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DE10163986A1 - In vitro selection of specific binding agents, useful potentially as pharmaceuticals and diagnostic agents, discriminates again non-specific, high-affinity agents - Google Patents

In vitro selection of specific binding agents, useful potentially as pharmaceuticals and diagnostic agents, discriminates again non-specific, high-affinity agents

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Publication number
DE10163986A1
DE10163986A1 DE10163986A DE10163986A DE10163986A1 DE 10163986 A1 DE10163986 A1 DE 10163986A1 DE 10163986 A DE10163986 A DE 10163986A DE 10163986 A DE10163986 A DE 10163986A DE 10163986 A1 DE10163986 A1 DE 10163986A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
molecules
binding
bound
force
library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10163986A
Other languages
German (de)
Inventor
Boris Steipe
Hauke Clausen-Schaumann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NANOTYPE GmbH
Original Assignee
NANOTYPE GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NANOTYPE GmbH filed Critical NANOTYPE GmbH
Priority to DE10163986A priority Critical patent/DE10163986A1/en
Priority to EP02799063A priority patent/EP1576184B1/en
Priority to DE50210214T priority patent/DE50210214D1/en
Priority to PCT/EP2002/014584 priority patent/WO2003056034A2/en
Priority to AT02799063T priority patent/ATE362996T1/en
Priority to AU2002364290A priority patent/AU2002364290A1/en
Publication of DE10163986A1 publication Critical patent/DE10163986A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

In vitro method for selecting agents (A), present in a library of molecules, that bind to a target molecule (TM). In vitro method for selecting agents (A), present in a library of molecules, that bind to a target molecule (TM) comprises first immobilizing TM and contacting them with many molecules, which are bound to a reference complex (RC) so that TM can bind to appropriate (A), forming a link of structure RC-(A)-TM. Non-bound components are separated and a force is applied to the link so that one bond in it is broken, and the TM-bound (A), or its complement, is identified and/or amplified. RC has a binding strength chosen to be smaller than that of a specifically bound (A), when a tractive force is applied. Independent claims are also included for the following: (1) similar method in which at least two subpopulations of test molecules are formed, one containing (A), and the binding forces of all molecules in the library to TM are determined simultaneously, and the forces are compared with those for RC; the subpopulation having a binding force greater than RC is selected (the other subpopulation has a binding force weaker than RC); and (2) device for in vitro selection of (A) from a library of molecules comprising a first surface with many immobilized RC, able to bind (A), and a second surface with many immobilized TM.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von mit einem Zielmolekül bindefähigen Bindern unter Ausnutzung eines differentiellen Krafttests. The invention relates to a method for the selection of bindable with a target molecule Binders using a differential force test.

In vielen Bereichen der Biochemie und Medizin sind Moleküle bekannt, die andere Moleküle spezifisch binden können. Für derartige Bindungspaare sind viele interessante Anwendungen beschrieben worden, die unter anderem in den Bereichen Diagnostik und Therapie nützlich sind. So erlaubt die Entwicklung und Untersuchung von spezifisch bindefähigen Molekülen Rückschlüsse auf Metabolismen und den Ablauf biochemischer Reaktionskaskaden im Bereich der Forschung und der Diagnostik, oder schafft Möglichkeiten zur Beeinflussung des Bindungspartners durch Aktivierung oder Hemmung im Bereich der Therapie. Eine wichtige Aufgabe in Therapie und Diagnostik ist daher die Untersuchung von spezifisch bindefähigen Paaren und das Auffinden von spezifischen Bindern für bekannte Zielmoleküle oder von Bindern, deren Zielmoleküle zwar noch nicht bekannt sind, bei denen das Bindungsereignis aber eine Auswirkung auf Zellen oder Organismen hat, geworden. Da der Entwurf solcher Binder allein aus Kenntnis der Prinzipien von Physik und Chemie im allgemeinen nicht gelingt, sind Methoden entwickelt worden, die in Anlehnung an das natürliche Prinzip der Evolution durch Bereitstellung einer Vielfalt von Molekülen und Selektion solcher mit gewünschten Eigenschaften zu geeigneten Bindern gelangen. Hierzu sind Selektionsverfahren notwendig, um spezifisch bindende Moleküle aus einem Gemisch, das aus einer Vielzahl möglicher Bindekandidaten besteht, aufzufinden. Ziel ist es meist, solche Moleküle aufzufinden, die ein hohes Maß an Spezifität und/oder Affinität für ein Zielmolekül haben. Die Erfolgschancen solcher Verfahren werden im allgemeinen durch zwei Kriterien bestimmt: zum einen die Komplexität des verwendeten Gemischs - geeignete Binder können nur aus einem Gemisch ausgewählt werden, in dem sie auch enthalten sind - zum anderen das Selektionsverfahren, das möglichst gut die gewünschten Eigenschaften des Binders modellhaft abbilden soll. In many areas of biochemistry and medicine, molecules are known, the other Can bind molecules specifically. There are many interesting ones for such bond pairs Applications have been described, among others in the fields of diagnostics and Therapy are useful. So allows the development and investigation of specific bindable molecules conclusions on metabolisms and the course of biochemical Reaction cascades in the field of research and diagnostics, or creates Possibilities for influencing the binding partner by activation or inhibition in Area of therapy. An important task in therapy and diagnostics is therefore Examination of specifically bindable pairs and the discovery of specific ones Binders for known target molecules or of binders whose target molecules are not yet are known in which the binding event has an effect on cells or Organisms has become. Since the design of such trusses is based solely on knowledge of Principles of physics and chemistry generally fail, methods have been developed that have been based on the natural principle of evolution by providing a Diversity of molecules and selection of those with desired properties suitable binders. This requires selection procedures to be specific binding molecules from a mixture of a variety of possible binding candidates exists to find. The goal is usually to find such molecules that have a high level of Have specificity and / or affinity for a target molecule. The chances of success of such Procedures are generally determined by two criteria: first, complexity of the mixture used - suitable binders can only be made from a mixture selected in which they are also included - secondly, the selection process, that should model the desired properties of the binder as well as possible.

Spezifisch bindefähige Moleküle sind interessant für Forschung und Diagnostik, um spezifisch Komponenten in geringer Konzentration nachzuweisen. In der Diagnostik werden z. B. schon lange Antikörper verwendet, die Antigene spezifisch erkennen. Antikörper müssen jedoch aufwendig durch Immunisierung von Tieren und Hybridomabildung gewonnen werden. Specifically bindable molecules are interesting for research and diagnostics specifically detect components in low concentrations. In diagnostics z. B. has long used antibodies that specifically recognize antigens. antibody however, must be elaborate through animal immunization and hybridoma formation be won.

Spezifisch bindefähige Moleküle sind auch interessant für die Therapie, wo sie beispielsweise als Pharmaka durch Aktivierung oder Hemmung von Zielmolekülen wirken. Specifically bindable molecules are also interesting for therapy where they are act as pharmaceuticals, for example, by activating or inhibiting target molecules.

Erwünscht ist es daher, spezifisch bindefähige Substanzen aufzufinden, die sich in vivo oder in vitro vermehren lassen und dann in der Diagnostik, zum Nachweis von Substanzen und in der Therapeutik, z. B. um Rezeptoren aufzufinden, zu blockieren oder zu aktivieren, eingesetzt werden können. Die zu untersuchende spezifische Bindung zwischen Molekülen beruht typischerweise nicht auf kovalenten Wechselwirkungen, sondern der Interaktion von Bindungspartnern durch Wasserstoffbrücken, ionische, hydrophobe und van-der-Waals-Kräfte. Diese Wechselwirkungen sind um Größenordnungen schwächer als kovalente Bindungen, die durch chemische Reaktionen gebildet oder gelöst werden, und sind daher auch durch äußere Einflüsse leichter beeinflußbar. Nicht kovalente Wechselwirkungen zwischen Bindungspartnern mit einem hohen Grad an selektiver Bindeeigenschaft sind die Voraussetzungen für die molekulare Erkennung. It is therefore desirable to find specifically bindable substances that are in vivo or let multiply in vitro and then in the diagnosis, for the detection of Substances and in therapeutics, e.g. B. to find or block receptors activate, can be used. The specific bond to be examined between Molecules are typically not based on covalent interactions, but on Interaction of binding partners through hydrogen bonds, ionic, hydrophobic and van-der-Waals forces. These interactions are orders of magnitude weaker as covalent bonds that are formed or dissolved by chemical reactions, and are therefore more easily influenced by external influences. Not covalent Interactions between binding partners with a high degree of selective Binding properties are the prerequisites for molecular recognition.

Um möglichst spezifische und/oder hoch affine Binder für ein Zielmolekül aufzufinden, kann man, wie oben erwähnt, eine Auswahl aus einer Vielzahl von Molekülen experimentell durchführen. In der Regel erstellt man mit kombinatorischen Verfahren Substanzbibliotheken, die z. B. bis zu 10'5 unterschiedliche Mitglieder oder auch mehr enthalten können. Daher mussten Verfahren entwickelt werden, um die Bindefähigkeit einer sehr großen Zahl von Substanzen parallel für vorgegebene Zielmoleküle testen zu können. In order to find specific and / or highly affine binders for a target molecule, you can, as mentioned above, choose from a variety of molecules perform experimentally. As a rule, combinatorial procedures are used Substance libraries, e.g. B. contain up to 10'5 different members or more can. Therefore, processes had to be developed to make it very bindable to be able to test a large number of substances in parallel for given target molecules.

Hierzu sind bereits einige Verfahren bekannt, die zur in-vitro-Selektion geeignet sind. For this purpose, some methods are already known which are suitable for in vitro selection.

Für das Screenen von antigenspezifischen Antikörperfragmenten ist z. B. das so genannte "PANNING" von Phage-Display Bibliotheken bekannt. Hier werden mit Antigen beschichtete Oberflächen mit einer Antikörper-Phagmid Bibliothek in Kontakt gebracht, die an Antigen gebundenen Antikörper werden von ungebundenen Antikörpern getrennt und anschließend werden die Phagmide in vivo repliziert, wodurch die Antikörperfragmente zur weiteren Verwendung hergestellt und in ihrer Sequenz und ihren Eigenschaften charakterisiert werden können. For the screening of antigen-specific antibody fragments, e.g. B. so known as "PANNING" from phage display libraries. Here with antigen coated surfaces are contacted with an antibody-phagmid library that Antibodies bound to antigen are separated from unbound antibodies and then the phagmids are replicated in vivo, causing the antibody fragments prepared for further use and in their sequence and properties can be characterized.

Für das Selektieren von RNA-Aptameren ist ein als "Selex" bezeichnetes Verfahren bekannt, das beispielsweise in EP-A 0 533 838 beschrieben wird. Hier wird eine Bibliothek von RNA-Molekülen hergestellt und dann aus dem Gemisch der vielen Bindekandidaten gegenüber einem bestimmten Zielmolekül eine in-vitro-Selektion durchgeführt, wobei ein Zielmolekül auf einer Oberfläche gebunden wird, mit einem Gemisch vieler RNA- Moleküle inkubiert wird, die an der Oberfläche gebundenen Moleküle abgetrennt werden, die an dem Zielmolekül gebundenen Moleküle abgelöst und amplifiziert werden. Die Inkubation dient dazu, die Binderkandidaten mit Zielmolekülen in Berührung zu bringen. Bei der Trennung werden vorzugsweise jene Binderkandidaten entfernt, die nicht oder nur sehr schwach an das Zielmolekül gebunden sind. Die Bindemoleküle, die über eine gewisse Affinität zum Zielmolekül verfügen, bleiben auf der Oberfläche und können durch einen Amplifikationsschritt vervielfacht werden. For the selection of RNA aptamers is a method called "Selex" known, which is described for example in EP-A 0 533 838. Here is a library made by RNA molecules and then from the mixture of the many binding candidates an in vitro selection was carried out for a specific target molecule, a Target molecule is bound to a surface with a mixture of many RNA Incubated molecules, the molecules bound to the surface are separated, the molecules bound to the target molecule are detached and amplified. The Incubation is used to bring the candidate candidates into contact with target molecules. at In the separation, those binding candidates that do not, or only, are preferably removed are very weakly bound to the target molecule. The binding molecules that have a certain affinity for the target molecule remain on the surface and can an amplification step can be multiplied.

Obwohl dieses Verfahren gegenüber früher benutzten Verfahren, bei denen z. B. Affinitätschromatographiestufen zwischengeschaltet werden mussten, eine Verbesserung darstellt, hat es doch auch einige Nachteile. Das Verfahren soll so durchgeführt werden, dass pro Inkubationsrunde etwa 3 bis 7% aller Nucleinsäuren an dem Zielmolekül gebunden werden. Hierdurch soll eine 10- bis 20-fache Anreicherung in jeder Runde erzielt werden. Da große, komplexe Substanzbibliotheken typischerweise nur wenige Moleküle mit den gesuchten Eigenschaften enthalten, werden mehrere Zyklen von Bindung, Selektion und Amplifikation notwendig um diese in ausreichender Reinheit für die Analyse ihrer Zusammensetzung zu erhalten. Außerdem handelt es sich bei dem Selex-Verfahren um ein Verfahren zur Selektion von RNA-Aptameren, die aufgrund des Aufbaus des Moleküls sehr bindefreudig sind. Um daher nicht zu viele unspezifisch gebundene Moleküle mitzuselektieren, müssen die Bedingungen der Inkubation sehr stringent eingestellt werden, damit nur die affineren Moleküle haften bleiben und eine zu starke Beladung der Zielmoleküle mit weniger affin gebundenen Molekülen vermieden wird. Dieses Verfahren ist daher nicht so geeignet, wenn die Bindefähigkeit unter physiologischen Bedingungen untersucht werden soll oder Bindemoleküle gesucht werden, die unter physiologischen Bedingungen eine hohe Spezifität und/oder Affinität zeigen. Although this method compared to previously used methods in which e.g. B. Affinity chromatography levels had to be interposed, an improvement it has some disadvantages. The process should be carried out that about 3 to 7% of all nucleic acids on the target molecule per round of incubation be bound. This is to achieve a 10 to 20-fold enrichment in each round become. Because large, complex substance libraries typically contain only a few molecules with the properties sought, several cycles of bonding, Selection and amplification are necessary to ensure that they are of sufficient purity for the analysis of their Get composition. The Selex process is also a method for the selection of RNA aptamers due to the structure of the molecule are very keen to bind. So not too many unspecifically bound molecules to select, the conditions of the incubation must be set very stringently, so that only the more affine molecules adhere and an excessive loading of the Target molecules with less affinity bound molecules is avoided. This procedure is therefore not so suitable if the binding ability under physiological conditions is to be examined or binding molecules are sought, which are under physiological Conditions show high specificity and / or affinity.

Ein weiterer Nachteil bekannter Verfahren besteht darin, dass mehrere bis viele Runden der Inkubation und Amplifikation notwendig sind, bis eine Anreicherung von Molekülen mit gewünschten Eigenschaften erfolgt ist. Je stärker affin die Binder bereits sind, desto schwieriger wird, es Binder mit weiter gesteigerter Affinität sicher zu unterscheiden. Dies liegt daran, daß Affinität sich aus dem Quotienten der Bindungsrate und der Dissoziationsrate ergibt und deswegen ein mehrfaches der Dissoziationshalbwertszeit abgewartet werden muss um das System ins Gleichgewicht zu bringen und die Qualität von Bindern zu vergleichen. In der Praxis wird deswegen häufig die Selektion unter zunehmend stringenten Bedingungen durchgeführt, was gleichzeitig meist zunehmende Abweichungen der Selektionsbedingungen von jenen Bedingungen bedeutet, unter denen der Binder letzlich seine Aufgabe erfüllen soll. Another disadvantage of known methods is that there are several to many rounds The incubation and amplification are necessary until an enrichment of molecules with the desired properties. The more affine the binders are, the more it becomes more difficult to differentiate between binders with further increased affinity. This is because affinity is made up of the quotient of the binding rate and the Dissociation rate results and therefore waited a multiple of the dissociation half-life in order to balance the system and the quality of binders to compare. In practice, the selection among is therefore increasing stringent conditions carried out, which at the same time mostly increasing deviations of the selection conditions means those under which the binder should ultimately do its job.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren aufzufinden, mit dem aus einer Vielzahl von Molekülen solche Moleküle, die an ein Zielmolekül spezifisch binden, in wenigen Stufen aufgefunden werden können. Außerdem war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem es vermieden wird, unspezifisch gebundene Moleküle mitzuschleppen. Außerdem sollte ein Verfahren bereitgestellt werden, mit dem sehr selektiv Moleküle mit ausgewählter Spezifität aufgefunden werden können, wobei die Spezifität im Vergleich zu bekannten Molekülen ausgewählt werden kann. Darüber hinaus sollte die Auswahl unter solchen Bedingungen erfolgen, unter denen das ausgewählte Molekül später dann seine Aktivität entfalten soll. Schließlich war es Aufgabe der Erfindung, die Selektion durchzuführen, ohne die Einstellung eines Gleichgewichts von Bindung und Dissoziation abzuwarten. Weiterhin soll eine Möglichkeit gegeben werden, die Selektion so durchzuführen, daß eine Anreicherung von Bindern in einer Bibliothek in Zwischenschritten nicht mehr notwendig ist.) It was therefore an object of the present invention to find a new method with that of a multitude of molecules those molecules that are specific to a target molecule bind, can be found in a few steps. It was also the job of Invention to provide a method in which it is avoided, non-specific carry along bound molecules. A procedure should also be provided with which molecules with selected specificity can be found very selectively, the specificity can be selected in comparison to known molecules. In addition, the selection should be made under conditions under which the selected molecule should then later develop its activity. Finally it was Object of the invention to carry out the selection without establishing an equilibrium to wait for commitment and dissociation. Furthermore, an opportunity should be given be to carry out the selection so that an enrichment of binders in a Library in intermediate steps is no longer necessary.)

Zur Lösung dieser Aufgaben wird ein Verfahren bereitgestellt, das sich eines neuen Prinzips zur Auswahl bedient, indem die Kraft, die notwendig ist um den Komplex zwischen einem Binder und einem Zielmolekül zu trennen, ausgewertet und für die Auswahl ausgenutzt wird. To solve these tasks, a method is provided which is a new one Principle to be served by the force necessary to move the complex between to separate a binder and a target molecule, evaluated and for selection is exploited.

Zur Beschreibung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke wie definiert verwendet: Definitionen Zielmolekül: Molekül, gegen das ein Binder gesucht wird, der dieses mit molekularer Erkennung bindet.
Binder: Molekül, das ein Zielmolekül mit molekularer Erkennung bindet.
Fängermolekül: Molekül, welches mittels eines Referenzkomplexes den Binder bindet.
Referenzkomplex: Komplex, dessen ausgewählte Bindungstrennkraft geringer ist als die der gesuchten Bindung molekularer Erkennung zwischen Binder und Zielmolekül.
Verkettung: Anordnung, bestehend aus einem Fängermolekül, das mittels eines Referenzkomplexes den Binder bindet, welcher Binder wiederum mittels eines Zielkomplexes das Zielmolekül bindet.
Zielkomplex: Komplex, basierend auf der gesuchten Bindung molekularer Erkennung zwischen Binder und Zielmolekül. To describe the method of the present invention, the following terms are used as defined: Definitions Target molecule: Molecule against which a binder is sought, which binds it with molecular recognition.
Binder: Molecule that binds a target molecule with molecular recognition.
Catcher molecule: Molecule that binds the binder using a reference complex.
Reference complex: Complex whose selected bond breaking force is lower than that of the molecular recognition between bond and target molecule.
Linking: Arrangement consisting of a capture molecule that binds the binder using a reference complex, which binder in turn binds the target molecule using a target complex.
Target complex: Complex, based on the desired molecular recognition bond between the binder and the target molecule.

Zur Auffindung von spezifisch bindenden Paaren biologischer Moleküle wird, wie oben ausgeführt, häufig die Affinität als Auswahlkriterium herangezogen. Moleküle können aber für andere Moleküle aufgrund von unspezifischen Eigenschaften, wie Oberflächenladung oder hydrophobe Flächen etc. eine Affinität haben. So ist bekannt, dass RNA- Aptamere beispielsweise aufgrund der negativen Ladung ihres Zucker-Phosphatgerüsts bestimmte andere Moleküle anziehen. Im Gegensatz zu dieser unspezifischen Anlagerung ist für die spezifische Bindung das Vorliegen bestimmter Strukturmerkmale notwendig. Antikörper und andere Proteine neigen dagegen beispielsweise zu starken, unspezifischen Wechselwirkungen mit hydrophoben Oberflächen. Bei Molekülen, die zu einer spezifischen Bindung fähig sind, liegen in der Regel Bindungstaschen vor, die für die Oberfläche des Zielmoleküls eine komplementäre Struktur vorgeben. Dabei gibt es sowohl flache Kontaktregionen als auch tiefe Bindungstaschen und viele Varianten, die dazwischen liegen. Wichtig für die Affinität der Bindung ist unter anderem die Anzahl der möglichen Kontakt- und Anknüpfungspunkte. Spezifität wird dagegen durch die genaue räumliche Anordnung komplementärer Strukturelemente, verbunden mit ausreichend hohen attraktiven Wechselwirkungen, erreicht. Häufig ist die Anzahl der Kontaktpunkte in dem spezifisch bindenden Bereich um so größer, je spezifischer eine Bindung ist. To find specifically binding pairs of biological molecules, as above carried out, often used the affinity as a selection criterion. Molecules can but for other molecules due to non-specific properties like Surface charge or hydrophobic surfaces etc. have an affinity. It is known that RNA Aptamers, for example, due to the negative charge on their sugar-phosphate structure attract certain other molecules. In contrast to this unspecific For the specific bond, attachment is the presence of certain structural features necessary. Antibodies and other proteins, on the other hand, tend to be strong, non-specific interactions with hydrophobic surfaces. For molecules that become one specific binding, there are usually binding pockets for the Specify a complementary structure on the surface of the target molecule. There are both flat contact regions as well as deep binding pockets and many variants that in between. One of the important factors for the affinity of the bond is the number of possible points of contact and connection. Specificity, on the other hand, is determined by the exact spatial arrangement of complementary structural elements, combined with sufficiently high ones attractive interactions. Often the number of contact points in the the more specific a binding, the larger the specific binding area.

Die Trennkraft einer Bindung korreliert mit der Summe aller Wechselwirkungen, die gleichzeitig gelöst werden müssen, um einen Komplex zu trennen. Im allgemeinen besitzen Komplexe, die eine hohe Trennkraft besitzen auch eine hohe Affinität, dagegen trifft die Umkehrung nicht allgemein zu. Im allgemeinen impliziert eine hohe Trennkraft hohe Anforderungen an die genaue räumliche Anordnung komplementärer Strukturelemente des Komplexes und läßt deswegen eine hohe Spezifität erwarten. Dies macht sich die vorliegende Erfindung zunutze, indem nicht oder nicht nur nach Affinität getrennt wird, sondern die zur Trennung der Bindung notwendige Kraft als unterscheidender Parameter ausgenutzt wird, der aussagekräftiger für die gewünschten Eigenschaften des Binders ist. The separation force of a bond correlates with the sum of all interactions that must be solved simultaneously to separate a complex. In general have complexes that have a high separating power also have a high affinity, against which hits the reverse is not general. In general, a high separation force implies a high one Requirements for the precise spatial arrangement of complementary structural elements of the complex and therefore high specificity can be expected. This makes it take advantage of the present invention by not separating or not only by affinity, but the force necessary to separate the bond as a distinguishing parameter is used, which is more meaningful for the desired properties of the binder.

Entscheidend für die Kraft beim Lösen einer solchen spezifischen Bindung ist es, wie viele Bindungen oder Kontakte gleichzeitig gelöst werden müssen und welche Form die Potenzialhyperfläche - als Funktion der Ortskoordinaten der Bindungspartner und des Potenzials - hat. Dazu kommt es auf die Details der Geometrie und die Flexibilität der Komponenten an. So kann es für das Lösen einer Bindung notwendig sein, dass das System Bindungsdrehungen, Biegungen und Umorientierungen durchlaufen muss, um den angelegten Kraftvektoren auf dem Weg des geringsten Widerstandes nachzugeben. Je weniger solche Drehungen möglich sind, desto eher wird es signifikante Barrieren geben, die nur durch hohe Kraft überwunden werden können. Mit hoher Kraft gelöst werden müssen in der Regel Wasserstoffbrücken und van-der-Waals-Kontakte zwischen rigiden, molekularen Gruppen. Diese Trennkräfte werden nun bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verglichen. How is it decisive for the force in releasing such a specific bond? many bonds or contacts have to be loosened at the same time and which form the Potential hypersurface - as a function of the spatial coordinates of the binding partners and the Potential - has. This depends on the details of the geometry and the flexibility of the Components. So for loosening a bond it may be necessary that the System must go through binding twists, bends, and reorientations in order to give in to the applied force vectors on the path of least resistance. The fewer such twists are possible, the more likely there will be significant barriers give that can only be overcome with high strength. Be solved with great force usually need hydrogen bonds and van der Waals contacts between rigid, molecular groups. These separating forces are now in the invention Compared procedures.

Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur in-vitro-Selektion von mit einem Zielmolekül bindefähigen Bindern aus einer Bibliothek von Molekülen zur Verfügung gestellt, bei dem immobilisierte Zielmoleküle mit einer Vielzahl von Molekülen, die jeweils an einen Referenzkomplex gebunden sind, in Kontakt gebracht werden, sodass Zielmoleküle mit möglichen Bindern reagieren können und eine Verkettung aus Referenzkomplex, Binder und Zielmolekül bilden können, dann nicht gebundene Komponenten abgetrennt werden und an die Verkettungen eine Kraft angelegt wird, sodass sich eine Bindung in der Verkettung löst, und die an Zielmoleküle gebundenen Binder oder deren Komplementäre identifiziert und/oder amplifiziert werden, wobei der Referenzkomplex aus zwei Komponenten besteht, deren Bindungskraft zueinander so ausgewählt wird, dass unter Anlegen einer Zugkraft die Bindungskraft der beiden Referenzkomponenten aneinander kleiner als die Bindungskraft eines spezifisch gebundenen Moleküls ist. According to the invention, therefore, a method for the in vitro selection of with a Targeted binders from a library of molecules are provided at the immobilized target molecules with a large number of molecules, each attached to one Reference complex are bound, brought into contact so that target molecules with possible binders can react and a chain of reference complex, binder and can form the target molecule, then unbound components are separated and a force is applied to the chains so that a bond in the Linking loosens, and the binders bound to target molecules or their complementaries identified and / or amplified, the reference complex consisting of two Components exist, the binding force to each other is selected so that under apply a tensile force the binding force of the two reference components to each other is less than is the binding force of a specifically bound molecule.

Es wurde gefunden, dass eine in-vitro-Selektion von Bindern möglich ist, indem ein Vergleich von Bindungskräften durchgeführt wird. Auf diese Weise ist es nicht notwendig, viele Selektionsrunden durchzuführen, sondern in kurzer Zeit kann man die interessierenden Moleküle herausfinden, die an den Zielmolekülen auch noch dann gebunden bleiben, wenn auf die Bindung eine Kraft ausgeübt wird. Dazu werden Zielmoleküle und mögliche Binder in Kontakt gebracht, wobei die Zielmoleküle immobilisiert sind und die Moleküle der Bibliothek an Referenzkomplexe gebunden sind. Wenn es zu einer Bindung eines Moleküls an ein Zielmolekül kommt, bildet sich eine Verkettung aus Referenzkomplex, Binder und Zielmolekül. Wenn auf diese Verkettung eine Kraft ausgeübt wird, löst sich die schwächste der Bindungen. Der Referenzkomplex ist so aufgebaut, dass seine Bindungskraft kleiner als die Bindungskraft der spezifischen Bindung zwischen Binder und Zielmolekül ist und bevorzugt auch kleiner als die Immobilisierungsbindung des Zielmoleküls ist. Hat daher der gewünschte Binder an das Zielmolekül gebunden, so löst sich bei Ausüben einer Kraft auf die Verkettung die Bindung des Referenzkomplexes als schwächste Bindung und der Binder bleibt am Zielmolekül gebunden und kann dort identifiziert und/oder amplifiziert werden. Es können auch seine Komplementäre identifiziert und/oder amplifiziert werden. Hat nur ein unspezifisches Molekül gebunden, so löst sich die unspezifische Bindung, das Molekül bleibt am Referenzkomplex gebunden und das Zielmolekül ist wieder frei. It has been found that in vitro selection of binders is possible by using a Comparison of binding forces is carried out. That way it is not necessary to carry out many selection rounds, but in a short time you can find out the molecules of interest that are still bound to the target molecules stay when a force is exerted on the binding. To do this, target molecules and possible binders are brought into contact, the target molecules being immobilized and the Library molecules are bound to reference complexes. If there is a bond of a molecule comes to a target molecule, a chain is formed Reference complex, binder and target molecule. If a force is exerted on this chain, it loosens the weakest of the bonds. The reference complex is structured so that its Binding force less than the binding force of the specific binding between binders and target molecule is and preferably also smaller than the immobilization bond of the Target molecule is. Therefore, if the desired binder has bound to the target molecule, it dissolves when a force is exerted on the chaining, the binding of the reference complex becomes weakest binding and the binder remains bound to the target molecule and can be there identified and / or amplified. It can also identify its general partners and / or be amplified. If only one unspecific molecule is bound, it dissolves the non-specific binding, the molecule remains bound to the reference complex and that The target molecule is free again.

Die Immobilisierung der Zielmoleküle und der Bibliothek kann jeweils an einem Träger, wie Beads, Kügelchen und dergleichen, oder an einer Oberfläche erfolgen. Die Art der Immobilisierung ist nicht kritisch, es muss nur die Möglichkeit bestehen, dass Binder und Zielmolekül in Kontakt kommen und aneinander binden können. The immobilization of the target molecules and the library can each be carried out on a support, such as beads, beads and the like, or on a surface. The kind of Immobilization is not critical, it just has to be the possibility that Binder and Target molecule can come into contact and bind to each other.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden dazu an eine erste Oberfläche Zielmoleküle gebunden und an eine zweiten Oberfläche eine Vielzahl von Molekülen über einen Referenzkomplex gebunden, wobei die beiden Oberflächen korrespondierende Flächenabschnitte aufweisen, die so in Kontakt gebracht werden, dass Zielmoleküle mit möglichen Bindern reagieren können, die Flächen dann getrennt werden und nicht gebundene Komponenten abgetrennt werden und die an Zielmoleküle gebundenen Binder oder deren Komplementäre identifiziert, amplifiziert oder gewonnen werden, wobei der ren Komplementäre identifiziert, amplifiziert oder gewonnen werden, wobei der Referenzkomplex aus zwei Komponenten besteht, deren Bindungskraft so ausgewählt wird, dass unter Anlegen einer Zugkraft die Bindungskraft der beiden Referenzkomponenten aneinander kleiner als die Bindungskraft zwischen dem Zielmolekül und einem spezifisch gebundenen Binder ist, aber größer als die Bindungskraft einer unspezifischen Bindung ist. In a preferred embodiment, this is done on a first surface Target molecules bound and a variety of molecules over to a second surface bound a reference complex, the two surfaces corresponding Have surface sections that are brought into contact so that target molecules with possible binders can react, the surfaces are then separated and not bound components are separated and the binders bound to target molecules or their complementaries are identified, amplified or obtained, the their complementary partners are identified, amplified or obtained, the Reference complex consists of two components, the binding force of which is selected in such a way that applying the tensile force, the binding force of the two reference components smaller than the binding force between the target molecule and one specific bound binder, but is greater than the binding force of an unspecific binding.

Im Gegensatz zu den bisher bekannten Verfahren wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Bindungskraft zur Selektion von Molekülen bezüglich ihrer Spezifität für ein Zielmolekül ausgewertet. Dazu werden die zu selektierenden Moleküle über einen so genannten Referenzkomplex gebunden, der bei einer bevorzugten Ausführungsform an eine Oberfläche gebunden ist. Die über den Referenzkomplex gebundenen Moleküle werden dann mit Zielmolekülen, die in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls an einer Oberfläche gebundenen sind, so in Kontakt gebracht, dass es bei miteinander bindefähigen Molekülen zu einer Bindung kommen kann. Es bildet sich dabei eine Verkettung aus Zielmolekül-Binder-Referenzkomplex. Ausgewertet wird dann einerseits, ob sich diese Verkettung gebildet hat - nur diese Moleküle sind für eine weitere Betrachtung interessant - und wie stark die Bindung des Zielmoleküls an den Binder ist. Dazu wird das Verhalten der Bindung Zielmolekül-Binder - auch als Zielkomplex bezeichnet - im Vergleich zum Referenzkomplex ausgewertet, indem die Verkettungen mit den gebundenen Molekülen einer Zugkraft ausgesetzt werden, d. h. auseinander gezogen werden. In contrast to the previously known methods, the method according to the invention Method of binding force for the selection of molecules with regard to their specificity for a Target molecule evaluated. For this purpose, the molecules to be selected are so mentioned reference complex bound to that in a preferred embodiment a surface is bound. The molecules bound via the reference complex are then linked to target molecules, which in a preferred embodiment also a surface are bound so that it is in contact with each other bindable molecules can bind. It forms one Linking from target molecule-binder reference complex. On the one hand, it is evaluated whether this chain has formed - only these molecules are for further consideration interesting - and how strong the target molecule binds to the binder. This will be Behavior of target-binder binding - also known as target complex - in Comparison to the reference complex evaluated by the linkages with the bound Molecules are subjected to a tensile force, d. H. be pulled apart.

Wenn sich eine Bindung zwischen Zielmolekül und bindefähigem Molekül gebildet hat, liegt eine Kette aus Zielmolekül, damit bindefähigem Molekül und Referenzkomplex vor, auf die die Zugkraft ausgeübt wird. Diese Kette wird an der schwächsten Stelle, d. h. der Bindung mit der schwächsten Bindekraft, aufreißen. Handelt es sich bei der Bindung zwischen dem bindefähigen Molekül und dem Zielmolekül nur um eine unspezifische Bindung, die mit schwacher Trennkraft gelöst werden kann, so wird diese unspezifische Bindung sich wieder lösen. Handelt es sich jedoch um eine spezifische Bindung hoher Bindungskraft und ist diese Bindungskraft größer als die Bindungskraft der beiden Komponenten des Referenzkomplexes, so müssen sich die beiden Komponenten des Referenzkomplexes trennen. Im ersteren Fall ist nach der Trennung der Oberflächen das Zielmolekül wieder ungebunden, im letzteren Fall ist ein Molekül mit den gewünschten Eigenschaften, einer starken Bindungskraft für das Zielmolekül und damit einer hohen Spezifität, an das Zielmolekül gebunden. If a bond has formed between the target molecule and the bindable molecule, there is a chain of target molecule, thus bindable molecule and reference complex, to which the traction is exerted. This chain is at the weakest point, i.e. H. the Break with the weakest binding force. Is it the binding between the bindable molecule and the target molecule only by an unspecific one Binding that can be released with weak separating force, then this becomes non-specific Loosen the bond again. However, it is a specific high binding Binding force and this binding force is greater than the binding force of the two Components of the reference complex, the two components of the Separate reference complex. In the former case that is after the separation of the surfaces Target molecule again unbound, in the latter case a molecule with the desired one Properties, a strong binding force for the target molecule and thus a high one Specificity, bound to the target molecule.

Anschließend kann der Binder beispielsweise gewonnen und/oder identifiziert und/oder amplifiziert werden, der Binder kann durch seine Lage bspw. auf einem Chip identifiziert werden, oder der Binder kann durch die Trennung des Referenzkomplexes so verändert werden, daß eine Identifizierung möglich wird ohne den Binder selbst zu gewinnen, beispielsweise durch Amplifikation komplementärer Nucleinsäuren und Sequenzierung. The binder can then be obtained and / or identified and / or, for example amplified, the binder can be identified by its location, for example on a chip or the binder can be changed by separating the reference complex that identification becomes possible without winning the binder itself, for example by amplifying complementary nucleic acids and sequencing.

Auf diese Weise können in einem einzigen Durchgang sehr viele Moleküle auf ihre Spezifität für ein Zielmolekül getestet werden und nach dem Trennen und Entfernen nicht gebundener Komponenten nur die Moleküle mit hoher Spezifität für das Zielmolekül herausgegriffen werden. In this way, a large number of molecules can be attached to them in a single pass Specificity to be tested for a target molecule and not after separation and removal bound components only the molecules with high specificity for the target molecule be picked out.

Es ist bevorzugt - aber nicht Voraussetzung für die Erfindung - wenn die ausgewählten Binder replizierbar oder amplifizierbar sind, um die Aufklärung ihrer Molekularstruktur zu erleichtern. It is preferred - but not a prerequisite for the invention - if the selected ones Binder are replicable or amplifiable to elucidate their molecular structure facilitate.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann überall dort eingesetzt werden, wo es um die Auswahl einer mit einem Partner spezifisch bindefähigen Substanz aus einer Vielzahl von Substanzen geht, insbesondere um eine Auswahl von biochemischen Molekülen, die an ein Zielmolekül binden. Bei dem Zielmolekül handelt es sich um ein Molekül mit einer dreidimensionalen Struktur, die mindestens eine spezifische Bindungsstelle bereitstellt. Beispiele sind Peptide und Proteine, Nucleinsäuren, Komplexe aus Aminosäuren und Kohlehydraten und generell alle als Rezeptoren bezeichneten Moleküle. The method according to the invention can be used wherever the Selection of a substance that is specifically bindable with a partner from a variety of Substances, especially a selection of biochemical molecules that are involved bind a target molecule. The target molecule is a molecule with a three-dimensional structure that provides at least one specific binding site. Examples are peptides and proteins, nucleic acids, complexes of amino acids and Carbohydrates and generally all molecules called receptors.

Zu diesen Zielmolekülen wird ein Binder gesucht, der aus einer großen Vielzahl ausgewählt werden soll. Diese Vielzahl an möglichen Bindern wird mit biochemischen Verfahren bereitgestellt, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Alle Verfahren, mit denen als Binder in Betracht kommende Moleküle hergestellt werden können, sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Bevorzugte Kandidaten für das erfindungsgemäße Verfahren sind Moleküle, die strukturelle mit genetischer Information verbinden. Als Beispiele zu nennen sind DNA, Aptamere, Phage Display, Ribosom-Display, Plasmid- Display, Profusion-Proteine oder mRNA-Protein-Moleküle, Bacterial oder Viral Display, die nach Bindung und Selektion amplifiziert werden können. A binder is sought for these target molecules, which consists of a large variety should be selected. This multitude of possible binders is made using biochemical Methods are provided as are known in the art. All procedures with which Molecules that can be produced as binders are for that Suitable method according to the invention. Preferred candidates for the invention Processes are molecules that combine structural with genetic information. As Examples include DNA, aptamers, phage display, ribosome display, plasmid Display, profusion proteins or mRNA protein molecules, bacterial or viral display, which can be amplified after binding and selection.

Die in Betracht kommenden Bindemoleküle werden in der Regel synthetisch hergestellt und zufällig variiert, wobei die Variation im molekularen Aufbau zu unterschiedlichen räumlichen Strukturen führt. Die unterschiedliche Struktur bedingt dabei unterschiedliche Eigenschaften insbesondere im Hinblick auf die Affinität und die Bindungskraft zum Zielmolekül. The binding molecules in question are usually produced synthetically and varies randomly, the variation in molecular structure being different spatial structures. The different structure causes different Properties especially with regard to affinity and binding power to Target molecule.

Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäß geeigneten Bibliotheken werden beispielsweise von R.W. Robert und J.W. Szostak in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Seiten 12297-12302 beschrieben. Ein Beispiel zur Herstellung von Protein-mRNA-Molekülen ist in US-A 6 258 558 angegeben. Ein Verfahren zur Erstellung einer Phage-Display- Bibliothek ist z. B. in EP-A 768 377 beschrieben. Processes for the production of libraries suitable according to the invention for example by R.W. Robert and J.W. Szostak in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, pages 12297-12302. An example of the production of protein mRNA molecules is in US-A 6 258 558. A method of creating a phage display Library is e.g. B. described in EP-A 768 377.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in einer Ausführungsform zwei Oberflächen bereitgestellt, wobei an einer Oberfläche Zielmoleküle immobilisiert sind, während an der anderen Oberfläche eine Bibliothek der zu selektierenden Moleküle gebunden ist. Die Zielmoleküle, in der Regel nur eine Art, werden an eine Oberfläche in an sich bekannter Weise gebunden, wobei die Bindung so sein sollte, dass sie unter den für das Verfahren angewendeten Bedingungen bei der Lagerung stabil ist und dass sie sich auch bei dem Anlegen einer Zugkraft auf die Bindungen nicht löst. Die Art der Bindung der Zielmoleküle an die Oberfläche ist nicht kritisch, sie sollte so sein, dass die spezifische Bindungsstelle des Ziels nicht beeinträchtigt wird und frei zugänglich bleibt. Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung über funktionelle Gruppen, die an den Zielmolekülen vorgesehen sind und funktionelle Gruppen, die die Oberfläche bereitstellt. Die Oberfläche kann in geeigneter Weise funktionalisiert werden, falls dies erforderlich ist. Die Oberfläche kann beispielsweise ein Glasträger sein, der mit einer Schicht oder Beschichtung überzogen ist. In one embodiment, the method according to the invention is carried out two surfaces are provided, target molecules being immobilized on one surface are, while on the other surface a library of the molecules to be selected is bound. The target molecules, usually only one species, are in on a surface bound in a known manner, the binding should be such that it is among the for the process conditions used in storage is stable and that they does not come off even when a tensile force is applied to the bindings. The kind of Binding of the target molecules to the surface is not critical, it should be such that the specific binding site of the target is not impaired and remains freely accessible. The immobilization is preferably carried out via functional groups on the target molecules are provided and functional groups that the surface provides. The surface can be suitably functionalized if necessary. The The surface can be, for example, a glass substrate with a layer or coating is covered.

In gleicher Weise kann die Immobilisierung an einem Träger erfolgen, indem statt an einer Oberfläche an einem Partikel oder ähnlichem Träger gebunden wird. Die Bindung der Zielmoleküle kann auch über brücken- oder rechenartige Moleküle erfolgen. In the same way, the immobilization can be carried out on a carrier by instead of on a surface is bound to a particle or similar carrier. Binding the Target molecules can also take place via bridge-like or rake-like molecules.

Die Immobilisierung der vielen verschiedenen zu untersuchenden Kandidatenmoleküle erfolgt, wie für die Zielmoleküle beschrieben, bevorzugt ebenfalls an einer Oberfläche, die in gleicher Weise, wie die erste Oberfläche zur Bindung der Zielmoleküle ausgebildet sein kann. Die zweite Oberfläche zur Aufnahme der Bibliothek kann auch aus anderem Material gebildet sein. Bevorzugt sind die beiden Oberflächen so ausgebildet, dass mindestens eine von ihnen aus einem elastischen Material besteht oder mit einem elastischen Material überzogen ist, um den Kontakt zwischen beiden Oberflächen zu optimieren. Möglichkeiten zur Ausbildung der Oberflächen sind beispielsweise in PCT/EP01/09206 beschrieben. The immobilization of the many different candidate molecules to be examined as described for the target molecules, preferably also on a surface, which is designed in the same way as the first surface for binding the target molecules can be. The second surface for the library can also be used for other purposes Material be formed. The two surfaces are preferably designed such that at least one of them consists of an elastic material or with one elastic material is coated to allow contact between both surfaces optimize. Possibilities for the formation of the surfaces are for example in PCT / EP01 / 09206.

Wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist der die Bindung der Bibliothek vermittelnde Referenzkomplex. Der Referenzkomplex hat die Funktion, den Vergleich der Bindungskraft zu ermöglichen. Dazu wird ein Komplex verwendet, der aus zwei Komponenten - Referenzkomponenten - besteht, die sich in definierter Weise und unter Anlegen einer ausgewählten Kraft voneinander lösen können. Es kann sich dabei um ein spezifisch bindendes Paar handeln, um Nucleinsäuredoppelstränge, aber auch um Moleküle, die an einer schwachen Stelle unter Anlegen einer Kraft auseinander brechen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Referenzkomplex zwei Nucleinsäurestränge verwendet. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass z. B. durch Auswahl der Länge und Auswahl der Bindungspaare die Bindungskraft der Bindung sehr gut eingestellt werden kann. Der Vergleich der Bindungskräfte verschiedener Bindungen kann dabei so erfolgen, wie in der Anmeldung der Anmelderin PCT/EP01/09206 mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis eines Bindekomplexes" beschrieben. An essential part of the present invention is the binding of the library mediating reference complex. The reference complex has the function of comparing the To enable binding power. For this, a complex is used that consists of two Components - reference components - exists, which are defined in a way and under Can apply a selected force from each other. It can be a act specifically binding pair, to nucleic acid double strands, but also to molecules, that break apart in a weak place by applying a force. In a preferred embodiment are two reference strands of nucleic acid used. An advantage of this embodiment is that e.g. B. by selection the length and selection of the binding pairs the binding power of the binding very well can be adjusted. The comparison of the binding forces of different bonds can take place as in the application of the applicant PCT / EP01 / 09206 with the title "Method and device for characterizing and / or detecting a Binding complex "described.

Der Referenzkomplex ist bevorzugt ein Komplex aus zwei Komponenten, die eine Bindung ausbilden, deren Bindungsaffinität groß genug ist, um die Kandidaten der zu selektierenden Bibliothek an der Oberfläche gebunden zu halten, so lange, bis der Kontakt mit dem Zielmolekül erfolgt und deren Bindungskraft unter einem von außen angelegten Zug schwächer ist als die Kraft einer spezifischen Bindung zwischen Zielmolekül und auszuwählendem Molekül, andererseits aber größer ist als die Kraft der unspezifischen Bindung zwischen einem Molekül der Bibliothek und dem Zielmolekül. Auf diese Weise wird dann, wenn auf beide über den Referenzkomplex und eine spezifische Bindung verbundenen Partnern ein Zug ausgeübt wird, der Referenzkomplex gelöst und damit der über den Referenzkomplex gebundene Binder auf das Zielmolekül übertragen. Wenn jedoch nur eine unspezifische Bindung stattgefunden hat, so bleiben die beiden Komponenten des Referenzkomplexes gebunden und es kommt nicht zu einer Übertragung auf das Zielmolekül. The reference complex is preferably a complex of two components, the one Form a bond that has a high enough affinity to bind the candidates to the to keep the selective library tied to the surface until contact with the target molecule takes place and its binding force under an externally applied pull is weaker than the force of a specific bond between the target molecule and molecule to be selected, but on the other hand is greater than the force of the non-specific Binding between a molecule of the library and the target molecule. That way then when both on the reference complex and a specific bond associated partners a train is exercised, the reference complex solved and thus the over transfer the bound binding complex to the target molecule. But when only one non-specific binding has taken place, so the two components remain of the reference complex and there is no transfer to the Target molecule.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zusätzlich zu dem Kraftvergleich noch die Zugrate als Parameter eingeführt werden. Bei einem Kraftvergleich kann die Größe der Kraft von der Zugrate abhängig sein und durch Auswahl der Zugrate können die Vergleichsbedingungen weiter optimiert werden. In one embodiment of the method according to the invention, in addition to the Force comparison nor the pull rate can be introduced as a parameter. At a Force comparison, the size of the force can depend on the pull rate and by selecting the Train rate, the comparison conditions can be further optimized.

Bevorzugt werden als Referenzkomplex, wie oben ausgeführt, zwei komplementäre Nucleinsäurestränge verwendet. Die für die Immobilisierung verwendeten komplementären Nucleinsäurestränge können jeweils sowohl über das 3'- als auch das 5'-Ende gebunden werden. Die passenden Nucleinsäurestränge können je nach den Anforderungen an die Bindungskraft genau zugeschnitten werden und in Größe und Sequenz angepasst werden. Bevorzugt werden Nucleinsäuren mit etwa 10 bis 100 Nucleotiden eingesetzt. Je nach zu untersuchender spezifischer Bindung kann außerdem ausgewählt werden, ob die Nucleinsäurestränge so gebunden werden, dass ihre einzelnen Bindungspaare reißverschlußartig nacheinander oder aber gleichzeitig getrennt werden. Wenn die Bindung so erfolgt, dass beim Ausüben einer Zugkraft auf die hybridisierten Stränge, die Bindungen reißverschlussartig aufgehen können, ist ein geringere Zugkraft notwendig als dann, wenn alle Paare gleichzeitig getrennt werden müssen. As a reference complex, two complementary ones are preferred, as explained above Nucleic acid strands used. The complementary used for the immobilization Nucleic acid strands can be bound via both the 3 'and the 5' end become. The appropriate nucleic acid strands can be selected depending on the requirements Binding force can be tailored precisely and adjusted in size and sequence become. Nucleic acids with about 10 to 100 nucleotides are preferably used. ever after the specific binding to be examined, it can also be selected whether the nucleic acid strands are bound so that their individual binding pairs can be separated like a zipper one after the other or at the same time. If the bond so that when a tractive force is exerted on the hybridized strands, the Bindings can open like a zipper, a lower tensile force is necessary than then when all pairs have to be separated at the same time.

In einer ersten Ausführungsform wird der immobilisierte Nucleinsäurestrang entweder mit beiden Enden an der Oberfläche fixiert oder es wird ringförmige Nucleinsäure, gegebenenfalls über ein Brückenmolekül immobilisiert. Der Gegenstrang, der mit dem Binder verknüpft ist, ist zu dem für die Hybridisierung verfügbaren Teil komplementär. Wenn die Hybridisierung erfolgt ist, trennen sich durch Zug auf jeden der beiden Enden des komplementären Strangs die Stränge reißverschlussartig, d. h. es geht eine Hybridbindung nach der anderen auf. Für diese Ausführungsform ist eine relativ geringe Zugkraft zur Trennung der Stränge erforderlich und daher kommt diese Bindungsart dann zum Einsatz, wenn das Zielmolekül, für das ein Binder gesucht wird, eine nicht sehr starke spezifische Bindung ausbildet. In a first embodiment, the immobilized nucleic acid strand is either with both ends fixed to the surface or it becomes ring-shaped nucleic acid, optionally immobilized via a bridge molecule. The opposite strand, the one with the binder linked is complementary to the part available for hybridization. If the Hybridization is done, separate by pulling on each of the two ends of the complementary strands zipper-like strands, d. H. it's a hybrid bond after another. For this embodiment, a relatively low tensile force is required Separation of the strands is required and this is why this type of binding then comes about Use when the target molecule for which a binder is being sought is not a very strong one forms specific bond.

Ist das Zielmolekül, für das ein Binder gesucht wird, zu einer sehr starken spezifischen Bindung fähig, so wird einerseits die Länge der Nucleinsäurestränge entsprechend eingestellt und andererseits wird der Strang so immobilisiert, dass beim Zug auf das an dem auszuwählenden Molekül gebundene Ende alle Hybridbindungen gleichzeitig aufgehen müssen, um die Stränge zu lösen. Hierzu ist eine weitaus größere Zugkraft notwendig als bei der reißverschlussartigen Öffnung. The target molecule for which a binder is being sought is a very strong specific one Binding capable, the length of the nucleic acid strands becomes corresponding on the one hand set and on the other hand, the strand is immobilized so that the train on the end of the molecule to be selected, all hybrid bonds open simultaneously need to loosen the strands. This requires a far greater pulling force than at the zipper-like opening.

Die Bindungskraft der Nucleinsäurestränge kann nicht nur durch die Anzahl der zu trennenden Bindungen variiert werden, sondern auch durch die Auswahl der verwendeten Basen. The binding power of the nucleic acid strands cannot be determined only by the number of separating bonds can be varied, but also by the choice of used Bases.

Das wesentliche Kriterium für die Auswahl des Referenzkomplexes ist nur die Bindungskraft, die kleiner sein muß, als die Bindungskraft der zu untersuchenden spezifischen Bindung und größer als eine unspezifische Bindung. The essential criterion for the selection of the reference complex is only that Binding force, which must be less than the binding force of the specific ones to be examined Binding and larger than an unspecific binding.

Falls die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt wird, bei der die Kandidaten und die Zielmoleküle an Oberflächen gebunden sind, müssen die beiden Oberflächen mit den gebundenen Molekülen so miteinander in Kontakt gebracht werden, dass eine Bindung von bindefähigen Molekülen stattfinden kann. Die Bedingungen können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, im Gegensatz zum bekannten Selex-Verfahren, so ausgewählt werden, dass sie für die Spezifität der Bindung optimal sind. Als Parameter, die eingestellt werden können, kommen der pH-Wert, die Oberflächenbehandlung, die Anwendung von Puffer, die Salzkonzentration etc. in Betracht. Zum Beispiel durch Beschichtung der Oberflächen kann eine unspezifische Bindung an die Oberfläche vermieden werden, was falschpositive Ergebnisse vermeiden hilft. Durch Auswahl von Bedingungen, die eine zu starke Anlagerung von Molekülen vermeiden, können falschnegative Ergebnisse vermieden werden, die durch Blockierung von Bindern auftreten können. If the preferred embodiment of the method according to the invention is carried out where the candidate and target molecules are bound to surfaces, the two surfaces have to be in contact with the bound molecules brought that binding capable molecules can take place. The Conditions can be in the process according to the invention, in contrast to known Selex method, so that they are selected for the specificity of the binding are optimal. The parameters that can be set are the pH value Surface treatment, the application of buffer, the salt concentration etc. in Consideration. For example, coating the surfaces can be non-specific Binding to the surface can be avoided, which avoids false positive results helps. By choosing conditions that overly attach molecules avoid false-negative results that can be avoided by blocking of binders can occur.

Da das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere dazu geeignet ist, Binder für Rezeptoren auszuwählen, die im therapeutischen und diagnostischen Bereich eingesetzt werden, werden diese Moleküle in der später Regel unter physiologischen Bedingungen eingesetzt. Daher sollte das Verfahren auch möglichst bei physiologischen Bedingungen stattfinden, d. h. bei geringer Salzkonzentration und Konzentration an Begleitstoffen, wie sie in den Zellen vorliegen. Since the method according to the invention is particularly suitable for binders for Select receptors used in the therapeutic and diagnostic field these molecules are usually later under physiological conditions used. Therefore, the method should also, if possible, under physiological conditions take place, d. H. with low salt concentration and concentration of accompanying substances, such as they are present in the cells.

Wichtig für die Auswahl des Referenzkomplexes und die Auswahl der Versuchsbedingungen ist auch, inwieweit die zu untersuchenden Moleküle durch eine Krafteinwirkung beeinflusst werden. Empfindliche Moleküle, deren Sekundär- und Tertiärstruktur unter Krafteinwirkung nicht sehr stabil ist, können nur in Kombination mit einem Referenzkomplex verwendet werden, für dessen Öffnung die Kraft nicht zu groß sein darf. Da für das erfindungsgemäße Verfahren unspezifische Wechselwirkungen zwischen Binder und Zielmolekül nicht stören, da die Auswahl über den Referenzkomplex erfolgt und nicht über die Affinität der Bindung, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch bei relativ niedrigen Salzkonzentrationen gearbeitet werden, die die Zunahme von unspezifischen Wechselwirkungen begünstigen und deswegen für Selektionsverfahren die auf Affinitätsunterschieden beruhen, weniger geeignet sind. Important for the selection of the reference complex and the selection of the The test conditions also include the extent to which the molecules to be examined are subjected to a force to be influenced. Sensitive molecules, their secondary and tertiary structure under Force is not very stable, can only be combined with one Reference complex can be used, for the opening of which the force must not be too great. As for that non-specific interactions between binder and Do not disturb the target molecule because the selection is made via the reference complex and not about the affinity of the bond, can also with the inventive method relatively low salt concentrations are working, which is the increase of favor non-specific interactions and therefore for selection procedures Differences in affinity are based, are less suitable.

Falls es notwendig ist, die Bindungskraft des Referenzkomplexes sehr genau einzustellen, kann man sich zur Messung der Bindungskraft eines AFM bedienen. Die Messung der Kraft von Bindungen unter Zug ist genauer in der Literaturstelle E.-L. Florin, V.T. Moy and H.E. Gaub, Science 264, 415 (1994) beschrieben. If necessary, the binding power of the reference complex is very precise can be used to measure the binding force of an AFM. The measurement the force of ties under tension is described in more detail in reference E.-L. Florin, V.T. Moy and H.E. Gaub, Science 264, 415 (1994).

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wurde, z. B. in der Ausführungsform, dass Zielmoleküle und möglicherweise damit bindefähige Moleküle an jeweils einer Oberfläche immobilisiert wurden, die Oberflächen und damit die Moleküle miteinander in Kontakt gebracht wurden, die Oberflächen dann wieder getrennt wurden, wobei nur spezifisch gebundene Moleküle auf der Oberfläche mit den Zielmolekülen zurückbleiben sollten, schließt sich als nächster Schritt die Identifizierung und/oder Amplifikation und/oder Gewinnung der zurückgebliebenen Moleküle an. If the method according to the invention was carried out, e.g. B. in the Embodiment that target molecules and possibly thus bindable molecules to one The surfaces and thus the molecules were immobilized in one another Contacted, the surfaces were then separated again, only specifically bound molecules remain on the surface with the target molecules the next step is identification and / or amplification and / or Extraction of the remaining molecules.

Zur Identifikation können die Moleküle einer Sequenzierung unterzogen werden oder die gebundenen Moleküle können als Matrize zur Erzeugung von Komplementären dienen, die dann wiederum identifiziert oder weiterverarbeitet werden können. Zur Gewinnung dieser Moleküle ist es am einfachsten, eine Amplifikation durchzuführen, wie sie an sich bekannt ist. Dazu werden die Bindermoleküle von den Zielmolekülen abgelöst oder die Komplementäre gewonnen und, üblicherweise mit PCR, amplifiziert. Um das Verfahren weiter zu verbessern, kann diese Amplifizierung unter Mutationsbedingungen erfolgen, so dass eine neue Bibliothek entsteht, die wiederum dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen werden kann. Auf diese Weise können sehr schnell in Bezug auf die Bindefähigkeit an das Zielmolekül optimierte Moleküle aufgefunden werden. For identification, the molecules can be subjected to sequencing or the bound molecules can serve as a template for generating complementaries, which in turn can then be identified or further processed. For extraction of these molecules, it is easiest to perform an amplification as it is per se is known. For this purpose, the binder molecules are detached from the target molecules or the Complementary was obtained and, usually with PCR, amplified. To the procedure To further improve this amplification can take place under mutation conditions, so that a new library is created, which in turn uses the method according to the invention can be subjected. This way you can very quickly in terms of Binding ability to the target molecule optimized molecules can be found.

Im folgenden wird noch eine bevorzugte Ausführungform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, die in Fig. 1 schematisch dargestellt ist. A preferred embodiment of the method according to the invention is described below, which is shown schematically in FIG. 1.

Wie in Fig. 1a) gezeigt, sind an einer Oberfläche 1 Zielmoleküle 3 immobilisiert, an einer Oberfläche 5 sind verschiedene Moleküle 7 einer Bibliothek über einen Referenzkomplex 9 gebunden. Beide Oberflächen werden so in Kontakt gebracht, dass Zielmoleküle und Moleküle der Bibliothek in Kontakt kommen und unter Bildung eines Zielkomplexes binden können. Danach wird eine Kraft auf die beiden Oberflächen ausgeübt, d. h. die beiden Oberflächen werden getrennt. Wie Fig. 1b) zeigt, bleibt der Binder 11, für den die Trennkraft des Zielkomplexes größer war als die Trennkraft des Referenzkomplexes, mit dem Zielmolekül verbunden, während sich die anderen Moleküle wieder vom Zielmolekül lösen. As shown in FIG. 1 a), target molecules 3 are immobilized on a surface 1 , and different molecules 7 of a library are bound on a surface 5 via a reference complex 9 . Both surfaces are brought into contact in such a way that target molecules and molecules of the library come into contact and can bind to form a target complex. Then a force is exerted on the two surfaces, ie the two surfaces are separated. As FIG. 1b) shows, the binder 11 , for which the separating force of the target complex was greater than the separating force of the reference complex, remains connected to the target molecule while the other molecules are detached from the target molecule.

Nach erfolgter Trennung von Zielmolekülen und matrixgebundener Bibliothek kann der Binder auf verschiedene Art weiterbehandelt werden. Er kann identifiziert, amplifiziert und/oder sequenziert werden oder er kann als Matrize dienen zur Amplifikation von Komplementären. After the target molecules and the matrix-bound library have been separated, the Binder can be treated in different ways. It can be identified, amplified and / or sequenced or it can serve as a template for the amplification of Complementary.

Claims (12)

1. Verfahren zur in-vitro-Selektion von mit einem Zielmolekül bindefähigen Bindern aus einer Bibliothek von Molekülen, bei dem immobilisierte Zielmoleküle mit einer Vielzahl von Molekülen, die an einen Referenzkomplex gebunden sind, in Kontakt gebracht werden, sodass Zielmoleküle mit möglichen Bindern reagieren können und eine Verkettung aus Referenzkomplex, Binder und Zielmolekül bilden können, dann nicht gebundene Komponenten abgetrennt werden und an die Verkettungen eine Kraft angelegt wird, sodass sich eine Bindung in der Verkettung löst, und die an Zielmoleküle gebundenen Binder oder deren Komplementäre identifiziert und/oder amplifiziert werden, wobei der Referenzkomplex aus zwei Komponenten besteht, deren Bindungskraft zueinander so ausgewählt wird, dass unter Anlegen einer Zugkraft die Bindungskraft der beiden Referenzkomponenten aneinander kleiner als die Bindungskraft als die Bindungskraft eines spezifisch gebundenen Moleküls ist. 1. Method for the in vitro selection of bindable with a target molecule Binders from a library of molecules in which immobilized Target molecules with a variety of molecules attached to a reference complex are bound, brought into contact so that target molecules with possible binders can react and a chain of reference complex, Binder and target molecule can then form unbound components be separated and a force is applied to the chains so that A bond breaks in the chain, and that to target molecules bound binder or their complementary identified and / or amplified are, the reference complex consists of two components, their Binding force to each other is selected so that under application of a Tensile force is the binding force of the two reference components to each other less than the binding force than the binding force of a specific one bound molecule. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Refernzkomplex so ausgewählt wird, dass die Bindungskraft der beiden Referenzkomponenten aneinander auch kleiner als die Bindungskraft der Immobilisierungsbindung des Zielmoleküls ist. 2. The method according to claim 1, characterized in that the Reference complex is selected so that the binding power of the two Reference components to one another are also smaller than the binding force of the Immobilization binding of the target molecule is. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Binder replizierbare oder amplifizierbare Moleküle sind. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Binder are replicable or amplifiable molecules. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bibliothek von Nucleinsäuren verwendet wird. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that a library of nucleic acids is used. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleinsäuren DNA, RNA, PNA oder LNA verwendet werden. 5. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that used as nucleic acids DNA, RNA, PNA or LNA become. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Bibliothek eine Phage-Display-, Ribosomen-, Plasmid-, Bacterial, Viral Display-Bibliothek oder eine Bibliothek von Protein-mRNA- Komplexen verwendet wird. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that as a library a phage display, ribosome, plasmid, Bacterial, Viral Display library or a library of protein mRNA Complexes is used. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzkomplex aus zwei Nucleinsäuresträngen besteht, die zumindest teilweise komplementär sind. 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that the reference complex consists of two nucleic acid strands exists that are at least partially complementary. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein einzelner Nucleinsäurestrang eine Länge von 10 bis 100 Nucleotiden aufweist. 8. The method according to claim 6, characterized in that a single Nucleic acid strand has a length of 10 to 100 nucleotides. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als weiterer Differenzierungsparameter die Zugrate definiert eingestellt wird. 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that the train rate is defined as a further differentiation parameter is set. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzkomplex aus einem spezifisch bindenden Paar besteht, dessen Bindungskraft zwischen der Bindungskraft einer spezifischen Bindung und der Bindungskraft einer unspezifischen Bindung zwischen Zielmolekül und Binder liegt. 10. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the reference complex from a specifically binding pair exists, the binding force between the binding force of a specific binding and the binding force of an unspecific binding lies between target molecule and binder. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielmoleküle an einer ersten Oberfläche gebunden sind und die Moleküle der Bibliothek an einer zweiten Oberfläche gebunden sind, wobei die Oberflächen korrespondierende Flächenabschnitte aufweisen. 11. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the target molecules are bound to a first surface and the library molecules are bound to a second surface, wherein the surfaces have corresponding surface sections. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Zielmoleküle und Moleküle der Bibliothek an Trägern, wie Chips, Partikel oder Beads immobilisiert sind. 12. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that Target molecules and library molecules on carriers such as chips, particles or beads are immobilized.
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