DE10113781A1

DE10113781A1 - Synthetische Spinnenseidenproteine und deren Expression in transgenen Pflanzen

Info

Publication number: DE10113781A1
Application number: DE10113781A
Authority: DE
Inventors: Juergen Scheller; Udo Conrad; Frank Grose; Karl-Heinz Guehrs
Original assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kult De
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2001-12-13
Also published as: ATE478953T1; DE50115604D1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, rekombinante Spinnenseidenproteine, die durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodiert sind, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die rekombinantes Spinnenseidenprotein enthalten sowie transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von pflanzlichem Spinnenseidenprotein aus transgenen Pflanzen sowie pflanzliche Spinnenseidenproteine, die nach einem derartigen Verfahren hergestellt worden sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, rekombinante Spinnenseidenproteine, die durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodiert sind, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die rekombinantes Spinnenseidenprotein enthalten sowie transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von pflanzlichem Spinnenseidenprotein aus transgenen Pflanzen sowie pflanzliche Spinnenseidenproteine, die nach einem derartigen Verfahren hergestellt worden sind.
RN : MH : uh

Spinnenseide weist hervorragende mechanische Eigenschaften auf, die jene vieler bekannter natürlicher und künstlicher Materialien übertrifft. Hauptbestandteile der Spinnenseide sind Faserproteine wie beispielsweise Fibroin aus dem Seidenspinner sowie Spidroin 1 und Spidroin 2 aus Nephila clavipes. Die Festigkeit und Elastizität der Seide beruht auf der Gegenwart von kurzen repetitiven Aminosäure-Einheiten, die in diesen natürlichen Proteinen vorliegen. Diese mechanischen Eigenschaften prädestinieren die Spinnenseide für eine Reihe von verschiedensten technischen Anwendungen wie beispielsweise die Herstellung von stabilen Fäden bzw. Seiden. Ferner verfügen die Spinnenseidenfäden aufgrund ihrer proteinchemischen Eigenschaften über ein geringes immunogenes und allergenes Potential, weshalb sich in Kombination mit den mechanischen Eigenschaften eine Anwendung in der Medizin beispielsweise als natürliches Garn zum Vernähen von Wunden, als Anheftungsflächen für kultivierte Zellen, als Gerüste für künstliche Organe und dergleichen anbietet.

Voraussetzung für eine derartige technische bzw. medizinische Nutzung der Spinnenseide ist jedoch die Herstellung von Spinnenfäden bzw. Spinnenseidenproteinen in großem Maßstab. Zu diesem Zweck wurde bislang versucht, die für die Produktion der Spinnenseide verantwortlichen Spidroin- bzw. Fibroingene in E. coli zu exprimieren. Die sich häufig wiederholenden Sequenzen in den entsprechenden Genen gehen jedoch bei der Reproduktion in Bakterien nach und nach verloren. Ein weiteres Problem ist die Größe der genetischen Information, die für das Bakterium zu umfangreich zu sein scheint, so daß die Spinnenseiden- Gene nicht immer vollständig ausgelesen werden.

Versuche der Expression in Hefezellen ergaben zwar stabilere und längere Seidenproteine, die Fäden, die daraus gesponnen wurden, weisen jedoch nicht die selben vorteilhaften Eigenschaften der natürlichen Seide auf, so daß beispielsweise eine medizinische Anwendung einer derart synthetisch hergestellten Seide nicht möglich ist. Es besteht somit ein Bedarf an synthetischen Seidenproteinen, die in technischem Maßstab hergestellt werden können und nach dem Verspinnen zu Fäden mechanische Eigenschaften aufweisen, die mit jenen der natürlichen Seide vergleichbar sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodieren, das eine möglichst große Ähnlichkeit mit den bisher bekannten natürlichen Sequenzen von Faserproteinen der Spinnenseide aufweist. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem synthetische Spinnenseidenproteine in großem Maßstab hergestellt werden können.

Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Oben genannte Aufgaben werden durch die Merkmale der unabhängigen Schutzansprüche gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird jetzt eine DNA-Sequenz offenbart, die für ein synthetisches Faserprotein, insbesondere ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, das eine mindestens 80%ige, vorzugsweise mindestens 84%ige, mehr bevorzugt mindestens 88%ige, besonders bevorzugt mindestens 90%ige und 92%ige, am meisten bevorzugt mindestens 94%ige Homologie zu Spidroin- und/oder Fibroin-Proteinen, insbesondere zu dem Spidroin 1-Protein, besonders bevorzugt zu dem Spidroin 1-Protein aus Nephila clavipes aufweist.

Homologie bedeutet im Rahmen dieser Erfindung Ähnlichkeit zwischen Aminosäure sequenzen aufgrund von identischen bzw. homologen Aminosäurebausteinen. Welche Aminosäuren als homolog anzusehen sind, ist dem Fachmann bekannt, z. B. (i) Isoleucin, Leucin und Valin untereinander, (ii) Asparagin und Glutamin, (iii) Asparaginsäure und Glutaminsäure.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ist aus Modulen aufgebaut, die eine Gruppe von aneinandergereihten Oligonukleotidsequenzen umfassen, wobei die Oligonukleotidsequenzen jeweils für repetitive Einheiten aus Spidroin- und/oder Fibroin-Proteinen kodieren.

Der Aufbau der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz aus verschiedenen Modulen, welche wiederum aus unterschiedlichen, für Spidroine bzw. Fibroine typischen kurzen Aminosäure- Repeats konstruiert sind, wobei sich das Prinzip der Aneinanderreihung der entsprechenden Oligonukleotidsequenzen bzw. der Module an natürlichen Spidroin- und/oder Fibroin- Sequenzen orientiert, gewährleistet eine sehr hohe Homologie zu bisher bekannten natürlichen Spidroin- bzw. Fibroin-Sequenzen. Dadurch wird sichergestellt, daß die durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierten Spinnenseidenproteine nach dem Verspinnen zu Fäden hervorragende mechanische Eigenschaften bezüglich ihrer Festigkeit und Elastizität aufweisen, die mit den mechanischen Eigenschaften von natürlichen Spinnenfäden vergleichbar sind.

Des weiteren ermöglicht der modulartige Aufbau der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz eine einfache gentechnische Modifizierung der synthetischen Gene, so daß Multimere von synthetischen Spinnenseidenproteinen mit beliebiger Größe je nach Wunsch hergestellt werden können. Ferner können die durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierten Spinnenseidenproteine aufgrund des modulartigen Aufbaus mit anderen Faserproteinsequenzen fusioniert werden. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz ist, daß sie aufgrund ihres modulartigen Aufbaus auf einfache Weise mit für Reinigungselemente oder Löslichkeits-verändernde Peptide kodierenden Sequenzen fusioniert werden kann.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierte Spinnenseidenprotein eine mindestens 84%ige, vorzugsweise mindestens 90%ige und besonders bevorzugt mindestens 94%ige Homologie zu dem Spidroin 1-Protein aus Nephila clavipes auf. Spidroin 1 aus Nephila clavipes ist wesentlich am Aufbau eines mechanisch besonders stabilen und elastischen Tragfadens beteiligt.

Aufgrund des modulartigen Aufbaus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz ist die Konstruktion von Genen, die sehr große Spinnenseidenproteine kodieren, ohne weiteres möglich, wobei die hohe Homologie zu Spidroin- und/oder Fibroin-Proteinen, insbesondere zu Spidroin 1, besonders bevorzugt zu Spidroin 1 von Nephila clavipes immer erhalten bleibt. Die so erzielbare Größenverteilung der durch die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kodierten Proteine entspricht dem Spektrum von Spinnenseidenproteinen, das nach der Auflösung von natürlicher Spinnenseide beobachten werden kann. Dieses identische Größenspektrum sowie die hohe Sequenzhomologie definieren die erfindungsgemäßen synthetischen Gene als Gene, die für Spinnenseidenproteine kodieren. Im Gegensatz zu natürlicher Spinnenseide, die aus einem Gemisch von Spinnenseidenproteinen besteht, werden durch die vorliegende Erfindung Spinnenseidenprotein-Gene bereitgestellt, die mit hoher Homologie eine Genklasse repräsentieren und eine einfache gentechnische Manipulation erlauben.

Die Module zum Aufbau der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz umfassen eine Gruppe von aneinandergereihten Oligonukleotidsequenzen, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) TATGAGCGCTCCCGGGCAGGGT;
b) AGCTTTTAGGTACCAATATTAATCTGGCCGGCTCCACC;
c) TATGGTCTGGGG;
d) GGCCAGGGTGCTGGCCAA;
e) GGTGCAGGAGCWGCWGCWGCWGCTGCAGGTGGA;
f) GCCGGCCAGATTAATATTGGTACCTAAA;
g) CTGCCCGGGAGCGCTCA;
h) ACCACCATAACCTCC;
i) AGCACCCTGGCCCCCCAG;
j) TGCAGCWGCWGCWGCWGCTCCTGCACCTTGGCC;
k) TATGAGATCTGGCCAAGGAGGT;
l) TTGGCCAGATCTCA;
m) AGTCAGGGTGCTGGTCGTGGAGGCCAA;
n) TCCACGACCAGCACCCTGACTCCCCAG;
o) AGTCAGGGCGCTGGTCGTGGGGGACTGGGTGGCCAA;
p) ACCCAGTCCCCCACGACCAGCGCCCTGACTCCCCAG;
q) CTGGGAGGGCAGGGAGCGGGCCAA;
r) CGCTCCCTGCCCTCCCAGACCTCC; und
s) Sequenzen, die zu den Sequenzen a) bis r) eine mindestens 80%ige, vorzugsweise mindestens 90%ige, besonders bevorzugt mindestens 94%ige Sequenzidentität aufweisen.

Die Module umfassen vorzugsweise mindestens vier Oligonukleotidsequenzen, die sich vorzugsweise unterscheiden, um die natürlichen Spinnenseidenproteine auf authentische Weise nachzugestalten. Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ist wiederum vorzugsweise aus mindestens vier der vorstehend beschriebenen Module aufgebaut.

Der Aufbau der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz wird im folgenden beispielhaft dargestellt. Zunächst werden die in Abb. 1 angegebenen Oligonukleotide bereitgestellt, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die Spidroin-typischen kurzen Aminosäure-Repeats entsprechen. Diese Oligonukleotide werden durch gentechnische Verfahren miteinander kombiniert, wobei sich die Kombination an der natürlichen Spidroin-Sequenz richtet (siehe Abb. 2). Die so entstandenen Module A, B, C, D, E und F werden erneut miteinander kombiniert (siehe Abb. 3). Auf diese Weise werden erfindungsgemäße DNA-Sequenzen bereitgestellt, die auf Aminosäureebene eine mindestens 85%ige, vorzugsweise mindestens 90%ige und besonders bevorzugt mindestens 94%ige Homologie zu Spidroin-Proteinen zeigen.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Modulen Nukleinsäuresequenzen, die für repetitive Einheiten aus Fibroin-Proteinen, vorzugsweise aus dem Fibroin-Protein des Seidenspinners kodieren.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße DNA-Sequenzen weisen die Sequenzen SEQ ID No. 19 bis 29 auf.

Erfindungsgemäß ist es ferner überraschenderweise erstmals gelungen, synthetische Spinnenseidenproteine in transgenen Pflanzen zu erzeugen. Auf diese Weise können synthetische Spinnenseidenproteine in großem Maßstab hergestellt werden. Um eine stabile Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in Pflanzen zu gewährleisten, wird erfindungsgemäß ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das die vorstehend beschriebene erfindungsgemäße DNA-Sequenz sowie einen ubiquitär wirkenden Promotor, vorzugsweise den CaMV35S-Promotor umfaßt. Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls ermöglicht die Expression und Akkumulation von synthetischen Spidroin- bzw. Fibroinsequenzen in transgenen Pflanzen.

Um sicherzustellen, daß die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in geeigneten Kompartimenten von transgenen Pflanzen exprimiert und akkumuliert wird, umfaßt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül zusätzlich zu der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz und einem ubiquitär wirkenden Promotor vorzugsweise mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein pflanzliches Signalpeptid kodiert.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird als Zielkompartiment für die Expression bzw. Akkumulation des synthetischen Spinnenseidenproteins das endoplasmatische Retikulum (ER) ausgewählt. Dieses Kompartiment ist für die stabile Akkumulation von Fremdproteinen in Pflanzen besonders geeignet. Um den Transport in das ER zu gewährleisten, umfaßt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül bevorzugt entsprechende Signalpeptide, besonders bevorzugt die LeB4Sp-Sequenz.

Die Retention im ER, falls gewünscht, wird erfindungsgemäß dadurch gewährleistet, daß das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die für ein ER-Retentionspeptid kodiert. Vorzugsweise wird die Retention in ER durch die C-terminal angefügte Aminosäuresequenz KDEL erreicht.

Ferner kann es vorteilhaft sein, die erfindungsgemäße DNA-Sequenz an der Plasmalemma, d. h. der Zellmembran, zu plazieren. Deshalb umfaßt das erfindungsgemäße rekombinante Nukleinsäuremolekül bei einer alternativen Ausführungsform die erfindungsgemäße DNA-Sequenz, fusioniert an den N-Terminus einer Transmembrandomäne. Vorzugsweise ist diese Transmembrandomäne die Transmembrandomäne des PDGF-Rezeptors, die sogenannte HOOK-Sequenz (siehe Abb. 4).

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül mit ELP's (elastin-like polypeptides) fusioniert. ELP's sind oligomere Repeats des Pentapeptids Val-Pro-Gly-Xaa-Gly (wobei Xaa jede Aminosäure außer Prolin und vorzugsweise Gly ist) und unterliegen einem reversiblen inversen Temperaturübergang. Sie sind in Wasser unterhalb der inversen Übergangstemperatur (T_t) sehr gut löslich, unterliegend jedoch einem scharfen Phasenübergang im Bereich von 2°C bis 3°C, wenn die Temperatur über T_t erhöht wird, was zur Ausfällung und Aggregation des Polypeptids führt. D. E. Meyer und A. Chilkoti, Nat. Biotech. 1999, 17, 1112-1115, haben beschrieben, daß ELP-Fusionen mit rekombinanten Proteinen das Löslichkeitsverhalten dieser rekombinanten Proteine bei verschiedenen Temperaturen und Konzentrationen gezielt verändern. Bei der vorliegenden Erfindung wird dies zur Etablierung von im nachfolgenden detailliert beschriebenen Reinigungsstrategien für das durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodierte Spinnenseidenprotein genutzt. Vorzugsweise umfassen die durch die Nukleinsäuresequenz in dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül kodierten ELP's von 10 bis 100 der vorstehend beschriebenen Pentamer-Einheiten (siehe Abb. 5).

Die Herstellung der vorstehend beschriebenen chimären Genkonstrukte bzw. rekombinanten Nukleinsäuremoleküle erfolgt mittels konventioneller Klonierungstechniken (siehe beispielsweise Sambrok et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York)). Mittels dieser gängigen molekularbiologischen Techniken ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse- und Restriktionsanalyse-Methoden sowie weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der jeweils gewünschten Fusion von Promotor, erfindungsgemäßer DNA-Sequenz, für ein pflanzliches Signalpeptid kodierender Sequenz, für ein ER-Retentionspeptid kodierender Sequenz, für eine Transmembrandomäne kodierender Sequenz und/oder für Reinigungselemente bzw. Löslichkeits-verändernde Peptide kodierenden Sequenzen hergestellt werden. Vielmehr kann der Fachmann mittels Routinetechniken, falls erwünscht, verschiedenartige Mutationen oder Deletionen in die jeweiligen Gene einführen.

Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung von Pflanzenzellen bzw. Pflanzen ermöglicht, die Spinnenseidenproteine produzieren. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.

Da die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufgrund ihres repetitiven Charakters kaum unikale Restriktionsorte aufweisen, wurden die erfindungsgemäßen Vektoren bzw. die das synthetische Spinnenseidenprotein kodierenden Gene durch verschiedene Strategien entsprechend angepaßt (siehe Abb. 6 bis 8). Bei der Amplifizierung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen durch PCR werden aufgrund des extrem repetitiven Charakters der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vorzugsweise zunächst Oligonukleotide anligiert, welche dann als Matrizen für die nachfolgenden PCR-Reaktionen dienen (siehe Abb. 7).

Des weiteren wird bei der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Spinnenseidenprotein bereitgestellt, das durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodiert wird. Dieses erfindungsgemäße synthetische Spinnenseidenprotein, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 160 kDa, weist eine mindestens 85%ige, vorzugsweise mindestens 90%ige und besonders bevorzugt mindestens 94%ige Homologie zu Spidroin- und/oder Fibroin-Proteinen auf. Durch diese hohe Homologie mit den natürlichen Faserproteinen der Spinne und des Seidenspinners wird gewährleistet, daß die herausragenden mechanischen Eigenschaften der natürlichen Spinnenfäden erreicht werden, wenn die erfindungsgemäßen Proteine zu Fäden gesponnen werden.

Ferner weisen die erfindungsgemäßen Proteine überraschenderweise neuartige physikochemische Eigenschaften auf. So bleibt die Löslichkeit dieser erfindungsgemäßen synthetischen Faserproteine in wäßrigen Lösungen auch nach längerem Kochen außerordentlich gut erhalten. Gemeinsam mit der ebenfalls auftretenden Löslichkeit in organischen Lösungen und dem Fällungsverhalten bei hohen Salzkonzentrationen können diese neuen Eigenschaften der erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseidenproteine somit für die Entwicklung technisch durchführbarer Extraktions- und Reinigungsverfahren genützt werden. Diese Eigenschaften werden noch verstärkt, wenn die erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseidenproteine gezielt in bestimmten Kompartimenten, insbesondere im ER von transgenen Pflanzen akkumuliert werden.

Beispiele für Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen rekombinanten synthetischen Spinnenseidenproteine weisen die Sequenzen SEQ ID No. 30 bis 40 auf. Die erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine können alternativ auch nach chemischen, dem Fachmann bekannten Methoden synthetisiert werden, eine rekombinante Herstellung ist jedoch bevorzugt.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Spinnenseidenprotein- produzierenden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellung eines wie vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls;
b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen; und
c) gegebenenfalls die Regeneration fertiler Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

Des weiteren betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bzw. den erfindungsgemäßen Vektor enthalten. Die Erfindung betrifft ferner Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün schte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwen det. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und an schließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmetho de zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktions analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden ein gesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA- Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Tech niken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierig keiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesen heit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert wer den, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die interme diären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplas mids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Kon jugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwen dung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentrans formation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengel segmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzen zellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Genta mycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestat ten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutretive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selek tionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgenen Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.

Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach übli chen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure, die ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, untersucht werden.

Bei der transgenen Pflanze bzw. der transgenen Pflanzenzelle kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um transgene Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Tabakpflanze (Nicotiana tabacum) und der Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum).

Die Expression des erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseidenproteins in den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern-Blot- Analyse oder eine Southern-Blot-Analyse.

Ein Beispiel für die Herstellung von transgenen Spinnenseidenprotein-produzierenden Pflanzen ist in Abb. 9 angegeben. Die durch PCR amplifizierten Sequenzen können möglicherweise frameshift-Mutationen enthalten. Deshalb müssen die erfindungsgemäßen Sequenzen vor der Erzeugung transgener Pflanzen überprüft werden. Dies kann durch Sequenzanalyse jeweils von den flankierenden Vektorsequenzen aus erfolgen. Längere Konstrukte über 1 kB können auf diese Weise nicht geprüft werden, da aufgrund der repetitiven Eigenschaften der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen interne Sequenzierungsprimer keine auswertbaren sicheren Sequenzen liefern. Aus diesem Grund wurden amplifizierte Spidroinsequenzen vorzugsweise in den bakteriellen Expressionsvektor pet23a (Novagen, Madison, USA) kloniert. Durch immunchemischen Nachweis der Expression können dann frameshift-Mutationen ausgeschlossen werden.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bzw. Expressionskassetten werden erfindungsgemäß üblicherweise als HindIII-Fragmente in Shuttle-Vektoren wie pBIN, pCB301 und/oder pGSGLUC1 kloniert. Diese Shuttle-Vektoren werden vorzugsweise in Agrobacterium tumefaciens transformiert. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wird üblicherweise durch Southern-Blot-Analyse und/oder PCR-Screening überprüft.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungs gemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge usw.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von pflanzlichem Spinnenseidenprotein, umfassend die folgenden Schritte:

a) die Übertragung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz erhält, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, auf Pflanzenzellen;
b) gegebenenfalls die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen;
c) die Verarbeitung der Pflanzenzellen aus a) bzw. der Pflanzen aus b) zur Gewinnung von pflanzlichem Spinnenseidenprotein.

Bei einem weiteren wesentlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Gewinnung von rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteinen bereitgestellt, die die Übertragung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, auf beliebige Zellen, d. h. neben Pflanzenzellen beispielsweise auch bakterielle oder tierische Zellen, umfassen. Wesentliches Merkmal bei diesen erfindungsgemäßen Verfahren ist dabei der Schritt der Reinigung der rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteine, bei dem u. a. deren besondere Eigenschaften hinsichtlich der Löslichkeit bei Erwärmung und/oder Säurezugabe ausgenutzt werden.

So erfolgt bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Reinigung des rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteins durch Hitzebehandlung des Zellextrakts, z. B. eines Pflanzensamen-Extrakts, und anschließende Abtrennung der denaturierten zelleigenen, z. B. der pflanzeneigenen Proteine beispielsweise durch Zentrifugation. Dabei wird die Eigenschaft der rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteine ausgenutzt, daß sie beim Erhitzen von wäßrigen Lösungen bis zum Siedepunkt löslich bleiben. Dagegen bleiben beispielsweise synthetische Faserproteine der Spinne und des Seidenspinners nach Expression in Pichia pastoris beim Erhitzen nur bis zu einer Temperatur von 63°C und dann nur für 10 Minuten in Lösung.

Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteinen erfolgt die Reinigung durch Einstellung eines sauren pH mittels Zugabe von Säure, vorzugsweise Salzsäure zu dem Zellextrakt, beispielsweise zu dem Pflanzenextrakt. Der saure pH, insbesondere ein pH im Bereich von 1,0 bis 4,0, besonders bevorzugt im Bereich von 2,5 bis 3,5, am meisten bevorzugt ein pH von 3,0, wird dabei vorzugsweise für eine Dauer von mehreren Minuten, besonders bevorzugt etwa 30 Minuten, bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur, vorzugsweise etwa 4°C, beibehalten. Wiederum wird eine nicht zu erwartende Eigenschaft der durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Proteine ausgenutzt, nämlich daß sie beim Ansäuern, insbesondere bis zu einem pH von 3,0 bei 4°C in Lösung bleiben. Die zelleigenen, beispielsweise pflanzeneigenen Proteine fallen dagegen aus und werden insbesondere durch Zentrifugation abgetrennt.

Die vorstehend beschriebenen Löslichkeitseigenschaften der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteine sind sehr überraschend und waren in dieser Form nicht vorhersehbar und ermöglichen eine effiziente, schnelle und kostengünstige Reinigung bei deren Extraktion aus Zellen, insbesondere Pflanzenzellen.

Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Nukleinsäuremolekül auf die Zellen übertragen, das zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die für ELP's kodiert. In diesem Fall erfolgt die Reinigung des rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteins auf die folgende Weise: In einem ersten Schritt wird das Spinnenseiden-ELP-Fusionsprotein durch Hitzebehandlung des Rohextrakts angereichert. Überraschenderweise behalten die Fusionsproteine dabei die außerordentliche Löslichkeit der Spinnenseidenproteine bei hohen Temperaturen bei. Ein Großteil der zelleigenen Proteine fällt bei dieser Temperaturerhöhung aus. Im nächsten Schritt werden die Spinnenseiden-ELP- Fusionsproteine durch weitere Temperaturerhöhung, vorzugsweise auf eine Temperatur von mindestens 60°C, ausgefällt. Vorzugsweise erfolgt die Ausfällung bei einer geeigneten Salz- Konzentration, beispielsweise einer NaCl-Konzentration von mindestens 0,5 M, vorzugsweise im Bereich von 1 M bis 2 M. Schließlich wird das ELP-Fragment, vorzugsweise durch Verdauung mit CNBr, abgespalten.

Durch das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von rekombinant hergestelltem Spinnenseidenprotein können die Proteine in Pflanzen zu hohen Konzentrationen, vorzugsweise bis zu einer Expressionshöhe von etwa 4% des gesamten löslichen Proteins angereichert werden. Damit werden erstmals Verfahren bereitgestellt, die zur technisch realisierbaren Anreicherung von rekombinantem Spinnenseidenprotein verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine können bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von synthetischen Fäden sowie von Folien und Membranen verwendet werden. Insbesondere sind derartige Produkte für medizinische Anwendungen, insbesondere zum Vernähen von Wunden und/oder als Gerüste bzw. als Abdeckung für künstliche Organe, geeignet. Ferner können die aus den erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine hergestellten Folien und Membrane u. a. als Anheftungsflächen für kultivierte Zellen sowie zur Filterung verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als einschränkend zu verstehen sind, erläutert.

Beispiele Beispiel 1

Expression und stabile Akkumulation von synthetischen Faserproteinen der Spinne und des Seidenspinners im endoplasmatischen Retikulum von Blättern bzw. Knollen transgener Tabak- und Kartoffelpflanzen.

In den Abb. 10a und b sind Aminosäuresequenzen von synthetischen Spinnenseidenproteinen mit einer hohen Homologie zu dem Spidroin 1-Protein aus Nephila clavipes dargestellt, wobei der C-terminale und nicht repetitive konstante Bereich nicht abgebildet sind. Diese synthetischen Spinnenseidenproteine bestehen aus Modulen, die wiederum aneinandergereihte Oligonukleotidsequenzen umfassen. Durch Kombination mehrerer Module wurden die verschiedenen synthetischen Gene assembliert, wobei auch Mischformen mit Fibroin 1-nachempfundenen Sequenzen erzeugt wurden.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind verschiedene Pflanzenexpressionskassetten aufgelistet, die für verschiedene erfindungsgemäße synthetische Faserproteine mit den Sequenzen SEQ ID No. 30 bis 40 kodieren.

Tabelle 1

Durch eine N-terminale Signalpeptidsequenz und eine C-terminale ER-Retentionssequenz (KDEL) wurde der zielgerichtete Transport und die Akkumulation der erfindungsgemäßen Sequenzen im endoplasmatischen Retikulum von Zellen transgener Pflanzen erreicht. Eine Nachweissequenz in Form eines c-myc-Tags am C-terminalen Ende der transgenen synthetischen Faserproteine erlaubt den Nachweis der transgenen Produkte in Pflanzenextrakten.

Die Kassetten SO1 und FA2 sind beispielhaft in den Abb. 10a und 10b im Detail dargestellt. Nach demselben Aufbauprinzip wurden die Pflanzenexpressionskassetten SB1, SD1, SA1, SE1, SF1, SM12, SO1SM12, SO1SO1 und SO1SO1SO1 erstellt. Durch Variation der Grundmodulwiederholungen entstehen synthetische Faserproteine verschiedener Aminosäureanzahl und entsprechend unterschiedlichen Molekulargewichts (siehe Tabelle 1).

Die Abb. 2 beschreibt schematisch den Weg zur Einstellung der oben genannten Konstrukte. Zur direkten Klonierung der erfindungsgemäßen synthetischen Faserproteingene wurden die Schnittstellen SmaI und NaeI eingeführt. Dazu wurde ein PCR-Produkt, welches die entsprechenden Schnittstellen enthielt, mit der Primerkombination 5'-pRTRA-SmaI und 3'-pRTRA-NotI in das Plasmid pRTRA ScFv SmaIΔ/BamHIΔ über BamHI und NotI kloniert. Synthetische Faserproteingene wurden aus den Faserproteingenderivaten der Plasmide 9905 oder 9609 in den Vektor pRTRA.7/3-Platzhalter kloniert. Durch die Wahl der Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen am 5'- und 3'-Ende der synthetischen Faserproteingene (SmaI und NaeI) sind diese frei miteinander kombinierbar, und größere Faserproteingene können erfindungsgemäß in einem Klonierungsschritt assembliert werden.

Auf diese Weise wurden transgene synthetische Spinnenseidenproteine zu hohen Konzentrationen im endoplasmatischen Retikulum transgener Tabak- und Kartoffelpflanzen akkumuliert (siehe Abb. 12a und 12b). In der folgenden Tabelle 2 ist die maximale Akkumulationshöhe von erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseidenproteinen im ER von Blättern transgener Tabak- und Kartoffelpflanzen dargestellt. Die Abschätzung der Anreicherung der transgenen synthetischen Faserproteine erfolgte über einen Vergleich mit transgenen rekombinanten Antikörpern, die auf identische Weise mit dem gleichen Tag versehen wurden. Damit wird erstmals eine Akkumulation von Spinnenseidenproteinen in Pflanzen am Beispiel von Kartoffeln und Tabak beschrieben.

Tabelle 2

Eine definierte Menge des faserproteinhaltigen Gesamtproteinextrakts (40 µg) und eine definierte Menge eines Referenzproteins mit c-myc-Immunotag (50 ng ScFv) wurden mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt, und synthetische Faserproteine und Referenzproteine wurden im Western Blot durch einen Antic-myc-Antikörper nachgewiesen (siehe Abb. 12 und 13). Die prozentualen Angaben resultieren aus dem Vergleich zwischen der Bandenintensität der Referenzproteine und der Bandenintensität der synthetischen erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine und stellen geschätzte Werte dar. Größenunterschiede der synthetischen Faserproteine und des Referenzproteins wurden berücksichtigt. Mögliche Unterschiede in der Markierungseffizienz können nahezu ausgeschlossen werden.

In Abb. 13 ist die Hitzestabilität von verschiedenen erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseidenproteinen in pflanzlichen Extrakten dargestellt. Überraschenderweise bleiben die erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine auch bei einer längeren Hitzebehandlung von 3 h in Lösung (Vergleich der Referenzprobe R zu den Proben H-60 min. H-120 min und H-180 min). Die übrigen pflanzlichen Proteine werden zu mehr als 90% denaturiert und können durch Zentrifugation einfach abgetrennt werden (Abb. 13a: Vergleich der Probe R zu H-60 min). Diese ungewöhnlichen Eigenschaften der erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseidenproteine, die unter anderem durch ihre Aminosäuresequenz und ihre Faltung im pflanzlichen ER bedingt sind, ermöglichen die Entwicklung von großtechnisch realisierbaren und kostengünstigen Reinigungsstrategien.

In Abb. 14 wird die Löslichkeit von synthetischen Faserproteinen aus transgenen Pflanzen dargestellt. Im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen bakteriell exprimierten synthetischen Faserproteinen weisen die erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine eine überraschend gute Löslichkeit in wäßrigen Puffern auf (R1, R2 = Tris-Puffer; T1, T2 = Phosphatpuffer). Auch diese Eigenschaften beruhen unter anderem auf der Aminosäuresequenz und insbesondere auf der Faltung im endoplasmatischen Retikulum pflanzlicher Zellen.

Beispiel 2

Expression und stabile Akkumulation von synthetischen Spinnenseidenproteinen im Plasmalemma von Blättern transgener Tabak- und Kartoffelpflanzen.

In diesem Beispiel wird die membranassoziierte Akkumulation von erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteinen in transgenen Tabak- und Kartoffelpflanzen beschrieben. Dabei wurden ausgehend von den in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukten Fusionsgene hergestellt, die für ein Spinnenseidenprotein und für eine Membrandomäne kodieren. Das allgemeine Schema dieser Konstruktionen ist in Abb. 15 dargestellt. Dabei wurde aus dem Plasmid pRT-HOOK ein NotI-Fragment isoliert, welches sowohl für die HOOK-Domäne als auch für einen c-myc-Immunotag kodiert, welches dann in Spinnenseidenproteingen-tragende Derivate des Vektors pRTA.7/3 kloniert wurde. Durch die Wahl der Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen am 5'- und 3'-Ende der synthetischen Spinnenseidenproteingene (SmaI und NaeI) sind diese wiederum miteinander kombinierbar, wodurch größere Faserproteingene in einem Klonierungsschritt assimiliert werden können.

Abb. 16 zeigt die Expression der vorstehend beschriebenen Gene in transgenen Tabak- und Kartoffelpflanzen. Wie aus dem Vergleich der Proben 1, 2 und 3 in dieser Abbildung ersichtlich ist, sind diese transgenen Spinnenseidenproteine im Gegensatz zu den im Beispiel 1 beschriebenen erfindungsgemäßen Proteinen in der wäßrigen Phase nicht löslich. Auch diese Eigenschaft kann für die Entwicklung von Reinigungsstrategien ausgenutzt werden.

Beispiel 3

Gezielte Veränderung der Löslichkeit von Spinnenseidenproteinen durch Fusion mit elastin-like peptides.

In einem ersten Schritt wurde gezeigt, daß Fusionen mit elastin-like peptides auch bei bakteriell exprimierten Spinnenseidenproteinen zu einer gezielten Veränderung des Löslichkeitsverhaltens in Abhängigkeit von Temperatur und Konzentration führen.

Eine entsprechende Expressionskassette ist in Abb. 5 dargestellt. Beispiele für ELP mit 10, 20, 30, 40, 60, 70 und 100 Pentamereinheiten sind in den Sequenzen SEQ ID No. 41 bis 47 angegeben. Beispiele für DNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen in Form des Konstrukts SM12-70xELP als Pflanzenexpressionskassette bzw. als Expressionskassette für E. coli sind in den Sequenzen SEQ ID No. 48-51 bzw. in den Abb. 19 bis 22 angegeben.

In Abb. 17 wird die gelelektrophoretische Analyse eines solchen Reinigungsverfahrens dargestellt. Durch Hitzebehandlung des Rohextrakts wurde das Spinnenseiden-ELP- Fusionsprotein angereichert. Überraschenderweise behielten die Fusionsproteine die außerordentliche Löslichkeit der Spinnenseidenproteine bei hohen Temperaturen bei. Ein Großteil der E. coli-Proteine wurde bei diesen Temperaturen ausgefällt.

Nach starker Konzentration des angereicherten Spinnenseidenproteinextrakts wurde das Extrakt einer Temperatur von 60°C ausgesetzt, woraufhin das ELP-Spinnenseidenprotein ausfiel und pelletiert wurde. Das Pellet wurde bei Raumtemperatur in Wasser gelöst, und unlösliche Bestandteile wurden durch Pelletieren entfernt.

Anschließend wurde die Spinnenseidenproteinfraktion lyophilisiert und durch Cyanbromidspaltung verdaut. Die Cyanbromidspaltung wurde durch den Methionin-Rest zwischen dem Spinnenseidenprotein und dem ELP-Peptid ermöglicht.

Anschließend wurde erneut lyophilisiert und in wäßrigem Puffer gelöst. Dann erfolgte eine starke Konzentration, wobei das abgespaltene ELP-Fragment (ELP(T-R); siehe Abb. 2) ausfiel und durch Pelletieren entfernt wurde. Das Spinnenseidenprotein blieb dabei in Lösung (SM12(T-R); siehe Abb. 17). Die Löslichkeit blieb für einen längeren Zeitraum erhalten, bei SM12 bei 4°C für 24 H. Die Identität des auf diese Weise gereinigten Spinnenseidenproteins wurde durch Peptidsequenzierung des N-terminalen Endes gezeigt.

In einem zweiten Schritt wurden Spinnenseidenproteine als ELP-Fusionen im endoplasmatischen Retikulum von transgenen Tabakpflanzen akkumuliert. Der prinzipielle Aufbau dieser Expressionskassetten ist ebenfalls in Abb. 5 dargestellt. Diese Fusionsproteine mit Molekulargewichten von 35.000 Dalton bis 100.000 Dalton wurden sämtlich in Pflanzen zu hohen Konzentrationen mit einer Expressionshöhe von etwa 4% des gesamt löslichen Proteins angereichert.

Abbildungen Abb. 1

Oligonukleotid-Sequenzen, die für Spidroin-typische kurze Aminosäurerepeats kodieren.

Abb. 2

Aneinanderreihung von Oligonukleotid-Sequenzen zum Aufbau von Modulen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen.

Abb. 3

Aufbau der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aus Modulen.

Abb. 4

Klonierung des Gens der Transmembrandomäne von HOOK mit NotI aus (pRT-HOOK) in (pRTA.73 syn.spidroin).

Abb. 5

Schematische Darstellung der Spidroin-ELP-Expressionskassetten. xELP-Einheiten: 10, 20, 30, 40; 60, 70 oder 100 Pentamere (Val-Pro-Gly-Val-Gly). Das Methionin zwischen dem Spinnenseidenprotein und dem ELP-Peptid ermöglicht die Cyanbromidspaltung.

Abb. 6

Veränderung einer Base in der Erkennungssequenz von BamHI (Position 1332) durch gezielte Mutagenese.

Abb. 7

Vorbereiten von (pRTRA.73, BamHIΔ) auf die direkte Klonierung der synthetischen Spidroingene aus p9905 oder p9609 - Aufheben der SmaI-Erkennungssequenz (Position 463).

Abb. 8

Einführung der Restriktionserkennungssequenzen von SmaI und NaeI in den Vektor (pRTRA.73, BamHIΔ+SmaIΔ) für die Klonierung synthetischer Spidroingene.

Abb. 9

Allgemeine Darstellung der Herstellung transgener Spinnseidenprotein-produzierender Pflanzen.

Abb. 10

(a) Darstellung des modulhaften Aufbaus der erfindungsgemäßen Spinnenseidenproteine am Beispiel der SO1-Sequenz. Aminosäuren 1-28: LeB4-Signalpeptid; Aminosäuren 29-659: synthetische Spinnenseidenproteinsequenz; Aminosäuren 660-672: c-myc-Tag; Aminosäuren 673-676 ER-Retentionssignal.

Anordnung der Sequenzmodule nach der in Simmons et al., 1996. Molecular orientation and two-component nature of the cristalline fraction of spider dragline silk. Science 271: 84-87 angegebenen Originalsequenz.

(b) Darstellung des modulhaften Aufbaus des synthetischen Faserhybridproteins FA2. Aminosäuren 1-28: LeB4-Signalpeptid; Aminosäuren 28-130: synthetische Faserproteinsequenz der Spinne; Aminosäuren 131-247: synthetische Faserproteinsequenz des Seidenspinners; Aminosäuren 248-260: c-myc-Tag; Aminosäuren 261-264: ER-Retentionssignal.

Abb. 11

Schematische Darstellung der Erstellung von Genkassetten für die Akkumulation von synthetischen Faserproteinen der Spinne und des Seidenspinners im ER von transgenen Pflanzen.

Abb. 12

(a) Expression der synthetischen Faserproteine der Spinne (SD1, SM12, SO1) bzw. des Hybrids aus Spinne und Seidenspinner (FA2) in Blättern von transgenen Tabakpflanzen. Analysiert wurden jeweils 40 µg Gesamtprotein in SDS-Probenpuffer. SD1: 13 kDa; FA2: 20 kDa; SM12: 31 kDa; SO1: 52 kDa; K: Positivkontrolle 50 ng ScFv.

(b) Expression der synthetischen Faserproteine der Spinne (SD1, SM12, SO1) bzw. des Hybrids aus Spinne und Seidenspinner (FA2) in transgenen Kartoffelpflanzen.

Analysiert wurden ebenfalls jeweils 40 µg Gesamtprotein in SDS-Probenpuffer. SD1: 13 kDa; FA2: 20 kDa; SM12: 31 kDa; SO1: 52 kDa; K: Positivkontrolle 50 ng ScFv.

Abb. 13

Darstellung der Hitzebeständigkeit der synthetischen Faserproteine der Spinne und des Seidenspinners anhand der Konstrukte SD1 und FA2. A: Coomassie-gefärbtes Gel. B: Immunochemischer Nachweis der synthetischen Faserproteine SD1 und FA2 mittels Anti- c-myc-Antikörper. PM: Proteinmarker; ScFv: 50 ng ScFv; R: wäßriges Pflanzenextrakt von Blättern von transgenen Pflanzen für SD1 und FA2; H: Hitzeschritt 60 min, 120 min, 180 min, 24 H und 48 H bei 90°C.

Bei der Hitzebehandlung ausgefallene Pflanzenextraktbestandteile wurden durch Zentrifugieren abgetrennt.

Abb. 14

Untersuchung der Lösungseigenschaften und Stabilität des synthetischen Spinnenseidenproteins SO1 nach Ammoniumsulfatfällung.

10 g Blattmaterial wurden in Stickstoff schockgefroren, zermörsert, in 20 ml Rohextraktpuffer aufgenommen, für 30 min bei 38°C geschüttelt, und unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt (30 min. 10.000 rpm). Anschließend wurde der Überstand (R) für 10 min auf 90°C erhitzt und das Präzipitat durch Zentrifugieren entfernt (30 min. 10.000 rpm). Der Überstand (H) wurde mit 20% Ammoniumsulfat versetzt, 4 h bei Raumtemperatur gerollt und das Präzipitat durch Zentrifugieren für 60 min bei 4000 rpm und 4°C entfernt. Der Überstand wurde auf 30% Endkonzentration Ammoniumsulfat eingestellt und über Nacht bei Raumtemperatur gerollt. Die Lösung wurde in 5 Aliquote getrennt und das Präzipitat durch Zentrifugieren entfernt (60 min. 4000 rpm, 4°C). Die Überstände wurden verworfen und die verbliebenen Pellets in folgenden Lösungen aufgenommen: R1: Rohextraktpuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,0; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄); S: SDS-Probenpuffer; G: 0,1 M Phosphatpuffer, 0,01 M Tris/HCl, 6 M Guanidiniumhydrochlorid/HCl pH 6,5; T: 1 × PBS, 1% TritonX-100; L: LiBr.

Die Ansätze wurden für 1 h bei 37°C geschüttelt, und durch Zentrifugieren wurden unlösliche Bestandteile entfernt (30 min. 10.000 rpm). Anschließend wurde ein Aliquot jedes Ansatzes entnommen und für die SDS-Gelelektrophorese vorbereitet (R1, S1, G1, T1, L1). Die Ansätze wurden nun 36 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Zentrifugieren wurden unlösliche Bestandteile entfernt (30 min, 10.000 rpm). Wiederum wurde ein Aliquot jedes Ansatzes entnommen und für die SDS-Gelelektrophorese vorbereitet (R2, S2, G2, T2, L2). Es wurden jeweils vergleichbare Volumina analysiert.

Abb. 15

Schematische Darstellung der Konstruktion von Genkassetten für die Akkumulation von Plasmalemma-ständigen synthetischen Faserproteinen der Spinne und des Seidenspinners in transgenen Pflanzen.

Abb. 16

Expression der Faserfusionsproteine SM12-HOOK, SO1-HOOK und FA2-HOOK in Blättern von transgenen Kartoffelpflanzen.

Abb. 17

Gelelektrophoretische Analyse der Anreicherung von bakteriell exprimierten Spinnenseidenproteinen nach Fusion mit ELP's. Spinnenseidenprotein: 30.000 Dalton.

Abb. 18

Western Blot-Analyse der Expression von Spinnenseiden-ELP-Fusionsproteinen in transgenen Tabakpflanzen. Jeweils 2,5 µg Gesamtpflanzenprotein wurden getrennt und die Spinnenseidenproteine auf dem Western Blot durch ECL nachgewiesen. Durch Vergleich mit dem Standard wird die Spinnenseidenproteinkonzentration auf mindestens 4% des gesamtlöslichen Proteins geschätzt.

Abb. 19

DNA-Sequenz von SM12-70xELP als Pflanzenexpressionskassette.

Abb. 20

Proteinsequenz von SM12-70xELP aus pflanzlicher Expression (SM12, c-myc-Tag, 70xELP, KDEL - jeweils durch Absatz gekennzeichnet).

Abb. 21

DNA-Sequenz von SM12-70xELP als Expressionskassette für E. coli.

Abb. 22

Proteinsequenz von SM12-70xELP aus bakterieller Expression (SM12, c-myc-Tag, 70xELP, c-myc-Tag, HisTag - jeweils durch Absatz gekennzeichnet).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Spinnenseidenprotein kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus Modulen aufgebaut ist, die eine Gruppe von aneinandergereihten Oligonukleotidsequenzen umfassen, wobei die Oligonukleotidsequenzen jeweils für repetitive Einheiten aus Spidroin-Proteinen kodieren, mit der Maßgabe, daß das durch die DNA-Sequenz kodierte Protein eine mindestens 84%ige, vorzugsweise mindestens 90%ige, besonders bevorzugt mindestens 94%ige Homologie zu Spidroin-Proteinen, insbesondere zu dem Spidroin 1-Protein, besonders bevorzugt zu dem Spidroin 1-Protein aus Nephila clavipes aufweist.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Module mindestens 4 Oligonukleotidsequenzen umfassen.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens 4 Modulen aufgebaut ist.

5. DNA-Sequenz nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die für repetitive Einheiten aus Fibroin-Proteinen, vorzugsweise aus dem Fibroin-Protein des Seidenspinners kodieren.

6. DNA-Sequenz nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend eine der in SEQ ID No. 19-29 angegebenen Sequenzen.

7. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der vorangehenden Ansprüche sowie einen ubiquitär wirkenden Promotor, vorzugsweise den CaMV 35S-Promotor.

8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, zusätzlich umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein pflanzliches Signalpeptid kodiert.

9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Signalpeptid den Transport in das endoplasmatische Retikulum (ER) gewährleistet.

10. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die für das pflanzliche Signalpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz eine LeB4Sp-Sequenz ist.

11. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 7 bis 10, zusätzlich umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein ER-Retentionspeptid kodiert.

12. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das ER-Retentionspeptid die Sequenz KDEL umfaßt.

13. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 7 bis 10, zusätzlich umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Transmembrandomäne kodiert.

14. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für die Transmembrandomäne des PDGF-Rezeptors kodiert.

15. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 7 bis 14, zusätzlich umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ELP's kodiert.

16. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die ELP's von 10 bis 100 Pentamer-Einheiten umfassen.

17. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15 oder 16, umfassend eine der in SEQ ID No. 48 und 50 angegebenen Sequenzen.

18. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 7 bis 17.

19. Mikroorganismus, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 18.

20. Rekombinantes Spinnenseidenprotein, kodiert durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

21. Spinnenseidenprotein nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 160 kDa aufweist.

22. Rekombinantes Spinnenseidenprotein, umfassend eine der in SEQ ID No. 30 bis 40 angegebenen Aminosäuresequenzen.

23. Verfahren zur Herstellung von Spinnenseidenprotein-produzierenden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 7 bis 17;
b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen; und
c) ggf. die Regeneration fertiler Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

24. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 18, oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 23.

25. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 24 oder hergestellt nach Anspruch 23, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.

26. Transgene Pflanzen nach Anspruch 25, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tabakpflanze und Kartoffelpflanze.

27. Verfahren zur Gewinnung von pflanzlichem Spinnenseidenprotein, umfassend die folgenden Schritte:

a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 18 auf Pflanzenzellen;
b) gegebenenfalls die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen; und
c) die Verarbeitung der Pflanzenzellen aus a) bzw. der Pflanzen aus b) zur Gewinnung von pflanzlichem Spinnenseidenprotein.

28. Verfahren zur Gewinnung von rekombinant hergestelltem Spinnenseidenprotein, umfassend die folgenden Schritte:

a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 18 auf Zellen;
b) die Reinigung des Spinnenseidenproteins durch Hitzebehandlung des Zellextrakts und anschließende Abtrennung der denaturierten zelleigenen Proteine.

29. Verfahren zur Gewinnung von rekombinant hergestelltem Spinnenseidenprotein, umfassend die folgenden Schritte:

a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 18 auf Zellen;
b) die Reinigung des pflanzlichen Spinnenseidenproteins durch Einstellung eines sauren pH, vorzugsweise eines pH im Bereich von 2,5 bis 3,5 mittels Zugabe von Säure, vorzugsweise Salzsäure zu dem Zellextrakt und anschließende Abtrennung der denaturierten zelleigenen Proteine.

30. Verfahren zur Gewinnung von rekombinant hergestelltem Spinnenseidenprotein, umfassend die folgenden Schritte:

a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 15 bis 17 auf Zellen;
b) die Reinigung des Spinnenseidenproteins auf folgende Weise:
- - Anreicherung des Spinnenseiden-ELP-Fusionsproteins durch Hitzebehandlung des Zellextrakts;
- - Ausfällung des Spinnenseiden-ELP-Fusionsproteins durch weitere Temperaturerhöhung, vorzugsweise auf eine Temperatur von mindestens 60°C, und vorzugsweise bei einer Salzkonzentration von 1 M bis 2 M; und
- - Abspaltung des ELP-Fragments, vorzugsweise durch Verdauung mit CNBr.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ausgewählt werden aus Pflanzenzellen, tierischen Zellen und bakteriellen Zellen.

32. Pflanzliches Spinnenseidenprotein, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31.

33. Spinnenseidenprotein nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 160 kDa aufweist.

34. Verwendung der Spinnenseidenproteine nach einem der Ansprüche 20 bis 22 bzw. nach Anspruch 32 oder 33 zur Herstellung von synthetische Fäden, Folien und/oder Membranen.

35. Verwendung nach Anspruch 34, wobei die Fäden, Folien und/oder Membrane für medizinische Anwendungen, insbesondere zum Vernähen von Wunden und/oder als Gerüste bzw. als Abdeckung für künstliche Organe, eingesetzt werden.

36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei die Folien und/oder Membrane als Anheftungsflächen für kultivierte Zellen und/oder zur Filterung verwendet werden.