DE10037111A1 - Herstellung eines rekombinanten Proteins in einer prokaryontischen Wirtszelle - Google Patents
Herstellung eines rekombinanten Proteins in einer prokaryontischen WirtszelleInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft vorteilhafte Verfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen in prokaryontischen Wirtszellen durch verbesserte Kodonverwendung und/oder Expression von tRNAs, die für in besagter Wirtszelle selten vorkommende Kodons kodieren.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft vorteilhafte Verfahren zur Herstellung von heterologen
Proteinen in prokaryontischen Wirtszellen durch verbesserte Kodonverwendung und/oder
Expression von tRNAs, die für in besagter Wirtszelle selten vorkommende Kodons kodieren.
Zahlreiche Bakterien, insbesondere z. B. Gram-positive Bacterien sind bereits als Wirtszellen für
die Herstellung heterologer rekombinanter Proteine, z. B. sezernierte Proteine, in einer Endotoxin
freien Umgebung verwendet worden (Referenzen 8, 9, 19). Das für die Nahrungsmittelindustrie
verwendete Bakterium Staphyloccocus carnosus (S. carnosus) beispielsweise, welches bei der
Fleisch- und Fischfermentierung verwendet wird, ist ein hierfür geeignetes Bakterium. Es ist frei
von Virulenzfaktoren und proteolytischen Aktivitäten im Überstand und es ist in der Lage, große
Mengen an Protein zu sezernieren (10). Weiterhin werden nur geringe Mengen an Wirtszellen
kodierten Proteinen sezerniert, welches die Aufreinigung der hergestellten Proteine erleichtert.
Bisher wurden bereits beispielsweise bakterielle Enzyme (7, 4, 17) rekombinant in S. carnosus
hergestellt und exprimiert. Rekombinante S. carnosus Stämme, die Antigene wie das
Streptokokken-Protein G an ihrer Oberfläche exprimieren, sind insbesondere vielversprechend als
Lebendimpfstoffe (5, 12).
Ein entscheidender Nachteil zahlreicher bakterieller Systeme ist die Verwendung seltener Kodons,
die sehr unterschiedlich von der Kodonpräferenz bei humanen Genen ist. Die Gegenwart von
seltenen Kodons bei E. coli führte zu verzögerter und reduzierter Expression rekombinanter Gene
(2, 6). Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diesen Nachteil im Stand der Technik
zu überwinden und ein prokaryontisches Expressionssystem mit verbesserten Eigenschaften
bereitzustellen.
Die Aufgabe wurde im Rahmen der Ansprüche und Beschreibung der vorliegenden Erfindung
gelöst.
Die Verwendung der Einzahl oder des Plurals in den Ansprüchen oder der Beschreibung soll in
keiner Weise limitierend sein und die andere Form ebenfalls mit einschliessen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins in
einer prokaryontischen Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Kodonverwendung der
Wirtszelle für Wirtszellgene ermittelt wird, bei der für das heterologe rekombinante Protein
kodierenden Nukleinsäure in der Wirtszelle selten vorkommende Kodons durch häufige Kodons
ersetzt werden, besagte Wirtszelle mit besagter für das rekombinante Protein kodierender
Nukleinsäure transformiert wird und besagte rekombinante Nukleinsäure exprimiert wird. Mit
einem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine deutlich verbesserte Expressionsrate des
heterologen Proteins gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch insbesondere vorteilhaft für die Expression
rekombinanter Proteine an der Oberfläche von Prokaryonten, da die kovalente Verankerung an
der Zellwand von intakten C-termini abhängt, welche den sezernierten trunkierten Proteinen, die
nicht nach erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, fehlen.
Unter heterolog wird verstanden, daß besagtes Protein in besagter prokaryontischer Wirtszelle
nicht nativ, d. h. als wirtzelleigenes Protein vorkommt. Rekombinant bedeutet mittels
molekularbiologischen Methoden hergestellt. Ein heterologes rekombinantes Protein kann ein
jegliches dem Fachmann bekanntes Protein sein, beispielsweise Insulin, hGH, tPA, Zytokine, wie
z. B. Interleukine (IL) wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-
12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon (IFN) alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN
omega oder IFN tau, Tumornekrosefaktor (TNF) TNF alpha und TNF beta, TRAIL; G-CSF,
GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF sein. Prokaryontische Wirtszellen können jegliche dem
Fachmann bekannte Wirtszellen sein, insbesondere Gram-positive und Gram-negative Wirtszellen.
Beispielsweise sind dies Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Proteus mirabilis oder
bevorzugt Staphylococcus, wie z. B. besonders bevorzugt Staphylococcus carnosus.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für besagte Wirtszelle zunächst für möglichst
viele native Proteine bei der zugrundeliegenden kodierenden Gensequenz die Verwendung der
Kodons, d. h. der kodierenden Nukleotidtripletts analysiert. Für den beispielshaften
Wirtsorganismus Staphylococcus carnosus wurden die Kodonfrequenzen von 51 Genen analysiert
und in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt:
Es wurde ermittelt, daß kodierende Sequenzen von Staphylokokken beispielsweise einen sehr
niedrigen G+C Gehalt von ca. 30% haben und die A+T-reichen Kodons präferiert sind. Daher
wird erfindungsgemäß die Produktion rekombinanter Proteine, beispielsweise hGH auf zwei
Weisen erhöht: (i) der Austausch seltener Kodons in der kodierenden Gensequenz durch häufige
(siehe auch Beispiel 1) und/oder (ii) die Expression von seltenen tRNAs (tRNA = transfeRNA;
siehe auch Beispiel 2).
Die Erfindung umfaßt daher Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins,
bei denen für S. carnosus, wie in Tabelle 1 dargestellt, oder ebenso für jede andere
erfindungsgemäße Wirtszelle, entweder einzelne oder sämtliche selten vorkommenden Kodons
durch häufige ersetzt werden, beispielsweise entsprechend der Analyse aus Tabelle 1 das Glu-
Kodon GAG durch GAA ersetzt wird oder die Leu-Kodons CTC, CTG und CTA durch TTA,
TTG oder CTT ersetzt werden.
Daher betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen
rekombinanten Proteins in einer prokaryontischen Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kodonverwendung der Wirtszelle für Wirtszellgene ermittelt wird, besagte Wirtszelle mit der
Nukleinsäure, die für selten vorkommende Kodons spezifische tRNA oder tRNAs kodiert, mit
besagter für das rekombinante Protein kodierender Nukleinsäure transformiert wird und besagte
rekombinante Nukleinsäure exprimiert wird (siehe auch Beispiel 2). Der Fachmann kann die
seltenen Kodons der Wirtszelle durch Analyse der Gene bzw. der cDNAs (bzw. durch reverse
Transkription der mRNA) ermitteln. Dies ist beispielhaft für die Wirtszelle S. carnosus in Tabelle
1 durchgeführt worden. Die Erfindung umfaßt das Einbringen von tRNAs bzw. dafür kodierende
Nukleinsäure für eine bis sämtliche in der Wirtszelle seltene tRNAs. Dadurch, daß die Wirtszelle
mit für seltene Kodons spezifischen tRNAs ausgestattet wird, wird das erfindungsgemäße
heterologe rekombinante Protein in höheren Mengen exprimiert als dies in bekannten Verfahren
aus dem Stand der Technik der Fall ist. Diese überraschend vorteilhafte Eigenschaft des
erfindungsgemäßen Verfahrens ist auch in Beispiel 2 dargestellt. Dies kann entweder alleine oder
in Kombination mit dem Ersetzen von für die Wirtszelle seltenen Kodons in der Nukleinsäure
kodierend für das heterologe Protein durch häufige Kodons erfolgen.
Daher umfaßt die Erfindung ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß bei der für das heterologe rekombinante Protein kodierenden
Nukleinsäure in der Wirtszelle selten vorkommende Kodons durch häufige Kodons ersetzt werden
und besagte Wirtszelle mit für selten vorkommende Kodons kodierenden tRNA oder tRNAs und
mit besagter für das rekombinante Protein kodierender Nukleinsäure transformiert wird.
Die Erfindung umfaßt ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß Kodons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz von
weniger als 15% verwendet werden, durch Kodons mit einer durchschnittlichen Frequenz von
mindestens 15% ersetzt werden; bevorzugt dadurch gekennzeichnet, daß Kodons, die in der
Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz von 7 bis 12% verwendet werden, durch Kodons
mit einer durchschnittlichen Frequenz von mehr als 12% ersetzt werden; besonders bevorzugt
dadurch gekennzeichnet, daß Kodons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz
von bis zu 7 oder 10% verwendet werden, durch Kodons mit einer durchschnittlichen Frequenz
von mehr als 7% oder mehr als 10% ersetzt werden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform
ist ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das
oder die Kodons, die in besagter Wirtszelle am seltensten vorkommen, durch das oder die Kodons
ersetzt wird, die in besagter Wirtszelle am häufigsten vorkommen. Eine Ausnahme kann sein,
wenn besagte Kodons unbedingt erforderlich für die Expression sind.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß bei der kodierenden Nukleinsäure Kodons, die in der Wirtszelle mit einer
durchschnittlichen Frequenz von weniger als 10% verwendet werden, durch Kodons mit einer
durchschnittlichen Frequenz von mindestens 10% ersetzt werden.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß die Wirtszelle Escherichia coli ist.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß die Wirtszelle eine Wirtszelle ausgewählt aus der Gattung Staphylococcus
ist.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß die Wirtszelle Staphylococcus carnosus ist (s. auch Beispiele 1 und 2).
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das rekombinante Protein ein
Antikörperprotein. Unter Antikörperprotein werden auch ein Fragment, z. B. ein Fab-Fragment
(Englisch "Fragment antigen-binding = Fab"), ein F(ab')2-Fragment, ein Fv-Fragment (Englisch:
"Fragment variable" = Fragment des variablen Teils) oder eine Fv-Einzelkette (Englisch: "single
chain-Fv" (scFv)), Minibodies, Dia-, Tria- und Tetrabodies verstanden.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das rekombinante Protein Insulin.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das rekombinante Protein
Gewebeplasminogenaktivator (tPa).
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das rekombinante Protein ein humanes
Protein.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das rekombinante Protein das
Wachstumshormon (growth hormone).
In einem besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist das rekombinante Protein
humanes Wachstumshormon (human growth hormone hGH, siehe Beispiele 1 und 2).
Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß G bzw.
C reiche Kodons durch A oder T enthaltene Kodons ersetzt werden. Dies bedeutet, daß Kodons,
die mehr G bzw. C enthalten, durch Kodons, die nun z. B. ein A oder ein T anstelle eines G bzw.
C enthalten, ersetzt werden - es bedeutet nicht, daß die Kodons nun ausschließlich G oder C
enthalten müssen (siehe besonders bevorzugte Ausführungsformen unten).
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle ermittelten seltenen Kodons durch häufige
ersetzt werden (s. z. B. Tabelle 1) und nicht nur diejenigen, die unten in den bevorzugten
Ausführungsformen angegeben sind.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon GCC durch GCA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon TGC durch TGT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon GAC durch GAT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon GAG durch GAA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon TTC durch TTT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon GGG durch GGT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon CAC durch CAT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon ATA durch ATT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon AAG durch AAA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon CTC durch TTA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon AAC durch AAT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon CCC durch CCA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon CAG durch CAA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon CGG durch CGT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon TCG durch TCA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon ACC durch ACA ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon GTC durch GTT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon TAC durch TAT ersetzt wird.
Ein weiteres besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon TGA durch TAA ersetzt wird.
Noch ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die
Wirtszelle mit der für AGG-tRNA oder AGA-tRNA kodierenden Nukleinsäure und mit besagter
für das rekombinante Protein kodierender Nukleinsäure transformiert wird.
Die Erfindung umfaßt insbesondere auch ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein
rekombinantes heterologes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein in der Wirtszelle
selten vorkommendes Kodon durch ein in der Wirtszelle häufig vorkommendes Kodon ersetzt
wurde. Exemplarisch wurden die Kodons für Wirtszelle S. carnosus in Tabelle 1 analysiert. Die
Erfindung umfaßt Nukleinsäuremoleküle, bei denen für S. carnosus oder ebenso für jede andere
erfindungsgemäße Wirtszelle entweder einzelne oder sämtliche selten vorkommenden Kodons
durch häufige ersetzt werden, beispielsweise das Glu-Kodon GAG durch GAA ersetzt wird oder
die Leu-Kodons CTC, CTG und CTA durch TTA, TTG oder CTT ersetzt werden.
Die Erfindung umfaßt ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein rekombinantes heterologes
Protein, dadurch gekennzeichnet, daß Kodons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen
Frequenz von weniger als 15% verwendet werden, durch Kodons mit einer durchschnittlichen
Frequenz von mindestens 15% ersetzt werden; bevorzugt dadurch gekennzeichnet, daß Kodons,
die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz von 7 bis 12% verwendet werden,
durch Kodons mit einer durchschnittlichen Frequenz von mehr als 12% ersetzt werden; besonders
bevorzugt dadurch gekennzeichnet, daß Kodons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen
Frequenz von bis zu 7 oder 10% verwendet werden, durch Kodons mit einer durchschnittlichen
Frequenz von mehr als 7% oder mehr als 10% ersetzt werden. Eine weitere bevorzugte
Ausführungsform ist ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein rekombinantes heterologes
Protein, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Kodons, die in besagter Wirtszelle am
seltensten vorkommen, durch das oder die Kodons ersetzt wird, die in besagter Wirtszelle am
häufigsten vorkommen. Eine Ausnahme kann sein, wenn besagte Kodons unbedingt erforderlich
für die Expression sind.
Die Erfindung betrifft daher in einer bevorzugten Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül,
dadurch gekennzeichnet, daß Kodons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz
von weniger als 10% verwendet werden, durch Kodons mit einer durchschnittlichen Frequenz von
mindestens 10% ersetzt sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, dadurch
gekennzeichnet, daß es für das humane Wachstumshormon hGH kodiert.
Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine
Nukleotidsequenz aus der folgenden Gruppe umfaßt: die folgende Sequenz
oder eine Teilsequenz hiervon, eine Nukleinsäure, die an besagte Sequenz unter stringenten
Bedingungen hybridisieren kann, eine allele Variante oder eine funktionelle Variante von besagter
Sequenz oder eine Variante der Nukleinsäure aufgrund des degenerativen Kodes. N steht im
Rahmen der Erfindung für jedes dem Fachmann bekannte Nukleotid.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Nukleinsäuremolekül kodiert durch die Nukleotidsequenz
Das vorgenannte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodiert für hGH mit der ebenfalls
erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz
Die Erfindung betrifft einen Vektor enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül.
Eine weitere wichtige Ausführungsform der Erfindung ist eine Wirtszelle enthaltend ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor.
Eine weitere wichtige Ausführungsform der Erfindung ist eine Wirtszelle enthaltend ein oder
mehrere tRNA Moleküle, die für in dieser Wirtszelle selten vorkommende Kodons kodieren.
Bevorzugt ist eine Wirtszelle aus der Gattung Staphylococcus und ganz besonders bevorzugt
Staphylococcus carnosus.
Die folgenden Beispiele sollen dem Verständnis der Erfindung dienen und in keiner Weise als
limitierend für die Breite der Erfindung angesehen werden.
Als beispielhaftes Protein wurde das humane Wachstumshormon (human growth hormone, hGH)
in S. carnosus exprimiert.
Der Vergleich der Kodonverwendung des reifen hGH mit der in S. carnosus zeigte, daß 51 der
Kodons des reifen hGH, welche 27% der gesamten Kodonzahl repräsentieren, nur 7% oder
weniger der S. carnosus Kodonfrequenz ausmachen (Tabelle 2). Es wurde eine Enterokinase-
Schnittstelle am 5'Ende der DNA-Sequenz des reifen hGH eingeführt und das hGH wurde mit S.
carnosus-spezifischer Kodonverwendung synthetisiert. Die Kodons im synthetischen Gen wurden
in ca. derselben Frequenz verwendet wie im S. carnosus Gen. Kodons, die von S. carnosus in
einer Häufigkeit von weniger als 10% verwendet wurden, wurden nicht verwendet bis auf
diejenigen, die notwendig waren, um Restriktionsschnittstellen einzuführen (s. Tabelle 2).
Die synthetische hGH DNA-Sequenz wurde aus überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert,
welche in vitro hybridisiert und ligiert wurden. Das hieraus resultierende DNA-Fragment wurde in
das E. coli Plasmid pSL1190 (3) kloniert, durch Sequenzierung verifiziert und in die hGH
Expressionskassette inseriert, um die hGH cDNA zwischen den NsiI und PstI Schnittstellen zu
ersetzen (Fig. 1). Die neue Expressionskassette wurde als BglII-ClaI Fragment isoliert, in die
kompatiblen BamHI und NarI Schnittstellen des Staphylokokken-Expressionsvektors pTX15
kloniert und in S. carnosus TM300 durch Protoplasten-Transformation transformiert. Im
erhaltenen Expressionsvektor wurde das lip-hGH Fusionsgen unter der Kontrolle des xyl-
Promotors von pTX15 exprimiert. Die Expression wurde nach der Inaktivierung von XylR, dem
Repressor des xyl-Promotors, durch Zugabe von 0,5% Xylose zum Nährmedium erreicht. Die In
vitro Klonierung und Sequenzierung wurde nach Standardverfahren durchgeführt (1).
Die Expression des hGH-Gens erfolgte als Fusion mit dem Lip-Signal und Propeptid aus
Staphylococcus hyicus, welches eine Enterokinase-Schnittstelle enthält, die die Freisetzung des
reifen hGH5 mit dem richtigen N-Terminus aus dem Fusionsprotein erlaubt (Fig. 1). Der
resultierende Expressionsvektor pTX-LipP-hGH4 ist identisch mit dem Vektor pTX-LipP-hGH2
bis auf die Kodonverwendung des reifen hGH. Die S. carnosus Stämme enthaltend eines der
Plasmide wurden in einem modifizierten LB-Medium (1% Sojabohnenextrakt, 0,5% Hefeextrakt,
0,5% NaCl) supplementiert mit 0,5% Xylose, um den xyl-Promoter der Expressionsvektoren zu
aktivieren, kultiviert. Die Verwendung der verbesserten hGH DNA hatte einen profunden Einfluß
auf die Effizienz der hGH Herstellung in S. carnosus. Die Lip-hGH Ausbeute war um mindestens
das zweifache verbessert und die Menge an verkürzten Lip-hGH Proteinen war signifikant
verringert (Figur. 2, Spuren 2 und 3). Die verkürzten Lip-hGH Proteine sind kein Ergebnis von
extrazellulären proteolytischen Aktivitäten, da das Lip-hGH Protein stabil in dem S. carnosus
Überstand ist. Die geringere Gegenwart der verkürzten Proteine im Überstand von S. carnosus
(pTX-LipP-hGH4) zeigt, daß hGH schneller von der optimierten DNA-Sequenz translatiert wird
und damit intrazellulären Proteasen weniger die Möglichkeit gibt, das Protein zu zerschneiden,
bevor es über die zytoplasmatische Membran hinweg sezerniert wird.
Das Argininkodon AGG ist extrem selten in S. carnosus Genen, da es nur in 0,8% der
Argininkodons verwendet wird. Die entsprechenden tRNA Gene in S. carnosus sind noch nicht
identifiziert worden. Daher exprimierten wir E. coli tRNAs für das AGG-Kodon in S. carnosus.
Die E. coli Gene argU und argW, welche die tRNAs für die Kodons AGG/AGA und AGG
kodieren, waren mit ihren natürlichen Promotern und Terminatoren in die Plasmide pUBS520
bzw. pSB101 kloniert worden (2, 16). Die Fragmente wurden als Sall-SpHI (argU) und XmaI-
EcoRI (argW) Fragmente isoliert und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des
"shuttle-"(Transfer-)Vektors pRB572 kloniert (4). Die erhaltenen Plasmide pRBargU und
pRBargW wurden in S. carnosus (pTX-LipP-hGH2), welche die hGH cDNA exprimieren,
transformiert.
Die Proteinmuster im Überstand der erhaltenen S. carnosus Stämme sind vergleichbar mit S.
carnosus (pTX-LipP-hGH4) mit erhöhter Produktion des Lip-hGH Proteins und weniger
trunkierten Proteinen. Daher hat die erfindungsgemäße Expression von seltenen tRNAs
vorteilhafte Eigenschaften für beispielsweise die Herstellung von humanen Proteinen in S.
carnosus.
Die Genfusion ist aus den DNA-Sequenzen kodierend für das Signalpeptid (SP) und das
Propeptid (PP) von der Staphyloccocus hyicus Lipase und dem hGH Teil des reifen Proteins (in
schwarz) zusammengesetzt und wird durch den xyl Promoter (als graues Dreieck dargestellt)
transkribiert. Die hGH cDNA oder die synthetische DNA Sequenz wurde zwischen der NsiI und
der PstI Schnittstelle eingefügt. Das 5'Ende der hGH DNA Sequenz wurde modifiziert, um die
Enterokinase Schnittstelle "DDDDK", gefolgt von der reifen hGH Sequenz zu kodieren, wie
unterhalb des Genes gezeigt.
Gleiche Mengen des
Überstandes wurden mittels SDS-PAGE auf Tris-Glycingelen enthaltend 15% Acrylamid
aufgetrennt und anschließend mit Coomassie Blue gefärbt. Die Spuren 1-5 enthalten Überstände
von S. carnosus Stämmen enthaltend den leeren Kontrollvektor pTX16 (15), einem Derivat von
pTXIS (Spur 1), die Plasmide pTX-LipP-hGH4 mit dem verbesserten hGH Gen (Spur 2), pTX-
LipP-hGH2 mit der hGH cDNA (Spur 3), pTX-LipP-hGH2 plus pRBargU (Spur 4), und pTX-
LipP-hGH2 plus pRBargW (Spur 5). Standardproteine und ihre Molekulargewicht (kDa) sind auf
der linken Seite angezeigt. Die Überstände wurden durch Präzipitation mit Trichloressigsäure
konzentriert. SDS page wurde nach Standardverfahren aus dem Stand der Technik durchgeführt.
Relevante Restriktionsschnittstellen sind einfach unterstrichen, die Shine-Dalgarno-Sequenz ist
doppelt unterstrichen. Die Signalpeptidase 1- und die Enterokinasespaltstelle im Protein sind mit
einer unterbrochenen Linie unterstrichen. Nur die Bereiche zwischen der BglII- und der NdeI-site
sowie zwischen der NsiI- und der PstI-site sind synthetisch hergestellt und optimiert worden. Der
Rest stellt die Originalsequenz von Signal- und Propeptid der Lipase aus Staphylococcus hyleus
dar.
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Claims (44)
1. Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins in einer
prokaryontischen Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Kodonverwendung der
Wirtszelle für Wirtszellgene ermittelt wird, bei der für das heterologe rekombinante Protein
kodierenden Nukleinsäure in der Wirtszelle selten vorkommende Kodons durch häufige
Kodons ersetzt werden, besagte Wirtszelle mit besagter für das rekombinante Protein
kodierender Nukleinsäure transformiert wird und besagte rekombinante Nukleinsäure
exprimiert wird.
2. Verfahren zur Herstellung eines heterologen rekombinanten Proteins in einer
prokaryontischen Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Kodonverwendung der
Wirtszelle für Wirtszellgene ermittelt wird, besagte Wirtszelle mit der Nukleinsäure, die für
selten vorkommende Kodons spezifische tRNA oder tRNAs kodiert, mit besagter für das
rekombinante Protein kodierender Nukleinsäure transformiert wird und besagte rekombinante
Nukleinsäure exprimiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der für das heterologe
rekombinante Protein kodierenden Nukleinsäure in der Wirtszelle selten vorkommende
Kodons durch häufige Kodons ersetzt werden und besagte Wirtszelle mit für selten
vorkommende Kodons kodierenden tRNA oder tRNAs und mit besagter für das rekombinante
Protein kodierender Nukleinsäure transformiert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der
kodierenden Nukleinsäure Kodons, die in der Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz
von weniger als 10% verwendet werden, durch Kodons mit einer durchschnittlichen Frequenz
von mindestens 10% ersetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle
Escherichia coli ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine
Wirtszelle ausgewählt aus der Gattung Staphylococcus ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Wirtszelle Staphylococcus carnosus ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante
Protein ein Antikörperprotein ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante
Protein Insulin ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante
Protein Gewebeplasminogenaktivator (tPa) ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante
Protein ein humanes ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante
Protein das Wachstumshormon (growth hormone) ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß das
rekombinante Protein humanes Wachstumshormon (human growth hormone hOH) ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß G bzw. C reiche
Kodons durch A oder T enthaltene Kodons ersetzt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon GCC
durch GCA ersetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon TGC
durch TGT ersetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon GAC
durch GAT ersetzt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon GAG
durch GAA ersetzt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon TTC
durch TTT ersetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon GGG
durch GGT ersetzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon CAC
durch CAT ersetzt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon ATA
durch ATT ersetzt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon AAG
durch AAA ersetzt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon CTC
durch TTA ersetzt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon AAC
durch AAT ersetzt wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon CCC
durch CCA ersetzt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon CAG
durch CAA ersetzt wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon CGG
durch CGT ersetzt wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon TCG
durch TCA ersetzt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon ACC
durch ACA ersetzt wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon GTC
durch GTT ersetzt wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 l, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon TAC
durch TAT ersetzt wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon TGA
durch TAA ersetzt wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit
der für AGG-tRNA oder AGA-tRNA kodierenden Nukleinsäure und mit besagter für das
rekombinante Protein kodierender Nukleinsäure transformiert wird.
35. Nukleinsäuremolekül kodierend für ein rekombinantes heterologes Protein, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens ein in der Wirtszelle selten vorkommendes Kodon durch ein
in der Wirtszelle häufig vorkommendes Kodon ersetzt wurde.
36. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß Kodons, die in der
Wirtszelle mit einer durchschnittlichen Frequenz von weniger als 10% verwendet werden,
durch Kodons mit einer durchschnittlichen Frequenz von mindestens 10% ersetzt sind.
37. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, daß es
für das humane Wachstumshormon hGH kodiert.
38. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleotidsequenz aus der
folgenden Gruppe umfaßt: die folgende Sequenz
oder eine Teilsequenz hiervon, eine Nukleinsäure, die an besagte Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, eine allele Variante oder eine funktionelle Variante von besagter Sequenz oder eine Variante der Nukleinsäure aufgrund des degenerativen Kodes.
oder eine Teilsequenz hiervon, eine Nukleinsäure, die an besagte Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, eine allele Variante oder eine funktionelle Variante von besagter Sequenz oder eine Variante der Nukleinsäure aufgrund des degenerativen Kodes.
39. Nukleinsäuremolekül kodiert durch die Nukleotidsequenz
40. Vektor enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 35 bis 39.
41. Wirtszelle enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 35 bis 39 oder einen
Vektor nach Anspruch 40.
42. Wirtszelle enthaltend ein oder mehrere tRNA Moleküle, die für in dieser Wirtszelle selten
vorkommende Kodons kodieren.
43. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle
eine Wirtszelle ausgewählt aus der Gattung Staphylococcus ist.
44. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 41 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle
Staphylococcus carnosus ist.
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