DE10155736A1

DE10155736A1 - New protein with adenylate cyclase and ion-channel domains, useful for developing therapeutic agents against e.g. malaria, also related nucleic acid

Info

Publication number: DE10155736A1
Application number: DE10155736A
Authority: DE
Inventors: Joachim E Schultz; Juergen Linder
Original assignee: Genopia Biomedical GmbH
Current assignee: Genopia Biomedical GmbH
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2003-05-22

Abstract

Protein (I) comprising both an adenylate cyclase domain (ACD) and an ion-channel domain (ICD), is new. Independent claims are also included for: (1) nucleic acid (II), or its fragments, that is at least 65, especially 70,% identical with sequences (1; 2673 bp) and/or (2; 2999 bp), reproduced; (2) proteins and peptides (Ia) that are at least partly encoded by (II) or its fragments; (3) nucleic acid sequences (IIa) related to (II) and identified using them; (4) proteins and peptides (Ib) encoded by (IIa); and (5) therapeutic agents (A), particularly for malaria, cardiovascular disease and/or epilepsy, developed using (II) or (IIa).

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein, welches eine Ionenkanaldomäne aufweist, sowie die entsprechende Nukleotidsequenz und die Verwendung dieser Nukleotidsequenz. The invention relates to a protein which has an ion channel domain has, as well as the corresponding nucleotide sequence and the use this nucleotide sequence.

Die Zellen lebender Organismen zeichnen sich unter anderem dadurch aus, daß im Zellinneren und im extrazellulären Raum jeweils ganz bestimmte Ionen-Verhältnisse bestehen. Im Zellinneren ist beispielsweise im Gegensatz zum extrazellulären Raum eine niedrige Na⁺- und CL^-- und eine hohe K⁺-Konzentration vorzufinden. Die verschiedenen Prozesse, die für das Einstellen und Aufrechterhalten dieser bestimmten Ionen- Verhältnisse verantwortlich sind, lassen sich unter dem Begriff der Ionenregulation zusammenfassen. The cells of living organisms are characterized, among other things, by the fact that there are very specific ion ratios in the cell interior and in the extracellular space. In contrast to the extracellular space, a low Na ⁺ - and CL ^- - and a high K ⁺ concentration can be found inside the cell. The various processes that are responsible for setting and maintaining these specific ion ratios can be summarized under the term ion regulation.

An der Ionenregulation sind zum einen die sogenannten Ionenpumpen beteiligt. Hierbei handelt es sich um Transportproteine, die durch aktive, energieverbrauchende Mechanismen Ionen durch die Membranlipidschicht transportieren. Wichtigster Energielieferant für diese Prozesse ist das ATP (Adenosintriphosphat). On the one hand, the so-called ion pumps are involved in ion regulation involved. These are transport proteins that are active, energy-consuming mechanisms ions through the Transport membrane lipid layer. The most important energy supplier for these processes is the ATP (adenosine triphosphate).

Einen zweiten Typ membranständiger Transportproteine bilden die lonenkanäle. Durch diese Kanäle können Ionen passiv die Zellmembran durchdringen. Für das Öffnen und Schließen dieser Kanäle sind verschiedene Mechanismen bekannt. Beispielsweise erfolgt diese Steuerung durch Bindung eines extrazellulären Liganden (ligandenabhängige Kanäle) oder durch Spannungsänderungen bzw. durch Änderung des Membranpotentials (spannungsabhängige Kanäle). They form a second type of membrane-bound transport protein ion channels. Through these channels, ions can passively cross the cell membrane penetrate. For opening and closing these channels are various mechanisms known. For example, this is done Control by binding an extracellular ligand (ligand-dependent Channels) or by voltage changes or by changing the Membrane potential (voltage-dependent channels).

Die durch die genannten Ionentransportmechanismen regulierten Ionenkonzentrationsgradienten sind für die Organismen von entscheidender Bedeutung. Beispielsweise folgt die Reizweiterleitung im Nervensystem durch elektrische Impulse, die durch ganz bestimmte Ionenströme verursacht sind. Die Membran von Nervenzellen zeichnet sich durch eine bestimmte elektrische Polarisierung, dem sogenannten Membranpotential, aus. Eine Reizung der Nervenzelle bedingt eine schlagartige elektrische Umpolung der Membran, das sogenannte Aktionspotential. Hierfür sind unter anderem spannungsgesteuerte Na⁺- und K⁺-Kanäle verantwortlich. The ion concentration gradients regulated by the ion transport mechanisms mentioned are of crucial importance for the organisms. For example, the transmission of stimuli in the nervous system follows through electrical impulses that are caused by specific ion currents. The membrane of nerve cells is characterized by a certain electrical polarization, the so-called membrane potential. Irritation of the nerve cell causes an abrupt electrical polarity reversal of the membrane, the so-called action potential. Among other things, voltage-controlled Na ⁺ and K ⁺ channels are responsible for this.

Der einzellige Ziliat Paramecium wurde verschiedentlich als Modellorganismus für Nervenzellen (Neuronen) von Säugern untersucht, da er als Folge einer Depolarisierung der Membran zur Bildung von Aktionspotentialen in der Lage ist (Satow, Y., Kung, C. (1974) Nature 247; 69-71). Die Elektrophysiologie von Paramecium wurde ausführlich untersucht. Hierbei wurde gefunden, daß das Membranpotential und der Ionenfluß, insbesondere der Ausfluß von Kaliumionen aus der Zelle, für die Bildung eines Signalmoleküls, dem zyklischen 3'5'-Adenosin-Monophosphat (cAMP), verantwortlich ist. Nach einer Hyperpolarisierung der Paramecium-Zelle war ein vorübergehender Anstieg von cAMP zu beobachten. The unicellular ciliate paramecium was variously called Model organism for nerve cells (neurons) of mammals examined as it Follow a depolarization of the membrane to form Action potentials (Satow, Y., Kung, C. (1974) Nature 247; 69-71). The Electrophysiology of Paramecium has been studied extensively. It was found that the membrane potential and the ion flow, especially the outflow of potassium ions from the cell, for formation of a signaling molecule, the cyclic 3'5'-adenosine monophosphate (cAMP), is responsible. After hyperpolarization of the A temporary increase in cAMP was observed in the Paramecium cell.

Dieser Effekt konnte durch Blocker von Kalium-Kanälen spezifisch verhindert werden (Schultz, J. E., et al. (1992) Science 255; 600-603). This effect could be made specific by blockers of potassium channels can be prevented (Schultz, J.E., et al. (1992) Science 255; 600-603).

Für die Bildung des intrazellulären Signalmoleküls cAMP ist das Enzym Adenylatcyclase (AC) verantwortlich, welches die Konversion von Adenosintriphosphat (ATP) zum zyklischen Adenosin-Monophosphat katalysiert. Adenylatcyclasen werden sowohl in Bakterien als auch in eukaryotischen Einzellern (Protozoen) und Mehrzellern (Metazoen) gefunden (Barzu, O., Danchin, A., (1994) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 49; 241-283). Zur Zeit werden zumindest drei Klassen von AdenyJatcyclasen diskutiert, welche untereinander keine Sequenzähnlichkeiten aufweisen. Vertreter der Klassen I und II der Adenylatcyclasen sind in verschiedenen Bakterien zu finden. Die Adenylatcyclasen der Klasse III sind die am weitesten verbreiteten ACs, die in vielen Bakterien, in Protozoen und in Metazoen nachzuweisen sind. The enzyme is responsible for the formation of the intracellular signaling molecule cAMP Adenylate cyclase (AC) responsible for the conversion of Adenosine triphosphate (ATP) for cyclic adenosine monophosphate catalyzed. Adenylate cyclases are found in both bacteria and eukaryotic unicellular organisms (protozoa) and multicellular organisms (metazoa) were found (Barzu, O., Danchin, A., (1994) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 49; 241-283). There are currently at least three classes of AdenyJatcyclases discussed, which show no sequence similarities to each other. Representatives of classes I and II of the adenylate cyclases are in to find different bacteria. Class III adenylate cyclases are the most most common ACs found in many bacteria, in protozoa and in Metazoa are to be demonstrated.

In Säugetieren haben die bekannten membrangebundenen ACs (Klasse III) eine Struktur mit zwei Membrandomänen, die aus jeweils sechs Transmembranenhelices bestehen (Sunahara, R. K., et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36; 461-480). Die bisher bekannte Regulierung von ACs aus Säugetieren verläuft über Hormone. Nach Bindung der Hormone an ihre bestimmten Rezeptoren werden die Signale zu ACs über verschiedene Wege weitergeleitet. An dieser Weiterleitung sind beispielsweise G-Proteine, Proteinkinasen oder Ca²⁺-Ionen beteiligt. In mammals, the known membrane-bound ACs (class III) have a structure with two membrane domains, each consisting of six transmembrane helices (Sunahara, RK, et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36; 461-480). The previously known regulation of ACs from mammals is via hormones. After the hormones have bound to their specific receptors, the signals are passed on to ACs in various ways. For example, G proteins, protein kinases or Ca ²⁺ ions are involved in this forwarding.

Die eingangs erwähnte cAMP-Bildung im Ziliat Paramecium scheint nicht hormonell reguliert zu sein. Vielmehr scheint hier eine Regulation über Ionenströme stattzufinden. Es wurde vermutet, daß die Adenylatcyclase-Aktivität und die Ionenleitfähigkeit durch ein Protein bewerkstelligt werden (Schultz, J. E., et al. (1992) Science 255; 600-603). Die Identität eines solchen postulierten Enzyms konnte bisher jedoch nicht geklärt werden. The cAMP formation in the ciliate paramecium mentioned at the outset appears to be not being hormonally regulated. Rather, regulation seems here to take place via ion currents. It was suspected that the Adenylate cyclase activity and the ion conductivity by a protein be accomplished (Schultz, J.E., et al. (1992) Science 255; 600-603). The So far, however, identity of such a postulated enzyme has not been possible be clarified.

Ein erster Versuch zur Identifizierung der AC aus Paramecium ging davon aus, daß dieses Enzym in enger Verwandtschaft zu bekannten ACs aus Säugern steht. Dieser Ansatz führte zur Klonierung und Charakterisierung von einem Enzym aus Paramecium, welches einer Säuger-AC ähnlich ist. Es stellte sich jedoch heraus, daß es sich hierbei um eine Guanylatcyclase (GC) handelt (Linder, J. U., et al. (1999) EMBO J. 18; 4222-4232. Durch Sequenzvergleiche wurde die Existenz von zwei ähnlichen GCs in Plasmodium aufgedeckt, welche später biochemisch bestätigt wurde (Carucci, D. J., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275; 22147-22156). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Enzyme, die zyklische Nukleotide bilden, bei Ziliaten wie Paramecium und bei Apikomplexa wie Plasmodium eng verwandt sind. A first attempt to identify the AC from Paramecium went assume that this enzyme is closely related to known ACs from mammals. This approach led to cloning and Characterization of an enzyme from Paramecium, which is a mammalian AC is similar. However, it turned out to be a Guanylate cyclase (GC) is (Linder, J.U., et al. (1999) EMBO J. 18; From 4222 to 4232. Sequence comparisons confirmed the existence of two Similar GCs were discovered in Plasmodium, which later became biochemical (Carucci, D.J., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275; 22147-22156). These results show that the enzymes that are cyclic Form nucleotides in ciliates like Paramecium and in Apikomplexa like Plasmodium are closely related.

In der Zwischenzeit wurden verschiedene Genomprojekte für Paramecium tetraurelia (Dessen, P., et al. (2001) Trends Genet. 17; 306-308) und für verschiedene Plasmodium-Arten vorgenommen (Gardner M. J. et al. (1998) Science 282; 1126-1132; Bowman, S., et al. (1999) Nature 400; 532-538). Hierbei wurde von Paramecium eine Teilsequenz veröffentlicht, die eine Ähnlichkeit mit der katalytischen Domäne einer AC aufweist. Das Genom von Plasmodium falciparum konnte bereits weitgehend komplett entschlüsselt werden. Eine entsprechende Exon-Intron- Struktur, die die Grundlage für die Expression des gesuchten Enzyms bilden würde, konnte jedoch nicht ermittelt werden. In the meantime, various genome projects for Paramecium tetraurelia (Dessen, P., et al. (2001) Trends Genet. 17; 306-308) and for different Plasmodium species (Gardner M. J. et al. (1998) Science 282; 1126-1132; Bowman, S., et al. (1999) Nature 400; 532-538). Here Paramecium became a partial sequence published a similarity to the catalytic domain of an AC having. The Plasmodium falciparum genome was already able to largely completely decrypted. A corresponding exon intron Structure that forms the basis for the expression of the desired enzyme would form, but could not be determined.

Die Erfindung stellt sich somit die Aufgabe, ein Protein zu identifizieren, welches für die enge Kopplung von Ionenkanalaktivität und Adenylatcyclaseaktivität, insbesondere in Paramecium, verantwortlich ist. Mit Hilfe dieses neuartigen, bisher nicht bekannten Proteins sollen weitere entsprechende Enzyme aus anderen Organismen, insbesondere aus Säugetieren, identifiziert werden. Die Identifizierung von solchen Ionenkanälen ist von besonderem Interesse, da Störungen von Ionenkanälen bei einer Vielzahl von Erkrankungen eine große Rolle spielen. Die Entwicklung von Wirkstoffen, die die Aktivitäten der neuartigen Proteine beeinflussen, ist daher eine weitere Aufgabe der Erfindung. The object of the invention is therefore to identify a protein, which for the close coupling of ion channel activity and Adenylate cyclase activity, especially in Paramecium, is responsible. With help this novel, previously unknown protein is said to be more corresponding enzymes from other organisms, in particular from Mammals. The identification of such Ion channels is of particular interest because of interference from ion channels a large number of diseases play a major role. The Development of active substances that the activities of the novel proteins influence, is therefore another object of the invention.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Protein, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Proteins bzw. die entsprechenden Nukleotidsequenzen sind den Ansprüchen 2 bis 12 zu entnehmen. Die folgenden Ansprüche 13 bis 21 betreffen verschiedene Verwendungen der Nukleotidsequenzen. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht. The object is achieved by a protein as claimed in claim 1 is described. Preferred embodiments of this protein or Corresponding nucleotide sequences are claims 2 to 12 remove. The following claims 13 to 21 relate to various Uses of the nucleotide sequences. The wording of all Claims are hereby incorporated by reference into the content of the description made.

Das erfindungsgemäße Protein ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Adenylatcyclasedomäne und eine Ionenkanaldomäne aufweist. Ein derartiger Ionenkanal, der zugleich eine enzymatische Aktivität, nämlich eine Adenylatcyclaseaktivität enthält, konnte von den Erfindern erstmals gezeigt werden. The protein according to the invention is characterized in that it is a Has adenylate cyclase domain and an ion channel domain. On such an ion channel, which is also an enzymatic activity, namely Contains adenylate cyclase activity by the inventors for the first time to be shown.

Bei der Ionenkanaldomäne handelt es sich bevorzugterweise um eine Kaliumionenkanaldomäne. Doch auch andere Ionenkanäle werden von der Erfindung mit umfaßt, beispielsweise Natrium- oder Kalziumkanäle. Der Ionenkanal ist vorteilhafterweise durch Spannung steuerbar. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle spielen bei vielen Vorgängen im Organismus eine sehr wichtige Rolle. Beispielsweise sind spannungsgesteuerte Ionenkanäle bei der Reizweiterleitung, insbesondere bei der Bildung von Aktionspotentialen, beteiligt. The ion channel domain is preferably one Potassium ion channel domain. But other ion channels are also used by the invention includes, for example sodium or calcium channels. The ion channel can advantageously be controlled by voltage. Voltage-controlled ion channels play a large part in many processes Organism a very important role. For example voltage-controlled ion channels in stimulus transmission, especially in education of action potentials involved.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Proteins weist die Ionenkanaldomäne sechs Transmembranhelices sowie eine Porenschleife auf. Beispielsweise die vierte Transmembranhelix ist die spannungsempfindliche Helix. Die Porenschleife ist vorzugsweise nach der sechsten Transmembranhelix angeordnet und ragt bevorzugterweise von der intrazellulären Seite her in die Zellmembran. Dies ist ein entscheidender Unterschied zu bekannten Ionenkanälen, bei welchen die Porenschleife in der Regel zwischen der fünften und sechsten Transmembranhelix zu finden ist und hierbei vom extrazellulären Raum her in die Zellmembran hineinreicht. In a preferred embodiment of the protein according to the invention the ion channel domain has six transmembrane helices and one Pore loop on. For example, the fourth transmembrane helix is voltage sensitive helix. The pore loop is preferably after the sixth transmembrane helix arranged and protruding preferably from the intracellular side into the cell membrane. This is a decisive difference to known ion channels, in which the Pore loop usually between the fifth and sixth Transmembrane helix can be found and here from the extracellular space the cell membrane reaches into it.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Protein durch eine Protein-Proteinlnteraktionsdomäne gekennzeichnet. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um eine sogenannte tetratricopeptide-repeat-like (TPR)-Domäne. Eine solche Domäne ist für die Funktionsfähigkeit des erfindungsgemäßen Proteins wichtig. Derartige Domänen sind bereits im Zusammenhang mit anderen Enzymen beschrieben worden. Die Kombination mit einer Adenylatcyclase, wie im erfindungsgemäßen Protein, war bisher jedoch noch nicht bekannt. Furthermore, the protein according to the invention is characterized by a Protein-protein interaction domain characterized. This is it preferably by a so-called tetratricopeptide repeat-like (TPR) domain. Such a domain is essential for the functionality of the protein of the invention important. Such domains are already in the Relation to other enzymes has been described. The combination with an adenylate cyclase, as in the protein according to the invention, was previously however not yet known.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protein- Protein-Interaktionsdomäne C-terminal im gesamten Protein angeordnet. Die Ionenkanaldomäne des erfindungsgemäßen Proteins befindet sich in einer bevorzugten Ausführungsform im N-terminalen Bereich des gesamten Proteins. In a preferred embodiment of the invention, the protein Protein interaction domain C-terminal in the entire protein arranged. The ion channel domain of the protein according to the invention is located in a preferred embodiment in the N-terminal region of the whole protein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die funktionelle Einheit des Proteins von einem Tetramer gebildet. Hierbei bilden vier Proteinketten jeweils eine Pore, also den Ionenkanal, und jeweils zwei Proteinketten eine katalytische Domäne der Adenylatcyclase, so daß das Ionenkanal-AC-Tetramer jeweils zwei AC-Dimere und ein Porentetramer aufweist. In a preferred embodiment of the invention, the functional unit of the protein formed by a tetramer. Form here four protein chains each have a pore, i.e. the ion channel, and two protein chains a catalytic domain of adenylate cyclase, so that the ion channel AC tetramer has two AC dimers and one Has pore tetramer.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Protein dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest teilweise von einer Nukleotidsequenz, die zumindest zu 65%, insbesondere zumindest zu 70%, identisch mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 und/oder SEQ ID NO 2 ist, oder Teilen davon kodiert ist. In a particularly preferred embodiment of the invention, this is Protein according to the invention characterized in that it is at least partly from a nucleotide sequence that is at least 65% in particular at least 70%, identical to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 2, or parts thereof is encoded.

Die SEQ ID NO 1 zeigt die cDNA-Sequenz, die für das erfindungsgemäße Protein aus Paramecium tetraurelia kodiert. Das offene Leseraster beginnt bei Nukleotid 2. Das Stopcodon befindet sich bei Nukleotid 2597. Aufgrund des anderen Codon-Gebrauchs von Paramecium kodieren die Triplets TAA und TAG für Glutamin. Die SEQ ID NO 2 zeigt die cDNA-Sequenz von Plasmodium falciparum, die für das erfindungsgemäße Protein aus diesem Organismus kodiert. Das offene Leseraster startet hier bei Nukleotid 1. Das Stopcodon befindet sich bei Nukleotid 2655. SEQ ID NO 1 shows the cDNA sequence required for the Protein encoded according to the invention from Paramecium tetraurelia. The open reading frame starts at nucleotide 2. The stop codon is at nucleotide 2597. Due to Paramecium's other codon usage encode the triplets TAA and TAG for glutamine. SEQ ID NO 2 shows the cDNA sequence of Plasmodium falciparum, which for the Protein encoded according to the invention from this organism. The open reading frame starts here at nucleotide 1. The stop codon is at nucleotide 2655th

Weiterhin umfaßt die Erfindung Proteine und Peptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zumindest teilweise von einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder Teilen davon und/oder SEQ ID NO 2 oder Teilen davon kodiert sind. Hierbei handelt es sich also im wesentlichen um das entsprechende Protein aus Paramecium tetraurelia bzw. aus Plasmodium falciparum bzw. um Teile dieser Proteine, wie beispielsweise der Teil mit der Adenylatcyclaseaktivität oder mit der Ionenkanalaktivität. Außerdem umfaßt die Erfindung Proteine und Peptide, die zumindest teilweise von einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 5 und/der NO 6 kodiert sind. The invention further encompasses proteins and peptides which are thereby are characterized that they are at least partially by a Nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 or parts thereof and / or SEQ ID NO 2 or parts of it are encoded. So this is in essential for the corresponding protein from Paramecium tetraurelia or from Plasmodium falciparum or parts of these proteins, such as for example the part with the adenylate cyclase activity or with the Ion channel activity. The invention also includes proteins and peptides that at least partially of a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 5 and / the NO 6 are coded.

Die erfindungsgemäßen Proteine können beispielsweise aus einem Organismus isoliert und auch gereinigt werden. Es ist jedoch besonders bevorzugt, wenn die Proteine in einem experimentellen System exprimiert werden. Hierfür eignen sich im wesentlichen alle dem Fachmann geläufigen Expressionsmethoden. Besonders vorteilhaft ist die Expression in einem heterologen System, beispielsweise die Expression in Insektenzellen wie beispielsweise Sf9-Zellen unter Verwendung der Baculovirus-Technik. Hierbei kann es vorteilhaft sein, jeweils nur bestimmte Teile des erfindungsgemäßen Proteins zu exprimieren, wie beispielsweise die katalytische Domäne der Adenylatcyclase. The proteins of the invention can, for example, from a Organism isolated and also cleaned. However, it is special preferred when the proteins are in an experimental system be expressed. Essentially all are suitable for the person skilled in the art for this common expression methods. This is particularly advantageous Expression in a heterologous system, for example expression in Insect cells such as Sf9 cells using the Baculovirus technology. It can be advantageous here, only certain To express parts of the protein according to the invention, such as for example the catalytic domain of adenylate cyclase.

Weiterhin umfaßt die Erfindung Nukleotidsequenzen oder Teile davon, die zumindest zu 65%, insbesondere zumindest zu 70%, identisch mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 und/oder SEQ ID NO 2 sind. Außerdem umfaßt die Erfindung die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder Teile davon bzw. die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 2 oder Teile davon sowie auch gemäß SEQ ID NO 5 und NO 6. Diese Nukleotidsequenzen sind vorteilhafterweise dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein mit einer Adenylatcyclasedomäne und/oder Ionenkanaldomäne, insbesondere einer Kaliumionenkanaldomäne, kodieren. Diese Nukleotidsequenzen sind vorteilhaftexweise dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Protein mit einer Adenylatcyclasedomäne und/oder einer Ionenkanaldomäne, insbesondere einer Kaliumionenkanaldomäne, kodieren. Diese Nukleotidsequenzen können in isolierter Form vorliegen. In Anpassung an den jeweiligen Verwendungszweck können sie auch in einem Vektor, wie beispielsweise einem Expressionsvektor, eingebaut sein. Darüber hinaus können diese Sequenzen auch mit anderen Sequenzen kombiniert sein. The invention further comprises nucleotide sequences or parts thereof, which are at least 65%, in particular at least 70%, identical to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 2 are. In addition, the invention encompasses the nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 or parts thereof or the nucleotide sequence according to SEQ ID NO 2 or parts thereof and also in accordance with SEQ ID NO 5 and NO 6. These nucleotide sequences are advantageously characterized by this characterized as being for a protein with an adenylate cyclase domain and / or ion channel domain, in particular one Potassium ion channel domain, encode. These nucleotide sequences are advantageous characterized in that it is for a protein with a Adenylate cyclase domain and / or an ion channel domain, especially one Potassium ion channel domain, encode. These nucleotide sequences can be found in isolated form. Adapted to the respective They can also be used in a vector, such as a Expression vector. In addition, this Sequences can also be combined with other sequences.

Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der genannten Nukleotidsequenzen zum Identifizieren von ähnlichen Nukleotidsequenzen, insbesondere zum Identifizieren von ähnlichen Nukleotidsequenzen aus Säugerzellen. The invention further includes the use of the above Nucleotide sequences for identifying similar nucleotide sequences, especially for identifying similar nucleotide sequences Mammalian cells.

Zwischen der Sequenz, die für die katalytische Domäne der Adenylatcyclase im erfindungsgemäßen Protein kodiert und der Sequenz für die katalytische Domäne der löslichen Adenylatcyclase aus Rattenhoden besteht eine auffällige Ähnlichkeit. Diese Tatsache und das Auftreten der erfindungsgemäßen Proteine in dem Ziliaten Paramecium und in dem Parasiten Plasmodium impliziert die Existenz von derartigen Proteinen in einer Vielzahl von Organismen einschließlich Säugern. Diese homologen Proteine können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen identifiziert werden. Between the sequence for the catalytic domain of Adenylate cyclase encoded in the protein of the invention and the sequence for Catalytic domain of soluble adenylate cyclase from rat testes there is a striking similarity. This fact and the appearance of the proteins according to the invention in the ciliate Paramecium and in the parasite plasmodium implies the existence of such Proteins in a wide variety of organisms including mammals. This homologous proteins can with the help of the invention Nucleotide sequences are identified.

Hierfür werden vorzugsweise bioinformatische und/oder immunologische Methoden eingesetzt. Beispielsweise kann die Kreuzreaktion von Antikörpern gegen das erfindungsgemäße Protein aus Paramecium und/oder Plasmodium in anderen Organismen getestet werden, um auf diese Weise die verwandten Proteine und letztendlich auch die jeweiligen Nukleotidsequenzen zu identifizieren. Für die Antikörperherstellung kann beispielsweise das gesamte erfindungsgemäße Protein oder nur bestimmte Teile hiervon verwendet werden. Als Epitope eignen sich vor allem der N-Terminus des gesamten Proteins oder die katalytische Domäne der Adenylatcyclase. Entsprechende Methoden zur Herstellung der Antikörper und zur Identifizierung der homologen Sequenzen bzw. Proteine mit Hilfe der Antikörper oder mit Hilfe bioinformatischer Methoden sind dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig. For this purpose, bioinformatic and / or immunological are preferably used Methods used. For example, the cross reaction of Antibodies against the protein from Paramecium according to the invention and / or Plasmodium in other organisms to be tested for this way the related proteins and ultimately the identify the respective nucleotide sequences. For antibody production can, for example, the entire protein according to the invention or only certain parts of it are used. Are suitable as epitopes especially the N-terminus of the whole protein or the catalytic one Domain of adenylate cyclase. Appropriate manufacturing methods the antibodies and to identify the homologous sequences or Proteins with the help of antibodies or with the help of bioinformatic Methods are known to the person skilled in the art in this area.

Außerdem umfaßt die Erfindung Nukleotidsequenzen, die gemäß der soeben beschriebenen Verwendung identifiziert wurden. Es handelt sich hierbei also um Sequenzen, die für Proteine kodieren, die den zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Proteinen ähnlich sind bzw. mit diesen verwandt sind. Die Erfindung umfaßt hierbei auch die entsprechenden Peptide oder Proteine, die von diesen identifizierten Nukleotidsequenzen kodiert sind. Besonders bevorzugt sind hierbei solche Proteine aus Säugetieren. The invention also encompasses nucleotide sequences which according to use just described have been identified. It is about in this case sequences that code for proteins that previously proteins according to the invention described are similar or with these are related. The invention also includes the corresponding ones Peptides or proteins identified by these nucleotide sequences are encoded. Such proteins are particularly preferred Mammals.

Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen Nukleotidsequenzen oder der Nukleotidsequenzen, die wie eben beschrieben identifiziert wurden, bzw. der davon kodierten Peptide oder Proteine für die Entwicklung von Wirkstoffen. Für diese Verwendung werden die entsprechenden Sequenzen vorteilhafterweise in einem dem Fachmann geläufigen System exprimiert und so für experimentelle Ansätze zugänglich gemacht. Besonders geeignet sind hierfür heterologe Expressionssysteme, wie beispielsweise die Expression in Insektenzellen unter Verwendung der Baculovirus-Technik. Durch Untersuchung der Wechselwirkung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder der entsprechenden Peptide oder Proteine mit potentiellen Wirkstoffen können Substanzen entwickelt und/oder identifiziert werden, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere in einem Säugetier, beeinflussen. Beispielsweise kann so die Ionenkanalaktivität aktiviert, gehemmt oder in anderer Weise moduliert werden. Weiterhin kann auch die Aktivität der Adenylatcyclase des erfindungsgemäßen Proteins gesteigert, gehemmt und/oder moduliert werden. Ferner kann der Wirkstoff auch auf die Protein-Protein-Interaktionsdomäne wirken. Die genannten Wirkungen des Wirkstoffs können jeweils einzeln oder auch in Kombination durch den Wirkstoff bewerkstelligt werden. Ob jeweils eine Aktivierung, Hemmung oder sonstige Modulation vorteilhaft ist, hängt vom jeweiligen Anwendungsfall ab. The invention further includes the use of the above described nucleotide sequences or the nucleotide sequences which just as described, or the peptides encoded thereby or Proteins for drug development. For this use the corresponding sequences are advantageously in a Expert system and thus expressed for experimental Approaches made accessible. Heterologous ones are particularly suitable for this Expression systems, such as the expression in Insect cells using the baculovirus technique. By investigation the interaction of the nucleotide sequences according to the invention or the corresponding peptides or proteins with potential active substances can be developed and / or identified substances that the Activity of the proteins according to the invention, in particular in a Mammal. For example, the ion channel activity activated, inhibited or otherwise modulated. Furthermore can also the activity of the adenylate cyclase of the protein according to the invention be increased, inhibited and / or modulated. Furthermore, the Active ingredient also act on the protein-protein interaction domain. The effects of the active ingredient can be individually or in Combination can be accomplished by the active ingredient. Whether one at a time Activation, inhibition or other modulation is beneficial depends depending on the respective application.

Vorteilhafterweise sind die erfindungsgemäß entwickelten Wirkstoffe für die Behandlung von Krankheiten vorgesehen, insbesondere von Herz- Kreislauf-Erkrankungen und/oder Epilepsie. Bei diesen Krankheiten spielen Kaliumkanäle bekanntermaßen eine besonders hervortretende Rolle, so daß Wirkstoffe, die an derartigen Kanälen ansetzen, pharmakologisch von ganz besonderem Interesse sind. Selbstverständlich können die entsprechenden Wirkstoffe auch für die Behandlung anderer Krankheiten eingesetzt werden, die mit Fehlfunktionen von Ionenkanälen und/oder Adenylatcyclasen, bzw. insbesondere mit Fehlfunktionen der erfindungsgemäßen Proteine, im Zusammenhang stehen, oder die sich durch eine Beeinflussung dieser Proteine in ihrem Verlauf positiv beeinflussen lassen. Ein weiterer, besonders bevorzugter Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen Wirkstoffe sind Erkrankungen der Sinnesorgane, wie beispielsweise des Auges oder des Innenohrs. The active substances developed according to the invention are advantageously for the treatment of diseases, especially cardiac Circulatory diseases and / or epilepsy. With these diseases potassium channels are known to play a particularly prominent one Role, so that active substances that attach to such channels, are of particular pharmacological interest. Of course the corresponding active ingredients can also be used to treat others Diseases used with malfunctions of Ion channels and / or adenylate cyclases, or in particular with malfunctions of the proteins according to the invention are related, or by influencing these proteins positively in their course be influenced. Another, particularly preferred Field of application of the active substances according to the invention are diseases of the Sensory organs, such as the eye or inner ear.

Die beschriebenen Expressionssysteme der erfindungsgemäßen Proteine eignen sich ferner auch dazu, Proteine zu identifizieren, die mit den erfindungsgemäßen Proteinen assoziiert und/oder funktionell verknüpft sind. Diese Anwendung ist vor allem für die Forschung interessant. Weiterhin können mit hieraus erzielten Ergebnissen auch weitere Ansatzpunkte für die Entwicklung von Wirkstoffen zur Behandlung von Krankheiten gezogen werden. The described expression systems of the invention Proteins are also suitable for identifying proteins that are associated with the Proteins according to the invention associated and / or functionally linked are. This application is particularly interesting for research. Furthermore, with the results obtained from this, more can be done Starting points for the development of active ingredients for the treatment of Diseases are drawn.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der Beispiele in Verbindung mit den Figuren und den Unteransprüchen. Die verschiedenen Merkmale können jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. Further features of the invention result from the following Description of the examples in connection with the figures and the Dependent claims. The different features can each be used individually or be realized in combination with each other.

In den Figuren zeigt: The figures show:

Fig. 1 die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins aus Paramecium tetraurelia. Die sechs Transmembranhelices sind schwarz, die Porenschleife grau unterlegt. Die katalytische Domäne ist unterstrichen, die TPR-artige Domäne ist doppelt unterstrichen. Fig. 1 shows the amino acid sequence of the protein according to the invention from Paramecium tetraurelia. The six transmembrane helices are black, the pore loop is highlighted in gray. The catalytic domain is underlined, the TPR-like domain is double underlined.

Fig. 2 die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins aus Plasmodium falciparum. Die sechs Transmembranhelices sind schwarz, die Porenschleife grau unterlegt. Die katalytische Domäne ist unterstrichen, die TPR-artige Domäne ist doppelt unterstrichen. Fig. 2 shows the amino acid sequence of the protein according to the invention from Plasmodium falciparum. The six transmembrane helices are black, the pore loop is highlighted in gray. The catalytic domain is underlined, the TPR-like domain is double underlined.

Fig. 3 die berechnete Topologie des erfindungsgemäßen Proteins. Die Zellmembran ist mit hellen Strichen dargestellt. Die Transmembranhelices sind durch Säulen symbolisiert. Die vierte Transmembranhelix bildet einen Spannungssensor und ist hoch positiv geladen. Die klassische Porenschleife von Ionenkanälen ist C- terminal von der sechsten Transmembranhelix lokalisiert. Fig. 3 shows the calculated topology of the protein of the invention. The cell membrane is shown with light lines. The transmembrane helices are symbolized by columns. The fourth transmembrane helix forms a voltage sensor and is highly positively charged. The classic pore loop of ion channels is located at the C-terminal of the sixth transmembrane helix.

Fig. 4 einen Vergleich der erfindungsgemäßen Proteine aus Paramecium und Plasmodium in Kombination mit den einzelnen Transmembranhelices und der Pore des humanen Inward Rectifier CIK2 (GenBank accession No. L02752) und den C-terminalen 265 Aminosäuren der Adenylatcyclase CyaB1 von Anabaena (GenBank accession No. D89623). Konservierte Bereiche zwischen diesen drei Sequenzen und einige signifikante konservative Bereiche zwischen den Proteinen aus Paramecium und Plasmodium in den Kanaldomänen sind schwarz unterlegt. Konservative Bereiche zwischen zwei Sequenzen sind grau unterlegt. Fig. 4 shows a comparison of the proteins of the invention from Paramecium and Plasmodium in combination with each of transmembrane helices and the pore of the human inward rectifier CIK2 (GenBank accession No. L02752) and the C-terminal 265 amino acids of the adenylate cyclase CyaB1 of Anabaena (GenBank Accession No. D89623). Conserved areas between these three sequences and some significant conservative areas between the Paramecium and Plasmodium proteins in the channel domains are highlighted in black. Conservative areas between two sequences are grayed out.

Overview of the sequence listing

SEQ ID NO 1: erfindungsgemäße Nukleotidsequenz aus Paramecium tetraurelia
SEQ ID NO 2: erfindungsgemäße Nukleotidsequenz aus Plasmodium falciparum
SEQ ID NO 3: erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aus Paramecium tetraurelia
SEQ ID NO 4: erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aus Plasmodium falciparum
SEQ ID NO 5: künstliche Expressionskassette der Adenylatcyclase aus Paramecium tetraurelle. Dem offenen Leseraster vorangestellt ist eine Kozak-Sequenz. Das offene Leseraster wird am 5'-Ende von der Restriktionsstelle Ehel und am 3'-Ende von Notl flankiert.
SEQ ID NO 6: künstliche Expressionskassette der Adenylatcyclase aus Plasmodium falciparum. Dem offenen Leseraster vorangestellt ist eine Kozak-Sequenz. Das offene Leseraster wird am 5'-Ende von der Restriktionsstelle Hpal und am 3'-Ende von Notl flankiert. SEQ ID NO 1: nucleotide sequence according to the invention from Paramecium tetraurelia
SEQ ID NO 2: nucleotide sequence according to the invention from Plasmodium falciparum
SEQ ID NO 3: amino acid sequence according to the invention from Paramecium tetraurelia
SEQ ID NO 4: amino acid sequence according to the invention from Plasmodium falciparum
SEQ ID NO 5: Artificial expression cassette of adenylate cyclase from Paramecium tetraurelle. A Kozak sequence precedes the open reading frame. The open reading frame is flanked at the 5 'end by the restriction site Ehel and at the 3' end by Notl.
SEQ ID NO 6: Artificial expression cassette of adenylate cyclase from Plasmodium falciparum. A Kozak sequence precedes the open reading frame. The open reading frame is flanked at the 5 'end by the restriction site Hpal and at the 3' end by Notl.

Examples

In Anlehnung an eine Sequenz auf Chromosom 14 von Plasmodium falciparum, die eine signifikante Ähnlichkeit mit Adenylatcyclasen der Klasse III auf der Proteinebene zeigt, wurden degenerierte Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entworfen. Eine PCR mit Gesamt-DNA von Paramecium tetraurelia 51s ergab ein DNA-Fragment, welches für eine Proteinsequenz kodiert, die eine hohe Ähnlichkeit mit der katalytischen Region von Adenylatcyclasen der Klasse III aufweist. Ein anschließendes Screening von cDNA und Gesamt-DNA-Bibliotheken ergab die komplette Sequenz der AC von Paramecium tetraurelia (SEQ ID NO 1). Das hiervon kodierte Protein (SEQ ID NO 3, Fig. 1) hat rechnerisch eine Masse von 98 kDa. Die Analyse der Aminosäuresequenz zeigt drei Hauptdomänen: eine N-terminale Ionenkanaldomäne (Aminosäuren 1-514), die mit einer katalytische Adenylatcyclasedomäne (Aminosäuren 530-741) und einer C-terminalen tetratricopeptide-repeatlike (TPR)-Domäne (Aminosäuren 800-833) verbunden ist. Diese Topologie des Enzyms ist in Fig. 3 gezeigt. Degenerate primers for a polymerase chain reaction (PCR) were designed based on a sequence on chromosome 14 of Plasmodium falciparum, which shows a significant similarity to adenylate cyclases of class III at the protein level. PCR with total DNA from Paramecium tetraurelia 51s revealed a DNA fragment which codes for a protein sequence which is very similar to the catalytic region of class III adenylate cyclases. Subsequent screening of cDNA and total DNA libraries revealed the complete sequence of the Paramecium tetraurelia AC (SEQ ID NO 1). The protein encoded thereby (SEQ ID NO 3, Fig. 1) has a calculated mass of 98 kDa. The analysis of the amino acid sequence shows three main domains: an N-terminal ion channel domain (amino acids 1-514), a catalytic adenylate cyclase domain (amino acids 530-741) and a C-terminal tetratricopeptide repeatlike (TPR) domain (amino acids 800-833) connected is. This topology of the enzyme is shown in Fig. 3.

Eine nachfolgende PCR mit Gesamt-DNA aus Paramecium ergab verschiedene andere Fragmente von möglichen Adenylatcyclasen. Dies legt die Vermutung nahe, daß das klonierte Gen ein Teil einer großen Familie von AC-Isoformen in Paramecium ist. A subsequent PCR with total DNA from Paramecium revealed various other fragments of possible adenylate cyclases. This suggests that the cloned gene is part of a large gene Family of AC isoforms in Paramecium's.

Ausgehend von der Aminosäuresequenz des Proteins aus Paramecium wurden die zur Verfügung stehenden Daten aus dem Genomprojekt von Plasmodium falciparum untersucht. Hierbei wurden DNA-Bereiche gefunden, die den katalytischen Bereich der putativen Plasmodium-AC umgeben und die signifikante Ähnlichkeiten zur Paramecium-AC auf der Proteinebene zeigen. Anschließend wurde eine revers transkribierte (RT)-PCR durchgeführt, wobei spezifische Primer gemäß den vorläufigen Sequenzdaten von Chromosom 14 eingesetzt wurden. Hierdurch wurden insgesamt 23 Introns identifiziert, die die cDNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO 2 ergeben. Das entsprechende Protein (SEQ ID NO 4, Fig. 2) hat eine identische Topologie wie das Protein aus Paramecium mit einer Ionenkanaldomäne, einer katalytischen AC-Domäne und einer TPR-Domäne. Based on the amino acid sequence of the Paramecium protein, the available data from the genome project of Plasmodium falciparum were examined. Here, DNA regions were found which surround the catalytic region of the putative Plasmodium AC and which show significant similarities to the Paramecium AC at the protein level. A reverse transcribed (RT) -PCR was then carried out, using specific primers according to the preliminary sequence data of chromosome 14. As a result, a total of 23 introns were identified which give the cDNA sequence according to SEQ ID NO 2. The corresponding protein (SEQ ID NO 4, FIG. 2) has an identical topology as the Paramecium protein with an ion channel domain, a catalytic AC domain and a TPR domain.

Ein Vergleich des Proteins aus Paramecium mit dem aus Plasmodium (Fig. 4) und mit bekannten Ionenkanälen und Adenylatcyclasen zeigt verschiedene strukturelle Merkmale dieser Enzyme: die Ionenkanaldomäne enthält sechs putative Transmembranhelices. Die vierte Helix korrespondiert genau mit dem klassischen Spannungssensor der spannungsempfindlichen Ionenkanäle. Die Helix besteht aus einem hoch positiv geladenen amphipathischen Peptid, in welchem polare Reste in der gleichen Art wie in Spannungssensoren von Ionenkanälen angeordnet sind (Fig. 4). Die Porenschleife von klassischen Ionenkanälen befindet sich zwischen der fünften und sechsten Transmembranhelix. Im Gegensatz dazu befindet sich die entsprechende Sequenz im Ionenkanal der erfindungsgemäßen Proteine von Protozoen stromabwärts von der sechsten Transmembranhelix, nahe am N-Terminus der katalytischen AC-Domäne (Fig. 4). Die Porenschleife ragt von der cytosolischen Seite in die Zellmembran. Dies ist vergleichbar mit dem Kaliumkanal vom Typ des Glutamatrezeptors aus Synechocystis-Arten (Chen, G. Q., et al. (1999) Nature 402; 817-821). A comparison of the protein from Paramecium with that from Plasmodium ( FIG. 4) and with known ion channels and adenylate cyclases shows various structural features of these enzymes: the ion channel domain contains six putative transmembrane helices. The fourth helix corresponds exactly with the classic voltage sensor of the voltage-sensitive ion channels. The helix consists of a highly positively charged amphipathic peptide, in which polar residues are arranged in the same way as in voltage sensors of ion channels ( FIG. 4). The pore loop of classic ion channels is located between the fifth and sixth transmembrane helix. In contrast, the corresponding sequence is located in the ion channel of the proteins of protozoa according to the invention downstream of the sixth transmembrane helix, close to the N-terminus of the catalytic AC domain ( FIG. 4). The pore loop protrudes from the cytosolic side into the cell membrane. This is comparable to the potassium channel of the glutamate receptor type from Synechocystis species (Chen, GQ, et al. (1999) Nature 402; 817-821).

Die katalytische AC-Domäne zeigt die höchste Ähnlichkeit mit bakteriellen Adenylatcyclasen der Klasse III, beispielsweise aus Anabaena, Rhizoblum, und Treponema. Die Ähnlichkeit mit anderen Adenylatcyclasen aus Protozoen und Metazoen ist deutlich schwächer. Eine Ausnahme hiervon bildet die lösliche Adenylatcyclase aus Rattenhoden, die deutliche Ähnlichkeiten mit der katalytischen AC-Domäne des erfindungsgemäßen Proteins aufweist. Dieser Typ der Adenylatcyclasen der Klasse III scheint damit zwischen Bakterien, Protozoen und auch Metazoen verbreitet zu sein. The catalytic AC domain is most similar to bacterial class III adenylate cyclases, for example from Anabaena, Rhizoblum, and Treponema. The similarity to other adenylate cyclases from protozoa and metazoa is significantly weaker. An exception the soluble adenylate cyclase from rat testis forms the clear similarities to the catalytic AC domain of the protein according to the invention. This type of class adenylate cyclases III seems between bacteria, protozoa and also metazoa to be common.

Die TPR-Domäne am C-Terminus des erfindungsgemäßen Proteins existiert nicht nur bei diesem Protein mit Adenylatcyclaseaktivität aus Paramecium und Plasmodium, sondern auch in der Adenylatcyclase CyaB1 (Fig. 4) und CyaB2 aus Anabaena spec. als auch in der Adenylatcyclase ACr von Dictyostellum discoideum. The TPR domain at the C-terminus of the protein according to the invention exists not only in this protein with adenylate cyclase activity from Paramecium and Plasmodium, but also in the adenylate cyclase CyaB1 ( FIG. 4) and CyaB2 from Anabaena spec. as well as in the adenylate cyclase ACr from Dictyostellum discoideum.

Um die enzymatische Aktivität der AC-Domänen der erfindungsgemäßen Proteine aus Paramecium und Plasmodium zu bestätigen, wurden die Enzyme in verschiedenen Zelltypen heterolog exprimiert. Problematisch hierbei ist, daß der Ziliat Paramecium einen alternativen genetischen Code benutzt, d. h. die universellen TAA/TAG-Stopcodons kodieren für Glutamin. Daher können Paramecium-Gene nicht ohne weiteres heterolog exprimiert werden. Weiterhin weist die cDNA der Plasmodium- AC-Domäne einen extrem hohen A/T-Gehalt (80%) auf. Hierdurch wird eine effiziente Expression in etablierten Systemen verhindert. Um diese Probleme zu umgehen, wurden künstliche Gene der Paramecium-AC und Plasmodium-AC kreiert, die den Codongebrauch von Säugern verwenden (SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6). To the enzymatic activity of the AC domains of proteins according to the invention from Paramecium and Plasmodium were confirmed the enzymes are heterologously expressed in different cell types. The problem here is that the Ziliat Paramecium is an alternative uses genetic code, d. H. the universal TAA / TAG stop codons code for glutamine. Therefore, Paramecium genes cannot be used easily be expressed heterologously. Furthermore, the cDNA of the Plasmodium AC domain has an extremely high A / T content (80%). This will prevents efficient expression in established systems. Around To circumvent problems, artificial genes of Paramecium-AC were created and Plasmodium-AC created the codon use of mammals use (SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6).

Die Expression der katalytischen Domäne der Paramecium-AC in E. coli führte zur Produktion von großen Mengen von Einschlußkörperchen. Expression of the catalytic domain of Paramecium-AC in E. coli led to the production of large amounts of inclusion bodies.

Eine AC-Aktivität wurde jedoch nicht erreicht. Eine Denaturierungsreinigung des exprimierten Proteins ergab genug Material, um Antikörper gegen das Enzym zu generieren. However, AC activity was not achieved. A Denaturation purification of the expressed protein revealed enough material to raise antibodies to generate against the enzyme.

Im Gegensatz dazu war die Expression der katalytischen DDmäne der Plasmodium-AC in E. coli sehr uneffektiv. Daher wurden Insektenzellen (Sf9-Zellen) als Expressionssystem eingesetzt, wobei die Baculovirus- Technik verwendet wurde. Die Expression der Plasmodium-AC war erfolgreich. Mit einem minimalen Konstrukt mit den Aminosäuren 472-830, die die katalytische AC-Domäne und die TPR-Domäne umfassen, wurde eine AC-Aktivität erreicht. Ein N-terminaler Hexahistidin-Tag erlaubte eine teilweise Reinigung des aktiven Enzyms durch Metallaffinitäts- Chromatographie. Ein größeres Konstrukt, welches die Aminosäuren 457-830 umfaßte, war gleichfalls aktiv und konnte auch gereinigt werden. Dieses Konstrukt umfaßte zusätzlich die Verbindung zwischen der katalytischen AC-Domäne und dem Ionenkanal. Es konnte also gezeigt werden, daß die Adenylatcyclase aus Plasmodium die Bildung von cAMP aus ATP katalysieren kann. Diese enzymatische Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins funktioniert selbstständig, und diese katalytische Aktivität sitzt im C-terminalen Teil des gesamten Proteins. Sequenzprotokoll

In contrast, expression of the Plasmodium-AC catalytic domain in E. coli was very ineffective. Therefore, insect cells (Sf9 cells) were used as an expression system, using the baculovirus technique. The expression of the Plasmodium AC was successful. AC activity was achieved with a minimal construct with amino acids 472-830, comprising the catalytic AC domain and the TPR domain. An N-terminal hexahistidine tag allowed partial purification of the active enzyme by metal affinity chromatography. A larger construct, which included amino acids 457-830, was also active and could also be purified. This construct also included the connection between the catalytic AC domain and the ion channel. It could thus be shown that adenylate cyclase from Plasmodium can catalyze the formation of cAMP from ATP. This enzymatic activity of the protein according to the invention functions independently, and this catalytic activity is located in the C-terminal part of the entire protein. sequence Listing

Claims

1. Protein, characterized in that it has an adenylate cyclase domain and an ion channel domain.

2. Protein according to claim 1, characterized in that the ion channel domain is a potassium ion channel domain.

3. Protein according to claim 1 or claim 2, characterized characterized in that the ion channel formed by the ion channel domain is controllable by voltage.

4. Protein according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the ion channel domain is six Has transmembrane helices and a pore loop, the pore loop preferably after the sixth transmembrane helix and is preferably arranged from the intracellular side.

5. Protein according to any one of the preceding claims, characterized characterized that there is an additional Protein-protein interaction domain, especially a tetratricopeptide repeat-like (TPR) domain.

6. Protein according to claim 5, characterized in that the Protein-protein interaction domain is arranged C-terminal.

7. Protein according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the ion channel domain is arranged N-terminal is.

8. Protein according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that it is at least partially by a Nucleotide sequence which is at least 65%, in particular at least 70%, identical to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 2, or parts thereof are encoded.

9. Protein according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that it is at least partially by a Nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 or parts thereof and / or SEQ ID NO 2 or parts thereof is encoded.

10. nucleotide sequence or parts thereof, characterized in that at least 65%, especially at least 70%, identical to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 2.

11. Nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 or parts thereof.

12. Nucleotide sequence according to SEQ ID NO 2 or parts thereof.

13. Use
a nucleotide sequence which is at least 65%, in particular at least 70%, identical to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 2, or parts thereof and / or
a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 1 or parts thereof and / or
a nucleotide sequence according to SEQ ID NO 2 or parts thereof
for identifying similar nucleotide sequences, in particular similar nucleotide sequences from mammalian cells.

14. Use according to claim 13, characterized in that identifying with the help of bioinformatics and / or immunological methods is carried out.

15. nucleotide sequence, characterized in that it according to a Use according to claim 13 or claim 14 is identified.

16. peptide or protein, characterized in that it is from a Nucleotide sequence is encoded according to one use Claim 13 or Claim 14 is identified.

17. Use of a nucleotide sequence according to claim 10, Claim 11 or Claim 12 or one according to Claim 13 or Claim 14 identified similar nucleotide sequence or one of which encoded peptide or protein for the development of Agents.

18. Use according to claim 17, characterized in that the expressed similar nucleotide sequences or parts thereof, are expressed in particular heterologously.

19. Use according to claim 17 or claim 18, characterized characterized in that the active substances ion channels, in particular Potassium ion channels affect their activity.

20. Use according to one of claims 17 to 19, characterized characterized in that the active substances adenylate cyclases in their activity influence.

21. Use according to one of claims 17 to 20, characterized characterized in that the active substances for the treatment of Diseases, especially cardiovascular diseases and / or Epilepsy, are provided.