DE10131971A1

DE10131971A1 - Hämatopoetisches Stammzell-Präparat und Verfahren zu dessen Herstellung

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Publication number: DE10131971A1
Application number: DE10131971A
Authority: DE
Original assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Current assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2003-01-30

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hämatopoetischen Stammzell-Präparates, das zur allogenen Transplantation geeignet ist und nach Transplantation in einen Rezipienten keine Graft-versus-Host-Erkrankung hervorruft, ein Verfahren zur Isolierung eines von allo-reaktiven T-Zellen befreiten T-Zell-Präparates, ein hämatopoetisches Stammzell-Präparat und die Verwendung dieses hämatopoetischen Stammzell-Präparates zur Herstellung eines Transplantats zur allogenen Transplantation.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hämatopoetischen Stammzell- Präparates, das zur allogenen Transplantation geeignet ist und nach Transplantation in einen Rezipienten keine Graft-versus-Host-Erkrankung hervorruft, ein Verfahren zur Isolierung eines von alloreaktiven T-Zellen weitgehend befreiten T-Zell- Präparates, ein hämatopoetisches Stammzell-Präparat und die Verwendung dieses hämatopoetischen Stammzell-Präparates zur Herstellung eines Transplantats zur allogenen Transplantation.
Unter dem Begriff Leukämien werden verschiedene Erkrankungen zusammengefasst, die durch maligne Transformation hämatopoetischer oder lymphatischer Zellen entstehen. Gemeinsames Merkmal dieser Krankheiten ist die Proliferation von Leukämiezellen in Knochenmark sowie häufig auch in lymphatischen Geweben und Blut. Die Symptome dieser Erkrankungen resultieren aus der Verdrängung und Unterdrückung der normalen Hämatopoese und der Beeinträchtigung des Immunsystems.
Die einzige kurative Therapie zur Behandlung von Leukämien ist die cytotoxische Chemotherapie. Nur bei ZNS-Beteiligung oder zur ZNS-Prophylaxe wird zusätzlich eine Strahlentherapie eingesetzt. Bei jüngeren Patienten (≤ 65 Jahre) besteht die Möglichkeit, zur Therapie von Leukämie-Erkrankungen eine Transplantation von Knochenmarks-Stammzellen (Knochenmarktransplantation) oder peripheren Blutstammzellen durchzuführen. Prinzipiell stehen zwei Verfahren zur Verfügung, nämlich die allogene Stammzelltransplantation HLA-identischer Geschwister, anderer Familienangehöriger oder unverwandter Fremdspender sowie die autologe Transplantation von in Vollremission gewonnenen Stammzellen des Patienten.
Bei der Knochenmarktransplantation wird eine Suspension gesunder Knochenmarkzellen in einen Empfänger mit gestörter Blutbildung transfundiert. Das Knochenmark enthält hämatopoetische Stammzellen, die sich in den Knochenmarkräumen ansiedeln und nach Proliferation und Differenzierung die Blutbildung des Empfängers ersetzen. Auch andere hämatopoetische Zellen, wie beispielsweise Stammzellen des peripheren Blutes, Zellen aus Nabelschnurblut oder fötale Leberzellen, können zur Transplantation verwendet werden.
Alle Suspensionen hämatopoetischer Zellen enthalten in unterschiedlichem Maße Lymphozyten, die zu Immunreaktionen gegen Organe des immungenetisch fremden Empfängers befähigt sind. Diese Reaktion, die insbesondere bei allogenen Transplantationen auftritt, wird als Graft-versus-Host-Reaktion (GvH- Reaktion; Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion) bezeichnet.
Die Graft-versus-Host-Reaktion oder Graft-versus- Host-Krankheit wird durch eine Immunreaktion des nicht-autologen Transplantates gegen fremde Histokompatibilitätsantigene des Empfängers verursacht. Bei Transplantation eines Transplantats aus HLA- identischen Spendern ist die GvH-Reaktion gegen Minor-Histokompatibilitätsantigene gerichtet, bei anderen Spendern ist sie auch gegen HLA-Antigene (human leucocyte antigen), also den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) gerichtet. Im gesunden Empfängerorganismus werden die übertragenen Zellen rasch eliminiert. Bei Empfängern, bei denen die Immunabwehr durch Bestrahlung oder immunsupressive Behandlung unterdrückt ist, kann die GvH-Reaktion zur sogenannten Sekundärreaktion führen, einer schweren akuten oder chronischen Erkrankung mit Leber- und Milzvergrößerung, Atrophie der lymphatischen Organe, Durchfall, Hautveränderungen und Kachexie. Der Ausbruch der Graft-versus-Host-Reaktion kann in einigen Fällen letal verlaufende Erkrankungen wie Leberinsuffizienz nach sich ziehen.
Akute Graft-versus-Host-Krankheit bricht häufig bereits in den ersten 2-3 Wochen nach Knochenmarktransplantation aus, also zu einem Zeitpunkt, wo eine schwere Neutropenie besteht und der Patient durch Infektionen mit Bakterien und Pilzen gefährdet ist. Eine chronische GvH-Reaktion bricht hingegen etwa 100 bis 400 Tage nach Transplantation aus. Bei chronischer GvH-Reaktion stellen insbesondere rezidivierende sinubronchiale Infektionen Probleme dar. Es kann ein "Asplenie-Syndrom" mit Abwehrschwäche gegen grampositive Erreger, insbesondere Pneumokokken, bestehen. Bedingt durch die GvH- Reaktion ist die Mortalitätsrate bei allogenen Knochenmarkstransplantationen in einer frühen Phase sehr hoch. In einer Studie von Barlogie et al. (Barlogie et al., Seminars in Hematology, 32 (1995), 31-44) erhielten 268 Patienten Allotransplantate. Innerhalb von einem Jahr starben etwa 50% der Patienten. Insgesamt überlebten in einem Zeitraum von 4 Jahren nur 35% aller Patienten.
Die Vermeidung und Behandlung der Graft-versus- Host-Reaktion stellt daher eines der Hauptprobleme der Knochenmarktransplantation dar.
Zur Vorbeugung der Graft-versus-Host-Reaktion wird nach Transplantation beispielsweise immunsupressiv mit Methotrexat und Ciclosporin A behandelt. Dennoch tritt bei etwa 30 bis 50% der HLA-identisch transplantierten Patienten eine behandlungsbedürftige GvH-Krankheit auf, die bei etwa 10 bis 20% lebensbedrohlich werden kann. Eine weitere Strategie zur Verhütung der GvH-Reaktion besteht in der Entfernung der Donor-T-Lymphozyten aus dem Knochenmark vor der Transplantation.
Zur Abtrennung oder Inaktivierung von T-Lymphozyten wurden zahlreiche Verfahren entwickelt. Beispielsweise können zur Entfernung von T-Zellen aus Knochenmarkstransplantaten Verfahren wie Dichtegradienten-Zentrifugation, Agglutination mit Sojabohnen-Lectin oder Schaferythrozyten-Rosettenbildung, aber auch Behandlungen mit cytotoxischen Medikamenten, Corticosteroiden oder gegen T-Zellen gerichteten monoklonalen Antikörpern sowie eine positive Selektion von CD34⁺-Zellen durchgeführt werden (Champlin, Journal of Hematotherapy, 2 (1993), 27-42; Reisner et al., The Lancet, 2 (1981), 327-331; Waldmann et al., The Lancet, 2 81984), 483-486; Antin et al., Blood, 78 (1991), 2139-2149; Soiffer et al., J. Clin. Oncol., 10 (1992), 1191-1200). Ein relativ effizientes Verfahren zur Entfernung von T- Zellen aus Knochenmark ist das von Reisner et al. (1981). Bei diesen Verfahren erfolgt zuerst eine differenzielle Agglutination mit Sojabohnen-Lectin, wobei reife Leukozyten einschließlich T-Zellen, B- Zellen, Monozyten und Granulozyten entfernt werden. Anschließend werden die restlichen T-Zellen mit Hilfe des Erythrozyten-Rosetten-Verfahrens entfernt. Derzeit werden T-Zellen sehr effizient unter Verwendung des MACS-Verfahrens entfernt. Dieses Selektionsverfahren, das auf einer magnetischen Separation mittels Mikroperlen (microbeads) gegen CD34 basiert, erlaubt eine sehr effiziente Depletion der T-Zellen und bewirkt gleichzeitig eine sehr gute Reinheit der CD34⁺-Stammzellen.
Durch die ex vivo-Entfernung von T-Zellen aus dem Transplantat kann zwar die Häufigkeit der Graft- versus-Host-Reaktion teilweise erheblich vermindert werden. Es hat sich aber auch herausgestellt, dass die Entfernung von T-Zellen mit einem erhöhten Risiko viraler opportunistischer Infektionen (Li et al., Blood, 83 (1994), 1971-1979), einem verstärkten Auftreten von Lymphomen, die mit dem Epstein- Barr-Virus im Zusammenhang stehen, einem beeinträchtigenden Einwachsen des Transplantates und damit einer erhöhten Transplantat-Abstoßung (Martin, J. Exp. Med., 178 (1993), 703-712) und dem Verlust des Graft-versus-Leukämie(GVL)-Effektes einhergeht, wobei die Rezidivrate von Leukämie drastisch ansteigen kann (Goldman et al., Ann. Intern. Med., 108 (1988), 806-814).
Dass erhöhte Risiko einer Transplantat-Abstoßung nach Entfernen der T-Lymphozyten ist in mehreren Publikationen dokumentiert worden (Beatty et al., N. Engl. J. Med., 315 (1985), 765-771; Hale et al., Transplantation, 45 (1988), 753-759; Patterson et al., Br. J. Hematol., 63 (1986), 221-230). Bei einem Maus-Modell zur allogenen Knochenmarkstransplantation wurde festgestellt, dass das Transplantat nur dann dauerhaft im Rezipienten verblieb, wenn eine starke immunsupressive Behandlung mit einer Strahlentherapie durchgeführt wurde, wobei die T-Zellen des Donors eliminiert wurden (Lapidot et al., Blood, 73 (1989), 2025).
Aufgrund des Fehlens reifer T-Zellen vom Donor im Transplantat tritt nach einer Knochenmarkstransplantation mit Knochenmarkstransplantaten, in denen T-Zellen eliminiert wurden, eine stark ausgeprägte Immunschwäche auf. Die Immunschwäche besteht primär in der Abwesenheit von reifen T-Zellen des Spenders, die eine temporal adaptive Immunrekonstitution, zum Beispiel gegen virale Infektionen übernehmen. Eine der Konsequenzen dieser schweren Immunschwäche besteht in dem erhöhten Risiko, dass in den ersten sechs Monaten nach Transplantation durch Epstein-Barr-Viren (EBV) verursachte lymphoproliferative Störungen auftreten (Shapiro et al., Blood, 71 (1988), 1234-1243; Zutter et al., Blood, 72 (1988), 520-522). Diese lymphoproliferativen Störungen sprechen sehr häufig nicht auf die üblichen Therapien an.
Das Risiko einer höheren Tumor-Rezidivrate nach ex vivo-Entfernen von T-Lymphozyten wird auf den Verlust des Graft-versus-Leukämie(GvL)-Effektes zurückgeführt. Der Begriff "Graft-versus-Leukämie- Effekt" beschreibt das Phänomen, dass bei einer allogenen Transplantation die Rezidivrate normalerweise geringer ist als bei einer autologen Transplantation. Ein direkter Beweis für einen Graft- versus-Leukämie-Effekt ist in Patienten mit wiederkehrender chronischer myelogener Leukämie erbracht worden, die nach einer Knochenmarkstransplantation mit von T-Zellen befreiten Knochenmark durch Infusion mononukleärer Zellen aus peripherem Blut aus dem Knochenmarks-Donor ohne weitere Chemotherapie oder Radiotherapie behandelt wurden. Diese Infusion führte zur Abtötung von Leukämiezellen (Drobyski et al., Blood, 82 (1993), 2310-2318; Sullivan et al., N. Engl. J. Med., 320 (1989), 828-834). Obwohl die Infusion mononukleärer Zellen aus peripherem Blut zu einer vollständigen und langfristigen Remission in solchen Patienten führen kann, kann eine solche Therapie dennoch mit der Graft-versus-Host- Erkrankung einhergehen (Bar et al., J. Clin. Oncol., 11 (1993), 513).
Die Rolle der T-Zellen wurde in Untersuchungen von Molldrem et al. und Gao et al. genauer aufgeschlüsselt (Molldrem et al., Blood, 88 (7) (1996), 2450- 2457; Gao et al., Blood, 94 (9) (1999), 2999-3006; Gao et al., Blood, 95 (2000), 2198-2203). Dabei wurden allo-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)- restringierte cytotoxische T-Lymphozyten (CTL), die spezifisch für Antigene sind, die sehr häufig in erhöhten Mengen auf der Oberfläche von Leukämiezellen exprimiert werden, aus einer allorestringierten T-Zell-Population kloniert und zur Vermittlung einer Graft-versus-Leukämie-Reaktion verwendet. Zusammengefasst zeigen die vorstehenden Beobachtungen, dass die kurative Wirkung einer allogenen Knochenmarktransplantation zumindest teilweise auf den Graft-versus-Leukämie-Effekt (GvL) zurückzuführen ist und dass T-Zellen nicht nur die Graft-versus-Host-Reaktion auslösen, sondern auch eine enorme Bedeutung bei der Vermittlung sowohl der antiviralen Immunität als auch des Graft-versus-Leukämie-Effektes haben. In jüngster Zeit wurden daher neue Ansätze entwickelt, die darauf basieren, dass T-Zellen erst nach Transplantation eliminiert werden und zwar vor dem Ausbruch der Graft-versus-Host-Reaktion oder während des Ausbruchs.
Tiberghien und Mitarbeiter entwickelten ein Verfahren, wobei T-Zellen mit einem retroviralen Vektor ex vivo transduziert wurden, der das Thymidinkinase-Gen vom Herpes simplex-Virus umfasst. Die T- Zellen können dann zusammen mit hämotopoetischen Stammzellen an einen Patienten verabreicht werden. Falls sich beim Patienten die Graft-versus-Host- Krankheit entwickelt, kann Ganciclovir an den Patienten verabreicht werden, um die transduzierten T- Zellen zu eliminieren. (Tiberghien et al., Blood, 84 (1994), 1333-1341).
Die WO 97/45142 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Patienten mit Leukämie, wobei diesen Patienten gentechnisch veränderte T-Zellen verabreicht werden, die ein Polynucleotid enthalten, das einen negativen selektiven Marker enthält. Nachdem die Zellen über einen bestimmten Zeitraum im Patienten verbleiben und so eine therapeutische Wirkung ausüben, wird ein interagierende Mittel, beispielsweise Ganciclovir, an den Patienten verabreicht, wobei die gentechnisch veränderten T-Zellen abgetötet werden und somit die Entwicklung von GvH- Krankheiten verhindert wird.
Weitere Verfahren zur Übertragung derartiger Suicide-Gene in Donor-T-Lymphocyten sind beispielsweise von Cohen et al. (Blood, 89 (1997), 4636-4645) und Bonini et al. (Science, 276 (1997), 1719-1723) beschrieben.
Die Verfahren unter Verwendung gentechnisch veränderter T-Zellen sind jedoch aus mehreren Gründen nachteilig. Ein Patient, der solche gentechnisch veränderten T-Zellen erhalten hat, muss mit Medikamenten oder chemischen Mitteln behandelt werden, um die T-Zellen abzutöten. Solche Medikamente oder chemischen Mittel gehen einerseits mit schweren Nebenwirkungen einher. Dazu kommt, dass, wenn die Anwendung der Medikamente oder Mittel zu spät erfolgt, sich trotzdem zumindest eine partielle GvH- Reaktion entwickeln kann. Außerdem hat sich herausgestellt, dass mit einem Suicide-Gene transduzierte T-Lymphozyten häufig eine Resistenz gegen Ganciclovir entwickeln (Garin et al., Blood, 97 (2001), 122-129).
Auch Verfahren zur Modifikation der T-Zell- Reaktionen unter Verwendung von Cytokinen (Yang et al., Blood, 90 (11) (1997), 4651-4660); Hill et al., J. Clin. Invest., 102 81998), 115-123), zur Eliminierung von T-Zellen unter Verwendung von Immuntoxinen gegen CD25 oder über eine Aktivierung des Antigens CD69 (Koh et al., Bone Marrow Transpl., 23 (1999), 1071-1079; Montagna et al., Blood, 93 (10) (1999), 3550-3557) und zur Blockierung von Costimulations-Signalen, die zur optimalen T-Zellaktivierung erforderlich sind (Blazar et al., J. Clin. Invest., 102 (1998), 473-482; Guinan et al., New Engl. J. Med., 340 (1999), 1704-1714), sind bekannt. Diese Verfahren sind jedoch deshalb nachteilig, weil dadurch alle T-Lymphocyten, unabhängig von ihrer Spezifität, beeinträchtigt oder eliminiert werden.
Die Entwicklung weiterer verbesserter Verfahren und Mittel zur Verhinderung der mit der allogenen Knochenmarktransplantation verbundenen Graft-versus- Host-Krankheit in einem Rezipienten, insbesondere zur Eliminierung der die Graft-versus-Host- Krankheit auslösenden T-Zellen, ist daher dringend erforderlich.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren zu entwickeln, mit deren Hilfe aus einem hämatopoetische Stammzellen enthaltenden transplantierbaren Material gezielt und selektiv nur die T-Zellen entfernt oder inaktiviert werden, die zur Entwicklung der Graft-versus-Host-Reaktion in einem Rezipienten beitragen, ohne jedoch die T-Zellen zu eliminieren oder zu inaktivieren, die den Graft-versus- Leukämie-Effekt und die antivirale Immunität vermitteln, sowie ein transplantierbares Stammzell- Material bereitzustellen, das nach Transplantation in einen Rezipienten nicht zur Entwicklung einer Graft-versus-Host-Erkrankung, zu einer erhöhten Tumor-Rezidivrate und einem verstärkten Auftreten viraler Erkrankungen führt, sondern in der Lage ist, den Graft-versus-Leukämie-Effekt und die antiviralen Immunitätseffekte zu vermitteln.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines hämatopoetischen Stammzell-Präparates, das zur allogenen Transplantation geeignet ist und nach Transplantation in einem Rezipienten keine Graft-versus-Host-Reaktion hervorruft, umfassend:

a) die Gewinnung eines hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materials aus einem Donor,
b) die Herstellung einer Zellsuspension aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material,
c) die Isolierung und Aufreinigung einer T-Zell- Population aus der Zellsuspension,
d) die Behandlung der T-Zell-Population, so dass ein Teil der T-Zell-Population selektiv eliminiert beziehungsweise funktionell inhibiert wird, und
e) die Vereinigung des nicht eliminierten Teils der T-Zell-Population mit der hämatopoetische Stammzellen umfassenden, T-Zell-freien Zellsuspension zum Zeitpunkt der Transplantation oder zu einem späteren Zeitpunkt im Rahmen einer modifizierten Donor-Lymphozyten- Infusion (DLI).

Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, nach Gewinnung des zu transplantierenden, Stammzellen enthaltenden Materials aus dem Donor aus diesem Material zunächst alle T-Lymphozyten zu isolieren und aufzureinigen. Anschließend werden diese T-Lymphozyten ex vivo einer speziellen Behandlung unterworfen, um spezifisch und selektiv diejenigen T-Zellen zu eliminieren, die im Rezipienten für den Ausbruch der Graft-versus-Host-Reaktion verantwortlich sind, während alle anderen T-Lymphozyten, wie die T- Zellen, die im Rezipienten die Graft-versus- Leukämie-Effekte und die antiviralen Immunitätseffekte bewirken, nicht beeinträchtigt oder eliminiert werden. Die Erfindung macht sich dabei die Erkenntnis zunutze, dass der Graft-versus-Leukämie- Effekt (GvL-Effekt) und die Graft-versus-Host- Reaktion (GvH-Reaktion) nur partiell durch die gleichen wirtspezifischen Donor-T-Zellen vermittelt werden, nach den gegenwärtigen klinischen und experimentellen Befunden jedoch durch unterschiedliche Leukämie-spezifische alloreaktive Donor-T-Zell- Populationen hervorgerufen werden.
Die erfindungsgemäße spezielle Behandlung ist daher ausschließlich auf die Eliminierung der alloreaktiven T-Zell-Subpopulation gerichtet, die im Rezipienten die GvH-Reaktion hervorruft, nicht jedoch auf die Eliminierung anderer T-Zellen. Zu den T- Lymphozyten, die durch die Behandlung nicht eliminiert werden, gehören die T-Lymphozyten, die Leukämie-restringierte Minor-Histokompatibilitäts- Antigene und Leukämie-Antigene erkennen und damit einhergehend im Rezipienten die Graft-versus- Leukämie-Reaktion vermitteln können. Zu den nicht- eliminierten T-Lymphozyten gehören auch die T- Lymphozyten, die Viren, insbesondere das Epstein- Barr-Virus und das Cytomegalovirus, erkennen und damit einhergehend im Rezipienten antivirale Immunitätseffekte vermitteln und das Risko schwerer viraler Infektionen senken können.
Nach Eliminierung der die GvH-Reaktion vermittelnden alloreaktiven T-Lymphozyten werden die restlichen T-Zellen anschließend wieder mit dem zu transplantierenden, hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material vereinigt und gemeinsam damit in den Rezipienten transplantiert. Alternativ werden die manipulierten T-Zellen nach erfolgter Transplantation zu einem späteren Zeitpunkt im Rahmen einer modifizierten Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) reinfundiert. Das so hergestellte, von alloreaktiven T-Lymphozyten befreite hämatopoetische Stammzell-Präparat führt im Wirt oder Rezipienten nicht zum Ausbruch der Graft-versus-Host-Krankheit, kann aber dennoch im Rezipienten den Graft-versus- Leukämie-Effekt vermitteln und Schutz vor viralen Infektionen bieten.
Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die selektive Eliminierung der die GvH-Reaktion hervorrufenden alloreaktiven T-Zellen über einen Aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD) erfolgt. Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung an einem Maus-Modell für Graft-versus-Host- Krankheiten haben überraschenderweise gezeigt, dass insbesondere der durch CD95/CD95-Ligand vermittelte Aktivierungs-induzierte Zelltod die Möglichkeit bietet, aktivierte alloreaktive T-Lymphozyten, insbesondere die für die GvH-Reaktion verantwortlichen T-Lymphozyten, selektiv und gezielt zu eliminieren, während Bystander-T-Zellen, also auch die T-Zellen, die im Rezipienten die GvL-Reaktion und antivirale Immunitätseffekte vermitteln können, nicht beeinträchtigt werden. Zur Induzierung von AICD wurden erfindungsgemäß alloreaktive T-Zellen zunächst wiederholt mit einem Wirts- oder Rezipientenspezifischen allo-Antigen, vorzugsweise in Gegenwart von Interleukin 2 (IL-2), ex vivo vor Transplantation stimuliert. Gleichzeitig erfolgte eine Behandlung mit einem gegen gegen den CD95-T-Zell- Rezeptor gerichteten agonistischen Antikörper oder einem CD95-Liganden.
Erfindungsgemäß konnte so gezeigt werden, dass die AICD-Induzierung während einer primären MLC (gemischte Lymphozytenkultur)-Proliferation zu einer erheblichen Eliminierung der mit dem Wirts- Immunsystem reagierenden (alloreaktiven) T-Zellen führt. Dabei verläuft die Eliminierung der alloreaktiven T-Zellen Antigen-spezifisch. Weitere Analysen zeigten, dass so behandelte, von alloreaktiven T-Zellen befreite T-Zell-Präparate stark verringerte proliferative Reaktionen aufweisen. In Cytolyse-Tests zeigte sich ferner, dass die Fähigkeit der von alloreaktiven T-Zellen befreiten T-Zell- Präparate zur Lyse allogener Zielzellen stark beeinträchtigt war. Die erfindungsgemäß hergestellten T-Zell-Präparate konnten jedoch Zielzellen abtöten, die andere Antigene als das zur Stimulierung verwendete allo-Antigen aufweisen. Durchfluss- Cytometrie-Analysen von Responder-T-Zellen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten während einer gemischten Lymphozytenkultur mit von T-Zellen befreiten Stimulatorzellen durchgeführt wurden, zeigten, dass aktivierte alloreaktive T-Lymphozyten die Expression der Aktivierungsmarker CD69, CD25 und CD95 zeitabhängig hochregulierten und dann bei Kultivierung mit einem gegen CD95 gerichteten, agonistischen monoklonalen Antikörper (mAK) für AICD zugänglich waren. Die AICD-Induzierung nach Aktivierung der T-Zellen mit einem bestimmten allo-Antigen ist spezifisch und beeinflusst die Reaktivität gegen dritte allo-Antigene nicht nennenswert.
Schließlich konnte unter Verwendung eines Maus- Modells für GvH-Reaktionen gezeigt werden, dass bei Übertragung von Donor-T-Zell-Populationen, die signifikant von alloreaktiven T-Zellen befreit wurden, in Rezipienten diese keine Graft-versus-Host- Erkrankung entwickelten. Rezipienten, die unbehandelte Donor-T-Zellen erhielten, zeigten hingegen alle klinische Anzeichen einer akuten GvH-Krankheit und starben innerhalb kurzer Zeit nach Übertragung der T-Zellen. Diese Befunde wurden durch Durchfluss-Cytometrie-Analysen untermauert. Diese zeigten, dass alloreaktive T-Zellen in Mäusen, denen unbehandelte T-Zellen verabreicht worden waren, stark expandierten, während die Expansion alloreaktiver T-Zellen in Mäusen, denen von alloreaktiven T-Zellen befreite T-Zell-Populationen verabreicht worden war, sehr gering war.
Diese Experimente zeigen daher sehr eindrucksvoll, dass die T-Zellen, die für den Ausbruch der GvH- Reaktion Rezipienten verantwortlich sind, unter Verwendung von AICD spezifisch und selektiv entfernt werden können. Die selektive Eliminierung wirtsreaktiver T-Lymphozyten aus einem zu transplantierenden hämopoetische Stammzellen enthaltenden Material stellt daher ein ideales Verfahren zur spezifischen Immuntherapie dar, da alle anderen T- Zell-Subpopulationen, die beispielsweise Viren, wie das Epstein-Barr-Virus oder das Cytomegalievirus, oder Leukämie-restringierte Minor-Histokompatibilitäts-Antigene und Leukämie-Antigene erkennen, nicht beeinträchtigt werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "Transplantation" die Übertragung von Zellen, Geweben oder Organen eines Individuums auf ein anderes Individuum oder auf eine andere Körperstelle des gleichen Individuums verstanden. Eine "autologe Transplantation" liegt dann vor, wenn der Spender (Donor) und der Empfänger (Rezipient) identisch sind. Bei einer "syngenen Transplantation" sind Donor und Rezipient genetisch identische Individuen, beispielsweise eineiige Zwillinge oder Tiere des gleichen Inzuchtstammes. Unter einer "allogenen Transplantation" wird eine Transplantation verstanden, bei der Donor und Rezipient genetisch differente Individuen sind, die jedoch der gleichen Spezies angehören.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "hämatopoetischen Stammzellen" alle die undeterminierten und determinierten Stammzellen verstanden, die für die Bildung der einzelnen Blutzelllinien, also für Erythropoese, Granulopoese, Thrombopoese und Lymphozytopoese, verantwortlich sind und den Zellverlust in den einzelnen Blutbildungsspeichern durch entsprechende Zelineubildung ausgleichen können. Die undeterminierten Stammzellen besitzen die Fähigkeit, in alle Blutzelllinien auszureifen, wobei ihre Teilungsaktivität sehr gering ist (sleeper cells). Die determinierten Stammzellen sind nur noch eingeschränkt, das heißt in Richtung einer Blutzelllinle entwicklungsfähig und füllen die nachgeordneten Proliferationssspeicher auf (feeder cells).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "hämatopoetischen Stammzell-Präparat" ein aus einem Donor gewonnenes zellhaltiges Material verstanden, das insbesondere hämatopoetische Stammzellen, aber auch Lymphozyten enthält. Hämatopoetische Stammzell-Präparate sind insbesondere zur Verwendung als Transplantationsmaterial bestimmt.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem beliebigen Säugerorganismus als Donor gewonnen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das hämatopoetische Stammzellen enthaltende Material aus dem Menschen gewonnen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus der Maus gewonnen. Erfindungsgemäß können jedoch auch andere Säuger als Donor dienen.
Das hämatopoetische Stammzellen enthaltendes Material wird insbesondere aus dem Knochenmark, dem peripheren Blut und Nabelschnurblut des Donors gewonnen. Peripheres Blut enthält im Vergleich zu Knochenmark geringere Konzentrationen hämatopoetischer Stammzellen, allerdings ist der Anteil von Lymphozyten höher. Durch G-CSF kann die Frequenz der Stammzellen im Blut erhöht werden. Mobilisierte Spender besitzen daher mehr Stammzellen im Blut. Auch Nabelschnurblut ist reich an hämatopoetischen Stammzellen, die sich zur Transplantation eignen. Nabelschnurzellen Neugeborener sind immunologisch weniger aggressiv und die GvH-Reaktionen fallen entsprechen schwächer aus.
Die Gewinnung eines hämatopoetischen Stammzellen umfassenden Materials aus einem Donor erfolgt erfindungsgemäß unter Verwendung von üblicherweise auf dem Fachgebiet angewandten Verfahren. Knochenmark kann beispielsweise durch Aspiration nach Punktion des Markraums von insbesondere platten Knochen unter Verwendung spezieller Hohlnadeln, vor allem als Sternal- und Beckenkamm-Punktion, entnommen werden. Bei der allogenen Blutstammzell- Transplantation muss sich der Spender im Gegensatz zur Knochenmark-Transplantation keiner Narkose unterziehen, er injiziert sich etwa 5 bis 6 Tage den hämatopoetischen Wachstumsfaktor G-CSF und spendet seine Blutleukozyten an einen Blutzellseperator. Nabelschnurblut kann nach der Trennung des neugeborenen Kindes vom Plazenta-Kreislauf aus der Plazenta gewonnen werden können, wobei etwa 100 ml Restblut erhalten werden. Diese Menge reicht in der Regel zur Transplantation für einen Patienten mit einem Gewicht bis zu 50 kg aus.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die HLA- Antigene zwischen Spender und Empfänger weitestgehend übereinstimmen. Das HLA (human leucocyte antigen)-System ist der Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) eines Säugers und wird beim Menschen von mindestens vier Genloci aus der HLA-Gen-Region codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem Geschwister isoliert wird, dessen HLA-System mit dem des Rezipienten identisch ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem nicht-verwandten Donor isoliert, dessen HLA-System mit dem des Rezipienten übereinstimmt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem Familien-Donor isoliert, wobei der 1-Locus seines HLA-Systems mit dem des Rezipienten nicht übereinstimmt.
Erfindungsgemäß werden nach der Gewinnung eines hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materials aus einem Spender die entnommenen Zellen in physiologischen Lösungen oder Medien aufgeschwemmt, wobei eine Zellsuspension aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material hergestellt wird. Zur Herstellung der Zellsuspension können alle auf dem Fachgebiet üblicherweise verwendeten physiologischen Lösungen oder Medien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die Zellsuspension unter Verwendung des gemäß Dulbecco modifizierten Eagles-Mediums (DMEM) herzustellen. Selbstverständlich können aber auch andere Medien, beispielsweise RPM1 1640-Medium und ähnliche eingesetzt werden. Das zur Herstellung der Zellsuspension verwendete Medium kann Serum und Antibiotika und gegebenenfalls andere Zusätze, wie Puffersubstanzen, Salze und/oder Aminosäuren, enthalten. Als Serum werden vorzugsweise fötales Kälberserum (FCS) oder Pferde-Serum eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass humane Zellen in serumfreien physiologischen Lösungen oder Medien suspendiert werden. Als Antibiotikum wird vorzugsweise ein zugelassenes Antibiotikum eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Antimycotic-Lösung (GibcoBRL, Ichinnan, Großbritannien), die Streptomycin und Penicillin enthält, verwendet. Selbstverständlich können aber auch andere geeignete Antibiotika verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass nach Herstellung einer Zellsuspension aus der Zellsuspension T- Zell-Populationen, beispielsweise CD90⁺-, CD3⁺-, CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zell-Populationen, isoliert und aufgereinigt werden. Zur Isolierung der T-Zell- Populationen können erfindungsgemäß alle üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendeten Verfahren eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Isolierung und Aufreinigung der T-Zell-Population unter Verwendung eines magnetischen Zellseparationssystems. Dazu werden die Zellen mit Mikroperlen, an die geeignete Antikörper konjugiert sind, inkubiert und nach Waschen mit Hilfe eines magnetischen Feldes aus der Zellsuspension abgetrennt. Beispielsweise kann eine murine CD90⁺-T-Zell-Population unter Verwendung von Mikroperlen, an die gegen murines CD90 gerichtete Antikörper konjugiert sind, isoliert und aufgereinigt werden. Eine humane CD4⁺-T-Zellpopulation kann unter Verwendung von Mikroperlen, an die gegen humanes CD4 gerichtete Antikörper konjugiert sind, gewonnen werden. Mikroperlen, an die gegen humanes CD8 gerichtete Antikörper gebunden sind, können zur Isolierung und Aufreinigung einer humanen CD8⁺-T- Zell-Population eingesetzt werden. Die über einen geeigneten Antikörper an die Mikroperlen gebundene T-Zellen können dann mit einem geeigneten Puffer von den Perlen abgewaschen und in geeignete Medien oder Lösungen überführt werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist insbesondere vorgesehen, dass aus der Zellsuspension eines aus einem humanen Donor isolierten, hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materials insbesondere CD3⁺-T-Zellen isoliert und aufgereinigt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass aus einem humanen, hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material CD4⁺-T-Zellen isoliert und aufgereinigt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass aus einem humanen, hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material CD8⁺-T-Zellen isoliert und aufgereinigt werden. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist vorgesehen, aus murinen, hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materialien CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen oder CD90⁺- T-Zellen zu isolieren und aufzureinigen.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die so isolierte T-Zell-Population dann ex vivo einer speziellen Behandlung unterworfen, die zur selektiven und gezielten Eliminierung beziehungsweise funktionellen Inaktivierung nur eines Teils der T-Zell- Population, nämlich der alloreaktive T-Zellen, führt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die ex vivo-Eliminierung der alloreaktiven T-Zellen über einen Aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) oder propriocidalen Zelltod (PCD). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die ex vivo- Eliminierung der alloreaktiven T-Zellen über den CD95/CD95-Liganden-vermittelten Aktivierungsinduzierten Zelltod erfolgt.
Der CD95/CD95-Liganden-vermittelte Aktivierungsinduzierte Zelltod stellt einen wichtigen physiologischen Pathway zur Kontrolle der klonalen Expansion Antigen-aktivierter T-Zellen in der Down-Phase der Immunreaktion dar (Lenardo et al., Annu. Rev. Immunol., 17 (1999), 221-253). Der AICD spielt auch eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz (Barrett et al., Bone Marrow Transpl., 21 (1998), 543-551; Van Parjis et al., Immunity, 4 81996), 321-329). Reife T-Zellen werden nach längerer Aktivierung empfänglich für AICD (Lenardo et al., Annu. Rev. Immunol., 17 (1999), 221-253; Klas et al., Int. Immunology, 5 81993), 625-630). Dieser Prozess erfordert ein wiederholtes T-Zell-Rezeptor (TCR)-Engagement unter Verwendung eines Antigens oder von Antikörpern gegen den TCR/CD3-Komplex und ist abhängig vom Zellzyklus, der durch Interleukin 2 (IL-2) bewirkt wird (Lenardo et al., Nature, 353 (1991), 858-862).
Das Prinzip des erfindungsgemäß induzierten CD95/CD95-Liganden-vermittelten AICD besteht darin, dass Donor-T-Zellen mit einem vom Rezipienten stammenden allo-Antigen in Gegenwart von Interleukin 2 (IL 2) wiederholt stimuliert und aktiviert werden, wobei die Expression des CD95-Rezeptors hochreguliert wird, und dadurch empfänglich für AICD werden. Die so aktivierten Donor-T-Zellen werden gleichzeitig mit dem CD95-Liganden oder einem gegen den CD95-Rezeptor gerichteten Antikörper behandelt. Sowohl der CD95-Ligand (CD95L) als auch der gegen den CD95-Rezeptor gerichtete Antikörper führen zur Vernetzung des CD95-Rezeptors auf der Oberfläche der T-Donor-Zellen und induzieren somit eine selektive Apoptose. Donor-T-Zellen, die nicht spezifisch für die wirtsspezifischen allo-Antigene sind, unterliegen nicht der CD95-vermittelten AICD- Induzierung und können daher überleben und anschließend isoliert werden. Somit ist es also möglich, spezifisch T-Zellen anzureichern und zu isolieren, die im Rezipienten beispielsweise auf maligne Zellen oder Viren reagieren. Die so isolierten T-Zellen können dann zum Zeitpunkt der Transplantation oder zu einem späteren Zeitpunkt im Rahmen einer sogenannten "DLI" (donor lymphocyte infusion) zusammen mit der hämatopoetische Stammzellen enthaltenden Zellsuspension, aus der die T-Zellen ursprünglich isoliert wurden, in den Rezipienten überführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher alloreaktive T-Zellen durch wiederholtes Inkontaktbringen der isolierten T-Zell- Population mit einem Antigen, vorzugsweise einem aus dem Rezipienten stammenden allo-Antigen, aktiviert und gleichzeitig mit einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörper, beispielsweise einem agonistischen anti- CD95-Antikörper, oder einem gegen einen Apoptoseinduzierenden T-Zell-Rezeptors gerichteten Liganden behandelt, um damit in den alloreaktiven T-Zellen Apoptose, beispielsweise AICD, zu induzieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die T-Zell-Population mit Zellen, auf deren Oberfläche allo-Antigene enthalten sind, in Kontakt gebracht wird. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, das es sich bei das den allo-Antigen enthaltenden Zellen vorzugsweise um Zellen handelt, die aus dem Rezipienten, einer geeigneten Zellkultur oder einer anderen geeigneten Quelle isoliert wurden. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um Antigen-präsentierende Zellen, wie beispielsweise Milzzellen oder von Monozyten stammende reife dendritische Zellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können zur Aktivierung alloreaktiver T-Zellen gentechnisch veränderte Zellen eingesetzt werden, insbesondere solche, die das allo- Antigen verstärkt exprimieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die T-Zell- Population auch mit isolierten und aufgereinigten allo-Antigenen in Kontakt gebracht und aktiviert werden. Dabei kann es sich um Antigen-Moleküle handeln, die aus Zellen, Geweben oder Organen des Rezipienten isoliert wurden. Erfindungsgemäß können zur Aktivierung alloreaktiver T-Zellen auch Antigen-Moleküle verwendet werden, die unter Verwendung chemischer Synthese-Verfahren oder mittels gentechnischer Verfahren hergestellt wurden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Aktivierung alloreaktiver T-Zellen unter Verwendung von Fragmenten des Antigen-Moleküls, insbesondere Peptidfragmenten, erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die T-Zell-Population mit Antigenpräsentierenden Zellen, insbesondere gentechnisch veränderten DC, die Liganden für Rezeptoren der "Death Receptor"-Familie exprimieren, in Kontakt gebracht, um damit AICD in alloreaktiven T-Zellen zu induzieren.
Vorzugsweise erfolgt das Inkontaktbringen der isolierten T-Lymphozyten mit dem allo-Antigen oder den das allo-Antigen enthaltenden Zellen in Gegenwart von Interleukin 2 (IL-2). Cytokine wie IL-2 bieten differenzierte Eingriffsmöglichkeiten in die Regulation hämatopoetischer Zellen und werden auch zur Induzierung von Graft-versus-Leukämie-Reaktionen verwendet.
Nach wiederholtem Inkontaktbringen oder während des Inkontaktbringens der isolierten T-Zell-Population mit dem allo-Antigen erfolgt erfindungsgemäß eine Behandlung mit einem gegen Apoptose-induzierenden T-Zell-Rezeptor gerichteten Liganden oder einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell-Rezeptor gerichteten agonistischen Antikörper, insbesondere einem agonistischen monoklonalen Antikörper, um in den aktivierten alloreaktiven Donor-T-Lymphozyten Apoptose, beispielsweise AICD zu induzieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Behandlung der aktivierten alloreaktiven T-Lymphozyten mit dem CD95-Liganden (CD95L). Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die aktivierten alloreaktiven T-Zellen mit einem aus natürlichen Quellen isolierten und aufgereinigten CD95L-Molekül behandelt werden. Erfindungsgemäß kann es sich bei dem CD95L-Molekül auch um ein unter Verwendung gentechnischer Verfahren hergestelltes Molekül handeln. Das zur Behandlung aktivierter alloreaktiver T-Zellen verwendete CD95L-Molekül kann auch unter Verwendung chemischer Synthese- Verfahren hergestellt sein. Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, lediglich ein Fragment des CD95L-Moleküls zu verwenden. In besonders bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem CD95L- Molekül um ein mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestelltes Molekül, insbesondere um den im Handel erhältlichen humanen CD95-Liganden "rec. Human super FasL". Bei dem rekombinanten humanen Liganden "rec. Human super FasL". handelt es sich um ein stabiles Homotrimer, das keine weitere Vernetzung erfordert, um den CD95-Rezeptor zu trimerisieren.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Behandlung der aktivierten alloreaktiven T-Zellen mit einem gegen den CD95-Rezeptor gerichteten agonistischen Antikörper (anti-CD95-mAK). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Antikörper" ein Polypeptid verstanden, das durch ein oder mehrere Immunglobulin-Gene kodiert wird und spezifische Strukturen auf einem Antigen, insbesondere auf dem CD95-Rezeptor, erkennt und spezifisch daran binden kann. Der Begriff "Antikörper" umfasst nicht nur ein vollständiges Molekül, sondern auch eine Reihe von Fragmenten, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erhältlich sind, beispielsweise Fragmente wie Fab, F(ab')₂ oder Fvm, oder die unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken erzeugt wurden und die in der Lage sind, Epitope auf dem CD95-Rezeptor zu erkennen und daran zu binden. Der Begriff "Antikörper" umfasst auch modifizierte Antikörper, wie oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper.
In besonders bevorzugter Ausführungsform erfolgt die Behandlung der aktivierten alloreaktiven T- Lymphozyten mit einem agonistischen monoklonalen Antikörper gegen den CD95-Rezeptor. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Verwendung des agonistischen monoklonalen Antikörpers Jo2.
Erfindungsgemäß können durch Induzierung des CD95- vermittelten AICD in der aktivierten alloreaktiven T-Zell-Population mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80% und am bevorzugtesten mindestens 85%, 90%, 95% oder mehr der alloreaktiven T-Lymphozyten, die im Rezipienten für den Ausbruch der Graft-versus-Host- Reaktion verantwortlich sind, eliminiert werden.
Nach dem Aktivierungs-induzierten Zelltod der alloreaktiven T-Lymphozyten können die übrig gebliebenen T-Zellen, die nicht für AICD zugänglich waren und daher nicht eliminiert wurden, aus der T-Zell- Population isoliert werden. Anschließend können diese isolierten T-Zellen mit der hämatopoetische Stammzellen umfassenden Zellsuspension, aus der ursprünglich die T-Zell-Population isoliert und aufgereinigt wurden, vereinigt werden. Das dadurch erhaltene Stammzell-Präparat ist zur allogenen Transplantation in Rezipienten geeignet und führt nach Übertragung in den Rezipienten nicht zum Ausbruch der Graft-versus-Host-Erkrankung, kann jedoch im Rezipienten den Graft-versus-Leukämie-Effekt und antivirale Immunitätseffekte vermitteln.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das hämatopoetische Stammzellen enthaltende Material aus einem menschlichen Organismus gewonnen wird und zur Herstellung eines menschlichen hämatopoetischen Stammzell-Präparates verwendet wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das hämatopoetische Material aus einer Maus gewonnen und zur Herstellung eines hämatopoetischen Stammzell-Präparates der Maus verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Isolierung eines von alloreaktiven T- Zellen befreiten T-Zell-Präparates, umfassend:

a) die Gewinnung eines hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materials aus einem Donor,
b) die Herstellung einer Zellsuspension aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material,
c) die Isolierung und Aufreinigung einer T-Zell- Population aus der Zellsuspension,
d) die Behandlung der T-Zell-Population durch wiederholtes Inkontaktbringen mit einem allo- Antigen,
e) die Behandlung der mit dem allo-Antigen in Kontakt gebrachten T-Zell-Population mit einem gegen einen Apoptose-induzierenden T- Zell-Rezeptor gerichteten Antikörper oder einem gegen einen Apoptose-induzierenden T- Zell-Rezeptor gerichteten Liganden, und
f) die Gewinnung der nicht mit dem Antikörper oder dem Liganden reagierenden T-Zellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein hämatopoetisches Stammzell-Präparat, das zur allogenen Transplantation geeignet ist und das insbesondere von der alloreaktiven T-Zell-Population befreit ist, die bei Transplantation in einem Rezipienten eine Graft-versus-Host-Reaktion hervorruft, das jedoch noch die T-Zellen enthält, die im Rezipienten den Graft-versus-Leukämie-Effekt und antivirale Immunitäts-Effekte vermitteln, und das nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde.
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieses hämatopoetischen Stammzell-Präparates zur Herstellung eines Stammzell-Transplantates, das zur allogenen Transplantation in einen Rezipienten geeignet ist, wobei im Rezipienten nach Transplantation keine Graft-versus-Host-Erkrankung hervorgerufen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verhinderung der Graft-versus-Host- Krankheit in einem Rezipienten, der insbesondere im Hinblick auf rezidivierende oder persistierende Leukämie behandelt wird, umfassend:

a) die Gewinnung eines hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materials aus einem Donor,
b) die Herstellung einer Zellsuspension aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material,
c) die Isolierung und Aufreinigung einer T-Zell- Population aus der Zellsuspension,
d) die Eliminierung alloreaktiver T-Zellen aus der isolierten T-Zell-Population durch Induzierung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes, insbesondere durch Inkontaktbringen der T-Zell-Population mit einem allo-Antigen und gleichzeitiges Behandeln mit einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörper oder einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell-Rezeptor gerichteten Liganden,
e) die Isolierung der nicht eliminierten T- Zellen,
f) die Verabreichung der von alloreaktiven T- Zellen befreiten, hämatopoetische Stammzellen umfassenden Zellsuspension an den Rezipienten, und
g) die Verabreichung der signifikant von alloreaktiven T-Zellen befreiten allogenen T- Zellen an den Rezipienten im Rahmen einer modifizierter Donor-Lymphozyten-Infusion.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele verdeutlicht. Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt, dass nach Induzierung von AICD mittels eines agonistischen monoklonalen Antikörpers (mAK) gegen den CD95-Rezeptor alloreaktive T-Zellen stark verminderte proliferative Reaktionen aufweisen, wobei A) die proliferativen Reaktionen allogener CD4⁺-T-Zellen zeigt und B) die proliferativen Reaktionen allogener CD8⁺-T-Zellen. Die Verminderung der Alloreaktivität von CD4⁺- und CD8⁺-T- Responderzellen nach Induzierung des CD95- vermittelten AICD und anschließender Behandlung mit einem agonistischen mAK verläuft dabei in Dosisabhängiger Weise.
Aus einer inaktivierten T-Zell-Population von C3H/He (H-2^k)-Mäusen wurden CD4⁺- und CD8⁺- Subpopulationen mittels immunmagnetischer Trennung isoliert. Die isolierten Subpopulationen wurden mit bestrahlten allogenen Milz-Zellen von Balb/c (H- 2^d)-Mäusen in einer gemischten Lymphozytenkultur (MLC) über einen Zeitraum von 6 bis 7 Tagen in Abwesenheit des agonstischen anti-CD65-mAK Jo-2 (ausgefüllte Quadrate) oder in dessen Gegenwart (1 µg/ml (ausgefüllte Kreise) oder 5 ng/ml (ausgefüllte Dreiecke)) stimuliert. Die Proliferation der T- Zellen wurde durch 3H-Thymidin-Aufnahme-Analysen in den letzten 12 Stunden bestimmt. Die Zugabe eines bezüglich des Isotyps übereinstimmenden Hamster-Ig- Antikörpers (offener Kreis) während der Kultur diente als Kontrolle der Spezifität. Syngene Kontrollen (nicht ausgefüllte Quadrate) sind ohne AICD-Induzierung gezeigt. Insgesamt wurden jeweils mindestens 5 Experimente durchgeführt, wobei jedoch nur die Ergebnisse eines Experimentes dargestellt sind. Die Ergebnisse sind als Durchschnitt ± Standardabweichung von drei Mikrotiterplatten- Vertiefungen angegeben.
Fig. 2 zeigt, dass sowohl in Ruhephase befindliche T-Lymphozyten als auch präaktivierte T-Lymphozyten auf eine AICD-Induzierung ansprechen. Nach AICD- Induzierung zeigten T-Responder-Zellen eine stark verringerte Proliferation, unabhängig davon, ob die alloreaktiven T-Zellen während der ersten oder zweiten Stimulierung einer Behandlung mit dem anti- CD95-mAK unterworfen wurden. Kleine in Ruhephase befindliche CD4⁺-T-Zellen (H-2^k) oder CD4⁺-T-Zellen, die durch Vernetzung des T-Zell-Rezeptors unter Verwendung eines gegen CD3 gerichteten monoklonalen Antikörpers (145-2C11) präaktiviert worden waren, wurden mit bestrahlten allogenen Milz- Stimulatorzellen (H-2^d) in Gegenwart eines agonistischen anti-CD95-mAK fünf Tage lang stimuliert. Danach wurden die verbleibenden T-Zellen aus den Kulturen gewonnen und hinsichtlich ihrer Alloreaktivität bezüglich des allo-Antigens H-2^d in einer 5-tägigen gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR) getestet. Die Ergebnisse eines von insgesamt drei Experiemnten sind als Durchschnitt ± Standardabweichung von drei Mikrotiterplatten-Vertiefungen gezeigt. (A) zeigt die Alloreaktivität von T-Zellen, die primär entweder nur mit H-2^d allein (ausgefüllte Quadrate) oder in Gegenwart anti-CD95-mAK (ausgefüllte Kreise) stimuliert worden waren. (B) zeigt die Alloreaktivität von T-Zellen, die mit dem gegen CD3 gerichteten Antikörper präaktiviert worden waren, nach Restimulierung mit H-2d allein (ausgefüllte Quadrate) oder in Gegenwart eines anti-CD95- mAK (ausgefüllte Kreise). Syngene Kontrollen sind ohne (nicht ausgefüllte Quadrate) oder mit (nicht ausgefüllte Kreise) AICD-Induzierung gezeigt.
Fig. 3 zeigt, dass die Entfernung alloreaktiver T- Zellen mittels AICD unter Verwendung des allo- Antigens H-2^d antigenspezifisch verläuft. Aufgereinigte CD90⁺-T-Zellen (H-2^k) wurden in Abwesenheit (gepunktete Balken) oder Gegenwart eines löslichen anti-CD95-mAK (1 µg/ml) (schraffierte Balken) oder eines anti-CD95-mAK, der mit einem beschichteten anti-Hamster-Ig (schwarze Balken) vernetzt war, mit dem allo-Antigen H-2^d in MLC 6 Tage stimuliert. Danach wurden die restlichen allogenen T-Lymphozyten mit H-2^d oder dem allo-Antigen H-2^b stimuliert. Gezeigt sind die Stimulationsindices einer sekundären MLR am dritten Tag. (A) zeigt die AICD-Induktion während der primären MLR, die zu einer verringerten Proliferation der auf H-2^d reagierenden T-Zellen nach Restimulierung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen führte. (B) zeigt, dass Responder- Zellen, die nach Eliminierung H-2^d-alloreaktiver T- Lymphozyten mit löslichem anti-CD95-mAK oder mit vernetztem anti-CD95-mAK gewonnen wurden, auf das allo-Antigen H2^b reagieren konnten. Zur Kontrolle wurde die Proliferation unbehandelter Zellen untersucht. Dargestellt sind die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten.
Fig. 4 zeigt die cytolytische Reaktion alloreaktiver T-Zellen nach AICD-Induzierung. Dargestellt sind die Ergebnisse eines typischen Experimentes, das die beeinträchtigte Fähigkeit allogener cytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) zur Lyse von H-2^d- exprimierenden A20-Zielzellen nach Eliminierung H- 2^d-alloreaktiver T-Zellen mittels AICD (ausgefüllte Kreise) im Vergleich zu unbehandelten aktivierten allogenen Kontrollzellen (ausgefüllte Quadrate) zeigt. Die Lyse der A20-Zielzellen erfolgte dabei antigenspezifisch, da H-2^b enthaltende EL-4- Zielzellen von unbehandelten alloreaktiven CTL (nicht ausgefüllte Quadrate) oder CTL, die mit einem gegen CD95 gerichteten Antikörper behandelt worden waren (nicht ausgefüllte Kreise), nicht erkannt wurden. Die cytotoxischen T-Lymphozyten wurden durch allogene Stimulierung aufgereinigter CD90⁺-T-Zellen (H-2^k) mit Milz-Stimulatorzellen (H- 2^d in Gegenwart eines ant-CD95-mAK über einen Zeitraum von fünf Tagen erzeugt. Die gewonnenen Zellen wurden mit Chrom-markierten A20- oder EL-4- Zielzellen fünf Stunden inkubiert und anschließend im Hinblick auf ihre Lyse-Fähigkeit analysiert.
Fig. 5 zeigt, dass die Eliminierung alloreaktiver T-Zellen mittels AICD den Ausbruch einer akuten GvH-Erkrankung in einem Maus-P → F₁-GvH-Modell verhindert. Dargestellt sind die Überlebenskurven von drei unabhängigen Experimenten, wobei F₁- Rezipienten (n = 10) 2,5 × 10⁶ aufgereinigte lebensfähige parentale Donor-T-Lymphozyten verabreicht wurden. T-Zellen von C3H/He-Mäusen (H-2^k), die zuvor mit dem allo-Antigen H-2^d in vivo behandelt worden waren, wurden mit H-2^d-exprimierenden Balb/c-Stimulatorzellen restimuliert und mittels AICD von alloreaktiven T-Zellen befreit. Nach Übertragung der behandelten T-Lymphozyten in bestrahlte (6,5 Gy) weibliche F₁-Rezipienten entwickelten die Tiere keine akute GvH-Erkrankung. Im Gegensatz dazu entwickelte sich bei Mäusen, denen unbehandelte allogene Kontrollzellen injiziert worden waren, akute GvH-Erkrankung. (A) zeigt, dass die Eliminierung wirtsreaktiver Antigene bei CD4⁺-T-Zellen durch AICD-Induzierung in F₁-Rezipienten die Entwicklung einer akuten GvH-Erkrankng verhindert (ausgefüllte Quadrate). Im Gegensatz dazu führt die Übertragung von aktivierten unbehandelten Kontrollzellen (ausgefüllte Dreiecke) oder von Donor-T-Lymphozyten, in denen alloreaktive Responderzellen mittels des löslichen anti-CD95-mAK (ausgefüllte Kreise) innerhalb von 20 Tagen nach Übertragung zur Entwicklung einer letalen GvH-Erkrankung. Bei Kontrollen wurde eine äquivalente Anzahl syngener Milzzellen übertragen (nicht ausgefüllte Quadrate). (B) zeigt die Ergebnisse eines zweiten Experiments, das mit allogenen CD8⁺-T-Zellen durchgeführt wurde.
Fig. 6 zeigt, dass Donor-T-Zellen, die von allogenen T-Zellen mittels AICD befreit worden waren, in vivo eine verringerte Expression aufweisen. Dargestellt sind die Ergebnisse von Durchfluss- Zytometrie-Analysen. 10 Tage nach Übertragung in F₁-Rezipienten hatten sich die Populationen unbehandelter allogener CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen (H-2^k) stark vergrößert (A), während allogene CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen (H-2^k), die von alloreaktiven Responderzellen befreit worden waren, eine sehr geringe Expansion zeigten (B). Die Expansions-Analyse wurde mit CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen durchgeführt, die aus Milz- und Lymphknoten-Suspensionskulturen mittels immunmagnetischer Trennung isoliert und hinsichtlich H-2k^k und H-2D^d markiert worden waren, um eine Unterscheidung zwischen den vom Donor stammenden T- Zellen (H-2^k) und den F₁-spezifischen T-Lymphozyten (H-2^kxd) zu ermöglichen.

Materialien und Methoden

Mausstämme und Tumorzelllinien

C3H/HeJ (H-2^k)-Mäuse, Balb/cN (H-2^d)-Mäuse, C57BL/6J (H-2^b)-Mäuse und (C3H/He × Balb/c)-F₁ (H- 2^kxd) Hybridmäuse wurden in der zentralen Tierhaltung der Universität Mainz gezüchtet und gehalten. Alle Mäuse waren frei vom Sendai-Virus, dem Maus- Pneumonie-Virus, dem Maus-Hepatitis-Virus usw. Die Tiere wurden in sterilisierten Mikrokäfigen mit Filtereinrichtungen gehalten, wobei ihnen freier Zugang zu autoklaviertem Futter und filtriertem Trinkwasser gewährt wurde. Zur Übertragung von T- Lymphozyten wurden 8-14 Wochen alte weibliche F₁- Mäuse als Rezipienten verwendet.
Die A20-Tumorzelllinie ist eine aus Balb/c (H-2^d)- Mäusen stammende B-Zell-Lymphom-Zelllinie. Die Thymom-Zelllinie EL4 stammt aus C57BL/6 (H-2^b)-Mäusen.

Medien und Reagenzien

Die Tumorzelllinien A20 und EL4 wurden in RPMI 1640-Medium (Biomed; Berlin, Deutschland) kultiviert, das mit 5% fötalem Kälberserum (FCS; GibcoBRL, Ichinnan, Großbritannien), 5 mmol/l L- Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, einer 1%-igen Antibiotika-Lösung (Antimycotic®; GibcoBRL; Ichinnan, Großbritannien)-Lösung, bestehend aus Penicillin (10.000 IE), Streptomycin (10 mg/ml) und Amphotericin B (25 µg/ml), 1% Natriumbicarbonat, 1 mmol/l Natriumpyruvat und 0,8% nicht-essentiellen Aminosäuren angereichert worden war. Zur Herstellung von Zellsuspensionen der ex vivo isolierten Zellen wurde nach Dulbecco modifiziertes Eagles- Medium (DMEM, Biomed) verwendet, das 2% fötales Kälberserum oder Pferdeserum (GibcoBRL; Ichinnan, Großbritannien) und 1% Antimycotic® (GibcoBRL; Ichinnan, Großbritannien)) enthielt. Das für gemischte Lymphozytenreaktionen verwendete Kulturmedium bestand aus RPMI 1640-Medium(Biomed), das mit 10% fötalem Kälberserum (GibcoBRL; Ichinnan, Großbritannien), 5% NCTC (GibcoBRL; Ichinnan, Großbritannien), 5 mmol/l L-Glutamin, 0,1 mM β- Mercaptoethanol, einer 1-prozentigen Antimycotic®- Lösung (GibcoBRL), 1% Natriumbicarbonat, 1 mmol/l Natriumpyruvat und 0,8% nicht-essentiellen Aminosäuren angereichert war.
Biotin-konjugierte Antikörper gegen H-2^d und H-2^k, FITC-markierte Antikörper gegen CD3 und gegen CD4, Phycoerytherin (PE)-konjugierte anti-CD8-Antikörper ebenso wie geeignete Isotyp-Kontrollen wurden von BD Biosciences (Mountain View, Kalifornien) bezogen. Von Jackson ImmunoResearch (West Grove, Pennsylvania) wurden FITC- und PE-markiertes Streptavidin bezogen. Zur immunmagnetischen Abtrennung von T-Zellen verwendete CD4- und CD8-Mikroperlen wurden von Miltenyi (Bergisch Gladbach, Deutschland) bezogen. Der gegen CD95 gerichtete Antikörper Jo-2 wurde von BD Biosciences (San Diego, Kalifornien) erhalten. Das Isotyp-übereinstimmende Hamster- Immunoglobulin (Ig) und polyklonales Ziegen-anti- Hamster-Ig wurde von Serotec (Oxford, Großbritannien) bezogen.

AICD-Induzierung in Tests mit gemischten Lymphozytenkulturen (MLC)

In vollständigem DMEM-Medium wurden Einzelzellsuspensionen von Milzzellen oder Gemischen aus Milzzellen und Lymphknotenzellen hergestellt. Die Lymphknotenzellen wurden dabei aus Leisten-, Achselhöhlen- und submandibulären Lymphknoten gewonnen. Anschließend wurden die roten Blutkörperchen mittels NH₄Cl-Behandlung lysiert. Die Aufreinigung von CD90⁺-, CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen von C3H/He- Mäusen erfolgte unter Verwendung eines magnetischen Zellabtrennungssystems (MAOS) entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland). Die Zellen wurden mit Mikroperlen, die entweder mit einem anti-CD90-, anti-CD4- oder einem anti-CD8-Antikörper beschichtet waren, in MACS-Puffer (PBS enthaltend 0,5% fötales Kälberserum) 15 bis 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach Entfernung überschüssiger Perlen durch Waschen wurde die Zellsuspension auf eine vorgewaschene VS⁺-Trennsäule gegeben und dann mittels eines Magnetfeldes aufgetrennt. Anschließend wurde die Säule zweimal mit MACS-Puffer gewaschen. Die an der Säule zurückgehaltenen Zellen wurden mit MACS-Puffer abgespült und in MLC-Medium überführt. T-Zell- Präparate wurden in regelmäßigen Abständen mit anti-CD90-, anti-CD4- oder anti-CD8-Antikörpern markiert und dann mittels Durchfluss-Zytometrie analysiert. Die angereicherten T-Zellen wiesen eine Reinheit von mehr als 95% auf.
Die aufgereinigten, nicht-aktivierten CD4⁺-, CD8⁺- oder CD90⁺-T-Responderzellen (H-2^k) wurden mit bestrahlten (30 Gy) Milz-Stimulatorzellen von Balb/c- Mäusen (H-2^d) gemischt, wobei Konzentrationen von 1 × 10⁶ Zellen/ml bzw. 5 × 10⁶ Zellen/ml erhalten wurden. Danach wurden die Zellen 5 bis 6 Tage in MLR-Medium auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Abwesenheit oder Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des löslichen agonistischen anti- CD95-mAK Jo-2 kultiviert. Zur Erhöhung des Proapoptose-Effektes wurden die Vertiefungen vor Zugabe des anti-CD95-Antikörpers mit anti-Hamster-Ig in einer Konzentration von 5 µg/ml in PBS beschichtet, um eine Vernetzung zu ermöglichen. Im Falle einer sekundären MLC wurden Responder-T-Zellen entweder in vitro prästimuliert, wobei die isolierten Zellen 3 Tage mit bestrahlten allogenen Milzzellen oder immobilisiertem anti-CD3-Antikörper behandelt wurden, oder in vivo prästimuliert, wobei Donor-Mäusen 10 bis 14 Tage vor Isolierung der T-Zellen 5 × 10⁶ bestrahlte Balb/c-Milzzellen intraperitoneal injiziert wurden. Danach wurden die T-Zellen aus der Kultur oder aus Milz- und Lymphknoten- Suspensionskulturen mittels immunmagnetischer Trennung isoliert. Anschließend wurden die T-Zellen in einer Konzentration von 5 × 10⁵ Responderzellen/ml in Mikrotiterplatten-Vertiefungen, die 5 × 10⁶ Milz-Stimulatorzellen/ml enthielten suspendiert. Danach wurden die Zellen 5 Tage in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers Jo2 in unterschiedlichen Konzentrationen kultiviert. Je nachdem, ob es sich um eine primäre oder sekundäre MLC handelte, wurden die Zellen 2, 3, 4, 5 und 6 Tage nach Beginn der Kultur geerntet. Vor der Zellernte erfolgte jeweils eine Übernacht-Markierung mit ³H-Thymidin (0,037 MBq (1 µCi) pro Vertiefung). Die in die DNA eingebaute Radioaktivität wurde mittels eines Beta- Flüssigszintillations-Counters (Wallace, Turku, Finnland) bestimmt.

Zytolytische Tests

Insgesamt 2 × 10⁶ A20 (H-2^d)-Zellen oder EL-4 (H- 2^b)-Tumorzellen wurden mit ⁵¹Chrom (100 µCi) 4 Stunden markiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS- Puffer wurden die markierten Zielzellen in einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit U-förmigem Boden (NUNC, Wiesbaden, Deutschland) ausplattiert. Allogene CD90⁺-Responder-T-Zellen (H-2^k), die in einer primären MLC unter Verwendung von H-2^d-Milzzellen 5 Tage präaktiviert worden waren, wurden dreimal gewaschen und dann in unterschiedlichen Effektorzellen/Zielzellen-Verhältnissen in drei Vertiefungen verteilt und danach 5 Stunden inkubiert. Die maximale Freisetzung und die spontane Freisetzung wurden durch Inkubation der Zielzellen mit Triton-100- Sigma, Deisenhofen, Deutschland) bzw. Zugabe von Medien bestimmt. 5 Stunden später wurden die Überstände gewonnen und die darin enthaltene ⁵¹Cr- Aktivität wurde in einem Auto-Gamma-Counter (Packard Instruments, Dreieich, Deutschland) bestimmt. Die Lyse wurde als Prozentsatz der maximalen Freisetzung angegeben.

Untersuchungsmodell zur Induzierung einer akuten letalen GvH-Erkrankung

Zur Untersuchung akuter, letal verlaufender GvH- Reaktionen wurde ein klassisches P → F₁-Modell verwendet, wobei C3H/HeJ-Mäuse (H-2^k) als Donor von T- Zellen und (C3H/He × Balb/c)-F₁-Mäusen (H-2^kxd) als Rezipienten eingesetzt wurden. In einer gemischten Lymphozytenkultur wurden alloreaktive T-Zellen in Gegenwart eines agonistischen anti-CD95-Antikörpers über einen Zeitraum von 5 bis 6 Tagen eliminiert. Die verbliebenen T-Zellen wurden mittels immunmagnetischer Trennung auf einer MACS-Säule aufgereinigt. Einzelzellsuspensionen der hochaufgereinigten, in vitro aktivierten, lebensfähigen (Trypan- Blue-Test) CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen wurden weiblichen Rezipienten (F₁-Mäuse) in unterschiedlichen Konzentrationen in die Schwanz-Vene injiziert, wobei die Rezipienten 4 bis 5 Stunden vor Übertragung der T-Zellen subletal mit ¹³⁷Cs-bestrahlt worden waren (6,5 Gy). Zur Kontrolle wurden F₁-Mäuse verwendet, die vom Alter und Geschlecht her den F₁-Mäusen entsprachen, denen T-Zellen injiziert wurden. Den Kontrollen wurden syngene Milzzellen oder unbehandelte allogene T-Zellen injiziert. Die Rezipienten- Mäuse wurden einer ständigen Kontrolle im Hinblick auf klinische Anzeichen einer GvH-Erkrankung wie Diarrhöe, Haarschwund und gekrümmte Körperhaltung unterzogen. Ebenso wurde ihr Gewichtsverlust bestimmt. Jede Untersuchungsgruppe umfasste mindestens 4 Tiere. Die Übertragung der T-Zellen wurde mindestens dreimal wiederholt.

Durchfluss-Zytometrie-Analyse

Im allgemeinen wurden pro Probe 1 × 10⁶ lebensfähige T-Zellen, die aus Milz- und Lymphknoten- Präparaten mittels immunmagnetischer Trennung unter Verwendung von CD4-, CD8- oder CD90-beschichteten Mikroperlen (Miltenyl, Bergisch Gladbach, Deutschland) isoliert worden waren, 15 Minuten bei 4°C mit den angegebenen Antikörpern inkubiert. Die Antikörper waren entweder direkt konjugiert oder biotinyliert, wobei sie mit Streptavidin-konjugiertem FITC oder Phycoerythrin (PE) als zweitem Reagens inkubiert wurden. Anschließend wurde zweimal mit PBS enthaltend 2,5% fötales Kälberserum und 1% Natriumazid gewaschen. Lebensfähige Lymphozyten wurden mittels Forward- oder Side-Scattering bestimmt. Unter Verwendung von 10.000 Zellen erfolgte eine Zweifarben-Fluoreszenz-Analyse auf einer Epics- Altra-FACS-Sort-Vorrichtung (Beckman-Coulter, Stanford, Kalifornien).

Beispiel 1

Alloreaktiver T-Zellen zeigen nach AICD-Induzierung mittels des agonistischen anti-CD95-mAK Jo2 stark verminderte proliferative Reaktionen

Da sowohl CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen nach Aktivierung mit CD95 Apoptose zeigen, wurde untersucht, ob die AICD-Induzierung als Verfahren zur selektiven Eliminierung alloreaktiver T-Zellen in einer allogenen gemischten Lymphozytenreaktion (allo-MLR) geeignet ist.
Nicht-aktivierte T-Zellen wurden ex vivo aus C3H/He (H-2^k)-Mäusen isoliert und mittels immunmagnetischer Trennung unter Verwendung des MACS-Verfahrens in CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zell-Subpopulationen aufgetrennt. Anschließend wurden die isolierten T-Zell- Subpopulationen zusammen mit bestrahlten nicht- fraktionierten Milz-Stimulatorzellen von Balb-c (H- 2^d)-Mäusen in Gegenwart steigender Konzentrationen des löslichen agonistischen anti-CD95-mAK Jo2 5 bis 6 Tage kultiviert. Nach Stimulierung mit dem allo- Antigen H-2^d wurden die proliferativen Reaktionen der alloreaktiven CD4⁺- oder CD8⁺-T-Lymphozyten in Gegenwart des anti-CD95-mAK in Abhängigkeit von der Dosis bis zu 90% verringert (Fig. 1a und 1b). Dabei war die Verminderung der proliferativen Reaktionen spezifisch für die Anti-CD95-vermittelte Apoptose von T-Zellen. Bei Responderzellen, die in Gegenwart von Hamster-Immunglobulin (Ha-Ig), dessen Isotyp dem des anti-CD95-mAK entsprach, stimuliert worden waren, wurden Ergebnisse erhalten, die den mit unbehandelten allogenen Kontrollen erhaltenen entsprachen (Fig. 1A und 1B).
Während der 6-tägigen Stimulierung mit von T-Zellen befreiten allogenen Stimulatoren (H-2^d) wurden CD90⁺-Responderzellen regelmäßig mittels immunmagnetischer Trennung isoliert und mittels Durchflusszytometrieanalyse analysiert. Nach Färbung mit Annexin V und 7-AAD zeigte sich, dass innerhalb der ersten 36 bis 48 Stunden nach Aktivierung die CD95- Expression erhöht war und nach Behandlung mit dem agonistischen anti-CD95-mAK der Anteil apoptotischer CD4⁺- und CD8⁺-T-Lymphozyten signifikant zugenommen hatte.

Beispiel 2

Inaktive und präaktivierte T-Lymphozyten sind gleichermaßen anfällig für AICD

Es liegen Berichte vor, denen zufolge T-Zellen nach primärer Aktivierung zunächst resistent gegenüber AICD sind. Werden sie jedoch in einem Zeitraum von 4 bis 5 Tagen kontinuierlich mit CD95 in Kontakt gebracht, zeigen sie eine erhöhte Anfälligkeit für eine CD95-vermittelte Apoptose-Induzierung (Lenardo et al., Annu. Rev. Immunol., 17 (1999), 221-253; Klas et al., Int. Immunology, 5 (1993), 625-630). Daher wurde die AICD-Aktivierung bei inaktiven T- Lymphozyten untersucht und mit der bei präaktivierten T-Zellen verglichen.
Sowohl CD4⁺-T-Zellen als auch frisch isolierte, in Ruhephase befindliche CD4⁺-T-Lymphozyten wurden nach 3-tägiger polyklonaler in vitro-Aktivierung mittels TCR-Vernetzung unter Verwendung des anti- CD3-mAK (145-2C11) mit dem allo-Antigen H-2^d in einer gemischten Lymphozytenkultur in Gegenwart eines agonistischen monoklonalen anti-CD95-Antikörpers 5 Tage stimuliert. Anschließend wurde die Reaktion der verbliebenen T-Zellen auf die Stimulierung mit dem allo-Antigen in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) getestet. Nach AICD-Induzierung war die Fähigkeit zur Proliferation sowohl bei den primär stimulierten T-Zellen (Fig. 2A) als auch bei den restimulierten T-Zellen (Fig. 2B) deutlich reduziert. Gegenüber unbehandelten Kontrollen ging die Proliferation am dritten Tag um 85% zurück (vergleiche Fig. 2A und 2B), obwohl die Reaktion auf das Antigen im Falle der mittels anti-CD3-mAK präaktivierten Responderzellen früher einsetzte.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die AICD-Induzierung nach wiederholter Stimulierung von T-Lymphozyten mit MHC-allo-Antigenen nicht vom Präaktivierungsstatus der alloreaktiven T-Zellen abhängig ist.

Beispiel 3

Die AICD-Induzierung bei alloreaktiven T-Zellen ist spezifisch im Hinblick auf das stimulierende allo- Antigen

Zur Bestätigung, dass die Eliminierung alloreaktiver T-Zellen spezifisch für einen bestimmten Haplotyp ist, wurden die CD90⁺-T-Zellen, die nach einer primären allogenen gemischten Lymphozytenreaktion unter Verwendung des allo-Antigen H-2^d in Gegenwart des anti-CD95-mAK übrig geblieben waren, isoliert und mit Milz-Stimulatorzellen in Kontakt gebracht, die das dritte, aus C57BL/6-Mäusen stammende Antigen H-2^b exprimieren. Wie aufgrund der vorstehend erhaltenen Ergebnissen zu erwarten, führte die Restimulierung mit dem allo-Antigen H-2^d dazu, dass die proliferative Reaktion der CD90⁺-T-Zellen gegenüber Kontrollen stark reduziert war (Fig. 3A). Interessanterweise wurde die AICD-Induzierung nach Vernetzung des ant-CD95-mAK unter Verwendung eines an die Mikrotiterplatte gebundenen Anti-Ha-Ig erhöht. Vermutlich bewirkt die Vernetzung eine effizientere Trimerisierung des CD95-Rezeptors. Im Gegensatz zeigten allogene T-Zellen (H-2^k), die mit einem Anti-CD95-mAK behandelt worden waren, bei Restimulierung mit dem dritten beteiligten allo- Antigen H-2^b keine verminderte Proliferation ( Fig. 3B).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die AICD- Induzierung unter Verwendung des gegen CD95 gerichteten agonistischen monoklonalen Antikörpers Jo2 zur Eliminierung alloreaktiver T-Zellen führt, die für ein bestimmtes allo-Antigen spezifisch sind. Außerdem zeigt es sich, dass die Vernetzung des monoklonalen Antikörpers die Apoptose-Induzierung verstärkt.

Beispiel 4

Nach AICD-Induzierung zeigen alloreaktive T-Zellen keine cytolytischen Reaktionen

In einem weiteren Experiment wurde getestet, ob die AICD-Induzierung unter Verwendung des anti-CD95-mAK auch zu einer Verminderung der zytolytischen Reaktionen alloreaktiver T-Zellen führt.
Aus C3H/He-Mäusen wurden CD90⁺-T-Responderzellen aufgereinigt und mit allogenen Milz- Stimulatorzellen von bestrahlten Balb/c-Mäusen in Gegenwart des gegen CD95 gerichteten monoklonalen Antikörpers (1 µg/ml) in einer gemischten Lymphozytenkultur 5 Tage stimuliert. Nach der Behandlung wurden die übrig gebliebenen T-Lymphozyten aus der Kultur gewonnen und in einem Zytolyse-Test unter Verwendung von Chrom-markierten A20-Zellen als Zielzellen getestet. Bei einem Effektor/Zielzellen- Verhältnis von 3 : 1 zeigten unbehandelte alloreaktive Kontroll-T-Lymphozyten eine 50%-ige-60%-ige spezifische Lyse. Im Vergleich dazu war die Fähigkeit der übrig gebliebenen cytotoxischen T- Lymphozyten (CTL) zur Abtötung der A20-Zielzellen um mindestens 80% vermindert (Fig. 4). Diese Verminderung der alloreaktiven Zytotoxizität nach AICD-Induzierung war dabei wiederum spezifisch für das allo-Antigen H-2^d, da keine signifikante Lyse von EL-4-Zielzellen, die das Antigen H-2^b exprimieren, festgestellt werden konnte (Fig. 4). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse und die vorstehend beschriebenen Ergebnisse, dass die Induzierung der allo-Antigen-abhängigen Apoptose in einer aktivierten allogenen T-Zell-Population durch Verabreichung eines gegen CD95 gerichteten agonistischen monoklonalen Antikörpers zu einer deutlichen Eliminierung allo-Antigen-spezifischer alloreaktiver T- Zellen führt. Dabei werden jedoch T-Zellen, die vorher nicht in Abhängigkeit von einem allo-Antigen aktiviert wurden, nicht beeinträchtigt.

Beispiel 5

Rezipienten von allogenen T-Zellen, die mittels AICD von wirtsreaktiven T-Zell-Subpopulationen befreit wurden, entwickeln keine GvH-Erkrankung

Um die Wirksamkeit der in vitro-Eliminierung alloreaktiver T-Zellen mittels AICD zu bestätigen, wurde die Fähigkeit der nach AICD-Induzierung übrig gebliebenen nicht liminierten T-Zellen zur Auslösung der Graft-versus-Host-Krankheit getestet. Dazu wurde ein klassisches Eltern C3H/He (H-2^k) → F₁ (Balb/c × C3H/He, H-2^dk)-GvHD-Modell verwendet. Nicht-aktivierte allogene CD90⁺-Donor T-Lymphozyten oder CD90⁺-T-Zellen, die 14 Tage vor Isolierung aus Donor-Mäusen mit H-2^d-Balb/c-Milzzellen in vivo behandelt worden waren, wurden mit Milz- Stimulatorzellen aus bestrahlten Balb/c-Milz-Mäusen in einer gemischten Lymphozytenkultur (MLC) in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers Jo2 5 bis 6 Tage kultiviert. Danach wurden die übrig gebliebenen lebensfähigen Responderzellen isoliert. Daraus wurden mittels immunmagnetischer Trennung CD4⁺- oder CD8⁺-Donor-T-Zellen gewonnen und in die Schwanz-Vene von F₁-Rezipienten injiziert, die 6 bis 8 Stunden vor Übertragung der T-zellen bestrahlt worden waren (6,5 Gy). Während der Aufbereitung der T-Responderzellen wurden diese gründlich gewaschen, um den im Überschuß vorliegenden anti-CD95-mAK zu entfernen. Ausnahmslos alle F₁- Mäuse, denen in vivo stimulierte und in vitro restimulierte Donor-T-Lymphozyten verabreicht worden waren, entwickelten 9 bis 13 Tage nach Übertragung der T-Lymphozyten eine akute Graft-versus- Host-Reaktion. Die GvH-Reaktion konnte klinisch anhand eines schnellen Gewichtsverlustes, einer schweren Diarrhöe und einer gekrümmten Körperhaltung charakterisiert werden. Alle Mäuse starben innerhalb von 20 Tagen nach Übertragung der T-Zellen (Fig. 5). Überraschenderweise führte die Übertragung von Donor-T-Lymphozyten, bei denen alloreaktive Donorzellen ausschließlich mit dem löslichen monoklonalen Antikörper gegen CD95 eliminiert worden waren, ebenfalls zur Entwicklung einer letalen GvH- Reaktion (Fig. 5). Im Gegensatz dazu führte die Eliminierung aktivierter alloreaktiver T-Zellen unter Verwendung des anti-CD95-mAK, der vor der Übertragung der aufgereinigten allogenen CD4⁺- (Fig. 5A) oder CD8⁺-T-Zellen (Fig. 5B) unter Verwendung des polyklonalen anti-Ha-Ig vernetzt worden war, zu einer deutlichen Verbesserung der akuten GvH- Erkrankung bei den F₁-Rezipienten. In dieser Gruppe überlebten alle Rezipienten und zeigten keine klinische Anzeichen einer GvH-Erkrankung. Der Zustand der Tiere blieb stabil und die Tiere entwickelten bis zum 120. Tag, dem Ende der Untersuchung, keine GvH-Reaktion. Auch bei Kontrollmäusen, denen syngene Milzzellen verabreicht worden waren, entwickelte sich keine GvH-Erkrankung.
Nach der Übertragung allo-Antigen-aktivierter T- Zellen in F₁-Wirtsmäuse wurde nicht nur die Entwicklung von GvH-Reaktionen untersucht, sondern auch die Expansion der transferierten Donor-T- Zellen in vivo. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Übertragung der T-Lymphozyten wurden aus F₁- Rezipienten Milz und Lymphknoten entfernt. Aus daraus hergestellten Zellsuspensionen wurden CD90⁺- Zellen mittels immunmagnetischer Trennung isoliert. Mittels Zweifarben-Durchfluss-Zytometrie wurde die Expansion von H-2^k-positiven T-Zellen in der CD90⁺- Zellpopulatlon analysiert und mit der Expansion der vom Rezipienten stammenden T-Lymphozyten (H-2^kxd) verglichen (Fig. 6). 10 Tage nach Übertragung von 2,5 × 10⁶ Zellen war die Proliferation allogener T- Zellen (H-2^k), die in vitro mittels AICD von alloreaktiven Responderzellen befreit worden waren, in den F₁-Rezipienten sehr gering. Für CD4⁺-Zellen wurde eine 6,4%-ige Proliferation ermittelt. Bei CD8⁺-Zellen betrug die Proliferation 4,5% (Fig. 6B). Im Gegensatz dazu wurde eine signifikante Expansion unbehandelter allogener T-Lymphozyten aus C3H/He-Mäusen festgestellt (Fig. 6A; 33,4% für CD4⁺- und 22,8% für CD8⁺-Zellen).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines hämatopoetischen Stammzell-Präparates, das zur allogenen Transplantation geeignet ist und nach Transplantation in einen Rezipienten keine Graft-versus-Host-Erkrankung hervorruft, umfassend:

a) die Gewinnung eines hämatopoetische Stammzellen umfassenden Materials aus einem Donor,

b) die Herstellung einer Zellsuspension aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material,

c) die Isolierung und Aufreinigung einer T- Zell-Population aus der Zellsuspension,

d) die Behandlung der T-Zell-Population, so dass ein Teil der T-Zell-Population selektiv eliminiert beziehungsweise funktionell inhibiert wird, und

e) die Vereinigung des nicht eliminierten Teils der T-Zell-Population mit der hämatopoetische Stammzellen umfassenden, T-Zell-freien Zellsuspension zum Zeitpunkt der Transplantation oder zu einem späteren Zeitpunkt im Rahmen einer modifizierten Donor-Lymphozyten- Infusion (DLI).

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die selektive Eliminierung beziehungsweise funktionelle Inhibierung des Teils der T-Zell-Population durch Aktivierungs-induzierten Zelltod erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem Geschwister isoliert wird, dessen HLA-System mit dem des Rezipienten identisch ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem nicht-verwandten Donor isoliert wird, dessen HLA-System mit dem des Rezipienten übereinstimmt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das hämatopoetische Stammzellen umfassende Material aus einem Familien-Donor isoliert wird, wobei der 1- Locus seines HLA-Systems mit dem des Rezipienten nicht übereinstimmt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material CD3⁺-T-Zellen isoliert und aufgereinigt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material CD4⁺-T-Zellen isoliert und aufgereinigt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei aus dem hämatopoetische Stammzellen umfassenden Material CD8⁺-T-Zellen isoliert und aufgereinigt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die isolierte T-Zell-Population so behandelt wird, dass alloreaktive T-Zellen eliminiert beziehungsweise funktionell inhibiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Eliminierung beziehungsweise funktionelle Inhibierung der alloreaktiven T-Zellen durch wiederholtes Inkontaktbringen der isolierten T- Zellpopulation mit einem Antigen und gleichzeitiges Behandeln mit einem gegen einen Apoptoseinduzierenden T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörper oder einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell-Rezeptors gerichteten Liganden erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die T-Zell- Population wiederholt mit aus dem Rezipienten stammenden allo-Antigenen in Kontakt gebracht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die T-Zell- Population mit Zellen, auf deren Oberfläche allo- Antigene enthalten sind, in Kontakt gebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die T-Zell- Population mit Milzzellen in Kontakt gebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die T-Zell- Population mit von Monocyten stammenden reifen dentritischen Zellen in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die T-Zell- Population mit isolierten und aufgereinigten allo- Antigenen in Kontakt gebracht wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die T-Zell- Population mit rekombinanten allo-Antigenen in Kontakt gebracht wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das Inkontaktbringen der T-Zell-Population mit dem Antigen in Gegenwart von Interleukin 2 (IL- 2) erfolgt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei die T-Zell-Population während des wiederholten Inkontaktbringen mit dem allo-Antigen oder danach mit einem gegen den CD95-Rezeptor gerichteten monoklonalen Antikörper behandelt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die T-Zell- Population während des wiederholten Inkontaktbringen mit dem allo-Antigen oder danach mit dem gegen den CD95-Rezeptor gerichteten monoklonalen Antikörper Jo2 behandelt wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei die T-Zell-Population während des wiederholten Inkontaktbringen mit dem allo-Antigen oder danach mit dem Liganden des CD95-Rezeptors behandelt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die T-Zell- Population während des wiederholten Inkontaktbringen mit dem allo-Antigen oder danach mit einem rekombinanten humanen CD95-Liganden behandelt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das hämatopoetische Material aus einem menschlichen Organismus gewonnen und zur Herstellung eines menschlichen hämatopoetischen Stammzell- Präparates verwendet wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das hämatopoetische Material aus einer Maus gewonnen und zur Herstellung eines hämatopoetischen Stammzell-Präparates der Maus verwendet wird.

24. Verfahren zur Isolierung eines von alloreaktiven T-Zellen befreiten T-Zell-Präparates, umfassend:

a) die Gewinnung eines Stammzellen umfassenden Materials aus einem Donor,

b) die Herstellung einer Zellsuspension aus dem Stammzellen umfassenden Material,

d) die Behandlung der T-Zell-Population durch wiederholtes Inkontaktbringen mit einem allo- Antigen,

e) die Behandlung der mit dem allo-Antigen in Kontakt gebrachten T-Zellpopulation mit einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell- Rezeptor gerichteten Antikörper oder einem gegen einen Apoptose-induzierenden T-Zell- Rezeptor gerichteten Liganden, und

f) die Gewinnung der nicht mit dem Antikörper oder dem Liganden reagierenden T-Zellen.

25. Hämatopoetisches Stammzell-Präparat, in dem die alloreaktive T-Zell-Population selektiv eliminiert beziehungsweise funktionell inhibiert ist und das zur allogenen Transplantation geeignet ist, wobei in einem Rezipienten keine Graft-versus-Host- Erkrankung hervorgerufen wird, herstellbar nach einem der Ansprüche 1 bis 23.

26. Verwendung eines hämatopoetischen Stammzell- Präparates nach Anspruch 25 zur Herstellung eines Stammzell-Transplantats zur allogenen Transplantation in einen Rezipienten, wobei im Rezipienten nach Transplantation keine Graft-versus-Host- Erkrankung hervorgerufen wird.