DE1011641B

DE1011641B - Method for the treatment of parts of plants for the detection of infestation with viruses

Info

Publication number: DE1011641B
Application number: DEH23024A
Authority: DE
Inventors: Dr Ursula Heilmann
Original assignee: URSULA HEILMANN DR
Current assignee: URSULA HEILMANN DR
Priority date: 1955-02-17
Filing date: 1955-02-17
Publication date: 1957-07-04

Description

Verfahren zur Behandlung von Pflanzenteilen zum Nachweis des Befalls mit Virosen Die Erfindung betrifft die Behandlung von Pflanzenteilen, wie Stengel, Blätter, insbesondere Knollen. Method for the treatment of parts of plants for the detection of the infestation with viroses The invention relates to the treatment of parts of plants, such as stems, Leaves, especially tubers.

Zweck der Erfindung ist, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Möglichkeit bietet, Erscheinungsformen oder -veränderungen in der Zellwand oder im Plasma durch Anfärbung sichtbar zu machen. Die Erfindung bezweckt vor allem, Virosen in Pflanzenteilen, namentlich die Blattrollkrankheit der Kartoffel, nachzuweisen. The purpose of the invention is to provide a method which offers the possibility of manifestations or changes in the cell wall or to make them visible in the plasma by staining. The main purpose of the invention is Detect viroses in parts of plants, namely leaf roll disease of the potato.

Die Erreger von Viruskrankheit lassen sich nur schwer nachweisen; ihre Größe liegt weit unterhalb der Grenze des Auflösungsvermögens der gewöhnlichen Mikroskope. The causative agents of viral disease are difficult to detect; their size is far below the limit of the resolution of the ordinary Microscopes.

Der Nachweis des Blattrollvirus gelingt durch den Augenstecklingstest, eine Methode, die vielfach angewandt wird, aber sehr zeitraubend ist. The leaf roll virus is detected by the eye cuttings test, a method that is used many times, but is very time consuming.

Weiterhin ist aus der Literatur bekannt (Beitrag zum frühzeitigen Nachweis der Blattrollkrankheit der Kartoffel durch Anfärbung des Phloems,- abgedruckt in Festschrift Appel Biol. Zentralanstalt 1947) der Fuchsintest mit einer Fuchsinlösung (Diamantfuchsin DAB 6). Furthermore, it is known from the literature (contribution to the early Evidence of leaf roll disease in potatoes by staining the phloem, - printed in Festschrift Appel Biol. Zentralanstalt 1947) the fuchsin test with a fuchsin solution (Diamantfuchsin DAB 6).

Fuchsin färbt alle Zellwände (von gesunden und kranken Pflanzen) intensiv rot und außerdem den Inhalt vereinzelter Phloemzellen in Stengeln und Blättern blattrollkranker Kartoffelpflanzen. Man muß hierbei in Querschnitten die sehr englumigen Zellen mit gefärbtem Plasma als Symptom für Blattroll suchen. Täuschungen sind bei diesem Test leicht möglich. Deshalb ist das Verfahren für den modernen Zuchtbetrieb mit vielen Serienuntersuchungen wenig geeignet.Fuchsin stains all cell walls (of healthy and diseased plants) intensively red and also the contents of isolated phloem cells in the stems and leaves of leaf roll sickness Potato plants. You have to include the very narrow cells in cross-sections look for colored plasma as a symptom of leaf roll. There are delusions in this test easily possible. That is why the procedure is for the modern farm with many Serial examinations are not very suitable.

Ferner wird in der gleichen Arbeit auch über die Anwendung der in neuerer Zeit eingeführten fluoreszenzmikroskopischen Analyse zum Nachweis des Blattrollvirus berichtet. Hierfür bedient man sich der Doppelfärbung zweier Fluorochrome, nämlich von Rhodamin B und Coriphosphin. In diesem Zusammenhang wird auch die Anfärbung an kranken Mutterknollen stark anfälliger Frühsorten erwähnt. The same work also discusses the application of the in recently introduced fluorescence microscopic analysis for the detection of leaf roll virus reported. For this purpose, the double coloration of two fluorochromes is used, namely of rhodamine B and coriphosphine. In this context, the staining is also used mentioned on sick tubers of highly susceptible early varieties.

Eine Nachprüfung dieser Versuche zeigte, daß die Anfärbung der Zellwände mit Rhodamin und Coriphosphin zwar reproduzierbar ist, jedoch technische Schwierigkeiten macht. A check of these experiments showed that the staining of the cell walls with rhodamine and coriphosphine is reproducible, but there are technical difficulties power.

Untersucht wurde auch das von Strugger vorgeschlagene Fluorochrom Akridinorange (Strugger: »Die Vitalfluorochromierung des Protoplasmas, abgedruckt in »Naturwissenschaften(( 34, 1947, S. 267 bis 273). In Phloemsträngen, die längs im Blickfeld lagen und den Blattrollvirus enthielten, trat nach Behandlung mit diesem Farbstoff folgende Fluoreszenzerscheinung auf: An einzelnen Zellen des Bündels konnte man die Tüpfel der Wand leuchtend grünlich schimmernd auf dunklem, rotem oder grünlichem Grund erkennen. The fluorochrome proposed by Strugger was also examined Acridine orange (Strugger: »The vital fluorochroming of the protoplasm, printed in »Natural Sciences ((34, 1947, pp. 267 to 273). In phloem strands, the lengthways were in view and contained the leaf roll virus, occurred after treatment with this Dye shows the following fluorescence appearance: On individual cells of the bundle the pits of the wall shimmer bright green on dark, red or greenish ones Recognize the reason.

Die Anfärbungen nach den Literaturangaben sind offenbar an die Zellwände gebunden. The staining according to the literature is apparently on the cell walls bound.

Weder der eine noch der andere Anfärbetest sind für die Bedürfnisse der Praxis ausreichend, weil sie bei der Kleinheit der Phloemzellen bzw. der relativ schwachen Fluoreszenz zu hohe Anforderungen an den Beobachter stellen. Neither one nor the other staining test is for needs In practice it is sufficient because the small size of the phloem cells or the relative weak fluorescence make too high demands on the observer.

Es wurde daher versucht, auf normale Farbstoffe und normales Licht auszuweichen, um den Zellinhalt wie beim Fuchsintest anzufärben. Zur Verbesserung dieses Testes mußten solche Farbstoffe ausfindig gemacht werden, welche nicht die Zellwände, wohl aber das kranke Plasma anfärben. Nun gibt es zwar viele Farbstoffe, welche die Zellwände färben, aber keinen Farbstoff, der lebendes Plasma anzufärben vermag (vgl. hierzu Strugger, a. a. O.). An attempt was therefore made to use normal dyes and normal light to avoid staining the cell contents as in the fuchsin test. For improvement In this test, those dyes had to be found which were not the Stain cell walls, but probably the diseased plasma. Now there are many dyes, which stain the cell walls, but no dye to stain living plasma able (cf. Strugger, op. cit.).

Für die Lösung des Problems war die eigene Erkenntnis auf Grund eigener Beobachtungen von Bedeutung, daß man Protoplasma von Pflanzenzellen mit scheinbar normaler Struktur kurz vor dem Tode, etwa bei Wundreiz, intensiv anfärben kann. In Weiterführung dieser Erkenntnis wurde angenommen, daß eine Behandlung von Pflanzenteilen mit Fluorochromen durch deren photodynamische Wirkung eine erhebliche Schädigung des Plasmas oder zumindest der den veränderten Zellwänden benachbarten Plasmateile zur Folge hat und daher die Aufnahmebereitschaft des Plasmas für bei normalem Licht sichtbare Farbstoffe erhöhen dürfte. Mit anderen Worten: Es wurde angenommen, daß man durch Behandlung der Pflanzenteile, insbesondere auch von Knollen, eine leichtere Anfärbbarkeit erzwingen könnte. Diese Vermutung hat sich bestätigt und führte zur Entwicklung des Verfahrens, das den Gegenstand vorliegender Erfindung bildet, nämlich die Pflanzenteile mit einer Lösung eines oder mehrerer Fluorochrome sowie mit der Lösung eines oder mehrerer bei normalem Licht sichtbarer Farbstoffe zu behandeln. Als normale Farbstoffe kommen Vitalfarbstoffe, namentlich basische Vitalfarbstoffe, in Betracht, d. h. solche, welche die Pflanzenzellen nicht oder wenigstens nicht so stark ändern, daß der Tod eintritt, zweckmäßig solche Farbstoffe, die normale Zellwände nicht oder kaum anfärben. Die Fluorochromlösung und die Lösung eines normalen Farbstoffes können miteinander gemischt oder nacheinander auf die Pflanzenteile zur Einwirkung gebracht werden. For the solution of the problem, one's own knowledge was based on one's own Observations of importance that one can apparently use protoplasm of plant cells normal structure shortly before death, for example in the case of irritation, can stain intensely. In continuation of this knowledge it was assumed that a treatment of plant parts with fluorochromes cause considerable damage due to their photodynamic effect of the plasma or at least of the plasma parts adjacent to the changed cell walls and therefore the readiness of the plasma to accept normal light visible dyes are likely to increase. In other words, it was assumed that by treating the parts of the plant, especially the tubers, a lighter one Could enforce colorability. This assumption has been confirmed and led to Development of the method which forms the subject of the present invention, namely the plant parts with a solution of one or more fluorochromes as well as with the To treat a solution of one or more dyes visible in normal light. As normal dyes come vital dyes, namely basic vital dyes, in Consideration, d. H. those which the plant cells do not or at least not change so strongly that death occurs, appropriately such dyes, that do not or hardly stain normal cell walls. The fluorochrome solution and the solution a normal dye can be mixed with each other or sequentially on the Plant parts are brought to action.

Vor der Anwendung der Fluorochromlösung bzw. gleichzeitig mit der Fluorochromlösung kann ein Agens auf die Pflanzenteile zur Einwirkung gebracht werden, welches die Anfärbbarkeit erhöht. Hierfür eignen sich Kaliumchlorid oder andere auf die Hydratation einwirkende Substanzen, ferner Narkotika wie Äthylalkohol. Before using the fluorochrome solution or at the same time as the Fluorochrome solution, an agent can be brought to act on the parts of the plant, which increases the dyeability. Potassium chloride or others are suitable for this Substances that affect hydration, as well as narcotics such as ethyl alcohol.

Beispiele 1. Eine Mischlösung, die 0,005010 Akridinorange, 3, 6-Tetramethyldiaminoakridin (Fa. Merck, Darmstadt), 0,01 01o Bordeauxrot, Natriumsalz der a-Naphthylaminoazo-2-Naphthol-3, 6-Disulfosäure bzw. der a-Naphthylaminoazo-j-Naphtholdisulfosäure (Fa. Merck, Darmstadt) und 0,3 Mol Kaliumchlorid enthält, wird mit einem pH von 3,7 bis 4,0 zum Nachweis einer Virusinfektion auf die zu prüfenden Pflanzenteile, z. B. vollausgereifte Kartoffelknollen, zur Einwirkung gebracht. Die Farblösung darf nicht zu dunkel sein, weil die Knollenschnitte während der Färbung belichtet werden müssen, und zwar am besten mit UV-Licht, um eine Rotfärbung in etwa 15 Minuten zu erreichen. Viruskranke Knollen zeigen in einer Reihe von Phloembündeln einzelne Zellen, zuweilen nur eine Zelle, die bei Längsaufsicht dunkelrot gefärbt erscheinen; diese heben sich sehr klar von den praktisch ungefärbten Nachbarzellen ab. Examples 1. A mixed solution containing 0.005010 acridine orange, 3,6-tetramethyldiaminoacridine (Merck, Darmstadt), 0.01 01o Bordeaux red, sodium salt of α-naphthylaminoazo-2-naphthol-3, 6-disulfonic acid or a-naphthylaminoazo-j-naphthol disulfonic acid (Merck, Darmstadt) and contains 0.3 moles of potassium chloride, a pH of 3.7 to 4.0 is used for detection a virus infection on the parts of the plant to be tested, e.g. B. fully ripened potato tubers, brought to action. The color solution must not be too dark, because the bulbous cuts need to be exposed during the dyeing process, preferably with UV light to reach a red color in about 15 minutes. Virus-infected tubers show in one Series of phloem bundles - individual cells, sometimes only one cell, when viewed longitudinally appear dark red colored; these stand out very clearly from the practically uncolored ones Neighboring cells.

Zweckmäßig arbeitet man zur Orientierung mit einer Vergrößerung, bei der man gerade noch die langgestreckten Phloemzellen als rote »Strichel« erkennen kann, und wählt hierfür ein schwach vergrößerndes Objektiv und ein stark vergrößerndes Okular. Zum Nachprüfen wird ein stärkeres Objektiv benutzt. It is advisable to work with a magnification for orientation, where you can just recognize the elongated phloem cells as red "lines" can, and for this purpose selects a low-magnification lens and a high-magnification lens Eyepiece. A stronger lens is used for checking.

2. Eine Mischlösung, die 0,01°/o Akridinorange sowie 0,008 01o Auramin (Chlorhydrat des Tetramethyldiaminobenzophenonimid), 0,04°/0 Bordeauxrot, 0,6 Mol Kaliumchlorid, 0,03 Mol Aluminiumchlorid, 4 Mol Harnstoff, 0,5 01o Äthylalkohol enthält, wird auf einen pH von eiswa 3,7 mit Salzsäure eingestellt und zum Nachweis einer Virusinfektion an Kartoffelknollen (dünne Schnitte mit Leitbündeln) verwendet. Während der Färbung wird mit UV-Licht 15 Minuten lang belichtet. Die Färbung wird klarer, wenn man die Färbung in zwei Stufen ausführt, zunächst mit beiden Fluoreszenzfarben + KCI + AlCl3 + Harnstoff + Alkohol bei pH 3,7 und 15 Minuten langer Bestrahlung mit UV-Licht; sodann wird mit Bordeauxrot und K Cl bei pR 3,7 ohne Bestrahlung etwa 8 Minuten lang nachgefärbt. 2. A mixed solution containing 0.01% acridine orange and 0.008 01o auramine (Chlorohydrate of tetramethyldiaminobenzophenonimide), 0.04% Bordeaux red, 0.6 mol Potassium chloride, 0.03 moles aluminum chloride, 4 moles urea, 0.5010 ethyl alcohol contains, is adjusted to a pH of around 3.7 with hydrochloric acid and used for detection virus infection on potato tubers (thin sections with vascular bundles). During the dyeing process, exposure to UV light is carried out for 15 minutes. The coloring will clearer if the staining is carried out in two stages, first with both fluorescent colors + KCI + AlCl3 + urea + alcohol at pH 3.7 and irradiation for 15 minutes with UV light; then with Bordeaux red and K Cl at pR 3.7 without irradiation about Post-stained for 8 minutes.

Es können sich im Phloem oder den Geleitzellen danach anfärben: a) die Phloemzelle, daß sie in Aufsicht langgestreckt rot erscheint; b) nur ein Ende der sonst ungefärbten Phloemzelle, so lang, wie die Zelle breit ist; c) eine Partie des Plasmas, scharf umgrenzt etwa wie eine Plastide; d) Zellkerne. It can then stain in the phloem or the escort cells: a) the phloem cell so that it appears elongated red when viewed from above; b) only one end the otherwise unstained phloem cell, as long as the cell is wide; c) a game of the plasma, sharply delineated like a plastid; d) cell nuclei.

Es gibt oft mehrere dieser Symptome in einem Schnitt. There are often several of these symptoms in one cut.

Sie lassen sich den verschiedenen Viren wie folgt zuordnen: Bei Befall mit Blattrollvirus können die Phloemzellen wie a) gefärbt sein. Sie sind dann stark gequollen.They can be assigned to the various viruses as follows: When infected with leaf roll virus the phloem cells can be stained like a). You are strong then swollen.

Dieses Zeichen für Blattroll tritt jedoch fast nur auf bei Pflanzen, die im Jahr vorher gesund waren. An sekundärkranken Pflanzen tritt die Färbung meist nach b) auf.However, this sign for leaf roll occurs almost only in plants, who were healthy the year before. The coloring usually occurs on secondary disease plants according to b).

Auch dann ist die gefärbte Partie stark gequollen.Even then, the colored area is severely swollen.

Sehr ähnlich sind die Symptome bei Befall mit Bukettvirus. Die Anfärbung nach Modus a) ist häufig. Die Färbung nach b) tritt ebenfalls oft auf, jedesmal schwächer gequollen als bei Blattrollvirus. Symptoms for an infestation with bouquet virus are very similar. The staining after mode a) is common. The coloration according to b) also occurs often, every time less swollen than leaf roll virus.

Bei mit X-Virus befallenen Knollen sind »Plastiden« nach Modus c) gefärbt und schwach gequollen. In the case of tubers infected with the X virus, »plastids« according to mode c) colored and slightly swollen.

Die Symptome a), b) und c) treten noch in anderer Form auf, indem sie durch verschiedene Quellung von den eben beschriebenen mehr oder minder gut unterscheidbar sind, wobei die Zugehörigkeit zu bestimmten Viren noch nicht sicher geklärt ist. So dürfte das Symptom für Y-Virus wie a) sein, nur ungequollen. Ein dem X-Virus ähnliches Symptom dürfte dem A-Virus zuzuschreiben sein. Symptoms a), b) and c) appear in another form by they are more or less good due to different swelling from those just described are distinguishable, whereby the affiliation to certain viruses is not yet certain is clarified. So the symptom for Y-Virus should be like a), only unswollen. A Symptom similar to the X virus is likely to be attributed to the A virus.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the treatment of plant parts for Detection of virus infestation using fluorochromes, characterized in that that the plant parts with the solution of one or more fluorochromes and then be treated with the solution of one or more vital pigments.

2. The method according to claim 1, characterized in that a basic Vital dye is applied in acidic solution.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Fluorochrome solution and the vital dye solution can be used mixed together.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that before Application of the fluorochrome solution or dissolved at the same time as the fluorochrome solution Substances like potassium chloride, which affect hydration, or narcotics like Ethyl alcohol are brought into action.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized by the use of acridine orange, 3, 6-tetramethyldiaminoakridine, as fluorochrome and bordeaux red, Sodium salt of a-naphthylaminoazo-2-naphthol-3, 6-disulfonic acid or of a-naphthylaminoazo-XF-naphthol disulfonic acid, as a vital pigment.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the Plant parts are irradiated with UV light during the staining process.