DE10055815A1

DE10055815A1 - Analytisches Verfahren

Info

Publication number: DE10055815A1
Application number: DE2000155815
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Ise; Monika Winzenbacher; Wolf-Ruediger Ulrich
Original assignee: Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik GmbH
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2002-05-23

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von hydrophoben Proteinen beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die zu untersuchenden Proben in einem organischen Medium gelöst werden, auf hydrophobe Membranen aufgesprüht werden und die hydrophoben Proteine detektiert werden.

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von hydrophoben Proteinen.

Stand der Technik

Die Quantifizierung von hydrophoben Proteinen ist mit den herkömmlich üblichen Techniken nicht oder nur unzureichend möglich. Die Anwendung von immunologischen Methoden, wie z. B. ELISA ("Enzy me Linked Immunosorbent Assay") ist sehr problematisch, weil diese in der Regel nur in wässrigen Systemen durchgeführt werden können in denen hydrophobe Proteine nicht oder nur unzureichend löslich sind. Organische Lösungsmittel dagegen können mit dem Material der Mikrotiterplatten reagie ren und sie unbrauchbar machen. Die zu quantifizierenden Analyten liegen zumeist nur in Spuren vor. Oft sind gerade hydrophobe Proteine zudem mit anderen lipophilen Substanzen assoziiert (z. B. Lipi de), was eine Quantifizierung nach herkömmlichen Methoden unmöglich macht.

Beschreibung der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das es erlaubt, hydrophobe Proteine, Protein Fragmente und Modifikationen und auch hydrophobe Peptide zu identifizieren und zu quantifizieren.

Ein weiteres Ziel ist es, ein solches Verfahren anzugeben, das sich insbesondere zur Bestimmung von hydrophoben Host-Cell-Proteinverunreinigungen (HCP) bei der biotechnologischen Produktion von hy drophoben Proteinen, wie z. B. des äußerst hydrophoben Lungensurfactantproteins ("Lung Surfactant Protein") SP-C, eignet. Weiteres Ziel ist es ein Verfahren anzugeben, das sich zur Bestimmung hydro phober Surfactant Proteine, wie des Lungensurfactantproteins C (SP-C) und des Lungensurfactant proteins B (SP-B) und Derivaten davon eignet.

Es wurde nun gefunden, dass diese Ziele erreicht werden durch Aufsprühen der in einem organischen Medium gelösten, zu untersuchenden Proben, auf hydrophobe Membranen und Quantifizierung der Proteine durch immunologische Detektion.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von hydro phoben Proteinen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die zu untersuchenden Proben in einem or ganischen Medium gelöst werden, auf hydrophobe Membranen aufgesprüht werden und die hydro phoben Proteine detektiert und quantifiziert werden.

Weitere Gegenstände ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung steht der Begriff hydrophobe Proteine, Protein Fragmente und Modifikationen und hydrophobe Peptide für hydrophobe Proteine, Protein Fragmente und Modifikationen und hydrophobe Peptide, welche ohne Zugabe von Detergenzien in wässerigen Lösungmittel-Systemen schlecht löslich sind wie z. B. Membranproteine. Beispielhaft genannt seien Membranproteine, insbesondere Membranproteine von Wirtssystemen, die in der Biotechnologie Ver wendung finden (z. B. Host-Cell-Proteine von transformierten Mikroorganismen). Bei der rekombinanten Herstellung von Lungensurfactantprotein C werden z. B. Host-Cell-Proteinverunreinigungen (HCP) beobachtet. Diese sind ähnlich hydrophob wie das rekombinante Lungensurfactantprotein C. Lungen surfactantprotein C und Lungensurfactantprotein B sind erfindungsgemäß ebenfalls hydrophobe Pro teine. Stark hydrophob bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Proteine, Protein Fragmente und Modifikationen und Peptide, die in wässerigen Lösungsmittel-Systemen unlöslich sind.

Protein Fragment steht erfindungsgemäß für ein Protein, das Teil einer kompletten Sequenz eines natürlich vorkommenden oder künstlichen (synthetischen) Protein bildet. Protein Modifikation steht für ein Protein das sich durch Hinzufügung, Ersatz oder Entfernung einer oder mehrere Aminosäuren oder chemischer Modifikation wie Alkylierung, Veresterung, Acylierung und Oxidation von Aminosäuren von einem natürlich vorkommenden oder künstlichen Protein unterscheidet.

Zur Herstellung einer Lösung der hydrophoben Proben in einem organischen Medium werden vorteil hafterweise organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet, die sich zum Auflösen von hydrophoben Proteinen bewährt haben. Beispielhaft genannt seien kurzkettige Alkohole, insbe sondere Methanol, Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol) oder n-Propanol. Besonders zweckmäßig sind auch Gemische von unpolaren und polaren Lösungsmitteln, wobei als unpolare Lösungsmittel insbe sondere Chloroform, Methylenchlorid und Toluol und als polare Lösungsmittel kurzkettige Alkohole in Frage kommen.

Gewünschtenfalls können zur Verbesserung der Lösungseigenschaften der vorstehend genannten Lösungsmittel oder -gemische geringe Mengen Wasser und/oder Säure oder Base oder Detergenzien zugesetzt werden.

Besonders geeignete hydrophobe Membranen, die im erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, sind Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen, bspw. Immobilon-P (Fa. Millipore). Das Auftra gen der Proben auf die trockenen Membranen erfolgt bevorzugt mittels handelsüblicher Automaten. Überraschenderweise wurde dabei festgestellt, dass ein flächenhaftes Aufsprühen beispielsweise in Viereck- oder Kreisform besonders vorteilhaft ist. Der Probenauftrag auf das Trägermaterial erfolgt bevorzugt langsam, damit das für die Proben verwendete organische Lösungsmittel während des Auf tragens verdunsten kann. Zum Schutz der Proteine kann gewünschtenfalls zum Ausschluss des Lufts auerstoffs für das Aufsprühen der Proben Stickstoff verwendet werden. Sollen beim vorliegenden Ver fahren kleinste Proteinmengen (pg bis ng-Bereich) quantifiziert werden, kann der Probenauftrag mit Hilfe von Präzisionsgeräten, bspw. Probenautomaten, wie sie in der analytische TLC- oder Planar chromatographie verwendet werden, durchgeführt werden.

Die Detektion und Quantifizierung der hydrophoben Proteine kann bevorzugt durch Anwendung geeig neter immunologischer Testmethoden über markierte Antigen-spezifische Antikörper direkt oder indi rekt auf bekannte Weise erfolgen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Antikörper eingesetzt die spe zifisch an das nachzuweisende hydrophobe Protein binden. Zur Vorbereitung auf die immunologische Detektion werden nach dem Probenauftrag die Membranen durch eine kurze Inkubation in alkoholi scher Lösung benetzbar gemacht. Anschließend werden die Membranen zur Absättigung unspezifi scher Bindungsstellen mit einer geeigneten Blockierlösung, z. B. Magermilch, Gelatine oder Proteine, inkubiert. Die Membranen werden dann mit einem Antigen-spezifischen primären Antikörper inkubiert. Trägt dieser keine Markierung, kann die Detektion mit Hilfe eines markierten zweiten Antikörpers, der den primären Antikörper erkennt, erfolgen. Dazu wird nach Entfernen von überschüssigem ersten Anti körper durch Waschen mit einem markierten sekundären Antikörper inkubiert. Nach der Entfernung von überschüssigem Antikörper durch Waschen erfolgt die Detektion und Quantifizierung der Antigen- Antikörperkomplexe mit Hilfe der Markierung.

Für den Detektions- und Quantifizierungsschritt geeignete Markierungen, die der Primär- bzw. Sekun därantikörper tragen kann, sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft genannt seien radioaktive Mar kierungen, fluoreszierende Farbstoffe und bevorzugt Enzyme wie Phosphatase oder Peroxidase, deren Substratumsatz einen kolorimetrischen Nachweis erlauben, oder aber auch Chemilumineszenz. Der anschließende Nachweis bzw. eine Quantifizierung erfolgt je nach verwendeter Markierung in be kannter Weise.

Insbesondere bevorzugt erfolgt die Detektion und Quantifizierung der Antigen-Antikörperkomplexe im erfindungsgemäßen Verfahren mit Hilfe von langanhaltender Chemilumineszenz.

Dabei finden beispielsweise Phosphatase-konjugierte Antikörper Verwendung denen im Detektions- und Quantifizierungsschritt geeignete 1,2-Dioxetanderivate (beispielsweise Lumi-Light Plus der Fa. Roche) als Substrat zugesetzt wird. Für die Aufzeichnung der Chemilumineszenz hat sich insbesonde re die Verwendung einer gekühlten Videokamera (CCD-Kamera) bewährt. Nach Digitalisierung der Bilder erfolgt eine Auswertung in an sich bekannter Weise, z. B. so wie im Beispiel beschrieben.

Im folgenden wird die Erfindung exemplarisch anhand eines Verfahrens zur Bestimmung der Host-Cell- Proteinverunreinigungen in einem biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von r-SP-C mittels E. coli beschrieben.

Die Bezeichnung r-SP-C steht für rekombinantes Lungensurfactantprotein SP-C oder davon abgelei tete Polypeptide mit Lungensurfactant-Aktivität. Gentechnologische Verfahren zur Herstellung von r-SP-C sind beispielsweise in WO 89/04326, WO 90/01540, WO 91/18015 und WO 95/32992 beschrie ben.

Beispiele 1. Gewinnung von HCP für Immunisierungszwecke

Im Einklang mit literaturbekannten Vorgehensweisen und mit einschlägigen behördlichen Vorschriften wurde eine Antigenfraktion aus der Endphase des Downstream-Prozesses angestrebt. Deshalb wur den für die Immunisierung HCPs aus einer Reinigungsstufe entnommen, bei der das r-SP-C zu 80 bis 90% rein ist. Zur Entnahme der HCP-Antigenfraktion wurden Einschlusskörper (inclusion bodies) aus einer 1000 l Leerfermentation (blank fermentation) benutzt. Diese Einschlusskörper wurden prinzipiell so aufgearbeitet wie dies nach dem jeweiligen Herstellungsprotokoll zur Reinigung des r-SP-C- Proteins geschieht. Die Aufarbeitung der Einschlusskörper und die Reinigung des r-SP-C ist beispiels weise in den oben genannten internationalen Patentanmeldungen oder auch in WO 92/00993 be schreiben.

2. Herstellung von Antisera

Die Herstellung der Antikörper erfolgte in Schafen nach Standardverfahren durch die Firma Charles River Deutschland GmbH. Für die Primärinjektion wurden jeweils 1 mg HCP in komplettem Freund schen Adjuvans subkutan appliziert. Nach der Primärimmunisierung erfolgten bis zu sechsmal alle 4 Wochen Boosterinjektionen. Blutabnahmen erfolgten jeweils 10 Tage nach der letzten Injektion, um die Entwicklung des Titers zu verfolgen. Sobald der Titer zufriedenstellend war, wurde Blut abgenommen und Serum nach Standardverfahren hergestellt. Die Antikörperproduktion in anderen Tierspezies, bspw. Kaninchen wurde ebenfalls bereits mit Erfolg durchgeführt.

3. Bestimmung der Titer

Zur Bestimmung der Titer wurden die individuellen Seren bei verschiedenen Verdünnungen (1 : 1.000- 1 : 100.000) mittels ELISA untersucht. Antisera mit ähnlichem Titer wurden gepoolt und reanalysiert. Das Serum wurde nach Standardverfahren charakterisiert und in Aliquots bei -20°C gelagert.

4. Probenvorbereitung und Aufbringen der Proben auf PVDF-Membranen

Zur Probenvorbereitung wurden die Proben in einem Vakuum-Konzentrator getrocknet, anschließend in CHCl₃/MeOH (1 : 1) oder 2-Propanol gelöst und auf trockene PVDF-Membranen (Immobilon-P® der Firma Millipore, USA) aufgesprüht. Das Aufsprühen der Proben auf die PVDF-Membranen wurde au tomatisch unter Benutzung eines Probenauftraggerätes ATS 4 (Camag, Berlin) unter Stickstoff ausge führt. Einzelne Proben wurden auf eine Fläche von 25 mm² aufgesprüht.

Zur Ermittlung des Blanks wurden jeweils identische Mengen rSP-C-Standard 3 × aufgesprüht. Die aufgesprühte Menge an rSP-C-Standard entspricht der optimalen Menge an Probe, die aus dem Vor versuch ermittelt wurde. In der gleichen Reihe wurden des weiteren 1, 2 und 3 ng HCP (pur) aufge sprüht (in lerne Kontrollen zur Überprüfung des Gesamtsystems [Reagenzien und Geräte]). In der 2. Reihe wurden zur Ermittlung der Kalibriergeraden 1, 2, 3, 4, 5 und 6 ng HCP-Standard, die mit der zur Analyse identischen Menge an rSP-C-Standard versetzt (spiked) wurden, aufgesprüht (2. Reihe). Nach Auftrag aller Standards und Kontrollen können nun in den Reihen 3-6 die jeweiligen Proben aufge sprüht werden. Zur Durchführung der eigentlichen Quantifizierung wurden die zu analysierenden Pro ben entsprechend der aus dem Vorversuch ermittelten optimalen Menge 6 × identisch aufgesprüht.

5. Immunoanfärbung von HCP mit anti-HCP Antikörpern

Die Prozessierung der Membranen zur Detektion der HCP erfolgte unter Verwendung des Immunopro zessors WERA (Fa. Raytest). Zur Benetzung wurden die getrockneten Membranen in einer flachen Schale kurz (20 sec.) mit 30%igem Methanol, 5% Tween-20 inkubiert und für die folgenden Inkuba tionen in den Immunoprozessor überführt. Zur Absättigung freier Bindungsstellen wurden die Membra nen für 1-2 Stunden mit 5%igem Magermilchpulver in PBS, bestehend aus 150 mM NaCl, 12 mM Na₂HPO₄ und 3 mM NaH₂PO₄, (pH 7,4), inkubiert. Danach wurden die Membranen für 12-16 h mit dem primären Antikörper bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 in PBS mit 0,5% BSA bei 4°C inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch 4-6maliges Waschen mit TBS/T bestehend aus 100 mM Tris- HCl, 4 mM NaCl, 0,05% Tween-20 (pH 7,4) entfernt. Zur Hybridisierung mit dem Primärantikörper wurden die Membranen 2 Stunden mit einem Phosphatase konjugiertem Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1 : 100.000 im TBS/T bestehend aus 100 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,05% Tween-20 bei 15°C inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden wie oben beschrieben durch mehrmaliges Wa schen der Membranen mit TBS/T entfernt. Immunreaktive Komplexe wurden unter Verwendung von Lumi-Light Plus nach Vorschrift des Herstellers inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde mit einer ge kühlten Videokamera (CCD-Kamera, Modell Fujifilm LAS-1000 Plus-System, Fa. Raytest, Deutsch land) über einen Zeitraum von 1-10 Minuten aufgenommen.

6. Quantifizierung von HCP

Die Auswertung erfolgte am PC mit der Software AIDA 2.0 der Firma Raytest, Straubenhardt, Deutschland.

Vorghensweise

Zunächst wurde das digitalisierte Bild in den Arbeitsspeicher geladen. Zur Auswertung der Signalinten sitäten kann ein Template mit den zur Auswertung nötigen Einstellungen geladen werden, das dann über der Membran positioniert und aktualisiert wird. Ist kein zur Analyse passendes Template verfüg bar, wird eine neue Auswertemaske erstellt. Bei Erstellen einer neuen Auswertemaske wurden 14 mm² Rahmen auf die aufgesprühten quadratischen Proteinflächen gelegt. Blanks und Hintergrund wurden mit "Region Integration/Background" festgelegt. Danach wurde den Rahmen der aufgesprühte Stan dardreihe die jeweilig aufgetragene Proteinmenge zugewiesen.

Berechnung

Zur Berechnung der Proteingehalte wurden die Signalintensitäten, der aufgesprühten Proteinproben mittels AIDA integriert. Die Integration der Signalintensität erfolgte über die Flächen, die durch die Rahmen festgelegt wurden.

Die durch die Integration erhaltenen Intensitätswerte wurden durch das Programm mittels der Kali briergeraden in Proteinmengen HCP umgerechnet.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von hydrophoben Proteinen, Protein Frag menten und Modifikationen und hydrophoben Peptiden dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben in einem organischen Medium gelöst werden, auf hydrophobe Membra nen aufgetragen werden und die hydrophoben Proteine, Protein Fragmente und Modifikationen und hydrophoben Peptide auf der hydrophoben Membran detektiert und quantifiziert werden.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion und Quantifizie rung durch immunologische Methoden über markierte Antigen-spezifische Antikörper erfolgt.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophobe Membranen Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen verwendet werden.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als organisches Medium Ge mische von Lösungsmitteln verwendet werden, in denen hydrophobe Proteine löslich sind.

5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als organisches Medium Ge mische von Chloroform und Methanol verwendet werden.

6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als organisches Lösungsmittel 2-Propanol verwendet wird.

7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den hydrophoben Proteinen um Host-Cell-Proteinverunreinigungen (HCP) handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion und Quantifizierung mit Hilfe von langanhaltender Chemilumineszenz erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe auf die Membranen auf gesprüht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich um ein stark hydrophobes Protein handelt.