umfassend a) ein Oligonukleotid geeignet für die Initiierung einer Nukleinsäureamplifikation, und/oder b) ein methylierungsspezifisches Blockermolekül.
Kit nach Anspruch 28 oder 29, weiterhin umfassend ein Substrat, das durch die katalytische Nukleinsäureaktivität in detektierbarer Weise modifizierbar ist.
Kit nach Anspruch 29–30, wobei der Bereich des Oligonukleotids, der die Initiierung der Nukleinsäure ermöglicht, a) die Basen A, C, T, oder G an Positionen umfasst, die geeignet sind, um zwischen umgesetzten methylierten und zwischen umgesetzte nicht-methylierte Positionen eines zu untersuchenden Nukleinsäure zu unterscheiden; und b) nur die Basen A, T, C oder nur die Basen A, T, G an allen weiteren Positionen umfasst.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, oder des Oligonukleotids nach Anspruch 26 oder 27, oder des Kits nach einem der Ansprüche 28 bis 31, zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: Unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; ZNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Gastrointestinaltraktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abnormalität im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25, oder des Oligonukleotids nach Anspruch 26 oder 27, oder des Kits nach einem der Ansprüche 28 bis 31 zur Unterscheidung von Zell- oder Gewebe-Typen oder zur Untersuchung der Zell-Differenzierung.