DE10112207A1 - Tierfuttersupplement enthaltend D-Pantothensäure und/oder deren Salze, verbessertes Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung - Google Patents
Tierfuttersupplement enthaltend D-Pantothensäure und/oder deren Salze, verbessertes Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen VerwendungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tierfuttersupplement, enthaltend freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze sowie ein verbessertes Verfahren zu dessen Herstellung. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Tierfuttersupplements in der Tierernährung.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein D-Pantothensäure enthaltendes
Tierfuttersupplement, ein verbessertes Verfahren zu dessen Herstellung und dessen
Verwendung.
Als ein Ausgangsprodukt der Biosynthese von Coenzym A ist D-Pantothenat in der
Pflanzen- und Tierwelt weit verbreitet. Im Gegensatz zum Menschen, der die
Pantothensäure in ausreichenden Mengen über die Nahrung zu sich nimmt, sind
jedoch sowohl für Pflanzen als auch für Tiere häufig Mangelerscheinungen für D-
Pantothenat beschrieben. Die Verfügbarkeit von D-Pantothenat ist daher von großem
wirtschaftlichen Interesse, insbesondere in der Tierfutterindustrie.
Herkömmlicher Weise erfolgt die Herstellung von D-Pantothenat durch chemische
Synthese aus D-Pantolacton und Calcium-β-Alaninat (Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry, 6th edition, 1999, electronic release, Kapitel "Vitamins"). Zur
Bereitstellung von D-Pantolacton ist eine aufwendige, klassische Racematspaltung
über diastereomere Salze erforderlich. Das aus der chemischen Synthese
resultierende Verkaufsprodukt ist meist das Calciumsalz der D-Pantothensäure
Calcium-D-Pantothenat.
Gegenüber der chemischen Synthese liegt der Vorteil biotechnologischer
Herstellungsverfahren mit Mikroorganismen in der selektiven (enantiomerenreinen)
Bereitstellung der für den höheren Organismus verwertbaren D-Form der
Pantothensäure. Eine aufwendige Racematspaltung, wie sie bei der chemischen
Synthese erforderlich ist, entfällt somit.
Fermentative Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure mit Mikroorganismen
sind zahlreich bekannt, so u. a. aus EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340,
DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 und EP 1 006 193.
So beschreibt die EP 1 006 189 ein Verfahren zur Herstellung von Pantothenat bei
dem in der Fermentationslösung ein Gehalt von max. 1 g/l, D-Pantothensäure erreicht
wird. Solche geringen Pantothensäure-Gehalte in der Fermentationslösung, also von
weniger als 10 Gew.-% bezogen auf den Feststoffgehalt sind jedoch für eine
wirtschaftliche Herstellung von D-Pantothensäure enthaltenden
Tierfuttersupplementen ungeeignet. Ein weiterer Nachteil bei den bislang
beschriebenen Verfahren ist, daß die Isolierung des Produkts aus dem
Fermentationsmedium zahlreiche aufwendige Aufarbeitungsschritte erfordert. Ein
wirtschaftliches Herstellungsverfahren für den großtechnischen Maßstab ist nicht
offenbart.
So beschreibt die US 6,013,492 die Aufarbeitung der D-Pantothensäure aus der
Fermentationslösung durch Abfiltern unlöslicher Bestandteile, wie z. B. Zellmaterial
vom Kulturmedium, eine Adsorption des Filtrats an Aktivkohle, eine sich
anschließende Elution der D-Pantothensäure mit einem organischen Lösungsmittel,
bevorzugt Methanol, eine Neutralisation mit Calciumhydroxid und eine
abschließende Kristallisation von Calcium-D-Pantothensäure. Ein wesentlicher
Nachteil dieser aufwendigen Aufarbeitungsschritte ist ein zusätzlicher Verlust an
Wertprodukt. Darüber hinaus wäre bei einer Produktion im technischen Maßstab eine
zusätzliche Anlage zur Rückgewinnung des eingesetzten Lösungsmittels erforderlich.
Ein weiterer Nachteil ist der zusätzliche Anfall großer Mengen an Abwasser, welches
seinerseits eine kostenintensive Behandlung oder sogar Entsorgung erfordert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines freie D-
Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement sowie
dessen Herstellung durch ein verbessertes Verfahren, das die zuvor genannten
Nachteile nicht mehr aufweist.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines freie D-
Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement, wobei
- a) ein D-Pantothensäure produzierender Organismus in einem Kulturmedium enthaltend wenigstens eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle, ohne die Zufütterung weiterer Vorstufen fermentiert wird und
- b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltende Fermentationslösung ohne die Durchführung weiterer Aufarbeitungsschritte einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, daß die
Fermentation solange durchgeführt wird, bis ein Feststoffgehalt von wenigstens 6 Gew.-%,
bevorzugt von 7-25 Gew.-% und/oder ein Gehalt an D-Pantothensäure
von wenigstens 2-15 Gew.-%, bevorzugt 4-15 Gew.-% erreicht wird
Dabei kann die Fermentation nach an sich bekannten Vorgehensweisen im batch-,
fed-batch- oder repeated-fed-batch-Betrieb oder bei kontinuierlicher Prozeßführung
durchgeführt werden. Unter einem Feststoffgehalt im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist die getrocknete Fermentationslösung enthaltend u. a. getrocknete
Biomasse, Mineralien und D-Pantothenat und/oder deren Salze zu verstehen. Zur
Bestimmung des Feststoffgehalts wird eine Probe der Fermentationslösung steril
entnommen und beispielsweise in einem Vakuumtrockenschrank 12 Stunden bei 120
°C getrocknet.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Stand
der Technik ist dabei, daß die Fermentationslösung nicht einer weiteren,
aufwendigen Aufarbeitung unterzogen werden muß, wie z. B. adsorptive Verfahren
über Aktivkohle, um ein Produkt zu liefern, das die Anforderungen an ein
Tierfuttersupplement der gewünschten Art erfüllt. Diese Anforderungen sind
beispielsweise ein relativ hoher Gehalt an D-Pantothensäure und eine gute
Verträglichkeit für den Zielorganismus sowie eine biologische Wertigkeit im Sinne der
"Vitamin-Wirkung" des erfindungsgemäßen Produktes, die der Wertigkeit der
chemisch synthetisierten D-Pantothensäure entspricht.
Der Reinheitsgrad der D-Pantothensäure als solche ist hier als nebensächlich
anzusehen, da sie für die Tierernährung in den meisten Fällen in Futtermischungen
eingearbeitet wird. Vielmehr ist ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen
Produktes gerade darin zu sehen, daß es aufgrund des zuvor genannten
Herstellungsverfahrens neben D-Pantothensäure weitere dem Wohlbefinden der
Tiere zuträgliche Bestandteile der Fermentationslösung, wie z. B. einen relativ hohen
Proteingehalt, während der Fermentation ggf. in das Medium sekretierte (ggf. sogar
essentielle) Aminosäuren, Mineralien, Vitamine u. a. Bestandteile enthält.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Einsparung
aufwendiger Aufarbeitungsschritte der Fermentationslösung zur Herstellung eines
Produktes mit guter biologischer Wertigkeit. Insbesondere zeichnet sich das
erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß die Bereitstellung des gewünschten
Wertstoffes völlig ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel erfolgt. Ferner
wird erfindungsgemäß die Menge an anfallendem Abwasser wesentlich reduziert.
Dies resultiert somit in weiteren Einsparungen an aufwendigen Aufbereitungs- und
Entsorgungsanlagen. Somit zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren in
vorteilhafter Weise dadurch aus, daß es einfacher, weniger störanfällig, weniger
zeitaufwendig, deutlich kostengünstiger und damit wirtschaftlicher ist, als
herkömmliche Verfahren.
Hierbei ist unter der Formulierung "produzieren" erfindungsgemäß zu verstehen, daß
der Organismus größere Mengen D-Pantothensäure und/oder deren Salze
synthetisieren kann, als für den eigenen Stoffwechselbedarf erforderlich sind. In einer
erfindungsgemäß vorteilhaften Variante liegt die synthetisierte Menge an D-
Pantothensäure und/oder deren Salze nicht zellintern vor, sondern wird idealerweise
vollständig aus dem Organismus in das Kulturmedium abgegeben. Dies
Ausschleusung kann aktiv oder passiv nach an sich bekannten Mechanismen
erfolgen.
Erfindungsgemäß werden als D-Pantothensäure produzierende Organismen
Mikroorganismen eingesetzt. Hierzu zählen erfindungsgemäß Pilze, Hefen und/oder
Bakterien. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Pilze wie beispielsweise Mucor oder
Hefen, wie z. B. Saccharomyces oder Debaromyces und hierbei bevorzugt
Saccharaomyces cerevisiae eingesetzt. Vorteilhaft werden erfindungsgemäß
coryneforme Bakterien oder Bacillaceae verwendet. Erfindungsgemäß umfaßt sind
bevorzugt z. B. Bakterien der Gattungen Corynebacterium, Escherichia, Bacillus,
Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebstella, Proteus,
Acinetobacter oder Rhizobium. Besonders bevorzugt sind hierbei beispielsweise
Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve oder Bacillus subtilis, B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus,
B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B.
thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus und andere Bacillusarten der Gruppe
1, die durch ihre 16sRNA charakerisiert sind oder Actinum mycetalis. Diese
Aufzählung dient der Erläuterung und ist keinesfalls limitierend für die vorliegende
Erfindung.
Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung auch den Einsatz genetisch
veränderter Organismen zur erfindungsgemäßen Herstellung eines
Tierfuttersupplements enthaltend freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze.
Solche genetisch veränderten Organismen können beispielsweise durch chemische
Mutagenese und anschließende Selektion durch eine geeignetes
"Screeningverfahren" isoliert werden. Erfindungsgemäß sind auch sogenannte
Produktionsstämme umfaßt, die zur Herstellung des Produktes im Sinne der
vorliegenden Erfindung geeignet sind und genetische Veränderungen hinsichtlich
des Stoffwechselflusses in Richtung D-Pantothensäure aufweisen, wobei auch
Veränderungen hinsichtlich der Ausschleusung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen über die Zellmembran inbegriffen sind.
Denkbar ist auch der Einsatz transgener Organismen, die aus der Übertragung
homologer und/oder heterologer Nukleotidsequenzen resultieren, welche zur
Synthese des gewünschten Produktes erforderlich sind oder förderlich sein können.
Hierbei ist die Überexpression und/oder Deregulation ein oder mehrerer Gene
einzeln und/oder in Kombination, lokalisiert im Genom und/oder auf einem Vektor,
denkbar.
Derartige transgene Organismen können in vorteilhafter Weise zusätzliche Kopien
und/oder genetisch veränderte Gene ausgewählt aus der Gruppe von panB, panC,
panD, panE und/oder deren Kombinationen und/oder sogar Organisationseinheiten,
wie das panBCD-Operon enthalten. Ferner können weitere Stoffwechselwege, wie z. B.
der Isoleucin-Valin-Biosyntheseweg, in den Organismen vorteilhaft manipuliert
sein, wie beispielsweise in der EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 oder EP 1 001 027
beschrieben ist. Dadurch werden verzweigtkettige Vorläufersubstanzen der
Pantothensäure-Biosynthese vermehrt zur Verfügung gestellt. Vorteilhaft werden
gegebenenfalls die Gene für diesen Biosyntheseweg d. h. ilvB, ilvN, ilvC und/oder
ilvD überexprimiert.
Darüber hinaus sind genetische Veränderungen der Aspartat-α-Decarboxylase
(panD), z. B. durch Überexpression und/oder Deregulation, in dem eingesetzten D-
Pantothensäure produzierenden Organismus erfindungsgemäß umfaßt. In
vorteilhafter Weise liegt so β-Alanin bereits in den Zellen in erhöhten
Konzentrationen gegenüber entsprechend nicht-genetisch veränderten Organismen
vor und muß somit nicht als Precursor dem Kulturmedium zugesetzt werden, wie es
beispielhaft in EP-A-0 590 857 beschrieben ist. Vorteilhaft sind Mikroorganismen,
deren Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin-Valin-(ilv)-Biosynthese und/oder
Asparat-α-Decarboxylase (panD) dereguliert ist.
Weiterhin ist eine zusätzliche Überexpression der Ketopanthoat-Reduktase (panE) in
den Mikroorganismen von Vorteil.
Weiterhin von Vorteil ist, wenn gegebenenfalls das coaA-Gen, das für die Synthese
von CoenzymA erforderlich ist, in seiner Aktivität erniedrigt ist oder (beispielsweise in
Bacillus-Arten) ganz ausgeschaltet ist. Bacillus enthält nämlich neben coaA ein
weiteres Gen für diese enzymatische Funktion (= coaX). Auch die Aktivität dieses
Gens coaX oder des korrespondierenden Enzyms kann verändert, bevorzugt
erniedrigt, oder sogar deletiert werden, sofern coaA selbst noch eine ausreichende,
wenn auch erniedrigte Enzymaktivität aufweist, d. h. die Enzymaktivität von coaA
nicht ganz verloren gegangen ist. Neben der Überexpression der verschiedenen
Gene ist auch eine genetische Manipulation der Promotorregionen dieser Gene in
der Art vorteilhaft, daß diese Manipulation zu einer Überexpression der Genprodukte
führt.
In einer Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung finden die gemäß der
Anlage (PCT/US-Anmeldung 0025993) beschriebenen Bakterienstämme, wie z. B.
PA 668 und/oder Derivate davon Einsatz. In einer bevorzugten Ausführungsvariante
findet erfindungsgemäß der Mikroorganismus Bacillus subtilis PA 377, wie gemäß
der Anlage (PCT/US-Anmeldung 0025993) beschrieben, Einsatz in dem
erfindungsgemäßen Verfahren. Dieser Stamm Bacillus subtilis PA 377 wurde wie
folgt hergestellt:
Ausgehend von dem Stamm Bacillus subtilis 168 (Marburg Stamm ATCC 6051), der den Genotyp trpC2 (Trp-) ausweist, wurde über Transduktion des Trp+ Markers (aus dem Bacillus subtilis Wildtyp W23) der Stamm PY79 erzeugt. In den Stamm PY79 wurden durch klassische gentechnische Methoden (wie z. B. in Harwood, C. R. and Cutting, S. M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England beschrieben) ΔpanB und ΔpanE1 Mutationen eingebracht.
Ausgehend von dem Stamm Bacillus subtilis 168 (Marburg Stamm ATCC 6051), der den Genotyp trpC2 (Trp-) ausweist, wurde über Transduktion des Trp+ Markers (aus dem Bacillus subtilis Wildtyp W23) der Stamm PY79 erzeugt. In den Stamm PY79 wurden durch klassische gentechnische Methoden (wie z. B. in Harwood, C. R. and Cutting, S. M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England beschrieben) ΔpanB und ΔpanE1 Mutationen eingebracht.
Der resultierende Stamm wurde mit genomischer DNA des Bacillus subtilis Stammes
PA221 (Genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp-)) und genomischer DNA des Bacillus
subtilis Stammes PA303 (Genotyp P26panE1) transformiert. Der resultierende Stamm
PA327 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1 und ist Tryptophan auxotroph (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA327 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium
(25 g/L Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L Difco Yeast Extract, 5 g/L Na-Glutamat, 2,7 g/L
Ammoniumsulfat auf 740 mL Wasser auffüllen, autoklavieren, anschließend
Zugabe von 200 mL 1 M Kaliumphosphat, pH 7,0 und 60 mL 50% steriler
Glucoselösung), das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert
war, Pantothensäure-Titer von bis zu 3,0 g/L (24 h) erreicht.
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stammes PA221 (Genotyp P26panBCD, trpC2
(Trp-)) ist in folgendem Abschnitt beschrieben:
Durch klassische gentechnische Methoden wurde mit Hilfe der Sequenzinformation des panBCD Operons von E. coli (siehe Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996: 247-252) ausgehend von einer Bacillus subtilis GP275 Plasmid-Bibliothek das panBCD Operon von Bacillus kloniert. Zur Klonierung wurde der E. coli Stamm BM4062 (birts) und die Information, daß das Bacillus Operon in der Nähe des birA Gens liegt, verwendet. Das panBCD Operon wurde in ein in E. coli replizierbares Plasmid eingebracht. Zur Verbesserung der Expression des panBCD Operons wurden starke, konstitutive Promotoren des Bacillus subtilis Phagen SP01 (P26) verwendet und die Ribosomenbindungsstelle (= RBS) vor dem panB-Gen durch eine artifizielle RBS ersetzt. Vor die P26panBCD Kassette auf dem Plasmid wurde ein DNA Fragment, das unmittelbar upstream des nativen panB Gens in Bacillus liegt, ligiert. Dieses Plasmid wurde in den Bacillus subtilis Stamm RL-1 (durch klassische Mutagenese erhaltenes Derivat des Bacillus subtilis 168 (Marburg Stamm ATCC 6051), Genotyp trpC2 (Trp-)) transformiert und durch homologe Rekombination wurde das native panBCD Operon durch das p26panBCD Operon ersetzt. Der resultierende Stamm heißt PA221 und hat den Genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp-). Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA221 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium, das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 0,92 g/L (24 h) erreicht.
Durch klassische gentechnische Methoden wurde mit Hilfe der Sequenzinformation des panBCD Operons von E. coli (siehe Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996: 247-252) ausgehend von einer Bacillus subtilis GP275 Plasmid-Bibliothek das panBCD Operon von Bacillus kloniert. Zur Klonierung wurde der E. coli Stamm BM4062 (birts) und die Information, daß das Bacillus Operon in der Nähe des birA Gens liegt, verwendet. Das panBCD Operon wurde in ein in E. coli replizierbares Plasmid eingebracht. Zur Verbesserung der Expression des panBCD Operons wurden starke, konstitutive Promotoren des Bacillus subtilis Phagen SP01 (P26) verwendet und die Ribosomenbindungsstelle (= RBS) vor dem panB-Gen durch eine artifizielle RBS ersetzt. Vor die P26panBCD Kassette auf dem Plasmid wurde ein DNA Fragment, das unmittelbar upstream des nativen panB Gens in Bacillus liegt, ligiert. Dieses Plasmid wurde in den Bacillus subtilis Stamm RL-1 (durch klassische Mutagenese erhaltenes Derivat des Bacillus subtilis 168 (Marburg Stamm ATCC 6051), Genotyp trpC2 (Trp-)) transformiert und durch homologe Rekombination wurde das native panBCD Operon durch das p26panBCD Operon ersetzt. Der resultierende Stamm heißt PA221 und hat den Genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp-). Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA221 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium, das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 0,92 g/L (24 h) erreicht.
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stamms PA303 (Genotyp P26panE1) ist in
folgendem Abschnitt beschrieben:
Mit Hilfe der E. coli panE Gensequenz wurde die Bacillus panE Sequenz analog kloniert. Es zeigte sich, daß in B. subtilis zwei Homologe des panE Gens von E. coli existieren, die mit panE1 und panE2 bezeichnet wurden. Durch Deletionsanalysen zeigte sich, daß das panE1 Gen für 90% der Pantothensäure Produktion verantwortlich ist, während die Deletion des panE2 Gens keinen signifikanten Effekt auf die Pantothensäure Produktion hatte. Auch hier wurde analog zur Klonierung des panBCD Operons der Promotor durch den starken konstitutiven Promotor P26 ersetzt und die Ribosomenbindungsstelle vor dem panE1 Gen durch die artifizielle Bindungsstelle ersetzt. Das P26panE1 Fragment wurde in einen Vektor kloniert, des so gestaltet war, daß das P26panE1 Fragment in den original panE1 locus im Genom von Bacillus subtilis integrieren konnte. Der nach Transformation und homologer Rekombination resultierende Stamm heißt PA303 und hat den Genotyp P26panE1. Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA303 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium, das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 1,66 g/L (24 h) erreicht.
Mit Hilfe der E. coli panE Gensequenz wurde die Bacillus panE Sequenz analog kloniert. Es zeigte sich, daß in B. subtilis zwei Homologe des panE Gens von E. coli existieren, die mit panE1 und panE2 bezeichnet wurden. Durch Deletionsanalysen zeigte sich, daß das panE1 Gen für 90% der Pantothensäure Produktion verantwortlich ist, während die Deletion des panE2 Gens keinen signifikanten Effekt auf die Pantothensäure Produktion hatte. Auch hier wurde analog zur Klonierung des panBCD Operons der Promotor durch den starken konstitutiven Promotor P26 ersetzt und die Ribosomenbindungsstelle vor dem panE1 Gen durch die artifizielle Bindungsstelle ersetzt. Das P26panE1 Fragment wurde in einen Vektor kloniert, des so gestaltet war, daß das P26panE1 Fragment in den original panE1 locus im Genom von Bacillus subtilis integrieren konnte. Der nach Transformation und homologer Rekombination resultierende Stamm heißt PA303 und hat den Genotyp P26panE1. Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA303 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium, das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 1,66 g/L (24 h) erreicht.
Die weitere Stammkonstruktion erfolgte durch Transformation von PA327 mit einem
Plasmid, welches das P26ilvBNC Operon und das Marker-Gen für Spectinomycin
enthielt. Das P26ilvBNC Operon integrierte in den amyE locus, was durch PCR
nachgewiesen wurde. Ein Transformante wurde als PA340 (Genotyp P26panBCD,
P26panE1, P26ilvBNC, specR, trpC2 (Trp-)) bezeichnet.
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA340 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium,
das nur mit 5 g/L β-Alanin supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 3,6 g/L
(24 h) erreicht, in 10 ml Kulturen mit SVY-Medium, das mit 5 g/L β-Alanin und 5 g/L
α-Ketoisovalerat supplementiert war, wurden Pantothensäure-Titer von bis zu 4,1 g/L
(24 h) erreicht.
Des weiteren wurde in den Stamm PA340 eine deregulierte ilvD-Kassette
eingebracht. Dazu wurde ein Plasmid, welches das ilvD Gen unter der Kontrolle des
P26Promotors mit der artifiziellen RBS2 enthält, in PA340 transformiert. Dabei wurde
das P26ilvD Gen durch homologe Rekombination in den original ilvD locus integriert.
Der resultierende Stamm PA374 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC,
P26ilvD, specR, und trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA374 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium,
das nur mit 5 g/L β-Alanin supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu 2,99 g/L
(24 h) erreicht.
Um mit dem Stamm PA374 β-Alanin zufütterungsfrei Pantothensäure zu
produzieren, wurden zusätzliche Kopien des für die Aspartat-α-decarboxylase
kodierenden Gens panD in den Stamm PA374 eingebracht. Dazu wurde
chromosomale DNA des Stammes PA401, der nachfolgend beschrieben wird, in
PA374 transformiert. Durch Selektion auf Tetrazyklin wurde der Stamm PA377
erhalten.
Der resultierende Stamm PA377 hat den Genotyp P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC,
P26ilvD, specR, tetR und trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA377 wurde in 10 mL Kulturen mit SVY-Medium
Vorstufen-zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von bis zu 1,31 g/L (24 h) erreicht.
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stamms PA401 (Genotyp P26panD) ist in
folgendem Abschnitt beschrieben:
Das Bacillus subtilis panD Gen wurde aus dem panBCD Operon in einen Vektor, der das Tetrazyklin Marker Gen trägt, kloniert. Vor das panD Gen wurde der Promotor P26 und eine oben beschriebene artifizielle RBS kloniert. Durch Restriktionsverdau wurde ein Fragment, das das Tetrazyklin Marker Gen und das P26panD Gen enthielt, hergestellt. Dieses Fragment wurde religiert und in den oben beschriebenen Stamm PA221 transformiert. Dabei integrierte das Fragment in das Genom des Stamms PA211. Der resultierende Stamm PA401 hat den Genotyp P26panBCD, P26panD, tetR und trpC2 (Trp-).
Das Bacillus subtilis panD Gen wurde aus dem panBCD Operon in einen Vektor, der das Tetrazyklin Marker Gen trägt, kloniert. Vor das panD Gen wurde der Promotor P26 und eine oben beschriebene artifizielle RBS kloniert. Durch Restriktionsverdau wurde ein Fragment, das das Tetrazyklin Marker Gen und das P26panD Gen enthielt, hergestellt. Dieses Fragment wurde religiert und in den oben beschriebenen Stamm PA221 transformiert. Dabei integrierte das Fragment in das Genom des Stamms PA211. Der resultierende Stamm PA401 hat den Genotyp P26panBCD, P26panD, tetR und trpC2 (Trp-).
Mit dem Bacillus subtilis Stamm PA401 wurde in 10 mL Kulturen in SVY-Medium,
das mit 5 g/L α-Ketoisovalerat supplementiert war, Pantothensäure-Titer von bis zu
0,3 g/L (24 h) erreicht. In 10 mL Kulturen mit SVY-Medium das mit 5 g/L D-
Pantoinsäure und 10 g/L L-Aspartat supplementiert war, wurden Pantothensäure-
Titer von bis zu 2,2 g/L (24 h) erreicht.
Die genaue Konstruktion der Stämme ist gemäß der Anlage der PCT/US-Anmeldung
0025993 zu entnehmen.
Mit dem oben beschriebenen Stamm PA377 wird bei Glucose-limitierter
Fermentation in SVY-Medium (25 g/L Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L Difco Yeast
Extract, 5 g/L Tryptophan, 5 g/L Na-Glutamat, 2 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L KH2PO4, 20 g/L
K2HPO4, 0,1 g/L CaCl2, 1 g/L MgSO4, 1 g/L Natriumcitrat, 0,01 g/L FeSO4.7H2O
und 1 ml/L einer Spurensalzlösung folgender Zusammensetzung: 0,15 g Na2MoO4 ×
2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4
H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O, mit Wasser auf 1 l aufgefüllt)) im 10 L Maßstab bei
kontinuierlicher Zufütterung einer Glucose-Lösung in 36 h (48 h) Pantothensäure-
Konzentrationen in der Fermentationsbrühe von 18-19 g/L (22-25 g/L) erreicht.
Durch Medien-, Stamm- und Fermentationsverfahrensentwicklung können die
Pantothensäure-Titer in den Fermentationsbrühen auf über 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, und < 90 g/L gesteigert werden.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die
Fermentation in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das außer wenigstens einer
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle als Ausgangsverbindungen keine weiteren
Vorstufen (Precursor) enthält. D. h. die Biosynthese von D-Pantothensäure ist von der
Zufütterung weiterer Vorstufen unabhängig. Unter solchen Vorstufen sind
erfindungsgemäß Substanzen wie z. B. β-Alanin und/oder L-Aspartat und/oder L-
Valin und/oder α-Ketoisovalerat und/oder deren Kombinationen zu verstehen.
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahren wird die
Fermentation des D-Pantothensäure produzierenden Organismus in einem
Kulturmedium durchgeführt, welches wenigstens eine Kohlenstoff- und eine
Stickstoffquelle als Vorstufe, aber kein dem Medium zugesetztes β-Alanin enthält.
Die Unabhängigkeit von der Zufütterung von Vorstufen stellt insbesondere einen
wesentlichen wirtschaftlichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber
bekannten Verfahren dar, da eine Vielzahl von Vorstufen sehr teuer sind.
Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Kohlenstoffquellen zum Einsatz in einem
Kulturmedium zur Fermentation der zuvor genannten Organismen sind Zucker, wie
Stärkehydrolysate (Mono-, Di-, Oligosaccharide), bevorzugt Glucose oder
Saccharose sowie Rüben- oder Rohrzuckermelasse, Proteine, Proteinhydrolysate,
Sojamehl, Maisquellwasser, Fette, freie Fettsäuren, rückgeführte Zellen aus bereits
durchgeführten Fermentationen oder deren Hydrolysate sowie Hefeextrakt. Auch
diese Aufzählungen sind nicht limitierend für die vorliegende Erfindung, ebenso wie
die nachfolgenden Beispiele geeigneter Stickstoffquellen, wie Ammoniak,
Ammoniumsulfat, Harnstoff, Proteine, Proteinhydrolysate oder Hefeextrakt. Ferner
enthält das Fermentationsmedium Mineralsalze und/oder Spurenelemente, wie
Aminosäuren und Vitamine. Die genauen Zusammensetzungen geeigneter
Fermentationsmedien sind zahlreich bekannt und dem Fachmann zugänglich.
Nach Inokkulation des Fermentationsmediums mit einem geeigneten D-
Pantothensäure produzierenden Organismus mit dem Fachmann bekannten
Zelldichten erfolgt ggf. unter Zusatz eines Antischaummittels die Kultivierung des
Organismus. Die Fermentation wird erfindungsgemäß so geführt, daß sie bei
Beendigung wenigstens einen Feststoffgehalt der getrockneten Fermentationslösung
von wenigstens 6 Gew.-% und einen Gehalt an freier D-Pantothensäure von
wenigstens 2 Gew.-%, bevorzugt von wenigstens 4 Gew.-% aufweist. Dazu kann die
Fermentation im batch-, fed-batch- oder repeated-fed-batch-Betrieb unter
Zudosierung der Kohlenstoffquelle durchgeführt oder kontinuierlich betrieben
werden. Die Fermentationstemperatur liegt bei 10-70°C, bevorzugt bei 20-50°C.
Die Begasung des Fermenters erfolgt mit Sauerstoff, Luft oder Mischungen mit
Stickstoff oder anderen Inertgasen. Der pH-Wert wird auf einen Wert im Bereich von
4-8, bevorzugt 5-7,5 eingestellt und ggf. durch Zudosierung geeigneter Basen
und/oder Säuren reguliert.
Ferner zeichnet sich das vorliegende Verfahren in vorteilhafter Weise dadurch aus,
daß der Gesamt-Zuckergehalt bis zum Ende der Fermentation auf ein Minimum
reduziert wird, da dieser anderenfalls die spätere Trocknung und/oder Formulierung
der Fermentationslösung durch Verkleben erschwert. Dies kann erfindungsgemäß
dadurch erreicht werden, daß die Fermentation noch einige Zeit weitergeführt wird,
nachdem die Kohlenstoffquelle verbraucht ist (bei Kultivierung im batch-Betrieb) oder
nachdem die Kohlenstoffzufuhr (bei einer Prozeßführung im fed-batch oder repeated-
fed-batch-Betrieb) unterbrochen ist und/oder derart reguliert ist, daß die
Konzentration der Kohlenstoffquelle nahezu Null ist (bei fed-batch, repeated-fed-
batch oder kontinuierlicher Prozeßführung).
Dies erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß nach Unterbrechung der Zudosierung
der Kohlenstoffquelle (z. B. Zuckerlösung) die Fermentation bis zum Erreichen der
Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2) auf wenigstens 80%, bevorzugt 90% und
besonders bevorzugt 95% des Sättigungswertes in der Fermentationslösung
weitergeführt wird.
Erfindungswesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner, daß die
Fermentationslösung ohne die Durchführung weiterer Aufarbeitungsschritte einer
Trocknung und/oder Formulierung unterzogen werden kann. D. h. aufwendige
Aufarbeitungsschritte zur Isolierung des gewünschten D-Pantothensäure
enthaltenden Wertproduktes aus der Fermentationslösung, wie z. B. adsorptive
Aufreinigungen über Aktivkohle, sind nicht erforderlich. Eine Abtrennung der
Biomasse aus der Fermentationslösung ist ebenfalls nicht zwingend erforderlich, so
daß der Proteingehalt des erfindungsgemäßen Produktes, d. h. des D-
Pantothensäure enthaltenden Tierfuttersupplements einen Proteingehalt von bis zu
50 Gew.-% aufweisen kann.
Die Trocknung und/oder Formulierung der Fermentationslösung erfolgt nach an sich
bekannten Verfahren, wie beispielsweise Sprühtrocknung, Sprühgranulation,
Wirbelschichttrocknung, Wirbelschichtgranulation, Trommeltrocknung oder Spin-flash
Trocknung (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 1999,
electronic release, Kapitel "Drying of Solid Materials"). Die Gaseintrittstemperatur bei
Konvektionstrocknung liegt im Bereich von 100-280°C, bevorzugt bei 120-210°C.
Die Gasaustrittstemperatur liegt bei 50-180°C, bevorzugt bei 60-150°C. Zur
Einstellung einer gewünschten Partikelgrößenverteilung und der damit verbundenen
Produkteigenschaften können Feinpartikel abgetrennt und zurückgeführt werden.
Ferner kann Grobgut in einer Mühle gemahlen und ebenfalls anschließend
zurückgeführt werden. Das erfindungsgemäße Produkt weist beispielsweise eine
beige bis braune Färbung auf. Ferner enthält es einen Restwassergehalt von
weniger als 5 Gew.-%, bevorzugt 1-3 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,5-
2 Gew.-%. Um ein Verklumpen des Produktes zu vermeiden, sollte ein Wassergehalt
von 5 Gew.-% nicht überschritten werden. Ein schematisches Blockfließdiagramm
des zuvor genannten Verfahrens ist in Fig. 1 zusammengefaßt.
In einer Variante des zuvor genannten erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vor der
Trocknung und/oder Formulierung der Fermentionslösung ggf. eine Abtrennung der
Biomasse von der Fermentationslösung. Diese Abtrennung kann nahezu vollständig
oder nur teilweise erfolgen. Bevorzugt wird eine teilweise Abtrennung der Biomasse,
wodurch der Proteingehalt auf unter 10 Gew.-% gesenkt werden kann. Zur Erzielung
einer nahezu vollständigen Abtrennung der Biomasse können die Feststoffanteile
von der wässrigen Flüssigkeit beispielsweise durch Zentrifugation abgetrennt
werden. Bezogen auf das getrocknete Endprodukt kann in einer weiteren Variante
der Erfindung sogar ein Proteingehalt von weniger als 5 Gew.-% eingestellt werden.
Die abgetrennte Biomasse kann in vorteilhafter Weise genutzt werden, um die
natürlichen und in bestimmten Toleranzbereichen auftretenden Schwankungen des
D-Pantothensäuregehaltes in den Fermentationslösungen unterschiedlicher
Produktionsansätze auszugleichen. Beispielsweise kann nach Abtrennung der
Biomasse mehrerer unterschiedlicher Ansätze durch die erneute Zugabe von zuvor
abgetrennter Biomasse ein Produkt mit gleichbleibend konstantem Gehalt an D-
Pantothenat und/oder deren Salze geliefert werden. Dies garantiert ein Produkt mit
reproduzierbar konstanter Qualität.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vor der
Trocknung und/oder Formulierung der Fermentionslösung und ggf. nach einer
Abtrennung der Biomasse eine Aufkonzentrierung der Fermentationslösung zur
Erhöhung des Feststoffgehaltes enthaltend D-Pantothensäure und/oder deren
Salzen erfolgen. Dies kann beispielsweise durch Wasserentzug durch eine
Eindampfung erreicht werden, die aus Kostengründen ggf. mehrstufig ausgeführt
sein kann und zur Schonung des Produktes neben Normaldruck auch im Vakuum
durchgeführt werden kann. Eine weitere Möglichkeit ist die Nutzung eines
Membranverfahrens. Hier können beispielsweise Verfahren wie Nanofiltration
und/oder Umkehrosmose verwendet werden. Die Aufkonzentrierung kann bis zu
einem D-Pantothensäure-Gehalt von 20 bis 50 Gew.-% erfolgen. Gegebenenfalls
kann gleichzeitig eine Rückführung des Wasser in den Fermentationsprozeß
vorgenommen werden. Dadurch wird in vorteilhafter Weise die anfallende Menge an
Abwasser reduziert, wodurch der Aufwand für die Abwasserbehandlung wesentlich
gesenkt wird. Dies ist schematisch in Fig. 2 dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung liegt eine
Kombination von Abtrennung der Biomasse und Aufkonzentrierung der
verbleibenden Fermentationslösung, ggf. bei gleichzeitiger Rückführung des
Wassers, vor. Eine Darstellung im Blockfließdiagramm ist in Fig. 3 gezeigt.
Hierzu kann zur Einstellung eines konstanten Wertstoffgehaltes im Produkt bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren nach Ende der Fermentation die Biomasse oder ein
Teil davon z. B. mittels Separation, Zentrifugation, Ultra-, Mikro- oder Tiefenfiltration
oder Kombinationen abgetrennt werden. Die so erhaltene Biomasse kann ihrerseits
nochmals mittels eines Dekanters weiter entfeuchtet werden. Der Klarlauf des
Dekanters wird dann zum Zulauf des Separators zurückgeführt. Durch die
Zellabtrennung kann der Gehalt der D-Pantothensäure im Produkt erhöht werden
bzw. der Gehalt auf einen konstanten Wert eingestellt werden, in dem verschiedene
Fraktionen miteinander vermischt werden, so daß auch schwankende Gehalte aus
der Fermentation problemlos verarbeitet werden können. Anschließend kann eine
weitere Aufkonzentrierung der Fermentationslösung erfolgen. Die Gehalte bezogen
auf die freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze liegen bei 20-95 Gew.-%,
bevorzugt 30-90 Gew.-%. Besonders bevorzugt weist das resultierende Produkt
einen hohen Gehalt an freier D-Pantothensäure und/oder deren Salze von 60-80 Gew.-%
und insbesondere von mehr als 80 Gew.-% auf.
In weiteren Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vor der Trocknung
und/oder Formulierung der Fermentionslösung wenigstens einer der nachfolgenden
Schritte umfassend
- 1. Lyse und/oder Abtötung der Biomasse und/oder
- 2. Abtrennung der Biomasse von der Fermentationslösung und/oder
- 3. Zugabe weiterer Zuschlagstoffe und/oder
- 4. Konzentrierung der Fermentationslösung, bevorzugt durch Wasserentzug und ggf. gleichzeitiger Rückführung des Wassers in den Fermentationsprozeß und/oder
- 5. Kombinationen der Schritte 1) bis 4) durchgeführt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Verfahren, wobei die Lyse
und/oder Abtötung der Biomasse noch in der Fermentationslösung oder erst nach
der Abtrennung der Biomasse von der Fermentationslösung durchgeführt wird. Dies
kann beispielsweise durch eine Temperaturbehandlung, bevorzugt bei 80-200°C
und/oder eine Säurebehandlung, bevorzugt mit Schwefelsäure oder Salzsäure
und/oder enzymatisch, bevorzugt mit Lysozym erfolgen. Ein Blockfließschema zur
Verdeutlichung ist in Fig. 4 gezeigt.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschreibt ein
Vorgehen, bei dem der Fermentationslösung vor der Aufkonzentrierung und/oder vor
der Trocknung und/oder Formulierung weitere Zuschlagstoffe und/oder Mischungen
davon zur Einstellung eines einheitlichen Gehaltes an D-Pantothensäure und/oder
zur Verbesserung der Produkteigenschaften, wie Staubverhalten,
Fließeigenschaften, Wasseraufnahmefähigkeit und Lagerstabilität zugesetzt werden.
Beispiele für solche Zuschlagstoffe und/oder Mischungen davon können auf der
Basis von Zuckern z. B. Lactose oder Maltodextrin, auf der Basis von Getreide- oder
Hülsenfruchtprodukten z. B. Maisspindelmehl, Weizenkleie und Sojaschrot, auf der
Basis von Mineralsalzen u. a. Calcium-, Magnesium-, Natrium-, Kaliumsalze, sowie
auch D-Pantothensäure oder deren Salze selbst (chemisch oder fermentativ
hergestelltes D-Pantothensäuresalz) sein. Die Zugabe kann vor der Trocknung
und/oder während des Granulierungs- bzw. Formulierungsschritts selbst erfolgen.
Dies ist zusammenfassend in Fig. 5 verdeutlicht.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung wird ein Calcium-D-
Pantothenat hergestellt, indem in einem möglichst späten Schritt des
erfindungsgemäßen Verfahrens, also bevorzugt vor und/oder während der
Aufarbeitung der Fermentationslösung, d. h. vor und/oder während der
Konzentrierung und/oder Trocknung und/oder Formulierung der Fermentationslösung
(siehe Fig. 5) die Zugabe von Calciumsalzen erfolgt. Hierbei wird der Gehalt an
Calciumionen durch Zugabe von Calciumsalzen so eingestellt, daß etwa 1 mol
Calciumsalz pro 2 mol D-Pantothensäure im formulierten Endprodukt enthalten sind.
Dabei kann der Gehalt an Calciumionen, der bereits in der Fermentationslösung
enthalten ist, vorteilhaft berücksichtigt werden. Als Calciumsalze können z. B.
Calciumoxid, Calciumhydroxid, Calciumhydrogenphosphat, Calciumcarbonat,
Calciumsulfat, Calciumchlorid und/oder ein anderes Calciumsalz verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren, bei dem bezogen auf
den Gehalt an D-Pantothensäure im formulierten Produkt vor und/oder während der
Aufkonzentrierung, Trocknung und/oder Formulierung 1 mol Calciumionen pro 2 mol
D-Pantothensäure in Form eines Calciumsalzes als Zuschlagstoff zugesetzt werden.
Darüber hinaus kann in einer anderen Variante des erfindungsgemäß durch die
Komposition des Fermentationsmediums und hier insbesondere die Auswahl der
Mineralsalze mit einem speziellen Kation ein Produkt hergestellt werden, das
vermehrt ein ausgewähltes Salz der D-Pantothensäure enthält. Beispielsweise kann
durch die Verwendung von Di-Kaliumhydrogenphosphat/Kaliumdihydrogenphosphat-
Puffer bereits im Verlauf der Fermentation ein Produkt hergestellt werden, das
weitgehend Kalium-D-Pantothensäure enthält. Denkbare Salze sind z. B. Calcium-,
Kalium-, Magnesium-, Natrium- oder Ammoniumsalze der D-Pantothensäure oder
beliebige Mischungen davon. Ein Blockfließdiagramm ist in Fig. 6 dargestellt.
Erfindungsgemäß sind alle zuvor genannten Varianten sowie die in den Fig. 1 bis 6
gezeigten Vorgehensweisen frei kombinierbar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Tierfuttersupplement
hergestellt nach einem der zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis einer durch
Fermentation wenigstens eines D-Pantothensäure produzierenden Organismus
erhaltenen Fermentationslösung enthaltend wenigstens freie D-Pantothensäure
und/oder deren Salze in einer Konzentration von wenigstens 30-95 Gew.-%, einen
Gesamt-Zuckeranteil von 0,1-15 Gew.-% und einen Proteingehalt von weniger als 5
bis 50 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse.
Das erfindungsgemäße Tierfuttersupplement zeichnet sich dadurch aus, daß es 50-
95 Gew.-%, bevorzugt 70-95 Gew.-%, besonders bevorzugt 60-80 Gew.-% und
insbesondere mehr als 80 Gew.-% an freier D-Pantothensäure und/oder deren Salze
enthält.
Erfindungsgemäß enthält die unbehandelte Fermentationslösung als Basis für das
erfindungsgemäße Tierfuttersupplement wenigstens 10 g/l, bevorzugt wenigstens 20 g/l,
und besonders bevorzugt wenigstens 40 g/l D-Pantothenat und/oder deren Salze.
Ferner kann das Tierfuttersupplement der vorliegenden Erfindung Calcium-, Kalium-,
Magnesium-, Natrium- und/oder Ammoniumsalze der D-Pantothensäure und/oder
Mischungen davon enthalten.
Eine besondere Variante des erfindungsgemäßen Tierfuttersupplements zeichnet
sich durch eine Zusammensetzung der Trockenmasse mit wenigstens folgenden
Komponenten aus:
| a) freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze | wenigstens 30-95 Gew.-% |
| b) Proteine | max. 50 Gew.-% |
| c) Gesamtzucker | max. 15 Gew.-% |
| d) Mineralstoffe | max. 20 Gew.-% |
Erfindungsgemäß kann das Tierfuttersupplement einen Proteingehalt von maximal
50 Gew.-% als Obergrenze und als Untergrenze weniger als 10 Gew.-%, bevorzugt
weniger als 7 Gew.-% und besonders bevorzugt von weniger als 5 Gew.-%
enthalten. Der Gesamt-Zuckeranteil des Tierfuttersupplements beträgt maximal etwa
15 Gew.-% und kann als untere Grenze weniger als etwa 0,1 Gew.-% enthalten,
wobei alle Zwischenstufen denkbar sind. Hinsichtlich seines Wassergehaltes
zeichnet sich das erfindungsgemäße D-Pantothensäure enthaltende Produkt durch
einen Restwassergehalt von weniger als 5 Gew.-%, bevorzugt 1-3 Gew.-% und
besonders bevorzugt von 0,5-2 Gew.-% aus.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Tierfuttersupplement
enthaltend unbelebte, lebende und/oder vermehrungsfähige Anteile an D-
Pantothensäure produzierenden Organismen. Bevorzugt handelt es sich dabei um
Mikroorganismen, bevorzugt Pilzen, Hefen und/oder Bakterien. Besonders bevorzugt
enthält das erfindungsgemäße Tierfuttersupplement unbelebte, lebende und/oder
vermehrungsfähige Anteile an Pilzen der Gattung Mucor, Hefen der Gattung
Saccharomyces und/oder Bakterien der Enterobakteriaceae, wie E. coli,
Salmonellen, wie Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonaden, wie
Pseudomonas matophila, Bacillaceae, wie Bacillus subtilis oder Bacillus cereus,
coryneformer Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium breve
und/oder Actinum mycetalis und/oder Mischungen davon. Ganz besonders bevorzugt
sind Bakterien der Gattung Bacillus und hierbei der Spezies Bacillus subtilis. Ebenso
sind genetisch veränderte und/oder transgene Organismen und/oder zur Herstellung
von Tierfuttersupplementen geeignete Produktionsstämme erfindungsgemäß umfaßt.
Die vorangehende Aufzählung ist dabei nicht limitierend für die vorliegende
Erfindung.
Ferner ist erfindungsgemäß ein Tierfuttersupplement eingeschlossen, das weitere
Zuschlagstoffe, bevorzugt auf Basis von Zuckern und/oder Getreide- und/oder
Hülsenfrüchten und/oder Mineralsalzen und/oder (separat hergestellte chemisch
und/oder fermentativ hergestellte) D-Pantothensäure und/oder deren Salze und/oder
deren Mischungen enthält.
Das erfindungsgemäße Tierfuttersupplement ist ferner charakterisiert durch eine
Formulierung mit einer Schüttdichte von 0,35 bis 0,7 kg/l, bevorzugt 0,4 bis 0,6 kg/l.
Dabei weist es erfindungsgemäß einen mittleren Korndurchmesser im Bereich von
10-2000 µm, bevorzugt von 20-1500 µm, besonders bevorzugt von 25-1000 µm
und höchst bevorzugt von 30-800 µm auf. Es hat eine beige bis braune Farbe. Das
erfindungsgemäße Tierfuttersupplement kann als Pulver, Granulat, Pellet, mit einem
Überzug versehen ("coated") und/oder als Kombinationen davon vorliegen. Die
Formulierung des erfindungsgemäßen Tierfuttersupplements, beispielsweise durch
umhüllende Verbindungen, dient z. B. zur Verbesserung der Produkteigenschaften,
wie Staubverhalten, Fließeigenschaften, Wasseraufnahmefähigkeit und
Lagerstabilität.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung des
Tierfuttersupplements mit den zuvor dargestellten Eigenschaften als Zusatz zu
Tierfutter und/oder Tierfutterergänzungsmitteln.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung,
wirken sich jedoch nicht limitierend aus:
In einem Laborfermenter mit Rührer und Begasungseinrichtung mit 14 l Inhalt wurde
wässriges Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung vorgelegt:
| Hefeextrakt | 20 g/l |
| Tryptophan | 5 g/l |
| Ammoniumsulfat | 2 g/l |
| Natriumglutamat | 5 g/l |
Nach der Sterilisation wurden folgende Medienkomponenten zusätzlich zugegeben:
| KH2PO4 | 10,00 g/l |
| K2HPO4 × 3H2O | 20,00 g/l |
| Glucose | 10,00 g/l |
| MgCl2 × 6H2O | 1,00 g/l |
| CaCl2 × 2H2O | 0,10 g/l |
| Natriumcitrat | 1,00 g/l |
| FeSO4 × 7H2O | 0,01 g/l |
| Spurensalz-Lösung | 6,00 ml/l |
Die Spurensalz-Lösung setzt sich wie folgt zusammen:
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.
0,15 g Na2MoO4 × 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 × 6H2O, 0,25 g CuSO4 × 5H2O, 1,6 g MnCl2 × 4H2O, 0,3 g ZnSO4 × 7H2O werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.
Die Zugabe der Spurensalzlösung erfolgt über eine Sterilfiltration. Das
Anfangsflüssigkeitsvolumen beträgt 6 l. Die oben angeführten Gehalte sind auf
diesen Wert bezogen.
Dieser Lösung wird 60 ml Impfkultur (OD600 = 9,5) von Bacillus subtilis PA 377
zugesetzt und bei 37°C bei 200 U/min bei einer Begasungsrate von 12 l/min
fermentiert. Dieser Stamm ist gemäß der Anlage in der PCT/US-Anmeldung 0025993
beschrieben.
Innerhalb von 72 h wurden 4,5 l einer sterilen, wässrigen Lösung zudosiert. Die
Zusammensetzung war:
| Glucose | 400,0 g/l |
| CaCl2 × 2H2O | 0,4 g/l |
| Hefeextrakt | 25,0 g/l |
Während der Fermentation wurde der pH-Wert bei 7,2 durch die Zudosierung von
Ammoniak in die Fermenterzuluft bzw. von Phosphorsäure gehalten. Ammoniak
dient gleichzeitig als Stickstoffquelle für die Fermentation. Die Drehzahl des
Rührorgans wurde geregelt, indem der Gelöstsauerstoffgehalt auf 30% des
Sättigungswertes gehalten wurde. Nach Abbruch der Zudosierung der
Kohlenstoffquelle wurde die Fermentation so lange weitergeführt, bis der
Gelöstsauerstoffgehalt (pO2) einen Wert von 95% des Sättigungswertes erreicht hat.
Danach wurde die Fermentation beendet und der Organismus thermisch abgetötet.
Dazu wurde die Fermentationslösung bei 1 h bei 100°C gehalten. Die Abtötung
wurde durch Ausplattieren nachgewiesen. Die Konzentration an D-Pantothensäure
bei Abbruch nach 72 h betrug 28 g/l.
In analoger Weise lassen sich auch Fermentationsbrühen erzeugen, die β-Alanin-
zufütterungsfrei Pantothensäure-Titer von über 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, und < 90 g/L aufweisen.
Bei dieser Fermentation wurde das Gegenion der D-Pantothensäure durch die
Verwendung eines Di-Kaliumhydrogenphosphat/Kaliumdihydrogenphosphat-Puffers
in der Fermentation so eingestellt, daß man weitgehend das Kaliumsalz der D-
Pantothensäure, also Kalium-D-Pantothenat erhält.
Die Herstellung von D-Pantothensäure-haltiger Fermentationslösung erfolgt nach
Beispiel 1 der US 6,013,492 mit Escherichia coli IFO 814/pFV 31. Im Anschluß daran
wird die Fermentation bis zum vollständigen Verbrauch der Kohlenstoffquelle weiter
begast, bis der Gelöstsauerstoffgehalt (pO2) auf über 80% angestiegen ist.
Anschließend werden die Zellen mit einem Separator abgetrennt. Der Gehalt an D-
Pantothensäure liegt hier bei 38,5 g/l. Nach einer Eindampfung mit einem
Rotationsverdampfer unter Vakuum (< 100 mbar) auf einen Feststoffgehalt von etwa
45 Gew.-% wird das Konzentrat in einem Laborsprühtrockner unter folgenden
Bedingungen getrocknet:
| Gaseintrittstemperatur: | 100-250°C |
| Gasaustrittstemperatur: | 60-150°C |
Man erhält ein rieselfähiges Produkt mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 20-
300 µm.
Fermentationslösung (1 l) aus Beispiel 1 wird in einem Laborsprühtrockner unter
folgenden Bedingungen getrocknet:
| Gaseintrittstemperatur: | 100-250°C |
| Gasaustrittstemperatur: | 60-150°C |
Man erhält ein rieselfähiges Produkt mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 20-
-300 µm.
Die Biomasse aus Fermentationslösung (1 l) aus Beispiel 1 wird in einer Zentrifuge
abzentrifugiert. Der Überstand wird mit 30 g Lactose versetzt und in einem
Laborsprühtrockner unter folgenden Bedingungen getrocknet:
| Gaseintrittstemperatur: | 100-250°C |
| Gasaustrittstemperatur: | 60-150°C |
Man erhält ein rieselfähiges Produkt mit einem Partikeldurchmesser von 40-500 µm
und einem Gehalt an freier D-Pantothensäure < 30 Gew.-%.
Die Biomasse aus Fermentationslösung (1 l) aus Beispiel 1 wird in einer Zentrifuge
abzentrifugiert. Der Überstand wird mit 100 g chemisch hergestelltem Calcium-D-
Pantothenat versetzt und in einem Laborsprühtrockner unter folgenden Bedingungen
getrocknet:
| Gaseintrittstemperatur: | 100-250°C |
| Gasaustrittstemperatur: | 60-150°C |
Man erhält ein rieselfähiges Produkt mit einem Partikeldurchmesser von 40-500 µm
und einem Gehalt an freier D-Pantothensäure < 60 Gew.-%.
Eine D-Pantothensäure-haltige Fermentationslösung enthält nach Abtrennung der
Biomasse einen Feststoffgehalt von 95 g/l, davon 70 g/l, D-Pantothensäure und 25 g/l,
sonstige Feststoffe (Salze, Reste der Biomasse, weitere feste Bestandteile je nach
Fermentationsmedium, keine Calciumionen).
Nachfolgend sind die sich ergebenden Gehalte an D-Pantothensäure im formulierten
Produkt bei Zugabe verschiedener Calciumsalze angegeben. Dabei wurde der
Calciumgehalt so eingestellt, daß 1 mol Calciumionen pro 2 mol D-Pantothensäure
enthalten sind.
Beschreibung der Figuren:
Fig. 1: Blockfließdiagramm eines Verfahren zur Herstellung eines D-
Pantothensäuresalzes durch Trocknung und/oder Formulierung
der Fermentationslösung.
Fig. 2: Blockfließdiagramm eines Verfahren zur Herstellung eines D-
Pantothensäuresalzes durch Trocknung und/oder Formulierung
der Fermentationslösung, mit zusätzlichem
Konzentrierungsschritt und Rückführung des abgetrennten
Wassers in die Fermentation.
Fig. 3: Blockfließdiagramm eines Verfahren zur Herstellung eines D-
Pantothensäuresalzes durch Trocknung und/oder Formulierung
der Fermentationslösung mit Zellabtrennung.
Fig. 4: Blockfließdiagramm eines Verfahren zur Herstellung eines D-
Pantothensäuresalzes bei dem die Lyse der Zellen und/oder die
Abtötung des Organismus nach der Fermentation (A) und/oder
nach der Zellabtrennung (B) erfolgt.
Fig. 5. Blockfließdiagramm eines Verfahren zur Herstellung eines D-
Pantothensäure-Salzes bei dem zur Trocknung Zuschlagstoffe
zugegeben werden.
Fig. 6: Blockfließdiagramm eines Verfahren zur Herstellung eines D-
Pantothensäuresalzes bei dem das gewünschte Kation durch die
Auswahl der beim Fermentationsmedium eingesetzten Salze
erreicht wird.
Claims (26)
1. Verfahren zur Herstellung eines freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze
enthaltendes Tierfuttersupplement, wobei
- a) ein D-Pantothensäure produzierender Organismus in einem Kulturmedium enthaltend wenigstens eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle, ohne die Zufütterung weiterer Vorstufen fermentiert wird und
- b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltende Fermentationslösung ohne die Durchführung weiterer Aufarbeitungsschritte einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation
solange durchgeführt wird, bis ein Feststoffgehalt von wenigstens 6 Gew.-%,
bevorzugt von 7-25 Gew.-% und/oder ein Gehalt an D-Pantothensäure von
wenigstens 2-15 Gew.-%, bevorzugt 4-15 Gew.-% erreicht wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Zudosierung der Kohlenstoffquelle unterbrochen und/oder derart reguliert
wird, daß eine Konzentration von nahezu Null eingestellt wird und/oder die
Fermentation bis zum Erreichen einer Gelöstsauerstoffkonzentration von
wenigstens 80%, bevorzugt 90% und besonders bevorzugt 95% des
Sättigungswertes in der Fermentationslösung weitergeführt wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein
D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen
Pantothensäure-(pan)- und/oder Isoleucin-Valin-(ilv)-Biosynthese und/oder
Asparat-α-Decarboxylase dereguliert ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vor
der Trocknung und/oder Formulierung ggf. eine Abtrennung der Biomasse von
der Fermentationslösung erfolgt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß vor
der Trocknung und/oder Formulierung und ggf. nach der Abtrennung der
Biomasse eine Aufkonzentrierung der Fermentationslösung durch Wasserentzug,
bei ggf. gleichzeitiger Rückführung des Wasser in den Fermentationsprozeß,
erfolgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß vor
der Trocknung und/oder Formulierung wenigstens einer der nachfolgenden
Schritte umfassend
- 1. Lyse und/oder Abtötung der Biomasse und/oder
- 2. Abtrennung der Biomasse von der Fermentationslösung und/oder
- 3. Zugabe weiterer Zuschlagstoffe und/oder
- 4. Konzentrierung der Fermentationslösung, bevorzugt durch Wasserentzug und ggf. gleichzeitiger Rückführung des Wassers in den Fermentationsprozeß und/oder
- 5. Kombinationen der Schritte 1) bis 4) durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
Lyse und/oder Abtötung der Biomasse noch in der Fermentationslösung oder
nach der Abtrennung der Biomasse von der Fermentationslösung durchgeführt
wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der
Fermentationslösung vor und/oder während der Aufkonzentrierung, Trocknung
und/oder Formulierung weitere Zuschlagstoffe und/oder Mischungen von
Zuschlagstoffen zugesetzt werden.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß
bezogen auf den Gehalt an D-Pantothensäure im formulierten Produkt vor
und/oder während der Aufkonzentrierung, Trocknung und/oder Formulierung 1 mol
Calciumionen pro 2 mol D-Pantothensäure in Form eines Calciumsalzes als
Zuschlagstoff zugesetzt werden.
11. Tierfuttersupplement auf der Basis einer durch Fermentation wenigstens eines D-
Pantothensäure produzierenden Organismus erhaltenen Fermentationslösung
enthaltend wenigstens freie D-Pantothensäure und/oder deren Salze in einer
Konzentration von wenigstens 30-95 Gew.-%, einen Gesamt-Zuckeranteil von
0,1-15 Gew.-% und einen Proteingehalt von weniger als 5 bis 50 Gew.-%
bezogen auf die Trockenmasse.
12. Tierfuttersupplement gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es 50-
95 Gew.-%, bevorzugt 70-95 Gew.-%, besonders bevorzugt 60-80 Gew.-%
und insbesondere mehr als 80 Gew.-% an freier D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen enthält.
13. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die unbehandelte Fermentationslösung wenigstens 10 g/l,
bevorzugt wenigstens 20 g/l, und besonders bevorzugt wenigstens 40 g/l, D-
Pantothenat und/oder deren Salze enthält.
14. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, daß es Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium- und/oder
Ammoniumsalze der D-Pantothensäure und/oder Mischungen davon enthält.
15. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, gekennzeichnet
durch eine Zusammensetzung der Trockenmasse mit wenigstens folgenden
Komponenten:
a) freie D-Pantothensäure
und/oder deren Salze wenigstens 30-95 Gew.-%
b) Proteine max. 50 Gew.-%
c) Gesamtzucker max. 15 Gew.-%
d) Mineralstoffe max. 20 Gew.-%
16. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, enthaltend einen
Proteingehalt von weniger als 10 Gew.-%, bevorzugt weniger als 7 Gew.-% und
besonders bevorzugt von weniger als 5 Gew.-%.
17. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, enthaltend einen
Gesamt-Zuckeranteil von weniger als 10 Gew.-%, bevorzugt von etwa 0,5 Gew.-
% und besonders bevorzugt von etwa 0,1 Gew.-%.
18. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, enthaltend einen
Restwassergehalt von weniger als 5 Gew.-%, bevorzugt 1-3 Gew.-% und
besonders bevorzugt von 0,5-2 Gew.-%.
19. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch
gekennzeichnet, daß es unbelebte, lebende und/oder vermehrungsfähige Anteile
an D-Pantothensäure produzierenden Organismen enthält.
20. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, daß es unbelebte, lebende und/oder vermehrungsfähige Anteile
an Mikroorganismen, bevorzugt Pilzen, Hefen und/oder Bakterien enthält.
21. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch
gekennzeichnet, daß unbelebte, lebende und/oder vermehrungsfähige Anteile an
Pilzen der Gattung Mucor, Hefen der Gattung Saccharomyces und/oder Bakterien
der Familien der Enterobakteriaceae, Salmonellen, Pseudomonaden,
Bacillaceae, coryneformer Bakterien und/oder der Gattung Proteus und/oder
Actinum und/oder Mischungen davon enthält.
22. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch
gekennzeichnet, daß es weitere Zuschlagstoffe, bevorzugt auf Basis von Zuckern
und/oder Getreide- und/oder Hülsenfrüchten und/oder Mineralsalzen und/oder D-
Pantothensäure, Salze davon und/oder deren Mischungen enthält.
23. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 22, dadurch
gekennzeichnet, daß es in einer Formulierung mit einer Schüttdichte von 0,35-
0,7 kg/l, bevorzugt 0,4-0,6 kg/l vorliegt.
24. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 23, dadurch
gekennzeichnet, daß es einen mittleren Korndurchmesser im Bereich von 10-2000 µm,
bevorzugt von 20-1500 µm, besonders bevorzugt von 25-1000 µm
und höchst bevorzugt von 30-800 µm aufweist.
25. Tierfuttersupplement gemäß einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, daß es als Pulver, Granulat, Pellet, mit einem Überzug versehen
und/oder als Kombinationen davon vorliegt.
26. Verwendung des Tierfuttersupplements gemäß einem der Ansprüche 11 bis 25
als Zusatz zu Tierfutter und/oder Tierfutterergänzungsmitteln.
Priority Applications (19)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10112207A DE10112207A1 (de) | 2001-03-14 | 2001-03-14 | Tierfuttersupplement enthaltend D-Pantothensäure und/oder deren Salze, verbessertes Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung |
| PL36059001A PL360590A1 (en) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use |
| US10/380,053 US20040050335A1 (en) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use |
| MXPA03002345A MXPA03002345A (es) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | Suplemento alimenticio para animales que contiene acido d-pantotenico y/o sus sales, metodo mejorado para la produccion del mismo, y su uso. |
| KR10-2003-7003965A KR20030038751A (ko) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | Ｄ-판토텐산 또는 그의 염을 포함하는 동물 사료 보충물,그의 개선된 제조 방법 및 그의 용도 |
| EEP200300112A EE200300112A (et) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | D-pantoteenhapet ja/või selle sooli sisaldav loomasöödalisand, saamismeetod, kasutamine |
| SK326-2003A SK3262003A3 (en) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | Animal feed supplement containing D-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use |
| EP01985230A EP1318725A2 (de) | 2000-09-20 | 2001-09-08 | Tierfuttersupplement enthaltend d-pantothensäure und/oder deren salze, verbessertes verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung |
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2001
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