DE10118725A1 - Testing pharmaceuticals comprises placing hydrophobic microtiter-filter plate impregnated with solution of lecithin in organic solvent over microtiter plate and measuring permeation rate through it - Google Patents
Testing pharmaceuticals comprises placing hydrophobic microtiter-filter plate impregnated with solution of lecithin in organic solvent over microtiter plate and measuring permeation rate through itInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Arzneimittelwirkstoffen in vitro, wobei eine Mikrotiter-Filterplatte aus hydrophobem Filtermaterial über einer Mikrotiterplatte angeordnet wird und vor Aufbringen der zu testenden Arzneimittelwirkstofflösung auf das hydrophobe Filtermaterial dieses mit einer Phospholipidlösung, insbesondere einer Lösung von Lecithin in einem organischen Lösungsmittel, imprägniert und anschließend die Permeationsrate des Wirkstoffes bestimmt wird.The invention relates to a method for testing active pharmaceutical ingredients in vitro, wherein a microtiter filter plate made of hydrophobic filter material over a microtiter plate is arranged and before applying the drug solution to be tested to the hydrophobic filter material this with a phospholipid solution, in particular a solution of lecithin in an organic solvent, impregnated and then the Permeation rate of the active ingredient is determined.
Um als Arzneistoff in Frage zu kommen, muß ein neuer Wirkstoff zwei
Grundvoraussetzungen erfüllen:
In order to be considered as a drug, a new drug must meet two basic requirements:
- - er muß eine ausreichend große biologische Aktivität aufweisen und- it must have a sufficiently large biological activity and
- - er muß am Wirkort in ausreichend großer Konzentration vorliegen, um seine biologische Aktivität entfalten zu können.- It must be present at the site of action in a sufficiently large concentration to ensure its to be able to develop biological activity.
Für Wirkstoffe, die peroral verabreicht werden, ist daher die Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt ein wesentliches Erfolgskriterium. Die Permeation durch die Darmschleimhaut kann durch in vitro Verfahren simuliert werden, wie dem in Journal of Medicinal Chemistry, 1998, Volume 41, Number 7, S. 1007-1010 beschriebenen und als Parallel Artificial Membrane Permeation Assay (PAMPA) bezeichneten Verfahren.For active substances that are administered orally, the absorption from the Gastrointestinal tract an essential success criterion. Permeation through the Intestinal mucosa can be simulated by in vitro methods such as the one in Journal of Medicinal Chemistry, 1998, Volume 41, Number 7, pp. 1007-1010 and a method known as the Parallel Artificial Membrane Permeation Assay (PAMPA).
Hierbei wird in einer Art Sandwichkonstruktion eine 96-well Mikrotiterplatte, die nach Angaben der Autoren als Filtermaterial hydrophobes Durapore enthält, über eine normale 96- well Mikrotiterplatte gelegt. Die hydrophoben Filter werden mit einer Lösung von Lecithin in organischem Lösungsmittel imprägniert, so daß eine der Biomembran nachempfundene Doppelschicht entsteht. Die Wirkstofflösung wird auf die Filterplatte aufgebracht und nach 15 Stunden die Permeationsrate durch Messung der Konzentration an Wirkstoff in der unteren Platte mittels UV-Spektroskopie bestimmt.Here, in a kind of sandwich construction, a 96-well microtiter plate is used According to the authors, the filter material contains hydrophobic Durapore, via a normal 96- well placed microtiter plate. The hydrophobic filters are mixed with a solution of lecithin impregnated organic solvent, so that a model based on the biomembrane Double layer arises. The active ingredient solution is applied to the filter plate and after 15 Hours the permeation rate by measuring the concentration of active ingredient in the lower Plate determined using UV spectroscopy.
Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist die Tatsache, daß sie nur für Substanzen geeignet ist, die über einen transzellulären Mechanismus transportiert werden. Da es sich um eine gänzlich künstliche Membran handelt, enthält diese keine Poren oder aktive Transportsysteme. Substanzen, die parazellulär transportiert werden oder über einen aktiven Transportmechanismus verfügen, können demnach mit diesem Verfahren nicht untersucht werden. Solche Substanzen müssen bislang an Zellkulturen getestet werden, was zeitaufwendig, teuer und schlecht reproduzierbar ist.A major disadvantage of this method is the fact that it is only for substances is suitable, which are transported via a transcellular mechanism. Since it is is a completely artificial membrane, it contains no pores or active Transportation systems. Substances that are transported paracellularly or via an active one Transport mechanism can therefore not be investigated with this method become. So far, such substances have had to be tested on cell cultures is time consuming, expensive and difficult to reproduce.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem auch Substanzen in vitro getestet werden können, die parazellulär transportiert werden oder über einen aktiven Transportmechanismus verfügen.The object of the invention is therefore to develop a method with which substances in can be tested in vitro, which are transported paracellularly or via an active Transport mechanism.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß mindestens ein weiterer derartiger Testdurchlauf mit der zu testenden Arzneimittelwirkstofflösung unter Verwendung eines anderen, weniger hydrophoben, ambiphilen oder hydrophilen Filtermaterials durchgeführt wird.This object is achieved according to the invention in a method according to the preamble solved that at least one other such test run with the test Drug solution using another, less hydrophobic, ambiphilic or hydrophilic filter material is carried out.
Es hat sich im Rahmen der Erfindung überraschend herausgestellt, daß mit einem anderen Filtermaterial auch Substanzen untersucht werden können, die aktiv bzw. parazellulär transportiert werden, die Membran überwinden, nicht aber solche, die an sich schlecht permeieren und über einen transzellulären Mechanismus verfügen.It has surprisingly been found in the context of the invention that with another Filter material can also be examined for substances that are active or paracellular transported, overcome the membrane, but not those that are bad in themselves permeate and have a transcellular mechanism.
Durch die Verwendung unterschiedlicher Membranmaterialien ist es also möglich, unbekannte Substanzen unabhängig von ihrem Transportmechanismus im PAMPA zu untersuchen und damit die Aussagekraft und die Verwendungsmöglichkeit für dieses Verfahren erheblich zu steigern. Mit diesem gut reproduzierbaren und effizienten Verfahren können die zeitaufwendigen, teuren und schlecht reproduzierbaren Testreihen mit Zellkulturen ersetzt werden.By using different membrane materials, it is possible unknown substances regardless of their transport mechanism in PAMPA investigate and thus the meaningfulness and the possible use for this To significantly increase procedures. With this easily reproducible and efficient process can use the time-consuming, expensive and poorly reproducible test series Cell cultures are replaced.
Hierbei ist es vorteilhaft, daß das andere Filtermaterial ein hydrophiles, modifiziertes PVDF enthaltendes Filtermaterial ist.It is advantageous here that the other filter material is a hydrophilic, modified PVDF containing filter material.
Eine Weiterbildung der Erfindung besteht darin, daß ein weiterer Testdurchlauf mit der zu testenden Arzneimittelwirkstofflösung durchgeführt wird, wobei die Verbindung der Phospholipidlösung mit dem anderen Filtermaterial durch mechanisches Bewegen erleichtert wird.A further development of the invention is that a further test run with the testing drug drug solution is performed, the connection of the Phospholipid solution with the other filter material facilitated by mechanical movement becomes.
Ebenso hat es sich überraschend gezeigt, daß, wenn die Verbindung der hydrophoben Lecithinlösung mit dem anderen Filtermaterial mechanisch erleichtert wird, bei Verwendung des gleichen (z. B. jeweils hydrophilen) Filtermaterials wie im ungeschüttelten Versuch die Substanzen, die aktiv oder parazellulär transportiert werden, nicht permeieren. Die Ergebnisse entsprachen im wesentlichen denen mit einem hydrophoben Filtermaterial.It has also surprisingly been found that when the compound is hydrophobic Lecithin solution with the other filter material is mechanically facilitated when in use the same (e.g. hydrophilic) filter material as in the unshaken experiment Substances that are actively or paracellularly transported do not permeate. The results corresponded essentially to those with a hydrophobic filter material.
Somit läßt sich durch Vergleich der Resultate (z. B. hydrophobe Membran/hydrophile Membran bzw. hydrophile Membran/hydrophile Membran, geschüttelt) eine Voraussage über den Transportmechanismus einer neuen, unbekannten Substanz treffen.Thus, by comparing the results (e.g. hydrophobic membrane / hydrophilic Membrane or hydrophilic membrane / hydrophilic membrane, shaken) a prediction about hit the transport mechanism of a new, unknown substance.
Hierbei ist es zweckmäßig, daß die Filterplatte und die Mikrotiterplatte mindestens 10 min. vorzugsweise 20 min lang geschüttelt wird.It is advantageous that the filter plate and the microtiter plate at least 10 min. is preferably shaken for 20 minutes.
Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, daß ein zweiter gleichlanger Schüttelvorgang erfolgt, wobei die Schüttelbewegung um 90° versetzt aufgebracht wird.It has proven particularly advantageous that a second shaking process of the same length takes place, the shaking movement is applied offset by 90 °.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines Ausführungsbeispieles erläutert.The method according to the invention is described below using an exemplary embodiment explained.
Eine 96-well Mikrotiterplatte wird mit einer Pufferlösung (TRIS-Puffer pH 7,4 oder pH 8,2 oder Phosphatpuffer pH 6,5) befüllt (150 µl/well) und sandwichartig eine Mikrotiter- Filterplatte darübergelegt. Die zu testenden Substanzen werden aus einer 10 mM Mutterlösung in Ethanol zu einer 500 µM Lösung in CMC 0,5% (Carboxy Methyl Cellulose Natriumsalz) zubereitet. A 96-well microtiter plate is mixed with a buffer solution (TRIS buffer pH 7.4 or pH 8.2 or phosphate buffer pH 6.5) filled (150 µl / well) and sandwiched a microtiter Filter plate placed over it. The substances to be tested are made from a 10 mM mother solution in ethanol to a 500 µM solution in CMC 0.5% (carboxy methyl cellulose sodium salt) prepared.
Das hydrophobe Filtermaterial (Immobilon-P Membran, Porengröße 65 µm, Millipore) muß mit einer Alkohollösung (70 µl Alkohol 70%/well) benetzt und zweifach mit deionisiertem Wasser (200µ1/well) ausgespült werden.The hydrophobic filter material (Immobilon-P membrane, pore size 65 µm, Millipore) must wetted with an alcohol solution (70 µl alcohol 70% / well) and twice with deionized Water (200µ1 / well) can be rinsed out.
Das hydrophobe Filtermaterial wird dann bis auf den Referenzbereich des Filtermaterials mit einer 10%igen Lecithin-Lösung in Dodekan imprägniert.The hydrophobic filter material is then included up to the reference range of the filter material a 10% lecithin solution impregnated in dodecane.
Die Transportuntersuchung wird durch das Aufbringen von 150 µl einer 500 µM-Lösung der zu untersuchenden Substanz in den Proben- und den Referenzbereich des Filtermaterials gestartet.The transport investigation is carried out by applying 150 µl of a 500 µM solution substance to be examined in the sample and reference area of the filter material started.
Nach 15 bis 16 Stunden werden die Lösungen aus dem Empfangsbereich (96-well Mikrotiterplatte) in eine 96-well Quarzplatte (Hellma) übertragen (130 µl/well) und die Permeationsraten mittels UV-Spektroskopie bestimmt, wobei ein Mikrotiterplattenleser Spectramax Plus 384 (Molecular Devices) verwendet wird.After 15 to 16 hours, the solutions from the reception area (96-well Microtiter plate) in a 96-well quartz plate (Hellma) (130 µl / well) and the Permeation rates determined by means of UV spectroscopy, using a microtiter plate reader Spectramax Plus 384 (Molecular Devices) is used.
Der Lamdamax-Wert jeder getesteten Substanz muß vorher mit einer 100-500 µM Lösung getestet werden. Als Hintergrund wird der OD einer 130 µl TRIS-Puffer Lösung gemessen und von den OD-Werten der Substanzen abgezogen.The Lamda max value of each substance tested must be tested beforehand with a 100-500 µM solution. As a background, the OD of a 130 µl TRIS buffer solution is measured and subtracted from the OD values of the substances.
Die Polyvinilidenfluorid (PVDF) Duropore Membran hat eine geringe Proteinbindungsrate und ist hydrophil. Sie muß daher nicht benetzt werden. Die Membran wird bis auf die Referenzbereiche direkt mit der 10%igen Lecithin-Lösung imprägniert und die Transportuntersuchung wird durch das Aufbringen von 150 µl einer 500 µM-Lösung der zu untersuchenden Substanz in den Proben- und den Referenzbereich des Filtermaterials gestartet. Im übrigen wird wie bei der hydrophoben Membran (1.) vorgegangen. The polyvinilidene fluoride (PVDF) Duropore membrane has a low protein binding rate and is hydrophilic. It therefore does not have to be wetted. The membrane is except for the Reference areas directly impregnated with the 10% lecithin solution and the Transport investigation is carried out by applying 150 µl of a 500 µM solution investigating substance in the sample and the reference area of the filter material started. Otherwise, the procedure is the same as for the hydrophobic membrane (1.).
Hierbei wird wie bei 2. vorgegangen, nur wird nach dem Aufbringen des Lecithins die Platte auf einen Horizontalschüttler verbracht und die Platte wird zunächst 20 min lang geschüttelt. Anschließend erfolgt eine Drehung um 90° vorgenommen und nochmals 20 min geschüttelt. Durch das Schütteln bedeckt das Lecithin die Membran vollständig. Anschließend wird die zu untersuchende Lösung aufgebracht.The procedure is the same as in 2, except that the plate is applied after the lecithin has been applied placed on a horizontal shaker and the plate is first shaken for 20 minutes. Then it is rotated 90 ° and shaken again for 20 min. By shaking the lecithin completely covers the membrane. Then the to investigating solution applied.
Die Ergebnisse mit den verschiedenen Membranmaterialien und Versuchsbedingungen sind in Fig. 1 als Tabelle dargestellt.The results with the various membrane materials and test conditions are shown in table 1 in FIG .
Es zeigt sich, daß mit der hydrophoben Membran (1.) sich die Daten gemäß dem obengenannten Stand der Technik sehr gut nachvollziehen lassen, d. h. Referenzsubstanzen, bei denen ein transzellulärer Transportmechanismus bekannt ist, konnten die Membran sehr gut permeieren, während Referenzsubstanzen, die bekanntermaßen aktiv oder parazellulär transportiert werden, nicht in der Lage waren, diese Membran zu überwinden.It turns out that with the hydrophobic membrane (1.) the data according to Allowing the above-mentioned prior art to be understood very well, d. H. Reference substances, in which a transcellular transport mechanism is known, the membrane could permeate well while reference substances are known to be active or paracellular transported, were unable to overcome this membrane.
Bei der hydrophilen Membran (2.) konnten auch Referenzsubstanzen, die nach Literaturangaben aktiv bzw. parazellulär transportiert werden, im Gegensatz zu 1. die Membran überwinden, nicht aber Wirkstoffe, die an sich schlecht permeieren und über einen transzellulären Mechanismus verfügen.In the case of the hydrophilic membrane (2.), reference substances could also be used, which are according to Literature are actively or paracellularly transported, in contrast to 1. the Overcome the membrane, but not active ingredients that do not permeate per se and through one transcellular mechanism.
Im Gegensatz zu der ungeschüttelten Membran (2.) konnten bei der geschüttelten Membran (3.) die Referenzsubstanzen, die aktiv oder parazellulär transportiert werden, nicht permeieren. Die hier erzielten Resultaten waren denen bei 1. sehr ähnlich.In contrast to the unshaken membrane (2.), the shaken membrane (3.) the reference substances that are actively or paracellularly transported do not permeate. The results achieved here were very similar to those for 1.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8304 | Grant after examination procedure | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |
Effective date: 20121101 |