Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörperkonstrukten die aus
mindestens drei antigenbindenden Antikörperfragmenten (variable Regionen, Fv) aufgebaut
sind und von denen mindestens zwei eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Antikörperkonstrukte für
nachweisende, insbesondere diagnostische, therapeutische und Forschungszwecken und sie
betrifft Reagenzien, die unter Verwendung wenigstens eines dieser Antikörperkonstrukte
hergestellt sind.The invention relates to a method for producing antibody constructs from
built up at least three antigen-binding antibody fragments (variable regions, Fv)
and at least two of which have a different primary structure.
The invention also relates to the use of these antibody constructs for
demonstrative, especially diagnostic, therapeutic and research purposes and them
relates to reagents using at least one of these antibody constructs
are manufactured.
Bispezifische Antikörper sind am besten rekombinant herzustellen, da bei der herkömmlichen
Quadroma- bzw. Hybrid-Hybridoma-Technik ein Gemisch aus 10 verschiedenen Produkten
auftritt, aus denen das einzige korrekte nur unter erheblichem Aufwand abgetrennt werden
kann (Milstein und Cuello, 1983, Nature 305, 537-540). Bispezifische Antikörper sind aber
als Agenzien für neuartige Therapieverfahren notwendig, die ohne solche Moleküle nicht
durchgeführt werden könnten. Anwendung finden sie im besonderen bei der Stimulierung der
Immunantwort gegen Tumorzellen (Segal et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11, 558-562;
Hombach et al., 1993, Int. J. Cancer 55, 830-836; Manzke et al., 1999, Int. J. Cancer 80, 715-
722). Dabei werden T-Lymphozyten spezifisch an Tumorzellen herangeführt und oft noch
zusätzlich durch einen der Bindungsarme des bispezifischen Agens aktiviert. Verschiedene
molekulare Formate wurden zur Herstellung von therapeutischen Antikörpern im allgemeinen
und von bispezifischen Antikörpern im speziellen entwickelt (Breitling und Dübel, 1997,
Rekombinante Antikörper, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg; Carter und
Merchant, 1997, Curr. Opin. Biotech. 8, 449-454). Bei ausführlichen Untersuchungen zur
Tumorlokalisation von verschiedenen Antikörperformaten (scFv, Diabody, Minibody,
komplette IgG) mit identischer Antigenbindestelle (Tumormarker carcinoembryonic antigen,
CEA) aber mit unterschiedlichem Molekulargewicht (ca. 30 kDa, 60 kDa, 90 kDa und 150 kDa)
zeigte sich, daß die beiden kleineren Formate aufgrund ihrer raschen Filtrierung durch die
Niere zu einem weit geringeren Konzentrationsverhältnis Tumor/Gewebe führten als
Konstrukte, deren Molekulargewichte über der Filtrationsgrenze der Niere lagen (Wu et al.,
1996, Immunotechnology 2, 21-36; Hu et al., 1996, Cancer Res. 56(13), 3055-61). Beste
Tumorlokalisation erbrachte der sog. Minibody (ca. 90 kDa), der aus zwei identischen scFv-
Fragenten besteht, welche durch fusionierte CH3 Domänen dimerisieren (Hu et al., 1996,
Cancer Res. 56(13), 3055-61). Dieses Konstrukt ist zwar bivalent, aber monospezifisch. Die
Herstellung von bispezifischen Antikörpern nach diesem Muster ist schwierig, da es wiederum
zu homologen Paarungen und damit zu unerwünschten und schwer abtrennbaren
Nebenprodukten kommen kann. Die Verwendung von CH1 und CL(kappa)-Domänen zur
Dimerisierung (Müller et al.,. 1998, FEBS Lett. 422, 259-64) löste zwar das Problem der
Nebenprodukte bei der Herstellung bispezifischer Minibodies, jedoch ist die Affinität durch
die Monovalenz der jeweiligen Antigenbindestellen eingeschränkt. Die Stabilisierung von Fv-
Fragmenten durch Disulfidbrücken (dsFv, Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 90(16), 7538-42; Reiter et al., 1995, Protein Eng. 8, 1323-31) verbesserte deren Serum-
Halbwertzeit gegenüber scFvs und führte zu einer erhöhten Lokalisierung dieser Konstrukte im
Tumorgewebe (Reiter et al., 1994, Protein Eng. 7, 697-704; Reiter et al., 1994, J. Biol. Chem.
269, 18327-18331; Reiter et al., 1994, Int. J. Cancer 58, 142-149; Webber et al., 1995, Mol.
Immunol. 4, 249-258). Bispezifische Diabodies, wie sie vielfach für die Therapie hergestellt
wurden, sind kleiner als das pharmakokinetisch optimale Konstrukt für die Tumortherapie,
indem sie lediglich aus zwei antigen-bindenden Antikörperfragmenten zusammengesetzt sind
(Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448; Hollinger et al., 1996,
Protein Eng. 9, 299-305; Holliger et al., 1999, Cancer Res. 59, 2909-16; Arndt et al., 1999,
Blood 94, 2562-2568; Helfrich et al., 1998, Int. J. Cancer 76, 232-9). Die Verwendung von
dsFv-dsFv'-Antikörpern, d. h., Konstrukten aus zwei Disulfidbrücken-stablisierten Fv-
Fragmenten, die durch ein kurzes Linker-Peptid verbunden sind (Breitling und Dübel, 1997,
Rekombinante Antikörper, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg; Schmiedl et al.,
submitted) beseitigt zwar die Stabilitätsprobleme der Diabodies, das Konstrukt hat aber auch
ein zu geringes Molekulargewicht für eine optimale Tumorlokalisation.Bispecific antibodies are best produced recombinantly, since in the conventional quadroma or hybrid hybridoma technique a mixture of 10 different products occurs, from which the only correct one can only be separated with considerable effort (Milstein and Cuello, 1983, Nature 305 , 537-540). However, bispecific antibodies are necessary as agents for new types of therapy that could not be carried out without such molecules. They are used in particular in stimulating the immune response against tumor cells (Segal et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11, 558-562; Hombach et al., 1993, Int. J. Cancer 55, 830-836; Manzke et al., 1999, Int. J. Cancer 80, 715-722). T-lymphocytes are specifically introduced to tumor cells and often additionally activated by one of the binding arms of the bispecific agent. Various molecular formats have been developed for the production of therapeutic antibodies in general and bispecific antibodies in particular (Breitling and Dübel, 1997, Recombinant Antibodies, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg; Carter and Merchant, 1997, Curr. Opin. Biotech. 8, 449 -454). Extensive studies on tumor localization of different antibody formats (scFv, diabody, minibody, complete IgG) with an identical antigen binding site (tumor marker carcinoembryonic antigen, CEA) but with different molecular weights (approx. 30 kDa, 60 kDa, 90 kDa and 150 kDa) showed that that the two smaller formats, because of their rapid filtration through the kidney, resulted in a much lower tumor / tissue concentration ratio than constructs whose molecular weights were above the filtration limit of the kidney (Wu et al., 1996, Immunotechnology 2, 21-36; Hu et al ., 1996, Cancer Res. 56 (13), 3055-61). The best tumor localization was achieved by the so-called minibody (approx. 90 kDa), which consists of two identical scFv fragments, which dimerize through fused C H 3 domains (Hu et al., 1996, Cancer Res. 56 (13), 3055-61 ). This construct is bivalent, but monospecific. The production of bispecific antibodies according to this pattern is difficult because it can lead to homologous pairings and thus to undesirable and difficult-to-separate by-products. The use of C H 1 and C L (kappa) domains for dimerization (Müller et al.,. 1998, FEBS Lett. 422, 259-64) solved the problem of the by-products in the production of bispecific minibodies, but the affinity is limited by the monovalence of the respective antigen binding sites. The stabilization of Fv fragments by disulfide bridges (dsFv, Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (16), 7538-42; Reiter et al., 1995, Protein Eng. 8, 1323- 31) improved their serum half-life compared to scFvs and led to an increased localization of these constructs in tumor tissue (Reiter et al., 1994, Protein Eng. 7, 697-704; Reiter et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 , 18327-18331; Reiter et al., 1994, Int. J. Cancer 58, 142-149; Webber et al., 1995, Mol. Immunol. 4, 249-258). Bispecific diabodies, such as were often produced for therapy, are smaller than the pharmacokinetically optimal construct for tumor therapy in that they are composed of only two antigen-binding antibody fragments (Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; Hollinger et al., 1996, Protein Eng. 9, 299-305; Holliger et al., 1999, Cancer Res. 59, 2909-16; Arndt et al., 1999, Blood 94, 2562 -2568; Helfrich et al., 1998, Int. J. Cancer 76, 232-9). The use of dsFv-dsFv 'antibodies, ie, constructs from two disulfide bridge-stabilized Fv fragments which are linked by a short linker peptide (Breitling and Dübel, 1997, Recombinant Antibodies, Spektrum der Wissenschaft Verlag, Heidelberg; Schmiedl et al., submitted) eliminates the stability problems of the diabodies, but the construct also has too low a molecular weight for optimal tumor localization.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb, ein neues Verfahren bereitzustellen, um
neuartige Antikörperkonstrukte für diagnostische, therapeutische und Forschungszwecken
bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik beseitigen.
The object of the present invention is therefore to provide a new method for
novel antibody constructs for diagnostic, therapeutic and research purposes
to provide, which eliminate the disadvantages of the prior art.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch das im Anspruch 1 näher gekennzeichnete
Verfahren gelöst. Dieses erfindungsgemässe Verfahren stellt Antikörperkonstrukte zur
Verfügung welche eine bivalente Bindung an den Tumor oder den Effektor und damit eine weit
höhere off-rate bei der Dissoziierung ermöglichen, dies hat eine längere Lokalisation im
Zielgewebe zur Folge, und kommt außerdem ohne jegliche Dimerisierungsdomänen aus (Fig. 1).
Dadurch wird bei optimalem Molekulargewicht (ca. 90 kDa) eine optimale Bindung erreicht,
die mit keinem der bisher beschriebenen Konstrukte in gleicher Weise erreicht werden kann.
Das hier beschriebene molekulare Design vereint deshalb erstmals die zuvor separat
gefundenen positiven Eigenschaften bisheriger Konstrukte:
This object is achieved according to the invention by the method characterized in more detail in claim 1. This method according to the invention provides antibody constructs which enable a bivalent binding to the tumor or the effector and thus a much higher off-rate in the dissociation, this results in a longer localization in the target tissue and also does without any dimerization domains ( Fig. 1). As a result, an optimal binding is achieved with an optimal molecular weight (approx. 90 kDa), which cannot be achieved in the same way with any of the constructs described so far. The molecular design described here therefore combines for the first time the previously separately found positive properties of previous constructs:
-
1. Stabilisierung durch Disulfidbrücken,1. stabilization by disulfide bridges,
-
2. Bivalenz zusätzlich zur Bispezifität und2. Bivalence in addition to bispecificity and
-
3. Minibody-Größe.3. Mini body size.
Diese Ziele werden dadurch erreicht, daß die Antikörperkonstrukte rekombinant hergestellt
werden, z. B. in E. coli, Insektenzellkulturen, Pichia patoris, CHO-Zellkulturzellen oder
transgenen Pflanzen. Dazu werden Vektoren mittels DNA-Klonierung nach Stand der Technik
hergestellt, welche nach Transfektion in die entsprechenden Wirtszellen bzw -organismen die
rekombinante Proteinproduktion der Untereinheiten ermöglichen. Die DNA-Moleküle, welche
für die Untereinheiten der V-bodies codieren, werden dafür solcherart durch PCR-Mutagenese
oder andere Mittel nach Stand der Technik konstruiert, daß im rekombinant produzierten
Protein 1. mindestens eines der beteiligten Fv-Regionen durch Mutation von zwei an der
Kontaktstelle zwischen VH und VL gegenüberliegenden Aminosäurepositionen (jeweil eine in
VH und eine in VL) zu Cystein mit einer interface-Disulphidbrücke stabilisiert werden
(Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(16), 7538-4), und 2.
Proteinkomkplexe nach Abb. 2 oder 3 produziert werden. Letzteres wird dadurch erreicht, daß
über die Einführung von kompatiblen Restriktionsschnittstellen an den Enden der
Genfragmente für die verschiedenen variablen Domänen und darauffolgende Ligation oder
durch PCR-Assembly die verschiedenen variablen Domänen in den entsprechenden
Expressionsvektoren so angeordnet werden, daß sie für die in Fig. 1, 2 oder 3 angezeigten
Polypeptidketten codieren. Bi-/Trivalenz resp. Bi-/Trispezifität und Minibody-Größe
werden dadurch erreicht, daß die für die variablen Regionen codierenden DNA-Fragmente so
zusammengesetzt werden, daß das resultierende Produkt aus 3 Fv-Fragmenten besteht. Die
resultierende Molekularmasse entspricht dadurch der vorteilhaften Minibody-Größe. Die
optimale Anordnung (Reihenfolge) der verschiedenen VH und VL-Ketten-Gene zueinander im
Vektor kann dabei individuell für jedes Konstrukt optimal gewählt werden. Mögliche
entstehende Nebenprodukte der rekombinanten Produktion können mithilfe
chromatographischer Methoden nach Stand der Technik abgetrennt werden.These goals are achieved in that the antibody constructs are produced recombinantly, e.g. B. in E. coli, insect cell cultures, Pichia patoris, CHO cell culture cells or transgenic plants. For this purpose, vectors are produced by means of DNA cloning according to the prior art, which, after transfection into the corresponding host cells or organisms, enable the subunits to be produced recombinantly. The DNA molecules which code for the subunits of the V-bodies are constructed for this purpose by PCR mutagenesis or other means according to the prior art that in the recombinantly produced protein 1. at least one of the Fv regions involved is mutated by two the contact point between V H and V L opposite amino acid positions (one in V H and one in V L ) to cysteine can be stabilized with an interface disulphide bridge (Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 ( 16), 7538-4), and 2. Protein complexes according to Fig. 2 or 3 are produced. The latter is achieved in that, by introducing compatible restriction sites at the ends of the gene fragments for the various variable domains and subsequent ligation or by PCR assembly, the various variable domains are arranged in the corresponding expression vectors in such a way that they are arranged for those in FIG. 1 , Encode 2 or 3 indicated polypeptide chains. Bi- / trivalence resp. Bi- / trispecificity and minibody size are achieved by assembling the DNA fragments coding for the variable regions in such a way that the resulting product consists of 3 Fv fragments. The resulting molecular mass thus corresponds to the advantageous minibody size. The optimal arrangement (order) of the different VH and VL chain genes in relation to each other in the vector can be optimally selected individually for each construct. Possible by-products of recombinant production can be separated using state-of-the-art chromatographic methods.
Die Antikörperkonstrukte werden ausschließlich aus antigenbindenden Domänen bestehen, da
konstante Domänen für die Dimerisierung nicht mehr notwendig sind, und die Konstrukte
durch den Einsatz von interchain-Disulfidbrücken optimal stabilisiert sind. Die beschriebenen
Antikörperkonstrukte werden deshalb im weiteren als "V-Bodies" bezeichnet, da sie bis auf
kurze Spacer-Peptide ausschließlich aus variablen Regionen zusammengesetzt sind. Eine
Herstellung von Molekülen mit den geschilderten Vorteilen war bisher nicht möglich.The antibody constructs will consist exclusively of antigen-binding domains because
constant domains are no longer necessary for dimerization, and the constructs
are optimally stabilized through the use of interchain disulfide bridges. The described
Antibody constructs are therefore referred to below as "V-bodies" because they are except
short spacer peptides are composed exclusively of variable regions. A
Up to now, it has not been possible to produce molecules with the advantages described.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht im Gegensatz zu anderen Methoden zur
Herstellung bispezifischer Antikörper, die Konstruktion der V-bodies aus humanen V-
Regionen dies ermöglicht die Herstellung des gesamten Konstruktes aus ausschließlich
humanen Protein-Fragmenten - damit wird eine Immunreaktion (z. B. HAMA) gegen das
therapeutische Agens vermieden, wie sie bei Konstrukten auftritt, die ihre Bivalenz oder
Bispezifität durch Fusion der antigen-bindenden Domänen an heterologe Fusionspartner
erreichen (wie Streptavidin, Zipper-Motive, Protein A-Fusionen etc.). Variationen der V
bodies bestehen aus 2, 3 oder 4 Polypeptidketten, wobei unterschiedliche Grade à
Disulfidstabilisierung zum Einsatz kommen (Fig. 1, 2, 3). Trispezifische Antikörper sind ohne
Mehraufwand gegenüber bispezifischen Antikörpern herzustellen, wenn die rekombinanten
Expressionsvektoren so konstruiert werden, daß zwei Polypeptidketten-Konstrukte aus je
einem scFv und einer variablen Domäne eines dsFv-Fragmentes eingesetzt werden.In contrast to other methods for the production of bispecific antibodies, the method according to the invention enables the construction of the V-bodies from human V regions. This enables the production of the entire construct from exclusively human protein fragments - this results in an immune reaction (e.g. HAMA). against the therapeutic agent, as occurs in constructs that achieve their bivalence or bispecificity by fusing the antigen-binding domains to heterologous fusion partners (such as streptavidin, zipper motifs, protein A fusions, etc.). Variations of the V bodies consist of 2, 3 or 4 polypeptide chains, different degrees of disulfide stabilization being used ( FIGS. 1, 2, 3). Trispecific antibodies can be produced without any additional effort compared to bispecific antibodies if the recombinant expression vectors are constructed in such a way that two polypeptide chain constructs, each from an scFv and a variable domain of a dsFv fragment, are used.
BeispieleExamples
1. Trispezifische Antikörper1. Trispecific antibodies
Unter Beibehaltung der für das in vivo-targeting optimalen Molekülgröße lassen sich
trispezifische Antikörper herstellen, ohne daß besondere Trimerisierungsmotive zusätzlich zu
den antigenbindenden Regionen der Antikörper eingesetzt werden müssen. Dies wird
eingesetzt, um therapeutische Agentien herzustellen, die zum einen mehrere Tumormarker auf
einer Zelle binden können, oder mehrere verschiedene Epitope eines Tumormarkers. Ebenso
kann eine Kombination aus einem Tumormarker und einem gewebespezifischen Antikörper
eingesetzt werden. Dadurch erhöht sich die Tumorspezifität erheblich gegenüber monovalenter
oder multivalent-monospezifischer Bindung, und verringert stark die Belastung der Patienten
durch die bisher sehr häufig auftretende Lokalisierung der Antikörper in unspezifischen
Geweben (sowohl durch Kreuzreaktionen wie durch Expression des Tumormarkers auf
anderen Geweben). Zudem wird die apparente Affinität durch die erhöhte Avidität verbessert.
Die verbleibende Bindestelle der trispezifischen Antikörper dient zur Verstärkung der
Immunantwort gegen den Tumor, insbesondere durch Bindung an CD3 oder CD28 der T-
Lymphozyten. Auch eine Aktivierung der Natural Killer (NK)-Zellen gegen den Tumor über
Bindung an CD16 ist möglich. Alternativ kann dieses Antikörperfragment auch
Komplementkaskaden aktivieren.While maintaining the optimal molecular size for in vivo targeting,
Produce trispecific antibodies without additional trimerization motifs
the antigen-binding regions of the antibodies must be used. this will
used to manufacture therapeutic agents that have multiple tumor markers
can bind to one cell, or several different epitopes of a tumor marker. As well
can be a combination of a tumor marker and a tissue-specific antibody
be used. This significantly increases tumor specificity compared to monovalent ones
or multivalent-monospecific binding, and greatly reduces patient stress
due to the localization of the antibodies in non-specific antibodies, which has been very common up to now
Tissues (both by cross-reactions and by expression of the tumor marker
other tissues). Apparent affinity is also improved by the increased avidity.
The remaining binding site of the trispecific antibodies serves to strengthen the
Immune response to the tumor, especially by binding to CD3 or CD28 of the T-
Lymphocytes. Also an activation of the Natural Killer (NK) cells against the tumor
Binding to CD16 is possible. Alternatively, this antibody fragment can also
Activate complement cascades.
2. Bispezifische Antikörper mit verbesserter Tumor Anreicherung und optimierter
Pharmakokinetik2. Bispecific antibodies with improved tumor enrichment and optimized
pharmacokinetics
Durch Produktion von zwei verschiedenen Antikörperketten in E. coli unter Benutzung von
kompatiblem Expressionsvektoren (z. B. pOPE und pDOPE), werden V-Bodies im Periplasma
von E. coli zusammengesetzt, welche eine Bindestelle für humanes CD3 enthalten, und zwei
Bindestellen für einen Tumormarker, z. B. MUC1, erbB2 o. ä., oder Differenzierungsmarker,
wie z. B. CD19. Die Proteine werden aus dem Periplasma gereinigt, und intravenös eingesetzt,
um T-Lymphozyten an den Tumor heranzuführen. Eine Produktion der Proteine in
eukaryontischen Zellinien (z. B. CHO oder Baculovirus) oder transgenen Pflanzen ist zur
Herstellung ebenfalls möglich.By producing two different antibody chains in E. coli using
compatible expression vectors (e.g. pOPE and pDOPE), become V-bodies in the periplasm
composed of E. coli, which contain a binding site for human CD3, and two
Binding sites for a tumor marker, e.g. B. MUC1, erbB2 or similar, or differentiation markers,
such as B. CD19. The proteins are purified from the periplasm and used intravenously,
to bring T lymphocytes to the tumor. Production of the proteins in
eukaryotic cell lines (e.g. CHO or baculovirus) or transgenic plants is used
Production also possible.