DE10111925A1

DE10111925A1 - heart chip

Info

Publication number: DE10111925A1
Application number: DE10111925A
Authority: DE
Inventors: Paul Cullen; Udo Seedorf
Original assignee: OGHAM GmbH
Current assignee: OGHAM GmbH
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2002-10-02
Also published as: WO2002072882A3; EP1368492A2; WO2002072882A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung des genetischen Arterioskleroserisikos, mit den Schritten Auswahl von für das Arterioskleroserisiko relevanter Referenznukleotidsequenzen einschließlich ihrer funktionell charakterisierten Mutationen; Aufbringen von Sonden dieser Nukleotidsequenzen bzw. derer Komplementärsequenzen auf einen Träger, Hybridisieren der Sonden mit Nukleotidsequenzen aus einer Patienten-Probe bzw. mit aus einer Patienten-Probe synthetisierten Nukleotidsequenzen, Nachweis der Hybridisierung und Auswerten der Hybridisierung.The invention relates to a method for determining the genetic risk of arteriosclerosis, comprising the steps of selecting reference nucleotide sequences relevant for the risk of arteriosclerosis, including their functionally characterized mutations; Application of probes of these nucleotide sequences or their complementary sequences to a support, hybridization of the probes with nucleotide sequences from a patient sample or with nucleotide sequences synthesized from a patient sample, detection of the hybridization and evaluation of the hybridization.

Description

Die Erfindung betrifft einen Genchip und ein Verfahren zum Bestimmen der genetischen Prädisposition für das Ausbilden arteriosklerotischer Erkrankun gen.The invention relates to a gene chip and a method for determining the genetic predisposition for the development of arteriosclerotic diseases gene.

Erkrankungen des Herzkreislaufsystems stellen weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar. In der Mehrzahl der Fälle sind solche Erkrankungen auf eine Verkalkung der großen und mittelgroßen Schlagader (Arteriosklerose) zurückzuführen. Von besonderer Bedeutung ist eine Arteriosklerose der Herzkranzgefäße und der Halsschlagader, da diese zum Herzinfarkt oder Schlaganfall führen kann. In Deutschland erleiden jährlich derzeit etwa 250.000 Menschen einen Herzinfarkt, der in der Hälfte der Fälle tödlich endet. Oftmals führt der Herzinfarkt bei den überlebenden Patienten zu erheblichen Folgeschäden und Behinderungen. Die Häufigkeit des Schlag anfalls liegt in Deutschland etwa bei der Hälfte der Herzinfarktfälle; es ver laufen etwa ein Viertel aller Fälle tödlich. Die Folgeschäden sind oft verhee render als beim Herzinfarkt.Cardiovascular diseases are one of the most common worldwide Causes of death. In the majority of cases, such diseases are present calcification of the large and medium-sized artery (arteriosclerosis) due. Arteriosclerosis is of particular importance Coronary arteries and the carotid artery, as these lead to a heart attack or Stroke. In Germany, about currently suffer approximately 250,000 people have a heart attack, which is fatal in half of the cases ends. The heart attack often leads to surviving patients considerable consequential damage and disabilities. The frequency of the blow in Germany, about half of all heart attacks occur; it ver about a quarter of all cases are fatal. The consequential damage is often terrible render than with a heart attack.

Bei der Arteriosklerose handelt es sich um ein komplexes Krankheitsbild, das auf multifaktorielle Ursachen zurückgeht. Dabei werden vornehmlich chemi sche und mechanische Schädigungen der Gefäße beispielsweise durch anhaltenden Nikotinkonsum, Stoffwechselstörungen wie z. B. Diabetes mel litus oder zu Adrenalin- oder Noradrenalin-Ausschüttungen führende psy chosomatische Einflüsse als wesentliche Ursachen diskutiert. Daneben spielen ein anhaltender Bluthochdruck und ein hoher Cholesteringehalt im Blut eine maßgebliche Rolle.Atherosclerosis is a complex clinical picture that is due to multifactorial causes. It is mainly chemi for example, mechanical and mechanical damage to the vessels persistent nicotine consumption, metabolic disorders such as B. Diabetes mel litus or psy leading to adrenaline or noradrenaline releases Chosomatic influences discussed as major causes. Besides play persistent high blood pressure and high cholesterol in the Blood plays a major role.

Darüber hinaus wurde bereits vor über 100 Jahren erkannt, daß sich inner halb einiger Familien Herzinfarkte und Schlaganfälle häuften, so daß der Vererbung eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der Arteriosklerose beige messen wurde. Erst in den letzten 10 bis 15 Jahren hat man jedoch begon nen, die Gründe für die familiäre Häufung dieser Erkrankungen auf molekula rer Basis zu verstehen.In addition, it was recognized over 100 years ago that inner Half of some families had heart attacks and strokes, so that the Inheritance plays an important role in the formation of beige atherosclerosis was measured. However, it has only started in the last 10 to 15 years NEN, the reasons for the family accumulation of these diseases on molecules to understand the basis.

Innerhalb der medizinischen Diagnostik kommt der Erfassung der Risikofak toren zur Bestimmung des Arterioskleroserisikos ein hoher Stellenwert zu. Dazu werden biochemische Analysen beispielsweise der Cholesterin- bzw. der Fettwerte im Blut durchgeführt und der Patient wird nach Lebensge wohnheiten sowie nach in der Familie häufig vorkommenden Krankheiten befragt. Sofern überhaupt die genetischen Risikofaktoren erfaßt werden, erfolgt dies über eine vollständige Sequenzierung der entsprechenden Nukleotidsequenz des relevanten Gens oder durch eine Darstellung der betroffenen Genabschnitte beispielsweise mittels der allelspezifischen Poly merasekettenreaktion, Restriktionslängenpolymorphismen oder der single strand conformation polymorphism-Methode (SSCP).Within medical diagnostics, the risk factor is recorded are of great importance for determining the risk of arteriosclerosis. For this purpose, biochemical analyzes, for example of cholesterol or the fat levels in the blood are performed and the patient is habits as well as diseases that are common in the family interviewed. If the genetic risk factors are recorded at all, this is done via a complete sequencing of the corresponding Nucleotide sequence of the relevant gene or by a representation of the affected gene segments, for example by means of the allele-specific poly merase chain reaction, restriction length polymorphisms or the single strand conformation polymorphism method (SSCP).

Nachteilig an diesen Methoden zur Erfassung der genetischen Disposition ist, daß sie in der Regel nur einzelne Sequenzveränderungen, allenfalls ein zelne Gene erfassen. Darüber hinaus sind sie oft sehr arbeitsintensiv und erfordern Spezialkenntnisse sowohl bei der Durchführung als auch bei der Interpretation. Daher eignen sie sich nicht für die Untersuchung einer Viel zahl möglicherweise betroffener Personen.A disadvantage of these methods for recording genetic disposition is that they usually only individual sequence changes, at most a capture individual genes. In addition, they are often very labor intensive and require special knowledge both in the implementation and in the Interpretation. Therefore, they are not suitable for examining a lot number of people possibly affected.

Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, eine Diagnosemöglichkeit bereitzustellen, die eine schnelle und aussagekräftige Diagnose über die genetische Prädisposition zur Erkrankung an der Arteriosklerose erlaubt.The invention is therefore based on the problem of a diagnostic possibility provide a quick and meaningful diagnosis about the genetic predisposition to arteriosclerosis disease allowed.

Dieses Problem wird gelöst mit einem Verfahren gemäß dem Hauptanspruch und einem Nukleotidträger gemäß dem nebengeordneten Erzeugnisan spruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand entsprechender Unteransprüche. This problem is solved with a method according to the main claim and a nucleotide carrier according to the related product entitlement. Advantageous further developments are the subject of corresponding Dependent claims.

Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, eine geeignete Auswahl von für das genetische Arterioskleroserisiko relevanten Nukleotidsequenzen (bzw. die dazu komplementäre Sequenzen) sowie deren funktionell charak terisierte Mutationen auf einen Träger (nachfolgend auch Genchip) zu brin gen, diese Nukleotidsequenzen mit einer Nukleotidsequenzprobe eines Pati enten zu hybridisieren und die Hybridisierung multifaktoriell auszuwerten. Die Nukleotidsequenzen stellen dabei Sonden für sog. Referenzsequenzen dar, deren indirekter oder direkter funktioneller Zusammenhang mit der Arterios klerose bekannt ist oder vermutet wird. Sofern eine Sonde auf dem Träger mit Oligonukleotiden aus der Patientenprobe hybridisiert, ist der Nachweis für das Vorhandensein der entsprechenden Referenzsequenz bei dem Pati enten erbracht.The invention is based on the idea of a suitable selection of nucleotide sequences relevant to the genetic risk of arteriosclerosis (or the complementary sequences) and their functional character terized mutations on a carrier (hereinafter also referred to as gene chip) gene, these nucleotide sequences with a nucleotide sequence sample from a patient hybridize ducks and evaluate the hybridization multifactorial. The Nucleotide sequences represent probes for so-called reference sequences, their indirect or direct functional connection with the arterios clerosis is known or suspected. Unless there is a probe on the carrier hybridized with oligonucleotides from the patient sample is the proof for the presence of the corresponding reference sequence with the pati ducks.

Mit dieser simultanen Erfassung und multifaktoriellen Analyse einer Vielzahl von für das Arterioskleroserisiko relevanten mutierten Sequenzen geht der besondere Vorteil einher, daß etwaige Synergieeffekte zwischen verschie denen Mutationen erkannt und dargestellt werden können. So ist es möglich, daß einzelne Mutationen für sich allein genommen kein erhebliches Risiko darstellen, treten sie jedoch in Kombination mit anderen - wiederum für sich allein genommen wenig bedeutsamen - Mutation auf, kann sich daraus ein beachtliches genetisches Risiko ergeben, das deutlich das Risiko aus der Summe der Einzelmutationen übersteigt. Dies gilt insbesondere auch für Mutationen, die im Zusammenhang mit der Arteriosklerose diskutiert werden, ohne daß ihnen jedoch derzeit eine konkrete Funktion zugewiesen werden kann (sog. Kandidatenmutationen).With this simultaneous acquisition and multifactorial analysis of a multitude of mutated sequences relevant for the risk of arteriosclerosis special advantage is that any synergy between different where mutations can be recognized and displayed. So it is possible that single mutations on their own do not pose a significant risk represent, however, they occur in combination with others - again for themselves taken alone little meaningful - mutation on, can result from it considerable genetic risk, which clearly shows the risk from the Sum of the individual mutations exceeds. This applies in particular to Mutations that are discussed in connection with arteriosclerosis, but they are not currently assigned a specific function can (so-called candidate mutations).

Diese Vorteile werden nachfolgend an einem Beispiel veranschaulicht:
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß ein hoher Blutspiegel des Fettpartikels Lipoprotein (a) das Herzinfarktrisiko erhöht. Ebenso ist es bekannt, daß ein Faktor V der Gerinnungskaskade teilweise in einer veränderten Form vorlie gen kann. Erst die Kombination des mutierten Faktors V mit einem hohen Lipoprotein (a)-Spiegel führt zu einer unerwartet großen Erhöhung des Risi kos für eine Blutgerinnung in der Zentralvene des Gehirns und dadurch für einen frühzeitigen schweren Schlaganfall. Diese Synergieeffekte können nur durch eine geeignete Auswahl der Nukleotide und eine simultane Erfassung der genetischen Veränderungen erfaßt werden.These advantages are illustrated below using an example:
It has been known for some time that a high blood level of the lipoprotein (a) fat particle increases the risk of heart attack. It is also known that a factor V of the coagulation cascade can be partially present in a modified form. Only the combination of the mutated factor V with a high lipoprotein (a) level leads to an unexpectedly large increase in the risk of blood clotting in the central vein of the brain and thus to an early, severe stroke. These synergy effects can only be detected by a suitable selection of the nucleotides and a simultaneous detection of the genetic changes.

Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Nukleotidträ ger erlauben damit eine genauere Diagnose des Arterioskleroserisikos, ins besondere dann, wenn dieses Verfahren mit der Erfassung der konventio nellen Risikofaktoren kombiniert wird. Eine genauere Diagnose ist eine wich tige Voraussetzung für neue Behandlungsmethoden, die eine spezifische Behandlung genetischer Defekte in naher Zukunft erlauben werden, wie zum Beispiel die Gentherapie.The method according to the invention and the nucleotide carrier according to the invention ger thus allow a more precise diagnosis of the risk of arteriosclerosis, ins especially if this procedure involves the registration of the convention combined risk factors. A more accurate diagnosis is important prerequisite for new treatment methods that have a specific Will allow treatment of genetic defects in the near future, such as Example of gene therapy.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß alle relevanten Mutationen der ausgewählten Referenzsequenzen in nur einem Arbeitsgang erfaßt wer den können, dessen Durchführung keiner Spezialkenntnisse bedarf. Dieses Verfahren eignet sich darüber hinaus für die Automatisierung und somit für die rasche Bearbeitung umfangreicher Probenserien. Somit wird erfindungs gemäß die gleichzeitige Erfassung relevanter Genveränderungen kosten günstig, schnell und zuverlässig möglich.Another advantage of the invention is that all relevant mutations who selected the selected reference sequences in a single operation can, the implementation of which requires no special knowledge. This Process is also suitable for automation and thus for the rapid processing of extensive sample series. Thus fiction according to the simultaneous detection of relevant gene changes cost cheap, fast and reliable.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich aber nicht nur für die klinische Diagnostik sondern insbesondere auch als Hilfsmittel für die wissenschaftli che Forschung. So können damit z. B. Bevölkerungsstudien, die zum Ziel haben, den Zusammenhang zwischen genetischen Veränderung und dem Risiko für Herzinfarkt oder Schlaganfall zu präzisieren, erleichtert werden, da eine im Vergleich zu herkömmlichen Studien sehr viel höhere Anzahl von Studienteilnehmern erfaßt werden kann. The method according to the invention is not only suitable for the clinical one Diagnostics but in particular also as an aid for scientific research. So z. B. Population studies aimed at have the connection between genetic modification and the Precise risk of heart attack or stroke can be relieved because a much higher number of compared to conventional studies Study participants can be recorded.

Da der erfindungsgemäße Nukleotidträger die Identifikation von Interaktio nen zwischen Mutationen bzw. Mutationskombinationen sowie zwischen Mutationen und konventionellen Risikofaktoren beispielsweise aus der Fami lienanamnese, dem Stoffwechsel oder dem Blutcholesterinspiegel erlaubt, kann er zum besseren Verständnis der Entstehung arteriosklerotischer Erscheinungen beitragen. Er weist somit eine besondere Eignung als For schungsreagenz auf.Since the nucleotide carrier according to the invention identifies interaction between mutations or mutation combinations and between Mutations and conventional risk factors, for example from the family medical history, metabolism or blood cholesterol level, it can help to better understand the development of arteriosclerotic Appearances. It is therefore particularly suitable as a for development reagent.

Der Einsatz des erfindungsgemäßen Nukleotidträgers beruht auf der Hybri disierung der auf dem Träger aufgebrachten Nukleotidsequenzen mit kom plementären Nukleotidsequenzen aus Probenmaterial des Patienten. Da die ausgewählten Nukleotidsequenzen Sonden für funktionell für das Ausbilden der Arteriosklerose relevanten Referenzsequenzen bestimmter Gene dar stellen, können mittels der Hybridisierung einzelne Gene oder Teile davon in einer Präparation genomischer DNA oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen werden. [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gille spie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Acade mic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymology 1987, 152: p582-87; Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: p467-470].The use of the nucleotide carrier according to the invention is based on the hybrid doping of the nucleotide sequences applied to the support with com complementary nucleotide sequences from patient sample material. Since the selected nucleotide sequences for forming functional probes the atherosclerosis relevant reference sequences of certain genes can, by means of hybridization, individual genes or parts thereof in a preparation of genomic DNA or the transcription product of a Genes (mRNA) can be detected. [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., Vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gille Spie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Acade mic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymology 1987, 152: p582-87; Schena M et al .: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: p467-470].

Die Hybridisierung kann mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz kombiniert werden. Dazu kann ein Nukleinsäurestrang beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemolumineszierende oder fluoreszierende Moleküle markiert werden, wäh rend der zweite an einem festen Träger beispielsweise aus Kunststoff oder Glas gebunden ist. Die Markierung der Nukleotidsequenz erfolgt dabei vor zugsweise bei der Synthese der Sequenz aus der Patientenprobe. Auf den Träger können mehrere tausend Oligonukleotide als Sonden aufgebracht werden. Die sich anschließende Hybridisierung auf dem Träger kann vorteil hafterweise über einen Scanner ausgewertet werden, so daß sich die Aus wertung weitgehend automatisieren läßt.Hybridization can be followed by a detection reaction and subsequent Identification of a nucleic acid sequence can be combined. This can be done using a Nucleic acid strand for example through dyes, radioactivity or chemiluminescent or fluorescent molecules are marked, while rend the second on a solid support such as plastic or Glass is bound. The nucleotide sequence is marked beforehand preferably in the synthesis of the sequence from the patient sample. On the Carriers can apply several thousand oligonucleotides as probes become. The subsequent hybridization on the carrier can be advantageous will be evaluated by a scanner, so that the off largely automated evaluation.

Im Kontext dieser Anmeldung werden die nachfolgenden Begriffe wie folgt verwendet:In the context of this application, the following terms are as follows used:

Der Begriff "Hybridisierung" schließt jede Form der Paarung oder Aneinan derlagerung von Nukleotidsequenzen ein. Die Hybridisierung kann sowohl unter stringenten als auch unter relaxierten Bedingungen erfolgen.The term "hybridization" includes any form of mating or juxtaposition storage of nucleotide sequences. Hybridization can be both take place under stringent as well as under relaxed conditions.

Der Begriff "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf jede oligomere oder poly mere Sequenz aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden oder aus einer Kombination daraus. Ebenso sind davon Ribonukleotide oder Desoxy ribonukleotide mit Basenanaloga erfaßt. Nukleotidsequenzen können syn thetischen oder natürlichen Ursprungs sein sowie auf rekombinante Verfah ren zurückgehen.The term "nucleotide sequence" refers to any oligomeric or poly mere sequence from ribonucleotides or deoxyribonucleotides or from a combination of these. Ribonucleotides or deoxy are also of these ribonucleotides detected with base analogs. Nucleotide sequences can be syn be of theoretical or natural origin, and by recombinant means ren go back.

Der Begriff "Arterioskleroserisiko" bezieht sich auf jede Erhöhung (oder Erniedrigung) der Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Arteriosklerose. Die Wahrscheinlichkeit bemißt sich an der Durchschnittswahrscheinlichkeit in der gesamten Bevölkerung. Sofern das Arterioskleroserisiko auf genetische Ursachen zurückzuführen ist, wird der Begriff genetisches Arterioskle roserisiko bzw. genetische Prädisposition oder nur Disposition verwendet.The term "atherosclerosis risk" refers to any increase (or Decrease) the likelihood of developing arteriosclerosis. The probability is measured by the average probability in of the entire population. If the risk of atherosclerosis is genetic Causes, the term genetic arterioskle pink risk or genetic predisposition or only disposition used.

Unter "Mutationen" werden alle Formen der Veränderung der genetischen Informationen einer Nukleotidsequenz im Vergleich mit der Wildtypsequenz - auch native Sequenz - verstanden. Dabei kann es sich beispielsweise um Substitutionen, Insertionen oder Deletionen handeln. Ebenso sind komple xere Mutationen wie Inversionen und Indels möglich. "Mutations" includes all forms of genetic modification Information of a nucleotide sequence in comparison with the wild type sequence - also native sequence - understood. This can be, for example Act substitutions, insertions or deletions. Likewise, they are complete Other mutations such as inversions and indels are possible.

Der Begriff "Referenzsequenz" bezieht sich auf bestimmte Nukleotidsequen zen ausgewählter Gene, wobei ein Gen eine Vielzahl von Referenzsequen zen einschließen kann. Die Referenzsequenzen können nativ, d. h. in der Wildtypformung, oder mutiert sein. Ein Zusammenhang zwischen den Muta tionen und dem Arterioskleroserisiko ist bekannt oder wird vermutet, d. h. die Mutation ist funktionell charakterisiert bzw. relevant.The term "reference sequence" refers to certain nucleotide sequences zen selected genes, wherein a gene a variety of reference sequences zen can include. The reference sequences can be native, i. H. in the Wild type, or be mutated. A connection between the muta ions and the risk of arteriosclerosis is known or suspected, d. H. the Mutation is functionally characterized or relevant.

Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf spezifische Oligonukleotidabschnitte einer Referenzsequenz bzw. dazu komplementärer Sequenzen. Damit erlaubt die Hybridisierung einer Oligonukleotidprobe mit einer Sonde den Nachweis der Referenzsequenz in dem Ursprungsgewebe der Probe. Die Sonden werden auf dem Nukleotidträger aufgebracht.The term "probe" refers to specific oligonucleotide sections a reference sequence or sequences complementary thereto. In order to allows the hybridization of an oligonucleotide sample with a probe Detection of the reference sequence in the original tissue of the sample. The Probes are applied to the nucleotide carrier.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind auf dem Träger Sonden für Referenzsequenzen der in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten Gene aufgebracht, deren Mutationen zu einer Erhöhung des genetischen Arterios kleroserisikos direkt oder indirekt beitragen. Alternativ können auch Sonden von zu den Referenzsequenzen komplementären Sequenzen verwendet werden (nachfolgend auch Komplementärsequenzen). Die Gene werden sowohl über ihre Codenummer aus der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) als auch über das für sie verwendete Symbol spezifiziert. Des weiteren enthält die Tabelle Angaben über die Häu figkeit genetischer Veränderungen dieser Gene und die Anzahl bekannter Mutationen.
In a preferred embodiment, probes for reference sequences of the genes listed in Table 1 below are applied to the carrier, the mutations of which directly or indirectly contribute to an increase in the genetic arteriosclerosis risk. Alternatively, probes of sequences complementary to the reference sequences can also be used (hereinafter also complementary sequences). The genes are specified both by their code number from the GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and by the symbol used for them. The table also contains information on the frequency of genetic changes in these genes and the number of known mutations.

Die einzelnen Referenzsequenzen dieser Gene sind Gegenstand der Tabelle 2. Die Referenzsequenzen sind wiederum über ihre Codenummern der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) identifizierbar (nachfolgend auch GenBank).The individual reference sequences of these genes are the subject of Table 2. The reference sequences are again based on their code numbers the GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) identifiable (hereinafter also GenBank).

Tabelle 2 Table 2

Im folgenden wird die Erfindung anhand folgender Ausführungsbeispiele des näheren erläutert.In the following the invention based on the following embodiments of the explained in more detail.

Embodiment 1 Detection of changes in the lipoprotein lipase gene

Sonden der Komplementärsequenzen der in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgelisteten Referenzsequenzen werden als Oligonukleotide mit Hilfe von Standardtechniken (DE 196 12 356; US5837832) auf einen geeigneten Träger, beispielsweise mit Gold beschichtetes Glas, aufgebracht. Dabei werden 10- bis 25-mere Nukleotidsequenzen, vorzugsweise 15-mere, verwendet. Die Sequenzen werden dabei so gewählt, daß sie die funktionellen Mutationen einschließen und die mutierte Kom plementärsequenz (i. e. Komplementärsequenz zu der mutierten Referenzsequenz) relativ zu der nativen Komplementärsequenz (i. e. Komplementärsequenz zu der nativen Referenzsequenz) etwa in der Mitte liegt.Probes of the complementary sequences in Table 3 below listed reference sequences are as oligonucleotides with the help of Standard techniques (DE 196 12 356; US5837832) to a suitable one Carrier, for example gold-coated glass, applied. there 10 to 25-mer nucleotide sequences, preferably 15-mer, used. The sequences are chosen so that they the include functional mutations and the mutated com complementary sequence (i.e. complementary sequence to the mutated Reference sequence) relative to the native complementary sequence (i. E. Complementary sequence to the native reference sequence) approximately in the middle lies.

Die Oligonukleotidsonden werden so auf den Träger aufgebracht, daß sich auf den Feldern des Trägers jeweils nur eine Variante der Oligonukleotide befindet. Bezüglich der bekannten Mutationen im Lipoprotein-Lipase Gen (LPL-Gen) ergeben sich 164 Felder, wobei z. B. das Feld 1.1 die Sequenz 5'- CTGGAGCCACACGGC-3' (komplementär zu der Referenzsequenz 5'- GCCGTGTGGCTCCAG-3'; Tabelle 2, Zeile 1, Spalte 2, angegebene Sequenz unterstrichen) und das Feld 1.2 die mutierte Komplemetärsequenz 5'-CTGGAGTCACACGGC-3' (komplementär zu der mutierten Referenzsequenz 5'-GCCGTGTGACTCCAG-3'; Tabelle 2, Zeile 1, Spalte 3; Mutation unterstrichen) trägt. Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 wird die Sequenzinformation der Zeile 2 der Tabelle 2 entsprechend benutzt usw.The oligonucleotide probes are applied to the support in such a way that there is only one variant of the oligonucleotide in each case on the fields of the support. With regard to the known mutations in the lipoprotein lipase gene (LPL gene), there are 164 fields. For example, field 1.1 underlines the sequence 5'-CTGGAGCCACACGGC-3 '(complementary to the reference sequence 5'-GCCGTG TGGC TCCAG-3'; Table 2, line 1, column 2, sequence given) and field 1.2 the mutated complementary sequence 5 '-CTGGAG T CACACGGC-3' (complementary to the mutated reference sequence 5'-GCCGTGTG A CTCCAG-3 '; Table 2, line 1, column 3; mutation underlined). The sequence information in row 2 of table 2 is used accordingly for the assignment of fields 2.1 and 2.2, etc.

Die Tabelle 3A) bis H) enthält Angaben über die Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequenzen als Sonden auf den Genchip aufgebracht werden (zwecks besserer Übersichtlichkeit wird nur der zentrale Bereich der 10- bis 25-mere gezeigt, die Position mit Bezug auf die native Referenzsequenz wird durch Angabe der Kodon-Nummer spezifiziert). Zu jeder Referenzsequenz wird an genau definierter Stelle auf dem Träger die komplementäre Sequenz der aus der dritten Spalte ersichtlichen nativen Referenzsequenz aufgebracht. Die angegebenen Kodon-Nummern beziehen sich auf die native Gensequenz mit der GenBank-Nummer der NCBINM 000237.Tables 3A) to H) contain information about the nucleic acid sequences, whose complementary sequences are applied as probes to the gene chip (for the sake of clarity, only the central area of the 10- to 25-mere shown the position with respect to the native Reference sequence is specified by specifying the codon number). To each reference sequence is placed in a precisely defined position on the carrier complementary sequence of the native from the third column Reference sequence applied. Obtain the specified codon numbers refer to the native gene sequence with the GenBank number of the NCBINM 000237.

Table 3 A) Missense or nonsense mutations

Spalte 1 kennzeichnet die Kodon-Nummer. In der letzten Spalte ist der die Mutation charakterisierende Aminosäureaustausch angegeben.
Column 1 identifies the codon number. The last column shows the amino acid exchange that characterizes the mutation.

B) Splice variants

Die Lage der nativen Referenzsequenzen (abgeleitet aus der Gensequenz mit den GenBank-Nummern M29549, M94221, M15856, M76722, M94222) ergibt sich aus den Spalten 1-3. Die Spalte 4 spezifiziert die Mutation.
The location of the native reference sequences (derived from the gene sequence with the GenBank numbers M29549, M94221, M15856, M76722, M94222) results from columns 1-3. Column 4 specifies the mutation.

C) Kleine Deletionen C) Small deletions

Die deletierten Nukleotide sind unterstrichen.
*Abgeleitet aus der normalen Gensequenz mit den GenBank-Nummern M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.The deleted nucleotides are underlined.
* Derived from the normal gene sequence with the GenBank numbers M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.

D) Kleine Insertionen D) Small insertions

E) Indels (Insertionen/Deletionen) E) Indels (insertions / deletions)

Die deletierten Basen sind in Kleinbuchstaben angegeben.The deleted bases are in lower case.

Die Mutationen sind abgeleitet aus der normalen Gensequenz mit den GenBank-Nummern M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.The mutations are derived from the normal gene sequence with the GenBank numbers M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.

F) Larger deletions

Die größere Deletion besteht in der Deletion von 2.100 Nukleotiden inklusive des Exons 9. Die Mutation wurde auf Ebene der genomischen DNA von Benlian beschrieben (Journal of Lipid Research 1995, 36, Seite 356).The larger deletion consists of the deletion of 2,100 nucleotides inclusive of exon 9. The mutation was detected at the level of the genomic DNA of Benlian described (Journal of Lipid Research 1995, 36, page 356).

G) Complex rearrangements

Die Rearrangierung besteht in der Insertion von ca. 2.000 Nukleotiden in das 6. Exon bzw. 6. Intron. Die Mutation wurde auf Ebene der genomischen DNA von Devlin et al. beschrieben (American Journal of Human Genetics 1990, 46, Seite 112 ff).The rearrangement consists in the insertion of approx. 2,000 nucleotides into the 6th exon or 6th intron. The mutation was at the genomic DNA level by Devlin et al. (American Journal of Human Genetics 1990, 46, page 112 ff).

H) Regulatorische Defekte H) Regulatory defects

*Relativ zu der Startstelle der Transkription des LPL- Gens mit den GenBank-Nummern M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.* Relative to the starting point for the transcription of the LPL gene with the GenBank numbers M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.

Example 2 Determination of the genetic risk of arteriosclerosis

Analog zu dem Ausführungsbeispiel 1 wird ein Genchip mit vorzugsweise 15- bis 18-mere Oligonukleotidsonden hergestellt. Die Sonden sind dabei komplementär zu den bekannten mutierten bzw. nativen in der Tabelle 4 aufgeführten Referenzsequenzen der folgenden Gene:Analogous to embodiment 1, a gene chip is preferred 15- to 18-mer oligonucleotide probes produced. The probes are included complementary to the known mutant or native in Table 4 listed reference sequences of the following genes:

Tabelle 4 Table 4

Die Anzahl der benötigten Hybridisierungsstellen und diagnostizierbaren Erkrankungen ist aus Tabelle 5 ersichtlich. Die bekannten funktionell rele vanten Mutationen sind im Anhang aufgeführt.The number of hybridization sites required and diagnosable Diseases are shown in Table 5. The well-known functionally rele Relevant mutations are listed in the appendix.

Tabelle 5 Table 5

Erfassung der genetischen Prädisposition zur Entwicklung einer Arteriosklerose mittels Genchips Assessment of the genetic predisposition to the development of arteriosclerosis using gene chips

Insgesamt werden in diesem Ausführungsbeispiel 6.298 Hybridisierungs stellen für die Ermittlung der genetischen Prädisposition für die Arterioskle rose auf einem DNA-Chip verwendet. Die gemeinsame Präsenz dieser Oli gonukleotidsonden auf einem Träger erlaubt die simultane Erfassung dieser Sequenzvariationen aus einer Patientenprobe. Deshalb eignet sich dieser DNA-Chip insbesondere für den Einsatz in epidemiologischen Studien, die das Ziel verfolgen, die relative Wertigkeit genetischer Faktoren für das Herzinfarktrisiko zu erforschen.In total, 6,298 hybridizations are used in this exemplary embodiment places for the determination of the genetic predisposition for the arterioskle rose used on a DNA chip. The common presence of this oli gonucleotide probes on a support allow simultaneous detection of these Sequence variations from a patient sample. That is why it is suitable DNA chip especially for use in epidemiological studies that pursue the goal of the relative importance of genetic factors for the Explore heart attack risk.

Die funktionell relevanten Mutationen der in Tabelle 5 aufgeführten Gene sind in der Tabelle 6 enthalten. Diese oder auch ihre Komplementärsequen zen werden auf einen Nukleotidträger aufgebracht. The functionally relevant mutations of the genes listed in Table 5 are included in Table 6. These or their complementary sequences Zen are applied to a nucleotide carrier.

Liste 3 List 3

Punktmutationen point mutations

Spleißdefekte Spleißdefekte

Kleine Deletionen Small deletions

Sonstige Mutationen Other mutations

Claims

1. A method for determining the genetic arteriosclerosis risk comprises the following steps:

- Selection of reference nucleotide sequences relevant to the risk of arteriosclerosis, including their functionally characterized mutations;
- Application of probes of these nucleotide sequences or their complementary sequences to a support;
Hybridizing the probes with nucleotide sequences from a patient sample or with nucleotide sequences synthesized from a patient sample;
- detection of hybridization and
- Evaluation of the hybridization.

2. The method according to claim 1, characterized by a marking the nucleotide sequence synthesized from a patient sample.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized by a multi factorial evaluation of the hybridization.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized by probes from 10- to 25-mer oligonucleotides.

5. The method according to claim 4, characterized by 15 to 18 mers Oligonucleotide probes.

6. The method according to claim 5, characterized by 15-mer oligonu kleotidsonden.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized by one or more of the references given in Table 2 sequences or their complementary sequences.

8. The method according to claim 7, characterized by a selection of in functional mutations given in Tables 3 and 6.

9. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized by Oligonucleotide probes that are at least 90% identical or complete mentally to a selection of the functions given in tables 3 and 6 mutations.

10. Nucleotide carrier with a selection of oligonucleotide probes that iden table or complementary to sections of for genetic arterios clerosis risk relevant reference sequences.

11. Nucleotide carrier according to claim 10, characterized in that the Reference sequences a selection of those listed in Table 2 Represent reference sequences.

12. Nucleotide carrier according to claim 11, characterized by a selection of the oligonucleotide probes shown in Tables 3 and 6.

13. Nucleotide carrier according to one of claims 10 to 12, characterized by 10- to 25-mer oligonucleotide probes.

14. Oligonucleotide carrier according to claim 13, characterized by 15 to 18-mer oligonucleotide probes.

15. Nucleotide carrier according to claim 14, characterized by 15-mer oli gonukleotidträger.

16. Nucleotide carrier according to one of claims 10 to 15, characterized records that the carrier consists of glass coated with gold.

17. Use of the oligonucleotide carrier according to one of claims 10 up to 16 for simultaneous diagnosis of at least two for the genetic one Arteriosclerosis risk of relevant genes.