DE10061166A1

DE10061166A1 - Method and kit for the direct detection of nucleotide sequences, amino acid sequences or antigens

Info

Publication number: DE10061166A1
Application number: DE10061166A
Authority: DE
Inventors: Werner Lehmann
Original assignee: Attomol Molekulare Diagno GmbH; Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Current assignee: Attomol Molekulare Diagno GmbH; Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Priority date: 2000-11-30
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2002-06-06
Also published as: AU2002221909A1; WO2002044405A2; WO2002044405A3

Abstract

The invention relates to a method for the direct identification of target nucleotide sequences, target amino acid sequences or target antigens by the amplification of DNA using a DNA polymerase and a DNA double-strand destabilising enzyme. According to the invention, the target molecule is present in situ or in solution, or is directly immobilised, or immobilised by means of a capture probe on a solid phase. A DNA polymerase that is capable of strand displacement, dNTPs and a DNA double-strand destabilising enzyme are then added and the resultant amplification product is directly detected, the target being identified by means of said detection. To identify non-amplifiable target molecules, a coupling probe carrying a DNA matrix is first added and a DNA polymerase that is capable of strand displacement, dNTPs and a DNA double-strand destabilising enzyme are then added and the resultant amplification product is directly detected, the target being identified by means of said detection.

Description

Die Erfindung betrifft ein als Restrictase Chain Reaction (RCR) bezeichnetes Verfahren und einen Kit zum direkten Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen, Target-Aminosäuresequenzen oder von Target-Antigenen durch Am plifikation einer DNS mittels einer DNS-Polymerase- und eines doppelstrangdestabilisierenden Enzyms und Verwendungen dieses Kits in der medizinischen und kriminalistischen Diagnostik sowie für Umwelt-, Lebens- und Arzneimittelanalysen.The invention relates to a restrictase chain reaction (RCR) designated method and a kit for direct Detection of target nucleotide sequences, Target amino acid sequences or target antigens by Am plification of a DNA by means of a DNA polymerase and a double strand destabilizing enzyme and uses of this Kits in medical and criminalistic diagnostics as well as for environmental, life and pharmaceutical analyzes.

Es ist bekannt, daß sich Spuren von DNS durch die Polymerase Chain Reaction (PCR) (US Patente: 4.638.159; 4.638.202) identisch vervielfältigen lassen, um diese in größeren Mengen für spätere Analysen wie Sequenzierungen, Klonierungen etc. aufzubereiten. Die hohe Amplifikationsrate von mehr als 10⁹ machen diese Methode ebenfalls für die Spurenanalyse in der medizinischen und kriminalistischen Diagnostik interessant. So können spezifisch Abschnitte des Genoms von pathogenen Mikroorganismen in Patientenproben vervielfältigt werden, bis diese in ausreichender Konzentration vorliegen, um sie danach mit konventionellen DNS-Nachweisverfahren zu detektieren oder zu quantifizieren. Die PCR läßt sich in vielfältiger Weise mit anderen Verfahren koppeln, wie z. B. einer reversen Transkription von Boten-Ribonukleinsäure (mRNS) zur Bestimmung der Genexpression oder in Kombination mit Immunoassays zum sensitiven Antigennachweis.It is known that traces of DNA can be reproduced identically by the polymerase chain reaction (PCR) (US Patents: 4,638,159; 4,638,202) in order to prepare them in larger quantities for later analyzes such as sequencing, cloning, etc. The high amplification rate of more than 10 ^{9 also} makes this method interesting for trace analysis in medical and criminalistic diagnostics. Specifically, sections of the genome of pathogenic microorganisms can be reproduced in patient samples until they are present in sufficient concentration to be subsequently detected or quantified using conventional DNA detection methods. The PCR can be coupled in a variety of ways with other methods, such as. B. a reverse transcription of messenger ribonucleic acid (mRNA) to determine gene expression or in combination with immunoassays for sensitive antigen detection.

Die PCR basiert auf der zyklischen Primerverlängerung zweier Primer (Oligonukleotide), die jeweils am komplementären Strang hybridisieren. Die Entfernung zwischen beiden Primern kann wenige Nukleotide bis ca. 40 kB betragen. Der Zyklus der Amplifikation wird durch eine stufenweise Temperaturführung gesteuert. Folgende Stufen werden nacheinander durchlaufen: Strangdenaturierung (95°C), Primerhybridisierung (50-70°C) und letztlich die Primerverlängerung (74°C), bei der eine Polymerase in Gegenwart von dNTPs an das freie 3'-Ende des Primers einen Zweitstrang synthetisiert, wobei der Erststrang als Matrize dient. Meist sind 30 Zyklen für eine PCR-Reaktion ausreichend (ca. 1 h). Jeder Zyklus verdoppelt die Menge der Zielsequenz, was eine exponentielle Zunahme des Reaktionsproduktes zwischen den Primern bewirkt.The PCR is based on the cyclic primer extension of two Primers (oligonucleotides), each complementary Hybridize strand. The distance between the two primers can be a few nucleotides up to approx. 40 kB. The cycle of Amplification is achieved through a gradual temperature control controlled. The following stages are run through in succession: Strand denaturation (95 ° C), primer hybridization (50-70 ° C) and finally the primer extension (74 ° C), in which one Polymerase in the presence of dNTPs at the free 3 'end of the Primers synthesized a second strand, the first strand serves as a matrix. There are usually 30 cycles for a PCR reaction sufficient (approx. 1 h). Each cycle doubles the amount of Target sequence what an exponential increase in the Reaction product between the primers causes.

Neben der PCR wurden weitere Amplifikationsmethoden entwickelt, die aber bei weitem nicht die Bedeutung erlangten, wie die PCR. Hier ist zum Einen die Ligase Chain Reaction (LCR) (Barany, F. [1991] PCR Methods and Applications 1: 5-16) zu nennen, bei der durch Kombination einer Polymerasereaktion mit einer Ligasereaktion jeweils an den komplementären DNS-Strängen Primerpaare miteinander verknüpft werden. Über eine stufenweise Temperaturregulation, ähnlich wie bei der PCR, kann dieser Prozeß zyklisch wiederholt werden, wobei die miteinander ligierten Primer eines DNS-Strangs die Targets für die nächste Runde bilden und es somit zu einer exponentiellen Amplifikation des gewünschten DNS-Bereichs kommt. Der Nachteil dieser Methode besteht, ebenso wie bei der PCR, in dem komplizierten Temperaturregime.In addition to PCR, other amplification methods were used developed, but by no means the meaning acquired how the PCR. Here is the ligase chain Reaction (LCR) (Barany, F. [1991] PCR Methods and Applications 1: 5-16) in which by combination a polymerase reaction with a ligase reaction in each case the complementary DNA strands primer pairs with each other be linked. Via gradual temperature regulation, Similar to PCR, this process can be cyclical can be repeated, the primers ligated together of a DNA strand form the targets for the next round and thus an exponential amplification of the desired DNS range comes. The disadvantage of this method consists, as with PCR, in the complicated Temperature regime.

Eine weitere Methode zur Amplifikation von DNS ist die Strand Displacement Amplification (SDA) (Walker, G. [1993] PCR Methods and Applications 3: 1-6). Hierbei werden eine Polymerase- und eine Restriktionsendonukleasereaktion miteinander kombiniert. Bei dieser Methode werden die Eigenschaften einer DNS-Polymerase ohne Exonukleasefunktion (z. B. KlenowExo^-) genutzt, einen DNS-Strang vom komplementären Strang während der DNS-Synthese zu verdrängen, bis er schließlich vollständig abgelöst ist. Eine Restriktionsendonuklease schneidet nun im Bereich des Primers nur den neusynthetisierten Strang, wobei ein neuer Ansatzpunkt für die Polymerase geschaffen wird. Damit kann der Prozeß von neuem mit der Ablösung des vorhandenen Stranges beginnen. Dieser Prozeß läuft bei einer konstanten Temperatur zwischen 37 und 65°C ab und führt zur Vervielfältigung der Analyt-DNS zwischen den vier verschiedenen Primern. Der Nachteil dieser Methode besteht in dem komplexen Reaktionsablauf.Another method for amplifying DNA is Strand Displacement Amplification (SDA) (Walker, G. [1993] PCR Methods and Applications 3: 1-6). Here, a polymerase and a restriction endonuclease reaction are combined. In this method, the properties of a DNA polymerase without exonuclease function (e.g. KlenowExo ^- ) are used to displace a DNA strand from the complementary strand during DNA synthesis until it is finally completely detached. A restriction endonuclease only cuts the newly synthesized strand in the area of the primer, creating a new starting point for the polymerase. The process can thus begin again with the replacement of the existing strand. This process takes place at a constant temperature between 37 and 65 ° C and leads to the amplification of the analyte DNA between the four different primers. The disadvantage of this method is the complex course of the reaction.

Eine weitere bekannte Methode zur Amplifikation von DNS ist die Primer Digestion Amplification (PDA) (Takarada, Y. [1994] Nucleic Acids Research 22(11): 2170-2172). Hierbei werden eine DNS-Polymerase und eine 3'→5'-Exonuklease miteinander kombiniert. Dabei kommt nur ein spezifischer Primer zum Einsatz der aus zwei Bereichen besteht: Eine zum 3'-Ende des Targets komplementäre und eine zum 5'-Ende des Targets homologe Sequenz. Der Primer hybridisiert an das 3'-Ende des Targets und wird verlängert, wobei ein zur Target-Sequenz komplementärer Zweitstrang entsteht. Nach der Verlängerung wird der zum 3'-Ende des Targets komplementäre Bereich des nicht-hybridisierten Primers mittels Exonuklease III abgebaut. Der homologe Bereich ist am 3'-Ende phosphorthioatisiert und somit vor einem Abbau durch Exonuklease geschützt. Der entstehende, nur noch aus dem zum 5'-Ende des Targets homologen Bereich bestehende Primer (verdauter Primer), hybridisiert an das 3'-Ende des neusynthetisierten, zuvor denaturierten Zweitstrangs und wird verlängert. Nach Denaturierung des entstandenen Produkts kann der verdaute Primer mit beiden Strängen hybridisieren. Anschließend werden die beiden Stränge, und damit die Target-DNS, thermozyklisch amplifiziert. Der Nachteil dieser Methode besteht auch in dem einzuhaltenden thermozyklischen Temperaturregime.Another known method for amplifying DNA is the primer digestion amplification (PDA) (Takarada, Y. [1994] Nucleic Acids Research 22 (11): 2170-2172). Here are a DNA polymerase and a 3 '→ 5' exonuclease with each other combined. Only one specific primer is used Use that consists of two areas: one at the 3 'end of the Targets complementary and one to the 5 'end of the target homologous sequence. The primer hybridizes to the 3 'end of the Targets and is extended, being one to the target sequence complementary second strand arises. After the extension the region of the. complementary to the 3 'end of the target non-hybridized primers using exonuclease III reduced. The homologous area is at the 3 'end phosphorothioated and thus before degradation Protected exonuclease. The emerging, only from the to 5'-end of the target homologous area existing primers (digested primer) hybridizes to the 3 'end of the newly synthesized, previously denatured second strand and will extended. After denaturing the resulting product can the digested primer hybridize with both strands. Then the two strands, and thus the Target DNA, amplified thermocyclically. The disadvantage of this method also consists in the thermocyclic to be observed Temperature regime.

Die Nachteile der bekannten Methoden des Standes der Technik, die auf alle Methoden zutreffen, bestehen darin, daß die Detektion des Amplifikats und die Amplifikation mit Ausnahme der kostenintensiven Real Time Amplifikation in verschiedenen Reaktionsansätzen erfolgen, was zeitaufwendig und kostenintensiv ist. Ein weiterer Nachteil ist, daß bei PCR, LCR und PDA die Amplifikationsreaktion thermozyklisch durchgeführt wird. Dadurch werden relativ aufwendige und teure Apparaturen zur Kontrolle des zyklischen Temperaturregimes benötigt. Außerdem verläuft die Amplifikation durch die thermischen Zyklen relativ träge, da während der Denaturierungsphasen keine Amplifikation erfolgen kann. Bedingt durch die genannten Probleme ist die Adaption der Methoden des Standes der Technik auf Routineanwendungen schwierig.The disadvantages of the known methods of the prior art, that apply to all methods are that the Detection of the amplificate and amplification with the exception costly real time amplification in different Reaction approaches take what is time consuming and is expensive. Another disadvantage is that with PCR, LCR and PDA thermocyclic the amplification reaction is carried out. This makes it relatively complex and expensive devices to control the cyclical Temperature regime needed. In addition, the Amplification by the thermal cycles is relatively sluggish because no amplification takes place during the denaturation phases can. The adaptation is due to the problems mentioned the methods of the prior art on routine applications difficult.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und einen Kit zum Nachweis verschiedener Biomoleküle zu entwickeln, die vorteilhaft im Routinebetrieb anwendbar sind. Weiterhin war es Aufgabe der Erfindung, die Amplifikation möglichst bei konstanten Temperaturen durchführen zu können.The invention was therefore based on the object of a method and a kit for the detection of different biomolecules develop that can be used advantageously in routine operation. Another object of the invention was amplification to be able to carry out at constant temperatures if possible.

Die Erfindung wird dadurch realisiert, daß die nachzuweisende Target-Nukleotidsequenz direkt amplifiziert wird, oder Target-Aminosäuresequenz oder das nachzuweisende Target-Antigen an eine Kopplungssonde gebunden wird, die eine Matrix-DNS trägt. Das Target ist dabei entweder direkt oder über eine Fangsonde an einer festen Phase immobilisiert oder es liegt in situ, z. B. in einem Gewebeschnitt vor.The invention is realized in that the one to be verified Target nucleotide sequence is directly amplified, or Target amino acid sequence or the one to be detected Target antigen is bound to a coupling probe which is a Matrix DNA carries. The target is either direct or immobilized on a fixed phase using a capture probe or it is in situ, e.g. B. in a tissue section.

Das direkt zu amplifizierende Target oder die Matrix stellt eine einzelsträngige bzw. doppelsträngige Oligo- bzw. Polynukleotidsequenz dar, die im Verlauf der Reaktion als Primer fungieren können oder an die Primernukleotidsequenzen binden können. Die Amplifikation wird durch ein Enzym oder Protein, das den DNS-Doppelstrang destabilisiert, eine DNS-Polymerase und aller Substanzen, die für die Wirkung beider Enzyme notwendig sind, ausgelöst. Während der Reaktion wird durch die Bindung des Destabilisierungsenzyms der DNS-Doppelstrang ohne Temperaturerhöhung wenigstens partiell in Einzelstränge aufgespalten, so daß freie 3'-Enden entstehen, die Primen oder Primer am Einzelstrang binden können. Während des Primens werden Nukleotidsequenzen, die mit ihrem 3'-Ende an eine Targetnukleotidsequenz hybridisiert vorliegen durch eine DNS-Polymerase unter Einbau von Nukleotiden verlängert. Durch Verlängerung der gebundenen Primer durch die DNS- Polymerase werden die Einzelstränge des ursprünglich doppelsträngigen DNS-Moleküls wenigstens partiell dauerhaft voneinander getrennt, z. B. in Form einer Strangablösung. Die resultierende Einzelstränge können erneut primen oder als Target für Primer dienen.The target or the matrix to be amplified directly a single-stranded or double-stranded oligo or Polynucleotide sequence, which in the course of the reaction as Primers can act or on the primer nucleotide sequences can bind. The amplification is carried out by an enzyme or Protein that destabilizes the DNA duplex, a DNA polymerase and all substances that are effective for both Enzymes are necessary to be triggered. During the reaction by binding the destabilizing enzyme DNA double strand at least partially in without temperature increase Split single strands so that free 3 'ends are formed, which can bind primers or primers on a single strand. While of the primes are nucleotide sequences that end with their 3 ' hybridized to a target nucleotide sequence a DNA polymerase extended with the incorporation of nucleotides. By extending the bound primers with the DNA Polymerase are the single strands of the original double-stranded DNA molecule at least partially permanently separated from each other, e.g. B. in the form of a strand separation. The resulting single strands can prime again or as Serve target for primer.

Während der Amplifikation läuft offensichtlich eine sehr komplexe Reaktion ab. Bisherige Untersuchungen zeigen, daß ein sehr großes Reaktionsprodukt - ein komplexes Amplifikat - entsteht, welches aus einzel- und doppelsträngigen Bereichen besteht. Dieses komplexe Amplifikat kann anschließend detektiert werden. Aus dem komplexen Amplifikat können distinkte DNS-Fraktionen bis ca. 10 kB isoliert werden oder durch eine Restriktionsendonuklease freigesetzt werden.Obviously, one is running a lot during amplification complex reaction. Previous studies show that a very large reaction product - a complex amplificate - arises, which consists of single and double-stranded areas consists. This complex amplificate can then can be detected. Can from the complex amplificate distinct DNA fractions up to approx. 10 kB are isolated or be released by a restriction endonuclease.

Alternativ dazu kann das komplexe Amplifikat an eine an der festen Phase immobilisierte Fangsonde für das Amplifikat hybridisieren, woraufhin die Fangsonde in 3'-Richtung verlängert wird. Über diese 3'-Verlängerung oder über das durch diese Verlängerung immobilisierte Amplifikat erfolgt dann die Detektion.Alternatively, the complex amplificate can be attached to another solid phase immobilized capture probe for the amplificate hybridize, whereupon the capture probe in the 3 'direction is extended. About this 3 'extension or about that by this extension immobilized amplificate takes place then the detection.

Alternativ kann das komplexe Amplifikat nach der Bildung als Endpunktbestimmung durch Zugabe DNA-bindender Farbstoffe wie Sybrgreen®, Ethidiumbromid oder DAPI sowie durch Zugabe spezieller fluoreszenz-/quenchermarkierter Sonden, wie Molecular Beacon® detektiert werden. Alternatively, the complex amplificate can be formed as End point determination by adding DNA-binding dyes such as Sybrgreen®, ethidium bromide or DAPI and by adding special fluorescence / quencher labeled probes, such as Molecular Beacon® can be detected.

Selbstverständlich kann die Bildung des komplexen Amplifikats auch als Echtzeitmessung durch Zugabe DNA-bindender Farbstoffe, wie Sybrgreen®, Ethidiumbromid oder DAPI sowie durch Zugabe spezieller fluoreszenz-/quenchermarkierter Sonden, wie Molecular Beacon® und Amplifluorprimer®, detektiert werden. Es kann auch die Erhöhung der Viskosität des Mediums durch das gebildete Amplifikat bestimmt werden.Of course, the formation of the complex amplificate also as real-time measurement by adding DNA-binding Dyes such as Sybrgreen®, ethidium bromide or DAPI as well by adding special fluorescence / quencher labeled Probes such as Molecular Beacon® and Amplifluorprimer®, can be detected. It can also increase the viscosity of the medium can be determined by the amplificate formed.

Wird das Target nicht selbst, sondern eine daran gekoppelte Nukleotidsequenz, die Matrix-DNS, amplifiziert, kann die Amplifikation - aufgrund der Waschschritte - nur erfolgen, wenn zunächst die die Matrix-DNS tragende spezifische Kopplungssonde an das entsprechende Target gebunden hat. Das Target ist die nachzuweisende Nukleotid- oder Aminosäuresequenz oder das nachzuweisende Antigen.If the target is not itself, but a coupled to it Nucleotide sequence that amplifies matrix DNA can Amplification - due to the washing steps - only done if at first the specific one carrying the matrix DNA Coupling probe has bound to the corresponding target. The Target is the nucleotide or Amino acid sequence or the antigen to be detected.

Erfindungsgemäß wird unter Target-Nukleotidsequenz eine DNS oder RNS verstanden.According to the invention, a DNA is under target nucleotide sequence or RNS understood.

Als Target-Aminosäuresequenzen können beispielsweise Enzyme, Antikörper, Antigene, Peptide, Proteine, Proteide, Rezeptoren im Sinne von Bindungsstellen und ihre Liganden und deren Komplexe - mit sich selbst und anderen Stoffen - nachgewiesen werden.For example, enzymes, Antibodies, antigens, peptides, proteins, proteids, receptors in the sense of binding sites and their ligands and their Complexes - with themselves and other substances - proven become.

Das Target-Antigen kann auch eine Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz sein oder ein Polysaccharid, ein Virus, ein Bakterium, eine Zelle eines Eukaryonten oder jede andere Substanz, die von einem Antikörper erkannt werden kann. The target antigen can also be an amino acid sequence or Be a nucleotide sequence or a polysaccharide, a virus Bacterium, a cell of a eukaryote or any other Substance that can be recognized by an antibody.

Erfindungsgemäß können DNA-bindende und doppelstrangdestabilisierende Enzyme sowohl DNA-Topoisomerasen, die einen oder beide Stränge eines DNA-Doppelstranges schneiden, Restriktionsendonukleasen, die beide Stränge eines Doppelstranges schneiden, sowie Nickenzyme, die einen Strang eines Doppelstranges schneiden sowie Helicasen, die doppelsträngige DNA entwinden, eingesetzt werden. Bevorzugt wird ein Nickenzym verwendet, wie z. B. N.BstNB I, N.CviQX I, N.CviP II, V.Bch I, V.EcoDcm. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform findet als Nickenzym N.BstNB I Verwendung.According to the invention, DNA-binding and double strand destabilizing enzymes both DNA topoisomerases that contain one or both strands of one DNA double strands cut, restriction endonucleases cut both strands of a double strand, as well Nick enzymes that cut a strand of a double strand as well as helicases that evolve double-stranded DNA, be used. A nick enzyme is preferably used, such as B. N.BstNB I, N.CviQX I, N.CviP II, V.Bch I, V.EcoDcm. In a particularly preferred embodiment, as Nickenzym N.BstNB I use.

Als Restriktionsendonuklease können z. B. Eco RI, Hind III oder Sac I eingesetzt werden. Dabei muß jedoch die Matrix-DNS im Bereich der Restriktionsenzymerkennungsstelle chemisch so modifiziert sein, daß nur der neusynthetisierte Strang geschnitten wird, da ansonsten die Selbstamplifikation der Matrix-DNS nicht funktioniert. Vorzugsweise findet eine Matrix-DNS Verwendung, die mit Methylgruppen (Methyl-Matrix-DNS) oder Phosphorthioaten (PTO-Matrix-DNS) modifiziert ist.As a restriction endonuclease, e.g. B. Eco RI, Hind III or Sac I can be used. However, the matrix DNA in the area of the restriction enzyme recognition site chemically so be modified that only the newly synthesized strand is cut, otherwise the self-amplification of the Matrix DNS is not working. Preferably one Matrix DNA use with methyl groups (methyl matrix DNA) or phosphorothioates (PTO matrix DNA) is modified.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Amplifikationsreaktion isothermisch durchgeführt, also bei einer konstanten Temperatur im Bereich von 20°-70°C, bevorzugt im Bereich von 30°-60°C. Es ist aber auch möglich die Amplifikationsreaktion thermozyklisch durchzuführen, wenn die verwendete DNS-Polymerase hitzestabil ist (z. B. Vent® (exo^-) oder Deep Vent® (exo^-)DNS-Polymerase von New England Biolabs, USA). In a preferred embodiment of the invention, the amplification reaction is carried out isothermally, that is to say at a constant temperature in the range from 20 ° -70 ° C., preferably in the range from 30 ° -60 ° C. However, it is also possible to carry out the amplification reaction thermocyclically if the DNA polymerase used is heat-stable (e.g. Vent® (exo ^- ) or Deep Vent® (exo ^- ) DNA polymerase from New England Biolabs, USA).

Als Matrix-DNS und Primer können in einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von N.BstNB I als doppelstrangdestabilisierendes Enzym z. B. folgende Sequenzen eingesetzt werden:
In a preferred embodiment using N.BstNB I as the double-strand destabilizing enzyme, z. B. the following sequences are used:

Als Matrix-DNS kann alternativ auch Amplifikat des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden. Die Zugabe von Primern ist insbesondere dann auch bei extrem hohen Amplifikatverdünnungen (bis 10¹⁰) nicht mehr notwendig.Alternatively, an amplificate of the method according to the invention can also be used as the matrix DNA. The addition of primers is then no longer necessary, especially in the case of extremely high amplification dilutions (up to 10 ¹⁰ ).

Erfindungsgemäß wird als Kopplungssonde für den Nachweis einer Target-Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz verwendet. Diese ist vollständig oder in einem Teilbereich komplementär zu einem Bereich der Target-Nukleotidsequenz. Über diese komplementäre Sequenz erfolgt eine Hybridisierung beider Moleküle. An die Kopplungssonde wird kovalent oder nicht kovalent über ein oder mehrere Biomoleküle die Matrix-DNS gebunden. According to the invention is used as a coupling probe for the detection a nucleotide sequence of a target nucleotide sequence used. This is complete or in a sub-area complementary to a region of the target nucleotide sequence. Hybridization takes place via this complementary sequence of both molecules. The coupling probe becomes covalent or not covalently across one or more biomolecules Matrix DNA bound.

Ist das Target ein Antigen, so ist die Kopplungssonde ein Antikörper, wobei erfindungsgemäß unter Antikörper ein spezifischer, monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper verstanden wird. Auch an diesen ist kovalent oder nicht kovalent über ein oder mehrere Biomoleküle die Matrix-DNS gebunden.If the target is an antigen, the coupling probe is on Antibodies, according to the invention under antibodies specific, monoclonal and / or polyclonal antibody is understood. On these, too, is covalent or not covalently the matrix DNA via one or more biomolecules bound.

Zum Nachweis einer Aminosäuresequenz ist die Kopplungssonde ein Ligand. Unter Ligand werden erfindungsgemäß Aminosäuresequenzen, Nucleinsäuresequenzen, Kohlenhydrate und/oder Lipide verstanden. An den Liganden ist ebenfalls kovalent oder nicht kovalent über ein oder mehrere Biomoleküle die Matrix-DNS gebunden.The coupling probe is used to detect an amino acid sequence a ligand. Under ligand are according to the invention Amino acid sequences, nucleic acid sequences, carbohydrates and / or lipids understood. On the ligand is also covalently or non-covalently via one or more Biomolecules bound the matrix DNA.

Als Biomoleküle, über die erfindungsgemäß die Kopplungssonde an die Matrix-DNS gebunden ist, werden Fluorescein, Anti-Fluorescein-Antikörper, Digoxigenin sowie Anti-Digoxigenin-Antikörper eingesetzt, bevorzugt Biotin sowie Avidin oder Streptavidin.As biomolecules, via which the coupling probe according to the invention attached to the matrix DNA, fluorescein, Anti-fluorescein antibodies, digoxigenin as well Anti-digoxigenin antibodies are used, preferably biotin and avidin or Streptavidin.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird als Kopplungssonde für den Nachweis der Expression des humanen p53-Gens folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO 2) verwendet (s. auch Beispiel):
5'-GGC GGG GGT GTG GAA TCA AC-3'.In one embodiment of the invention, the following nucleotide sequence (SEQ ID NO 2) is used as the coupling probe for the detection of the expression of the human p53 gene (see also example):
5'-GGC GGG GGT GTG GAA TCA AC-3 '.

Vorzugsweise ist diese Nukleotidsequenz über Biotin an eine Matrix-DNS, z. B. die der SEQ ID NO 1, gebunden.This nucleotide sequence is preferably via biotin to one Matrix DNA, e.g. B. that of SEQ ID NO 1 bound.

Für den Fall, daß ein Schutz vor Amplifikatkontamination notwendig sein sollte, wird dem Reaktionsansatz vor Durchführung der Amplifikation Exonuklease III zugegeben. Exonuklease III ist eine 3'-5'-Exonuklease, die DNS-Stränge vom 3'-Ende her hydrolysiert. Damit Matrix-DNS und gegebenenfalls Kopplungs-Nukleotidsequenz nicht durch Exonuklease abgebaut werden, sind die 3'-Enden dieser Moleküle vor einer Exonuklease III-Hydrolysierung zu schützen. Vorzugsweise kann dies durch Phosphorthioatisierung erfolgen. Vor Beginn der Amplifikationsreaktion wird die Exonuklease III inaktiviert, damit sie den weiteren Reaktionsablauf nicht stören kann. Dies kann bevorzugt durch Erhitzen erfolgen, beispielsweise bei mindestens 70°C für mindestens 20 Minuten. In the event that protection against amplification contamination should be necessary, the reaction approach is given Performed the amplification of exonuclease III added. Exonuclease III is a 3'-5 'exonuclease that strands of DNA hydrolyzed from the 3 'end. So that matrix DNA and possibly not by coupling nucleotide sequence Exonucleases are broken down, the 3 'ends of these Molecules prior to exonuclease III hydrolysis protect. This can preferably be done by phosphorothioatisation respectively. Before the amplification reaction begins, the Exonuclease III inactivated so that it can continue Reaction process can not interfere. This can preferably be done by Heating is done, for example, at at least 70 ° C for at least 20 minutes.

Als DNS-Polymerase wird erfindungsgemäß eine DNS-Polymerase verwendet, die Strangverdrängung bewirkt, also den in 5'-Richtung von der Schnittstelle liegenden Teil des geschnittenen Strangs nicht hydrolysiert, sondern freisetzt. Vorzugsweise wird eine DNS-Polymerase ohne Exonukleasefunktion eingesetzt, d. h. sowohl ohne 5'→3'-Exonukleasefunktion, als auch ohne 3'→5'-Exonukleasefunktion. Dies können beispielsweise sein: Bst-DNS-Polymerase, Vent® (exo^-)DNS-Polymerase, Deep Vent® (exo^-)DNS-Polymerase (beide von New England Biolabs, USA) oder Klenow-Fragment 3'→5'-exo^-.According to the invention, a DNA polymerase is used as the DNA polymerase which effects strand displacement, that is to say that it does not hydrolyze, but rather releases the part of the cut strand lying in the 5 'direction from the interface. A DNA polymerase without an exonuclease function is preferably used, ie both without a 5 '→ 3' exonuclease function and without a 3 '→ 5' exonuclease function. These can be, for example: Bst DNA polymerase, Vent® (exo ^- ) DNA polymerase, Deep Vent® (exo ^- ) DNA polymerase (both from New England Biolabs, USA) or Klenow fragment 3 '→ 5'- exo ^- .

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als DNS-Polymerase Bst-DNS-Polymerase Large Fragment verwendet.In a preferred embodiment, the DNA polymerase Bst DNA Polymerase Large Fragment used.

Vor der Kopplung der Matrix-DNS an das Target-Molekül wird dieses an der festen Phase immobilisiert oder es liegt in situ vor. Das Target-Molekül kann kovalent bzw. nicht kovalent direkt an die feste Phase gebunden werden. Im Fall einer nachzuweisenden Target-Nukleotidsequenz ist es auch möglich, an der festen Phase mit ihrem 5'-Ende eine Fangsonde, vorzugsweise durch Phosphatisierung des 5'-terminalen Nukleotids, zu immobilisieren, die an ihrem 3'-Ende zu einem Bereich der Target-Nukleotidsequenz komplementär ist und an dieser Stelle mit der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert. Zum Schutz vor einem Abbau durch Exonuklease III ist die Fangsonde 3'-terminal modifiziert, vorzugsweise durch Phosphorthioatisierung. Before coupling the matrix DNA to the target molecule this is immobilized on the solid phase or it lies in situ before. The target molecule may or may not be covalent covalently bound directly to the solid phase. In the case it is also a target nucleotide sequence to be detected possible, at the solid phase with its 5 'end Capture probe, preferably by phosphating the 5'-terminal nucleotide, immobilized on their 3 'end to a region of the target nucleotide sequence is complementary and at this point with the Target nucleotide sequence hybridizes. To protect against degradation exonuclease III makes the capture probe 3'-terminal modified, preferably by phosphorothioatisation.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird als Fangsonde für den Nachweis der Expression des humanen p53-Gens folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO 3) verwendet (s. auch Beispiel):
5'-CAA GAA GCC CAG ACG GAA ACT TGA TTG TCA CAC CCA CAC CCC GTG TGT GTG T-3'.In one embodiment of the invention, the following nucleotide sequence (SEQ ID NO 3) is used as the capture probe for the detection of the expression of the human p53 gene (see also example):
5'-CAA GAA GCC CAG ACG GAA ACT TGA TTG TCA CAC CCA CAC CCC GTG TGT GTG T-3 '.

Der Bereich der Sequenz, der komplementär zur p53-cDNS 459-478 ist, ist in Fettdruck dargestellt.The region of the sequence that is complementary to the p53 cDNA 459-478 is shown in bold.

Als feste Phase wird erfindungsgemäß polymeres Material oder ein Halbleitermaterial eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als feste Phase eine Mikrotiterplatte oder eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran verwendet.According to the invention, polymeric material or a semiconductor material used. In a preferred one Embodiment of the invention is a solid phase Microtiter plate or a nitrocellulose or nylon membrane used.

Zur Detektion liegt das komplexe Amplifikat in Lösung, an der festen Phase oder im Gewebeschnitt vor. Die Detektion erfolgt erfindungsgemäß entweder über einen DNS-Farbstoff, der beispielsweise in das komplexe Amplifikat interkaliert, oder durch Einbau eines markierten dNTPs während der Amplifikation oder durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde. Interkalierende oder an das Phosphatgerüst bindende Farbstoffe binden vorteilhafterweise stabil und werden durch Waschen nicht sofort entfernt. Im Falle DNS-bindender Farbstoffe muß mit Vorteil nicht gewaschen werden, da die Farbstoffe nur fluoreszieren, wenn sie an DNS binden und sich dadurch ausreichend von nicht gebundenem Farbstoff unterscheiden. For the detection, the complex amplificate is in solution at which solid phase or in tissue section before. The detection takes place according to the invention either via a DNA dye which for example intercalated into the complex amplificate, or by incorporating a labeled dNTP during amplification or by hybridization with a specific probe. Intercalating or binding to the phosphate structure Dyes advantageously bind stable and become Do not wash away immediately. In the case of DNA binding Dyes do not have to be washed with advantage, since the Dyes only fluoresce when they bind to and bind to DNA therefore sufficient of unbound dye differ.

Für den letzten Fall wird vor der Kopplung der Matrix-DNS an das Target-Molekül - gegebenenfalls zusätzlich zur Fangsonde - eine Fangsonde für das Amplifikat mit ihrem 5'-Ende, bevorzugt durch Phosphatisierung des 5'-Endes, an die feste Phase oder den Gewebeschnitt gebunden. Die Fangsonde weist an ihrem 3'-Ende eine zu einem einzelsträngigen Bereich des komplexen Amplifikats komplementäre Sequenz auf, über die sie mit dem Amplifikat hybridisiert. Zum Schutz vor einem Abbau durch Exonuklease III ist sie 3'-terminal modifiziert, bevorzugt durch Phosphorthioatisierung. Nach der Hybridisierung von Fangsonde und komplexem Amplifikat wird die Fangsonde durch die DNS-Polymerase in 3'-Richtung verlängert, wobei der einzelsträngige Bereich des komplexen Amplifikats als Matrize dient. Es folgt ein Denaturierungsschritt, beispielsweise durch Erhitzen, in dessen Folge die Fangsonde wieder einzelsträngig vorliegt. Die Denatuierung ist optional, da insbesondere bereits im immobilisierten Amplifikat einzelsträngige Bereiche vorliegen, mit der die Sonde im folgenden Schritt hybridisieren kann.In the latter case, the matrix DNS is connected before the target molecule - if necessary in addition to the capture probe a capture probe for the amplificate with its 5 'end, preferably by phosphating the 5 'end to the solid Phase or the tissue section bound. The capture probe instructs its 3 'end one to a single-stranded area of the complex amplificate complementary sequence over which they hybridized with the amplificate. To protect against degradation it is 3'-terminally modified by exonuclease III, preferably by phosphorothioatisation. After Hybridization of capture probe and complex amplificate the capture probe by the DNA polymerase in the 3 'direction lengthened, the single-stranded area of the complex Amplificate serves as a matrix. It follows Denaturation step, for example by heating, in the result of which the capture probe is again single-stranded. The denaturation is optional, because especially in immobilized amplificate single-stranded areas with which the probe is present in the following step can hybridize.

Nun wird dem Reaktionsansatz markierte Detektionssonde zugegeben, eine Nukleotidsequenz die homolog ist zu einem Bereich des komplexen Amplifikats, der in 5'-Richtung von dem Bereich des Amplifikats liegt, der zum 3-Ende der Detektionssonde komplementär ist. Diese Detektionssonde hybridisiert dann mit dem entsprechenden Bereich der in 3'-Richtung verlängerten Sequenz der Fangsonde für das Amplifikat. Now the detection probe is marked for the reaction batch added a nucleotide sequence that is homologous to one Area of the complex amplificate which is in the 5 'direction from the The range of the amplificate lies at the 3-end of the Detection probe is complementary. This detection probe then hybridizes to the corresponding area of the in 3 'direction extended sequence of the capture probe for the Amplicon.

Alternativ dazu ist es auch möglich, dem Reaktionsansatz ein markiertes dNTP zuzugeben, also eines der zur Amplifikation notwendigen dNTPs zu markieren. Dadurch wird sowohl das komplexe Amplifikat selbst als auch die 3'-Verlängerung der Fangsonde markiert. Auf den Einsatz der Detektionssonde kann hierbei verzichtet werden, da die Detektion über die Markierungen des komplexen Amplifikats und/oder die Markierungen der Fangsonde für das Amplifikat erfolgt.Alternatively, it is also possible to use the reaction mixture Add labeled dNTP, i.e. one of those for amplification mark necessary dNTPs. This will both complex amplificate itself as well as the 3 'extension of the Trap marked. Can use the detection probe can be dispensed with here, since the detection via the Markings of the complex amplificate and / or the The capture probe is marked for the amplificate.

Vor Durchführung der Visualisierung des DNS-Farbstoffs oder der Markierung kann ein Waschschritt durchgeführt werden, durch den nicht interkalierter oder gebundener Farbstoff, nicht eingebautes markiertes dNTP oder nicht hybridisierte markierte Detektionssonde aus dem Reaktionsansatz entfernt wird.Before performing the visualization of the DNA dye or a washing step can be carried out on the marking, due to the non-intercalated or bound dye, unincorporated labeled dNTP or non-hybridized marked detection probe removed from the reaction mixture becomes.

Als DNS-Farbstoff wird bevorzugt ein Fluorogen, z. B. Ethidiumbromid, DAPI, Akridinorrange eingesetzt, das über Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge visualisiert werden kann. Besonders bevorzugt wird SybrGreen® verwendet.A fluorogen, e.g. B. Ethidium bromide, DAPI, acridine orange used, which about Irradiation with light of a certain wavelength can be visualized. SybrGreen® is particularly preferred used.

Als Markierung der Detektionssonde oder des markierten dNTPs wird bevorzugt ein Biomolekül, wie z. B. Fluorescein, Aminocumarin oder Rhodamin B, Digoxigenin oder Biotin, ein Enzym, wie z. B. Meerrettichperoxidase, oder ein radioaktives Isotop, wie z. B. ³²P oder ³⁵S, verwendet, um den Nachweis mit den üblichen enzymometrischen, fluorometrischen oder autoradiographischen Verfahren durchführen zu können. A biomolecule, such as, for example, is preferably used as the label for the detection probe or the labeled dNTP. B. fluorescein, aminocoumarin or rhodamine B, digoxigenin or biotin, an enzyme such as. B. horseradish peroxidase, or a radioactive isotope, such as. B. ³² P or ³⁵ S, used to carry out the detection with the usual enzymometric, fluorometric or autoradiographic methods.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dieser enthält mindestens die oben beschriebene, der Amplifikation dienende Matrix-DNS. Die anderen zur Durchführung des Verfahrens notwendigen Bestandteile können kommerziell bezogen werden.Another object of the invention is a kit for Implementation of the method according to the invention. This contains at least the one for amplification described above Matrix DNA. The others to carry out the procedure necessary components can be obtained commercially.

Zusätzlich zur Matrix-DNS kann der Kit auch, der Kopplung der Matrix-DNS an das Target dienende, oben beschriebene Kopplungssonde enthalten, je nachdem, welches Target nachgewiesen werden soll.In addition to matrix DNA, the kit can also be used to couple the Matrix DNA serving the target as described above Coupling probe included, depending on which target should be demonstrated.

Zusätzlich zur Matrix kann der Kit auch Primer enthalten, wenn sie für die Amplifikation notwendig sind. Zusätzlich zur Matrix-DNS und der Kopplungssonde können in dem Kit noch der Kopplung der Matrix-DNS an die Kopplungssonde dienende Biomoleküle, wie oben beschrieben, enthalten sein. Bevorzugt sind die Biomoleküle Biotin sowie Avidin oder Streptavidin. Alternativ kann die Matrix-DNS in gekoppelter Form, indem sie bereits über die Biomoleküle an die Kopplungssonde gekoppelt ist, in dem Kit enthalten sein.In addition to the matrix, the kit can also contain primers, if they are necessary for the amplification. In addition to Matrix DNA and the coupling probe can also be used in the kit Coupling the matrix DNA to the coupling probe Biomolecules as described above may be included. Prefers the biomolecules are biotin and avidin or streptavidin. Alternatively, the matrix DNA can be linked by: already coupled to the coupling probe via the biomolecules is included in the kit.

Zusätzlich zur Matrix-DNS und gegebenenfalls zu der Kopplungssonde und den Biomolekülen kann in dem Kit der Amplifikation der Matrix-DNS dienende DNS-Polymerase, wie oben beschrieben, enthalten sein.In addition to the matrix DNA and possibly the Coupling probe and the biomolecules can be found in the kit Amplification of the matrix DNA serving DNA polymerase, such as described above.

Auch kann der Kit zusätzlich zur Matrix-DNS und gegebenenfalls der Kopplungssonde, den Biomolekülen und der DNS-Polymerase das vorstehend beschriebene DNS-doppelstrangdestabilisierende Enzym enthalten. The kit can also be used in addition to matrix DNA and where appropriate, the coupling probe, the biomolecules and the DNA polymerase the one described above DNA double strand destabilizing enzyme included.

Zudem kann in dem Kit zusätzlich zur Matrix-DNS und gegebenenfalls zu der Kopplungssonde, den Biomolekülen, der DNS-Polymerase und dem DNS-doppelstrangdestabilisierenden Enzym die oben beschriebene feste Phase beinhalten.In addition to the matrix DNA and optionally to the coupling probe, the biomolecules, the DNA polymerase and the DNA double-strand destabilizing Enzyme include the solid phase described above.

Zusätzlich zur Matrix-DNS und der festen Phase sowie gegebenenfalls der Kopplungssonde, den Biomolekülen, der DNS-Polymerase und dem DNS-doppelstrangdestabilisierenden Enzym kann in dem Kit die oben beschriebene Fangsonde für das Target sowie gegebenenfalls die oben beschriebene Fangsonde für das Amplifikat und gegebenenfalls die oben beschriebene markierte Detektionssonde enthalten sein. Alternativ können die Fangsonden auch bereits an der festen Phase immobilisiert in dem Kit enthalten sein.In addition to the matrix DNA and the solid phase as well optionally the coupling probe, the biomolecules, the DNA polymerase and the DNA double-strand destabilizing enzyme can the capture probe described above for the Target and possibly the capture probe described above for the amplificate and possibly the one described above marked detection probe may be included. Alternatively, you can the capture probes are already immobilized on the solid phase included in the kit.

Desweiteren kann der Kit zusätzlich zur Matrix-DNS sowie gegebenenfalls zu der Kopplungssonde, den Biomolekülen, der DNS-Polymerase, dem DNS-doppelstrangdestabilisierenden Enzym, der festen Phase, den Fangsonden sowie der markierten Detektionssonde den oben beschriebenen DNS-Farbstoff zur direkten Detektion des Amplifikats enthalten.Furthermore, the kit can be used in addition to the matrix DNA as well optionally to the coupling probe, the biomolecules, the DNA polymerase, the DNA double-strand destabilizing enzyme, the fixed phase, the capture probes and the marked Detection probe for the DNA dye described above contain direct detection of the amplificate.

Zusätzlich zur Matrix-DNS sowie gegebenenfalls zu der Kopplungssonde, den Biomolekülen, der DNS-Polymerase, dem DNS-doppelstrangdestabilisierenden Enzym, der festen Phase, den Fangsonden, der markierten Detektionssonde und dem DNS-Farbstoff kann in dem Kit dem Kontaminationsschutz des Amplifikats dienende Exonuklease III, wie oben beschrieben, enthalten sein. In addition to the matrix DNA and, if applicable, the Coupling probe, the biomolecules, the DNA polymerase, the DNA double strand destabilizing enzyme, the solid phase, the capture probes, the marked detection probe and the DNA dye in the kit can protect against contamination Exonuclease III serving as amplificate, as described above, be included.

Zusätzlich zur Matrix-DNS sowie gegebenenfalls zu der Kopplungssonde, den Biomolekülen, der DNS-Polymerase, dem DNS-doppelstrangdestabilisierende Enzym, der festen Phase, den Fangsonden, der markierten Detektionssonde, dem DNS- Farbstoff und der Exonuklease III kann der Kit die vier dNTPs, wovon eines markiert sein kann, sowie geeignete Reaktions- und Waschpuffer enthalten.In addition to the matrix DNA and, if applicable, the Coupling probe, the biomolecules, the DNA polymerase, the DNA double strand destabilizing enzyme, the solid phase, the capture probes, the marked detection probe, the DNA Dye and exonuclease III, the kit can be the four dNTPs, one of which can be marked, and suitable ones Reaction and wash buffer included.

Desweiteren kann der Kit zusätzlich zur Matrix-DNS sowie gegebenenfalls zu den oben bereits genannten Bestandteilen der Detektionssonde dienende Reagenzien enthalten.Furthermore, the kit can be used in addition to the matrix DNA as well if necessary to the components already mentioned above contain reagents serving the detection probe.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits in der medizinischen Diagnostik, in der kriminalistischen Diagnostik sowie für Umwelt-, Lebens- und Arzneimittelanlysen. So kann der Kit beispielsweise zum Nachweis der Expression eines Gens verwendet werden. In der medizinischen Diagnostik bietet sich der Kit insbesondere zur Diagnose von Infektionen, besonders bevorzugt zur Diagnose bakterieller und viraler Infektionen oder von Prionen an, aber auch der Nachweis des Vorhandenseins bestimmter Gene spielt in der medizinischen Diagnostik eine Rolle.Another object of the invention is the use of Kits according to the invention in medical diagnostics, in of criminalistic diagnostics as well as for environmental, living and Arzneimittelanlysen. For example, the kit can be used for Detection of the expression of a gene can be used. In the The kit is particularly suitable for medical diagnostics Diagnosis of infections, particularly preferred for diagnosis bacterial and viral infections or from prions, but also the detection of the presence of certain genes plays a role in medical diagnostics.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous embodiments of the invention result from the subclaims.

Aus den obigen Darlegungen wird deutlich, daß ein wesentlicher Vorteil der Erfindung darin besteht, daß die Amplifikation und die Detektion des Amplifikats im gleichen Reaktionsansatz ablaufen können. Dies spart Zeit und Kosten. Dadurch, daß die Amplifikationsreaktion unter isothermischen Bedingungen durchgeführt werden kann, kann auf den Einsatz aufwendiger Geräte zur Kontrolle eines zyklischen Temperaturregimes verzichtet werden. Gleichzeitig erhöht sich dadurch die Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der thermozyklischen Amplifikation. Die erfindungsgemäß erzielten Amplifikationsraten entsprechen denen, die bei der PCR erzielt werden, wobei die gebildete DNS-Menge größer als bei der PCR ist. From the above it is clear that a A significant advantage of the invention is that the Amplification and detection of the amplificate in the same Reaction approach can run. This saves time and money. The fact that the amplification reaction under isothermal Conditions can be carried out on the use complex devices to control a cyclical Temperature regimes are waived. At the same time increases thereby the reaction speed compared to the thermocyclic amplification. The achieved according to the invention Amplification rates correspond to those used in PCR can be achieved, the amount of DNA formed larger than in the PCR is.

embodiment Detection of expression of the human p53 gene using the matrix DNA according to the invention (SEQ ID NO 1) and the Sequences SEQ ID NOs 2 to 5 according to the invention

Zum Nachweis der Expression des p53-Gens wird nach Standardverfahren über eine reverse Transkriptasereaktion copy-DNS (cDNS) hergestellt (hier nicht beschrieben) und im RCR-Verfahren eingesetzt. Die cDNS kann über eine Fangsonde (Sequenz siehe Sequenzprotokoll) auf einem Halbleiter, einer Nylon- oder Nitrozellulosemembran oder Mikrotestplatte immobilisiert werden. Eine andere Möglichkeit besteht im Nachweis der cDNS in situ. Im Folgenden soll die Immobilisierung an einer Mikrotestplatte (NukleoLink) beschrieben werden.To demonstrate the expression of the p53 gene, Standard procedure for a reverse transcriptase reaction copy-DNS (cDNS) produced (not described here) and in RCR process used. The cDNA can use a capture probe (Sequence see sequence listing) on a semiconductor, one Nylon or nitrocellulose membrane or micro test plate be immobilized. Another possibility is in Detection of cDNA in situ. In the following, the Immobilization on a micro test plate (NucleoLink) to be discribed.

An die über die Fangsonde immobilisierte cDNS (Sequenz siehe Sequenzprotokoll SEQ ID NO 4) wird eine biotinylierte Kopplungssonde (Sequenz siehe Sequenzprotokoll SEQ ID NO 5) hybridisiert, so daß anschließend die an Streptavidin immobilisierte biotinylierte Matrix-DNS (Herstellung der Matrix-DNS siehe Ende des Beispiels) gebunden und amplifiziert werden kann.To the cDNA immobilized via the capture probe (sequence see Sequence listing SEQ ID NO 4) is a biotinylated Coupling probe (for sequence, see sequence listing SEQ ID NO 5) hybridized, so that subsequently to streptavidin immobilized biotinylated matrix DNA (preparation of the Matrix DNA see end of the example) bound and can be amplified.

Die Arbeitsschritte laufen wie folgt ab:
The steps are as follows:

1. Coating of nucleolink plates (Nunc) with the Capture probe (for sequence see end of example) after Reaction sequence of the DIAPOPS process (Nunc)
2. Pipette cDNA solution and block reagent under Add biotinylated coupling probe to the prepared micro test plates
3. Denaturation of the cDNA by heating and subsequent Hybridization of the cDNA (p53 459-478) with the capture probe and with the biotinylated coupling probe (p53 sequence 574-593)
4. Rinse with SSC-T
5. Incubation of streptavidin (Sigma) in SSC-T
6. Rinse with SSC-T
7. Incubate biotinylated matrix DNA in SSC below Addition of block reagent (Roche Diagnostics GmbH)
8. Rinse with SSC-T
9. Rinse with TBS
10. Add master mix of the following composition and incubation:
Tris-HCl, pH 8.8
NaCl
KCl
MgCl 2
N.BstNB I (New England Biolabs / NEB)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment (NEB)
dATP, dCTP, dGTP, dTTP (all Promega)
11. Incubate the wells with SybrGreen (Biozym) to the Wells diluted in Tris / HCl buffer, pH 7.5 below Addition of NaCl (TBS)
12. Measurement of fluorescence in a fluorescence reader (Excitation wavelength 495 nm, emission wavelength 520 nm).

Folgende Reaktionsansätze sind für Proben und Kontrollen im Rahmen eines Tests notwendig:
The following reaction approaches are necessary for samples and controls as part of a test:

1. cDNA solution of the sample
2. Positive control of known p53 cDNA concentration
3. H 2 O (reagent control)

Herstellung der Matrix-DNS (Sequenzen siehe Sequenzprotokoll):
Preparation of the matrix DNA (for sequences, see sequence listing):

1. Perform a PCR using SEQ 1 as Template and SEQ 2 and 3 as primers, thermosequenase (Amersham Pharmacia), dUTP-Biotin (Roche Diagnostics) and other standard substances).
2. Preparation of the following RCR reaction mixture:
Tris-HCl, pH 8.8
NaCl
KCl
MgCl 2
N.BstNB I (New England Biolabs / NEB)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment (NEB)
dATP, dCTP, dGTP, dTTP (all Promega)
3. Add 5 µl of unpurified PCR product from "1." To 25 µl RCR reaction mixture from "2."
4. Incubation for 2 h at 55 ° C

Claims

1. A method for the direct detection of target nucleotide sequences, target amino acid sequences or target antigens by amplification of DNA using a DNA polymerase and a DNA double-strand destabilizing enzyme, characterized in that the target molecule is present in situ or directly or via a capture probe is immobilized on a solid phase, a coupling probe carrying matrix DNA is added, then a DNA polymerase capable of strand displacement, dNTPs and a DNA double-strand-destabilizing enzyme are added, and the complex amplificate formed is directly detected and the target is detected via the detection becomes.

2. The method according to claim 1, characterized in that double-stranded as target nucleotide sequences, single-stranded and / or a mixture of double-stranded and / or single-stranded Nucleotide sequences are used.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the sample is incubated with primers.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the amplification of the matrix DNA isothermal is carried out.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the detection of a target nucleotide sequence as Coupling probe uses a nucleotide sequence that completely or in a part complementary to is a region of the target nucleotide sequence for which Detection of a target antigen as a coupling probe Antibody is used or for the detection of a Amino acid sequence a ligand as a coupling probe is used.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the coupling probe is covalent or via one or more Biomolecules, preferably biotin and avidin or Streptavidin to which matrix DNA is bound.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as a DNA double-strand destabilizing enzyme Topoisomerase, one helicase, one Restriction endonuclease and / or a nick enzyme is used.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as nick enzyme N.BstNB I, a sequence homologous and / or sequence-analogous enzyme can be used.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a DNA polymerase without exonuclease function, preferably Bst DNA polymerase is used.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that before amplifying the matrix nucleotide sequence Approach exonuclease III is added, with the 3 'end the matrix DNA and if the coupling probe is a Nucleotide sequence is the 3 'end of this Nucleotide sequence for protection against exonuclease III chemical is modified and the exonuclease III subsequently is deactivated.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that to detect a target nucleotide sequence before Amplification on the solid phase using a capture probe is immobilized at its 5'-end, which at its 3'- End to a region of the target nucleotide sequence is complementary and that at its 3'-terminal Nucleotide is protected from exonuclease III.

12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the direct detection of the complex amplificate in Solution, on the solid phase or in tissue with one Dye is carried out, preferably with a Fluorogenic.

13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the direct detection of the complex amplificate in Solution, by measuring the change in viscosity of the Medium is done.

14. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that direct detection by adding a probe or the primer is done with the fluorogen and one Quencher are provided and the quencher only by the Interaction of the probes or the primer with the complex Amplificate at a spatial distance from the fluorogen is brought and thus the fluorogen when excited Fluorescence emitted.

15. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a capture probe on the solid phase before amplification is immobilized for the complex amplificate, which with hybridizes the resulting amplificate and by the DNA polymerase is extended and the extended Sequence of this capture probe is detected.

16. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the capture probe for the amplified product at its 3 'end to a single-stranded area of the complex Contains complementary sequence and with their 5 'end is immobilized on the solid phase, afterwards labeled detection probe is added to the approach, the is homologous to an area of the complex amplificate, this area in the 5 'direction from the area of the complex amplificate, which is at the 3 'end of the Detection probe is complementary and then over the marking of the detection probe the detection he follows.

17. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the direct detection of the amplificate one of those for the Amplification necessary dNTPs is marked and the Detection of the complex amplificate via this Marking is done.

18. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that to detect the amplificate one of those for the Amplification necessary dNTPs is marked and the Capture probe for the amplificate at its 3 'end a single-stranded area of the complex amplificate contains complementary sequence and with its 5 'end the solid phase is immobilized and the detection the extended sequence of the capture probe over the built-in labeled nucleotides.

19. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the target nucleotide sequences in the sample before the Detection can be duplicated using the sample Deoxynucleotide triphosphates, a polymerase and one double strand destabilizing enzyme is incubated.

20. Kit for performing the method according to the claims 1-19, characterized in that the kit at least amplification matrix DNA contains.

21. Kit according to claim 20, characterized in that the kit includes a coupling probe.

22. Kit according to claim 20 or 21, characterized in that the DNA polymerase kit that causes strand displacement, preferably DNA polymerase without exonuclease function contains.

23. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit is a DNA double strand destabilizing enzyme contains.

24. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit includes the solid phase.

25. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that on the solid phase, the target or capture probe for the target and / or the capture probe for the amplificate is / are immobilized.

26. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit contains labeled detection probe.

27. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit contains DNA dye.

28. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit contains exonuclease III.

29. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit the four dNTPs, one of which, if applicable is marked and contains suitable reaction buffers.

30. Kit according to one of the preceding claims, characterized in that the kit of detection of the labeled nucleotides or the marked detection probe and / or primer serving Contains reagents.

31. Use of the kit according to one of the preceding Expectations in medical and criminological diagnostics as well as for environmental, life and pharmaceutical analyzes.

32. Use of the kit according to one of the preceding Expectations for the detection of the expression of a gene.

33. Use of the kit according to one of the preceding Expectations for the diagnosis of infections.