DE10117730A1 - Umsetzung von (Di)Aminen in Gegenwart einer Lysinoxidase und eines Reduktionsmittels - Google Patents
Umsetzung von (Di)Aminen in Gegenwart einer Lysinoxidase und eines ReduktionsmittelsInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von Aminen der allgemeinen Formel (I) DOLLAR F1 mit A- in der Bedeutung von DOLLAR F2 zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III) DOLLAR F3 mit B- in der Bedeutung von HO-CH¶2¶-R·3·- oder R·4·- enthaltend die folgenden Schritte: DOLLAR A a) Oxidation mindestens einer DOLLAR F4 Gruppe eines Amins der allgemeinen Formel (I) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; DOLLAR A b) gegebenenfalls Reaktion der zweiten NH¶2¶-Gruppe eines Amins der allgemeinen Formel (I) mit DOLLAR F5 mit der gemäß Schritt a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin; DOLLAR A c) Reduktion der nach a) entstandenen Carbonylgruppe(n) bzw. des nach b) gegebenenfalls entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen bzw. zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II); DOLLAR A wobei R·1· NR·5· oder ein - gegebenenfalls mit CO¶2¶H, CO¶2¶R·6·, OH, SH und/oder N(R·5·)¶2¶ substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C¶2¶-C¶6¶-Kohlenwasserstoffrest ist, DOLLAR A wobei R·5· für H oder lineares C¶1¶-C¶6¶-Alkyl und R·6· für lineares C¶1¶-C¶6¶-Alkyl oder verzweigtes C¶3¶-C¶6¶-Alkyl oder C¶6¶-C¶10¶-Aryl stehen, DOLLAR A und R·2· = H, CO¶2¶H, CO¶2¶R·6· oder CN ist, DOLLAR A dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und DOLLAR A in der Definition von A in der ...
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Umsetzung von (Di)Aminen als Substrate in
Gegenwart einer Lysinoxidase und eines Reduktionsmittels. Je nach Substrat werden
hierbei Alkohole, Diole oder cyclische sekundäre Amine erhalten.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Lysinoxidase in den
genannten Verfahren.
Prolinderivate sind wichtige Zwischenprodukte für Thrombininhibitoren (WO 95/35309,
WO 98/06740, WO94/29336), Piperazin-2-carbonsäurederivate finden Anwendung in
HIV-Proteasehemmern. Die Darstellung solcher cyclischen sekundären Amine wie
Piperazin-2-carbonsäure-, Piperidin-2-carbonsäure- und Prolin-derivaten erfordert häufig
einen großen synthetischen Aufwand, wie von D. Askin et al. in Tetrahedron Lett. 1994,
35(5), 673-676 und in WO 98/04523 beschrieben. Eine im Vergleich dazu recht einfache
Darstellungsmethode für teilweise ungesättigte Piperidin-2-carbonsäurederivate geht aus
von L-Lysin. Dessen α-Aminogruppe wird in Gegenwart von Sauerstoff und unter Bildung
von H2O2 und NH3 zur Ketogruppe oxidiert und es entsteht 2-Oxo-6-aminohexansäure, wie
in J. Basic Microbiol. 1994, 34(4), 265-276 beschrieben. Findet diese Reaktion in
Anwesenheit von Catalase statt, so wird die entstandene 2-Oxo-6-aminohexansäure zu 1,2-
Didehydropiperidin-2-carbonsäure cyclisiert. Um daraus Piperidin-2-carbonsäure
herzustellen, müßte die 1,2-Didehydropiperidin-2-carbonsäure nach Aufreinigung in einem
zusätzlichen Verfahrensschritt reduziert werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein weiteres Verfahren zur Herstellung von cyclischen
sekundären Aminen zu finden, welches auch für die Synthese von Piperidin-2-
carbonsäure- und Prolin-derivaten geeignet ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Umsetzung von Aminen der allgemeinen
Formel (I)
mit A- in der Bedeutung von
zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III)
mit B- in der Bedeutung von HO-CH2-R3- oder R4-
enthaltend die folgenden Schritte:
enthaltend die folgenden Schritte:
- a) Oxidation mindestens einer
eines Amins der allgemeinen Formel (I) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; - b) gegebenenfalls Reaktion der zweiten NH2-Gruppe eines Amins der
allgemeinen Formel (I) mit
mit der nach a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin; - c) Reduktion der nach a) entstandenen Carbonylgruppe(n) bzw. des nach b) gegebenenfalls entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen bzw. zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II),
wobei R1
NR5
oder ein - gegebenenfalls mit CO2
H, CO2
R6
, OH, SH und/oder N(R5
)2
substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer
bivalenter C2
-C6
-Kohlenwasserstoffrest ist,
wobei R5
wobei R5
für H oder lineares C1
-C6
-Alkyl und R6
für lineares C1
-C6
-Alkyl oder
verzweigtes C3
-C6
-Alkyl oder C6
-C10
-Aryl stehen,
und R2
und R2
H, CO2
H, CO2
R6
oder CN ist,
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I)
R3
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I)
R3
ein - gegebenenfalls mit linearem C1
-C6
-Alkyl oder verzweigtem C3
-C6
-Alkyl, C6
-C10
-
Aryl, C4
-C10
-Heteroaryl und/oder CO2
R6
substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S-
und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0
-C1
- oder C5
-C18
-Kohlenwasserstoffrest ist,
und
R4
R4
für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2
H und/oder CO2
R6
substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden -
linearen C1
-C20
-Kohlenwasserstoffrest steht.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Eintopfverfahren ist umso
erstaunlicher, da nicht zu erwarten war, daß Lysinoxidasen ihre Aktivität in Gegenwart
eines Reduktionsmittels beibehalten. Eine Aufreinigung der nach b) entstandenen
cyclischen Enamine, Imine oder der nach a) entstandenen Verbindungen mit mindestens
einer Carbonylgruppe vor Reduktion zu cyclischen sekundären Aminen der allgemeinen
Formel (II) oder Alkoholen der allgemeinen Formel (III) ist also nicht nötig. Zudem findet
Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Cyclisierung zum Enamin oder Imin, im
Gegensatz zum bekannten Verfahren spontan auch ohne Zusatz von Catalase statt.
Je nach der Struktur des Amins der allgemeinen Formel (I), dem Substrat, laufen die
einzelnen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens im Detail folgendermaßen ab:
- 1. Wird ein Amin der allgemeinen Formel (I) mit
eingesetzt, wobei R1 und R2 die obengenannte Bedeutung haben, so handelt es sich bei dem Substrat um ein Diamin. In Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine der beiden
dieses Diamins zu einer Carbonylgruppe unter Katalyse einer Lysinoxidase oxidiert. Es konnte beobachtet werden, daß bei Einsatz der Lysinoxidase aus Pichia pastoris ausschließlich die ε-Aminogruppe und nicht die α-Aminogruppe des L- und D-Lysins oxidiert wird. Für die Folgeschritte ist es jedoch unerheblich, welche Aminogruppe oxidiert wurde bzw. ob ein Aldehyd oder Keton vorliegt. Die in Schritt a) erzeugte Carbonylgruppe reagiert dann spontan in Schritt b) mit der zweiten - nicht umgesetzten - Aminogruppe zu einer Schiffschen Base (einem Imin) oder einem Enamin. Da diese Reaktion intramolekular abläuft, entsteht dabei ein cyclisches Enamin oder Imin. Dieses kann auch isoliert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch dadurch gekennzeichnet, daß eine Isolierung vor Schritt c) nicht nötig ist, da die Schritte a) bis c) als Eintopfverfahren durchgeführt werden. In Schritt c) wird dann das cyclische Enamin oder Imin durch ein in der Substratlösung vorhandenes Reduktionsmittel zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II) reduziert. - 2. Wird ein Amin der allgemeinen Formel (I) mit A- = H2N-CH2-R3- eingesetzt, wobei R3 die obengenannte Bedeutung hat, so handelt es sich bei dem Substrat um ein Diamin mit zwei Aminomethylgruppen. Beide Aminomethylgruppen werden in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator zu Formylgruppen oxidiert. Eine intramolekulare Reaktion ist im Gegensatz zu I) nicht möglich oder nicht begünstigt und findet daher auch nicht statt. Beide Formylgruppen werden anschließend gemäß Schritt c) mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen reduziert unter Bildung eines Alkohols der allgemeinen Formel (III) mit B- = HO-CH2-R3-.
- 3. Wird als Substrat ein Amin der allgemeinen Formel (I) mit A = R4 eingesetzt, wobei R4 die oben angegebene Bedeutung hat, so wird dessen Aminomethylgruppe zu einer Formylgruppe oxidiert. Diese Formylgruppe wird anschließend gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens durch das in der Substratlösung vorhandene Reduktionsmittel zu einer Hydroxymethylgruppe reduziert unter Bildung eines primären Alkohols der allgemeinen Formel (III) mit B = R4.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich detailliert wie folgt beschreiben:
- 1. Verfahren zur Herstellung von cyclischen sekundären Aminen der allgemeinen Formel
(II) aus Diaminen der allgemeinen Formel (Ia)
wobei R1 für NR5 oder einen linearen bivalenten Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 6 C- Atomen steht, der gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H, CO2R6, OH, SH und/oder N(R5)2 substituiert ist und/oder nicht-benachbarte Heteroatome wie O, S, N enthält,
wobei R5 für H oder lineares C1-C6-Alkyl und R6 für lineares C1-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl stehen, und R2 H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
enthaltend die folgenden Schritte:- a) Oxidation einer der beiden
eines Diamins der allgemei nen Formel (Ia) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; - b) Reaktion der zweiten NH2-Gruppe des Diamins der allgemeinen Formel (Ia) mit der gemäß Schritt a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin;
- c) Reduktion des nach b) entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II);
- a) Oxidation einer der beiden
Bei der Definition des Restes R1 sind von dem Begriff "Kohlenwasserstoffrest" auch
(teilweise) ungesättigte Kohlenwasserstoffreste umfaßt, wobei die Doppelbindungen cis-
ständig vorliegen.
Beispiele für geeignete Diamine der allgemeinen Formel (Ia) sind basische Aminosäuren
wie D- und L-Lysin und D- und L-Ornithin, 2,6-Diamino-4-azahexansäure sowie 1,6-
Diaminohexan. Bevorzugt werden L-Lysin und L-Ornithin eingesetzt. Beim Einsatz von L-
Lysin entsteht Piperidin-2-carbonsäure und beim Einsatz von L-Ornithin entsteht Prolin.
- 1. Verfahren zur Herstellung von Diolen der allgemeinen Formel (IIIa) aus Diaminen der
allgemeinen Formel (Ib)
enthaltend die folgenden Schritte:- a) Oxidation der beiden Aminomethylgruppen eines Diamins der allgemeinen Formel (Ib) zu Formylgruppen in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator;
- b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppen mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen unter Bildung eines Diols der allgemeinen Formel (IIIa);
R3 ein - gegebenenfalls mit linearem C1-C6-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, C6-C10- Aryl, C4-C10-Heteroaryl und/oder CO2R6 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0-C1- oder C5-C18-Kohlenwasserstoffrest ist.
Von dem Begriff "bivalenter Kohlenwasserstoffrest" sind hier auch Aryl-, Alkylaryl-,
(Alkyl)Cycloalkyl- sowie gegebenenfalls teilweise ungesättigte (Alkyl)Heterocycloalkylgruppen
umfaßt. Der Begriff "Heteroaryl" umfaßt teilweise oder vollständig ungesättigte
Cyclen, welche 4 bis 10 C-Atome und ein oder mehrere nicht-benachbarte O-, N- oder S-
Atome oder N(H)-Gruppierungen enthalten.
Bevorzugt werden Verbindungen der allgemeinen Formel (Ib) eingesetzt, in denen R3 ein -
gegebenenfalls mit CO2R6 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-
Atome enthaltender - linearer bivalenter C0-C1- oder C5-C18-Kohlenwasserstoffrest ist.
Beispiele für geeignete Diamine der allgemeinen Formel (Ib) sind Ethylendiamin, 1,4-
Diaminobutan, 1,8-Diaminooctan und Spermin.
- 1. Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen R4-CH2-OH aus Aminen
R4-CH2-NH2 enthaltend die folgenden Schritte:
- a) Oxidation der Aminomethylgruppe eines Amins R4-CH2-NH2 zu einer Formylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator;
- b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppe mit einem Reduktionsmittel zu einer Hydroxymethylgruppe unter Bildung eines primären Alkohols R4-CH2-OH;
R4 für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R6 (mit R6 = lineares C1-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl) substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen C1-C20- Kohlenwasserstoffrest steht.
Der Begriff "linearer Kohlenwasserstoffrest" umfaßt auch lineare (Alkyl)Arylgruppen,
lineare (Alkyl)Cycloalkylgruppen und lineare (Alkyl)Heterocycloalkylgruppen.
Beispiele für geeignete Amine R4-CH2-NH2 sind n-Butylamin, Ethanolamin,
Glycinethylester, 3-Aminomethylpyridin sowie Benzylamin.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer Lysinoxidase in Verfahren zur
Umsetzung von (Di)Aminen zu cyclischen sekundären Aminen, Diolen oder Alkoholen in
Gegenwart eines Reduktionsmittels.
Lysinoxidasen katalysieren in vivo die Oxidation der ε-Aminogruppe des Lysins zu
Aldehyden und initiieren so die Stabilisierung von Kollagen- und Elastinfasern durch die
Bildung kovalenter Quervernetzungen (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991, 5, 206-210).
Für die erfindungsgemäßen Verfahren werden im Allgemeinen Lysinoxidasen (E. C.-
Klasse 1.4.3) mikrobiellen Ursprungs eingesetzt, d. h. aus Eukaryonten wie Pilzen oder
Hefen oder Prokaryonten wie gram-positiven oder gram-negativen Bakterien oder
Archaebakterien. Bevorzugt werden die Lysinoxidasen aus Hefen der Gattungen Candida,
Hansenula, Pichia, Sporobolomyces, Sporopachydermia oder Trigonopsis verwendet.
Besonders bevorzugt sind Lysinoxidasen aus den Gattungen und Arten Candida
nagoyaensis, Candida nemodendra, Candida boidinii, Candida lipolytica, Candida
steatolytica, Candida tropicalis, Candida utilis, Hansenula minuta, Hansenula polymorpha,
Pichia pinus, Pichia pastoris, Sporobolomyces alborubescens, Sporopachydermia cereana
oder Trigonopsis variabilis. Ganz besonders bevorzugt für das erfindungsgemäße
Verfahren ist die Lysinoxidase aus der Gattung und Art Pichia pastoris.
Es können sowohl unaufgereinigte Rohenzyme als auch gereinigte Enzyme eingesetzt
werden. Auch ganze Organismen oder Zellen können für das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden, soweit die Enzyme ins extrazelluläre Milieu sezerniert werden oder die
Zellen permeabilisiert wurden. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren mit
gereinigten Enzymen durchgeführt.
Vorteilhaft ist, daß Lysinoxidasen über Fermentationsprozesse in großem Maßstab
gewonnen werden können. Beispielsweise werden Lysinoxidasen aus Hefen dadurch
gewonnen, daß die Hefe, die die gewünschte Lysinoxidase sezerniert, in einem
Nährmedium enthaltend Hefe-Extrakt, Sojaöl und übliche Zusatzstoffe wie Mineralsalze
und Spurenelemente sowie gegebenenfalls Puffersubstanzen fermentiert wird. Nach dem
Fermentationsprozeß werden die Lysinoxidasen über einen Zellaufschluß sezerniert, der
nach dem Fachmann bekannten, üblichen Methoden durchgeführt wird. Nach
anschließender Zentrifugation wird die überstehende Lösung durch eine
Ionenaustauschchromatographie mit anschließender Molekularsiebohromatographie und
nachfolgender nochmaliger Ionenaustauschchromatographie aufgereinigt. Hierdurch
können Lysinoxidasen mit einer Reinheit von über 90%, bevorzugt von über 95%,
besonders bevorzugt von über 99% dargestellt werden. Anstelle von
Ionenaustauschchromatographie und Molekularsiebohromatographie kann eine Reinigung
auch durch hydrophobe Chromatographie und Fällungsmethoden erfolgen.
Zur Umsetzung der (Di)Amine in den erfindungsgemäßen Verfahren wird die
Lysinoxidase im allgemeinen in einer Konzentration von 2 bis 20 Units pro mmol Substrat
eingesetzt. 1 Unit wird definiert als die Menge an Enzym, die die Bildung von 1 µmol
H2O2 pro Minute bei 30°C katalysiert.
Als Reduktionsmittel werden im allgemeinen solche Reduktionsmittel eingesetzt, die eine
Durchführung der Reaktion im wäßrigen Medium erlauben. Beispiele hierfür sind die
Alkalimetall- und Erdalkalimetall-borhydride, -triacetoxyborhydride, -cyanoborhydride
und -dithionite. Anstelle der (Erd)Alkalimetallsalze können auch die Übergangs
metallsalze von Übergangsmetallen wie Zink, Eisen, Mangan eingesetzt werden.
Bevorzugt ist der Einsatz von Alkalimetallsalzen, insbesondere von NaBH4. Das
Reduktionsmittel wird im allgemeinen in einer Konzentration ≦ 1 Gew.-%, bevorzugt in
einer Konzentration ≦ 0,5 Gew.-% - bezogen auf die Gesamtmenge an Reaktionsmedium
eingesetzt. Die Gesamtmenge an Reaktionsmedium beinhaltet die Lösung, in der die
Reaktion durchgeführt wird, und gegebenenfalls darin enthaltene Puffersubstanzen,
Substrat, Lysinoxidase und Reduktionsmittel.
Die Reaktion wird im allgemeinen in wäßrigen Lösungen enthaltend Puffersubstanzen
durchgeführt. Als Puffersubstanzen kommen alle diejenigen Puffersubstanzen in Frage, die
einen pH-Bereich von 6,5 bis 7,4, bevorzugt einen pH-Bereich von 6,8 bis 7,2, puffern. Als
Puffersubstanzen kommen als sog. Good'schen Puffer bekannte organische
Puffersubstanzen in Betracht sowie Phosphat-Diphosphat-Puffer. Bevorzugt sind
Puffersubstanzen, die Amino-Gruppen enthalten, sowie (Kalium-/Natrium-)Phos
phat/Diphosphat, besonders bevorzugt ist Trishydroxymethylaminomethan (sog. TRIS-
Puffer). Weitere geeignete Puffersubstanzen, die in dem Bereich zwischen pH 6,5 und pH
7,4 puffern, können den Standard-Nachschlagewerken entnommen werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Reaktionsdurchführung durch Zugabe
des (Di)Amins zu der Lysinoxidase und Reduktionsmittel enthaltenden wäßrigen
Pufferlösung unter Rühren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das
(Di)Amin vorgelegt und die Lysinoxidase und das Reduktionsmittel werden gleichzeitig
unter Rühren zugeben.
Die erwähnten Reduktionsmittel sind meist gelöst oder suspendiert in organischen
Lösungsmitteln wie Glyme (Glykolether), niederen Alkoholen oder Dioxan kommerziell
erhältlich und werden in dieser Form eingesetzt. Es können jedoch auch wäßrige Lösungen
der Reduktionsmittel eingesetzt werden.
Die Zugabe der Reaktanden kann sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich
erfolgen, bevorzugt erfolgt sie diskontinuierlich.
Die Lysinoxidase kann zurückgewonnen werden, z. B. durch Ultrafiltration und
Chromatographie.
Im allgemeinen ist das erfindungsgemäße Verfahren bei Temperaturen zwischen 0 und
60°C durchführbar, bevorzugt zwischen 10 und 40°C, besonders bevorzugt zwischen 20
und 30°C.
Das Verfahren kann sowohl bei Normaldruck als auch bei erhöhtem Druck von bis zu 2 bar
durchgeführt werden, bevorzugt wird es jedoch bei Normaldruck durchgeführt.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen zusätzlich näher erläutert.
3 g/l Malt Extract der Firma Difco,
5 g/l Pepton der Firma Difco,
3 g/l Yeast Extract der Firma Difco und
20 g/l Agar der Firma Difco
wurden auf YM-Agarplatten kultiviert. Die Platten wurden hierfür bei 28°C für 48 Stunden bebrütet und sind danach bei 45°C für mindestens 4 Wochen haltbar.
5 g/l Pepton der Firma Difco,
3 g/l Yeast Extract der Firma Difco und
20 g/l Agar der Firma Difco
wurden auf YM-Agarplatten kultiviert. Die Platten wurden hierfür bei 28°C für 48 Stunden bebrütet und sind danach bei 45°C für mindestens 4 Wochen haltbar.
- 1. 10 g/l Glucose wurden 30 Minuten bei 121°C autoklaviert.
- 2. 0,2 g/l MgSO4.7H2O,
3,0 g/l KH2PO4,
0,2 ml/l einer Salzlösung nach Vishniac & Santer enthaltend 50 g/l Titriplex III, 22 g/l ZnSO4.7H2O, 5,54 g/l CaCl2, 5,06 g/l MnCl2.4H2O, 4,99 g/l FeSO4.7H2O, 1,1 g/l Ammoniumheptamolybdat.4H2O, 1,57 g/l CuSO4.5H2O, 1,61 g/l CoCl2.6H2O und mit KOH auf pH 6,0 eingestellt,
wurden 30 Minuten lang bei 121°C autoklaviert. - 3. 10 ml/l einer Vitaminlösung nach Lodder enthaltend 20 µg/l Biotin, 20 mg/l Calciumpantothenat, 2 µg/l Folsäure, 10 mg/l Inositol, 200 µg/l p- Aminobenzoesäure, 400 µg/l Nicotinsäure, 400 µg/l Pyridoxinhydrochlorid, 200 µg/l Riboflavin und 400 µg/l Thiaminhydrochlorid wurden steril filtriert.
Die Mediumsbestandteile b1) bis b3) wurden nach der Sterilisation vereinigt.
500 ml dieses Fermentationsmediums wurden in einen 1 l Erlenmeyerkolben überführt und
mit jeweils 3 bis 4 Agarplatten enthaltend die Bakterienkultur aus Pichia pastoris (siehe
1.a)) beimpft und 24 Stunden bei 28°C und 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Die nach 1.b) hergestellte Vorkultur wurde in einen 10 l Fermenter überführt und mit
Wasser verdünnt. Durch Zugabe von 50 Vol.%iger wäßriger n-Butylaminlösung wurde
der pH auf ca. 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 28°C und
einer Belüftung von 5 l/min bei 400 Umdrehungen pro Minute für ca. 28 bis 30 Stunden
durchgeführt. Der Zeitpunkt des Fermentationsendes wurde über die Bestimmung der
Absorption bei 600 nm (OD 600; OD = optical density) festgelegt. Der OD 600 der
Fermenterproben wurde gegen Luft als Referenz gemessen und sollte bei 0,9 bis 1,0 liegen.
Zur Aufarbeitung wurde der Fermenterinhalt bei 45°C und 5000 Umdrehungen pro Minute
(ca. 9500 g; g = Erdbeschleunigung) für 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende
Lösung wurde abgenommen und der Rückstand mit 250 ml 50 mmolarer Kaliumphosphat
diphosphat-pufferlösung gewaschen und erneut zentrifugiert. Die überstehende Lösung
wurde erneut abgenommen und die im Rückstand verbleibende Zellmasse bei -15°C im
Tiefkühlschrank gelagert.
18 ml der bei -20°C gelagerten und aufgetauten Zellmasse von Pichia pastoris wurden mit
einer Pufferlösung enthaltend 20 mmol/l Natriumphosphat und 1 mmol/l Ethanolamin (pH
7,0) auf 50 ml verdünnt. Zu dieser Lösung wurden 50 ml Glasperlen mit einem
Durchmesser von 0,5 mm zugegeben und das Ganze wurde 30 Minuten bei 5000
Umdrehungen pro Minute und 0°C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über Gaze
filtriert. Das Filtrat wurde 10 Minuten bei 8000 Umdrehungen pro Minute und 4°C
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen.
Der abgenommene Überstand wurde mit NaOH auf pH 7,0 gebracht und auf eine Q-
Sepharose-Fast-Flow-Säule der Firma Pharmacia mit einem Durchmesser von 5 cm, einer
Höhe von 13 cm und einem Volumen von 250 ml aufgetragen. Nach dem Auftrag wurde
die Säule mit 600 ml der Lösung A gewaschen. Lösung A enthält Natriumphosphat in
einer Konzentration von 20 mmol/l und Ethanolamin in einer Konzentration von 1 mmol/l.
Lösung B enthält Natriumphosphat in einer Konzentration von 20 mmol/l, Ethanolamin in
einer Konzentration von 1 mmol/l und NaCl in einer Konzentration von 1 mol/l. Eluiert
wurde mit einem linearen Gradienten von 11 Lösung A und 11 Lösung B. Die aktiven
Fraktionen wurden gesammelt.
Die aktiven Fraktionen wurden über einen 10 kDa-Omega-Filter filtriert (Ultrafiltration)
und über eine präparative Superdex-Säule der Firma Pharmacia mit einem Durchmesser
von 2,6 cm, einer Länge von 60 cm und einem Volumen von 320 ml getrennt. Als
Laufmittel wurde eine Lösung, enthaltend 20 mmol/l Natriumphosphat-/Natrium
diphosphat-Puffer, 150 mmol/l NaCl und 1 mmol/l Ethanolamin mit einem pH von 7,5
verwendet. Das Laufmittel wurde in einer Geschwindigkeit von 3 ml/min über die Säule
gegeben. Die aktiven Fraktionen wurden mit dem unter 2.d) beschriebenen Verfahren
bestimmt und vereinigt.
Die unter 2.b) erhaltenen und vereinigten aktiven Fraktionen wurden erneut durch
Chromatographie an einer Mono-Q-HR5/5-Säule der Firma Pharmacia gereinigt. Als
Laufmittel diente ein Gemisch aus Lösung A und Lösung B. Dieses wurde mit einer
Geschwindigkeit von 1 ml/min über die Säule gegeben und es wurden 100 Fraktionen zu je
1 ml gesammelt. Die aktiven Fraktionen wurden ebenfalls mit dem unter 2.d)
beschriebenen Verfahren bestimmt und vereinigt. Die Lysinoxidase eluierte als aktives
Hauptprotein. Das Protein hatte im SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen, beispiels
weise durch Zugabe von β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, ein Molekulargewicht von
ca. 121000 Da.
Zur Bestimmung der aktiven Fraktionen, also der Aktivität der Lysinoxidase, wurde die
Umsetzung von Benzylamin zu Benzaldehyd in Gegenwart von Lysinoxidase ausgenutzt.
Benzaldehyd ist UV-aktiv und läßt sich bei 250 nm detektieren. Ein Aliquot der unter 2.a)
bis 2.c) gesammelten Fraktionen wurde jeweils mit 3 mmol Benzylamin in einem
Phosphat-Dihydrogenphosphat-Puffer für 1 bis 5 Stunden inkubiert. Die so erhaltene
Lösung wurde unter Verwendung einer Li-Chrosorb 5RP C18-Chromatographiesäule der
Fa. Merck in einer HPLC-Anlage analysiert. Als Laufmittel A wurde Wasser enthaltend
0,1 Vol.% Trifluoressigsäure und als Laufmittel B Acetonitril enthaltend 0,1 Vol.% Tri
fluoressigsäure verwendet.
Die Menge an entstandenem Benzaldehyd wurde über eine Eichkurve (1-100µmol)
ermittelt.
Beim Edman-Abbau der Lysinoxidase aus Pichia pastoris wurde eine aminoterminale
Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO 1 (s. Sequenzprotokoll) erhalten. Durch proteoly
tischen Abbau der Lysinoxidase aus Pichia pastoris mit Trypsin wurden Teilsequenzen
SEQ ID NO 2 bis 12 (s. Sequenzprotokoll) erhalten.
Als Substrate wurden L-Lysin-Monohydrochlorid (für biochemische Zwecke, 99% der
Firma Merck), Ethanolamin der Firma BASF AG, Glycinethylester, 1,8-Diaminooctan der
Firma Aldrich, n-Butylamin der Firma BASF AG, 1,4-Diaminobutan der Firma BASF AG,
Ethylendiamin der Firma BASF AG, Spermin der Firma Aldrich, 3-Aminomethylpyridin
der Firma Aldrich, Benzylamin der Firma Aldrich, L-(+)-Ornithin-Hydrochlorid (99% der
Firma Aldrich) sowie 1,6-Diaminohexan der Firma BASF AG eingesetzt.
In einer Mikrotiterplatte wurden jeweils Meßreihen mit einer Konzentration von 1200,
600, 300, 150, 75, 37,5 und 18,75 µmol (Di)Amin pro 1 l Wasser durchgeführt. Es wurden
jeweils 2 Meßreihen durchgeführt: eine mit Enzym und eine ohne Enzym als Referenz.
Es wurden jeweils 100 µl der verdünnten Lösungen genommen. Zu dieser Lösung wurden
25 µl Lysinoxidase sowie 40 µl 35 mmolarer Phenollösung in 200 mmolarer
Kaliumphosphat-Kaliumdiphosphatlösung mit einem pH von 7,5, 40 µl einer 2 mmolaren
wäßrigen 4-Aminoantipyrin-Lösung und 40 µl einer Lösung von 0,35 mg Peroxidase
(Horseradish der Firma Sigma) in 1 ml Wasser gegeben.
In der Referenz-Meßreihe wurden die 25 µl Lysinoxidase durch 25 µl Wasser ersetzt.
Durch den bei der Umsetzung der Substrate entstandenen Ammoniak wurde ein violetter
Farbstoff gebildet, dessen Absorption im UV bei 500 nm gemessen wurde (T. Uwajima, O.
Terada, Methods in Enzymology 1982, 89, 243 ff.).
Die relativen Umsatzgeschwindigkeiten der Substrate im Vergleich zu L-Lysin sind
Tabelle 1 zu entnehmen.
Es zeigte sich, daß sich sowohl (un)substituierte aliphatische Amine und Diamine als auch
Aminosäuren und deren Derivate in Gegenwart von Lysinoxidase umsetzen lassen.
Erstaunlicherweise ist bei einigen Substraten die Umsatzgeschwindigkeit gegenüber L-
Lysin teilweise erhöht. Der Einsatz von Derivaten des Lysins und Ornithins ist besonders
im Hinblick auf die Darstellung von Piperidin-2-carbonsäure- und Prolin-derivaten
interessant.
Um die Toleranz der Lysinoxidasen gegenüber Reduktionsmittel zu testen, wurde
beispielhaft die Meßreihe mit L-Lysin unter Verwendung der Lysinoxidase aus Pichia
pastoris in Gegenwart von 0,001 Gew.-%, 0,01 Gew.-%, 0,1 Gew.-%, 0,5 Gew.-% und 1 Gew.-%
NaBH4 - bezogen auf die Gesamtmenge der Substratlösung - wiederholt. Die
Ergebnisse sind Tabelle 2 zu entnehmen.
Es zeigte sich, daß die Aktivität der Lysinoxidase bis zu einer Konzentration von 0,1 Gew.-%
NaBH4 nahezu unverändert blieb. Bei Konzentrationen von ≧ 0,5 Gew.-% NaBH4
nahm die Aktivität aufgrund der Erhöhung des pH-Wertes ab. Relativ gute Umsätze
wurden noch bis zu einer NaBH4-Konzentration von 1 Gew.-% erzielt. In den weiteren
Versuchen wurden daher jeweils 1 Gew.-% NaBH4 - bezogen auf die Gesamtmenge der
Substratlösung - eingesetzt.
50 ml einer - in Gegenwart von Lysinoxidase umgesetzten - 1,2 mmolaren L-Lysinlösung
wurde zur Trockene eingeengt, in der fünffachen Menge Ethanol aufgenommen, mit 1
Tropfen konzentrierter Schwefelsäure versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Nach Abdestillieren des Ethanols im Vakuum wurde der Rückstand mit einem
Überschuß an Triethylamin und Chlorameisensäurebenzylester versetzt und 3 h bei
Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach Zugabe von Wasser wurden die N-Benzyl
oxycarbonylderivate mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde per
Massenspektrometrie und NMR charakterisiert. Die erhaltenen Spektren entsprachen
denen authentischer Proben von Piperidin-2-carbonsäure.
Die anderen Substratlösungen wurden analog aufgearbeitet.
Claims (8)
1. Verfahren zur Umsetzung von Aminen der allgemeinen Formel (I)
mit A- in der Bedeutung von
zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III)
mit B- in der Bedeutung von HO-CH2-R3- oder R4-
enthaltend die folgenden Schritte:
wobei R5 für H oder lineares C1-C6-Alkyl und R6 für lineares C1-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl stehen,
und R2 = H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I)
R3 ein - gegebenenfalls mit linearem C1-C6-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, C6-C10-Aryl, C4-C10-Heteroaryl und/oder CO2R6 substituierter und/oder nicht- benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0-C1- oder C5- C18-Kohlenwasserstoffrest ist und
R4 für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R6 substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthal tenden - linearen C1-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.
mit A- in der Bedeutung von
zu Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (III)
mit B- in der Bedeutung von HO-CH2-R3- oder R4-
enthaltend die folgenden Schritte:
- a) Oxidation mindestens einer
eines Amins der allgemeinen Formel (I) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; - b) gegebenenfalls Reaktion der zweiten NH2-Gruppe eines Amins der
allgemeinen Formel (I) mit
mit der nach a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin; - c) Reduktion der nach a) entstandenen Carbonylgruppe(n) bzw. des nach b) gegebenenfalls entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen bzw. zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II),
wobei R5 für H oder lineares C1-C6-Alkyl und R6 für lineares C1-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl stehen,
und R2 = H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Eintopfverfahren durchgeführt wird, Lysinoxidase und Reduktionsmittel nebeneinander vorliegen und
in der Definition von A in der allgemeinen Formel (I)
R3 ein - gegebenenfalls mit linearem C1-C6-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, C6-C10-Aryl, C4-C10-Heteroaryl und/oder CO2R6 substituierter und/oder nicht- benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0-C1- oder C5- C18-Kohlenwasserstoffrest ist und
R4 für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R6 substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthal tenden - linearen C1-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.
2. Verfahren zur Herstellung von cyclischen sekundären Aminen der allgemeinen
Formel (II) aus Diaminen der allgemeinen Formel der allgemeinen Formel (Ia)
wobei R1 NR5 oder ein - gegebenenfalls mit CO2H, CO2R6, OH, SH und/oder N(R5)2 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C2-C6-Kohlenwasserstoffrest ist,
wobei R5 für H oder lineares C1-C6-Alkyl und R6 für lineares C1-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl stehen,
und R2 = H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
enthaltend die folgenden Schritte:
wobei R1 NR5 oder ein - gegebenenfalls mit CO2H, CO2R6, OH, SH und/oder N(R5)2 substituierter und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - linearer bivalenter C2-C6-Kohlenwasserstoffrest ist,
wobei R5 für H oder lineares C1-C6-Alkyl und R6 für lineares C1-C6-Alkyl oder verzweigtes C3-C6-Alkyl oder C6-C10-Aryl stehen,
und R2 = H, CO2H, CO2R6 oder CN ist,
enthaltend die folgenden Schritte:
- a) Oxidation einer der beiden
eines Diamins der allgemeinen Formel (Ia) zu einer Carbonylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator; - b) Reaktion der zweiten NH2-Gruppe des Diamins der allgemeinen Formel (Ia) mit der gemäß Schritt a) entstandenen Carbonylgruppe unter Cyclisierung zu einem Enamin oder Imin;
- c) Reduktion des nach b) entstandenen Enamins oder Imins mit einem Reduktionsmittel zu einem cyclischen sekundären Amin der allgemeinen Formel (II);
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diamin der
allgemeinen Formel (Ia) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lysin,
Ornithin und 1,6-Diaminohexan.
4. Verfahren zur Herstellung von Diolen der allgemeinen Formel (IIIa) aus Diaminen
der allgemeinen Formel (Ib)
enthaltend die folgenden Schritte:
R3 ein - gegebenenfalls mit linearem C1-C6-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, C6-C10-Aryl, C4-C10-Heteroaryl und/oder CO2R6 substituierter und/oder nicht- benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0-C1- oder C5- C18-Kohlenwasserstoffrest ist.
enthaltend die folgenden Schritte:
- a) Oxidation der beiden Aminomethylgruppen eines Diamins der allgemeinen Formel (Ib) zu Formylgruppen in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator;
- b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppen mit einem Reduktionsmittel zu Hydroxymethylgruppen unter Bildung eines Diols der allgemeinen Formel (IIIa);
R3 ein - gegebenenfalls mit linearem C1-C6-Alkyl oder verzweigtem C3-C6-Alkyl, C6-C10-Aryl, C4-C10-Heteroaryl und/oder CO2R6 substituierter und/oder nicht- benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltender - bivalenter C0-C1- oder C5- C18-Kohlenwasserstoffrest ist.
5. Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen R4-CH2-OH aus Aminen
R4-CH2-NH2 enthaltend die folgenden Schritte:
R4 für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R6 substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen C1-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.
- a) Oxidation der Aminomethylgruppe eines Amins R4-CH2-NH2 zu einer Formylgruppe in Gegenwart einer Lysinoxidase als Katalysator;
- b) Reduktion der nach a) entstandenen Formylgruppe mit einem Reduktionsmittel zu einer Hydroxymethylgruppe unter Bildung eines primären Alkohols R4-CH2-OH;
R4 für einen - gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen wie CO2H und/oder CO2R6 substituierten und/oder nicht-benachbarte O-, S- und/oder N-Atome enthaltenden - linearen C1-C20-Kohlenwasserstoffrest steht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Lysinoxidase aus einer Hefe eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lysinoxidase aus
Pichia pastoris eingesetzt wird.
8. Verwendung einer Lysinoxidase in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1
bis 7.
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