DE10019901A1

DE10019901A1 - Neues neuronal exprimiertes Protein und seine Verwendung

Info

Publication number: DE10019901A1
Application number: DE10019901A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Goetz; Birgitta Kammandel; Rohini Kuner; Sigrid Scheek; Holger Hiemisch
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2000-04-20
Filing date: 2000-04-20
Publication date: 2001-10-25
Also published as: AU2001254810A1; WO2001081623A3; US20050147967A1; WO2001081623A2; EP1282701A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue spezifisch exprimierte Proteine und Nukleinsäuresequenzen oder rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, die für die Proteine kodieren. DOLLAR A Die Erfindung betrifft außerdem Wirtsorganismen oder transgene Tiere, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität an die erfindungsgemäßen Proteine, ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der erfindungsgemäßen Proteine. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen und Proteine.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue spezifisch exprimierte Proteine, und Nukleinsäuresequenzen oder rekombinante Nuklein säurekonstrukte, die für die Proteine kodieren.

Die Erfindung betrifft ausserdem Wirtsorganismen oder transgene Tiere, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte sowie mono- oder polyklonale Antikörper, die gegen die isolierten Proteine gerichtet sind.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität an die erfindungs gemäßen Proteine, ein Verfahren zum qualitativen oder quanti tativen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der erfindungsgemäßen Proteine. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen und Proteine.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bilden eine neue Genfamilie, die zu den sogenannten Immediate Early Genes (= IEG) gehört.

Alle bisher beschriebenen klonierten IEG-Gene werden neuronal exprimiert [Brakeman et al., (1997), Nature 386: 284-288; Kauf mann et al., (1994), Int. J. Dev. Neurosci. 12: 263-271; Kato et al., (1998), J. Biol. Chem. 273: 23969-23975; Lyford et al., (1995), Neuron 14: 433-445; Tsui et al., (1996), J. Neurosci. 16: 2463-2478; Kaufmann et al., (1997), Brain Dev. 19: 25-34; Wallace et al., (1998) J. Neurosci. 18: 26-35; Steward et al., (1998), Neuron 21: 741-751; O'Brien et al., (1999), Neuron 23: 309-323].

Ihre Expression wird rasch durch einen Stimulus erhöht. Für das IEG Homer 1A konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass es sich dabei um eine trunkierte Variante eines Mitglieds einer grösseren Genfamilie handelt und dass die Induktion dieser Variante zur (dominant-negativen) Unterbrechung der Signalweiterleitung führt, die von den anderen Mitgliedern der Genfamilie zwischen extra zellulären Rezeptoren und internen Kalziumspeichern vermittelt wird [Tu et al., (1998), Neuron 21: 717-726; 73; Xiao et al., (1998), Neuron 21: 707-716; Yuguchi et al., (1997), J. Cereb. Blood Flow Metab. 17: 745-752]. Somit führt ein externer Stimulus (z. B. Krampfanfall) zu direkten Veränderungen wichtiger Second Messenger Systeme.

Ein weiteres Beispiel für die wichtige Rolle der neuronal expri mierten IEGs im Hippocampus ist das sogenannte Arc. Dieses Gen wird ebenfalls nach Auslösung eines Krampfanfalles in Pyramiden zellen der hippocampalen Subregionen CA1 und CA3 in seiner mRNA-Expression induziert. Es wurde gezeigt, dass die Arc mRNA Expression im CA1 Areal durch blosses Verbringen der Ratte in eine neue Umgebung induziert wird. Da das Muster der induzierten Neuronen spezifisch für die jeweilige Umgebung war, in der sich die Ratte befand, konnte man nachweisen, dass die Induktion der Arc mRNA-Expression mit Vorgängen der neuronalen Informations speicherung im Hippocampus korreliert [Guzowski et al., (1999), Nat. Neurosci. 2: 1120-1124]. Diese sogenannten IEGs scheinen wichtige intrazelluläre Regulationspunkte darzustellen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Organismen sowie bei pathologischen Prozessen innerhalb der Organismen bzw. innerhalb der einzelnen Zelle.

Es bestand daher die Aufgabe weitere IEGs zur Verfügung zu stellen, die als Interventionspunkte bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden können. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäuresequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit Apoptaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Poly peptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 90% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

Diese Nukleinsäuren lassen sich in eukaryontischen und prokaryon tischen Organismen vorteilhaft Mammalia wie Homo sapiens, Rattus, norvegicus oder Mus musculus finden. Diese Nukleinsäuren codieren für die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 (Homo sapiens), SEQ ID NO: 3 (Mus musculus), SEQ ID NO: 7 (Homo sapiens) und SEQ ID NO: 9 (Rattus norvegicus).

Aus der Ratte konnte ein erster cDNA-Klon dieser Genfamilie isoliert werden (WO 99/40225). Der so gewonnene cDNA-Klon kodiert für ein Protein, das als L100-Protein bezeichnet wurde. In SEQ ID NO: 10 wird die Sequenz von L100 aus der Ratte wieder gegeben. SEQ ID NO: 11 ist die zugehörige Aminosäuresequenz. Die Vertreter dieser Genfamilie scheinen zu den neuronalen sogenann ten Immediate Early Genes (= IEG) zu gehören.

Ein Gen wird als IEG bezeichnet, wenn es drei Bedingungen erfüllt:

a) seine mRNA muss in ruhenden bzw. nicht stimulierten Zellen niedrig exprimiert werden,
b) seine mRNA Expression kann auch unter Abwesenheit von de novo Proteinsynthese erfolgen,
c) nach geeigneter Stimulierung wird die Transkription des Gens aktiviert.

Basierend auf der Kinetik der mRNA Akkumulation werden IEGs häufig in 3 Klassen eingeteilt.

a) IEGs der Klasse I sind oft in ruhenden bzw. nicht stimu lierten Zellen nicht detektierbar. Die maximale mRNA Konzentration wird etwa 30-60 Minuten nach Stimulation erreicht. Nach etwa 1,5 bis 2 Stunden geht die mRNA Konzentration wieder auf die basalen Werte zurück (Bei spiele sind c-fos, c-jun, zif268).
b) IEGs der Klasse II erreichen maximale mRNA Konzentrationen 2 Stunden nach Stimulation. Die basalen Werte werden wieder nach etwa 8 Stunden (Beispiele hierfür sind Narp, c-myc, GLUT1) erreicht.
c) Gene der Klasse 3 werden sehr schnell induziert, ihre mRNAs akkumulieren über viele Stunden. Diese mRNAs zeigen eine lange Halbwertszeit (z. B. Fibronectin).

Basierend auf diesen Kriterien können die erfindungsgemäßen Proteine und die für die Proteine kodierenden Nukleinsäuren L100 und L100 Homologe als IEGs der Klasse I klassifiziert werden.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäureseguenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 90% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 92% Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Inser tion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die biologische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine nicht wesent lich reduziert sein sollte. Unter Proteinen mit einer nicht wesentlich reduzierten biologischen Aktivität sind Proteine zu verstehen, die eine biologische Aktivität von mindestens 20%, bevorzugt 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevor zugt 90% aufweisen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), (1988), 85(8), 2444-2448 bzw. Alignments wurden nach ALIGN calculates von Myers und Miller CABIOS (1989), 4: 11-17 durchgeführt. Die Erfindung betrifft damit auch Aminosäuresequenzen, die durch die oben dar gestellte Gruppe von Nukleinsäuresequenzen kodiert werden. Vor teilhaft betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 kodiert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für Proteine kodieren, die die biologische Aktivität von L100 und dessen Homo loge aufweisen und die mindestens 50% der Aktivität der unter SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 genannten Sequenzen aufweisen. Diese funktionellen Äquivalente interagieren vorteilhafterweise mit anderen Proteinen, mit denen sie sogenannte Proteinkomplexe (= Proteinheteromere) bilden.

Unter der wesentlichen biologischen Eigenschaft der erfindungs gemäßen Proteine sind weiterhin beispielsweise die Membrandomänen und die Cystein-, Serin- und Glutamin-reichen Domänen sowie die Kernlokalisierungsdomäne zu verstehen. Diese Eigenschaft er möglicht die spezielle biologische Wirkung der Proteine.

Das isolierte Protein und seine funktionellen Varianten läßt sich vorteilhafterweise aus dem menschlichen oder tierischen Gehirn isolieren.

Eine weitere wesentliche biologische Eigenschaft ist die Fähig keit mit Proteinen, das heißt anderen Rezeptoren interagieren zu können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Proteine, die noch die Rezeptorbindungsaktivität aufweisen und die ausgehend von der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz durch gezielte Veränderungen her stellbar sind. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raum erfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Bei spielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutamin säurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen mit einander kombiniert werden.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8, bei spielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzel strang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA- Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besitzen auf DNA- Ebene eine Homologie von mindestens 80%, bevorzugt von min destens 85%, besonders bevorzugt von mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 95% über den gesamten in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 angegebenen DNA-Bereich.

Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 Derivate wie bei spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des Weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Ausgehend von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 wurde eine Blastsuche [BLASTN 2.0.11 (Jan-20-2000), Altschul et al., (1997), Nucleic Acid Res., 25: 3389-3402] in verschiedenen Nukleinsäuresequenzbanken nach EST-Sequenzen durch geführt. Dabei wurden folgende Sequenzen in den Datenbanken gefunden (EMBL-Sequenzen):

AI505116, AA623763, AW476299, D21599, AA370045, AA956920, AA135236, AI027708, AV272584, AI923037, AA429440, AI806476, AA305194, AI374746, AI205148, AI919283, AW251698, AW251940, AW254416, AW358288, AW347356, AW344462, AI710614, AW254235, AI713621, AI902420, AI713491, AW484184, AW426087, AI271020, AA849418, AA814410, Aw313920, AI011502, AA990527, AI416381, AV168326, AV325720, AA429440, AI806476, AA305194, AI374746, AI205148, AI919283, AW251698, AW251940, AW254416, AW358288, AW347356, AW344462, AI710614, AW254235, AI713621, AI902420, AI713491, AW484184, AW426087, AI171010, AA849418, AA814410, AI011502, AA990527, AI416381, AV168326, AV325720, AW251698, AW251940, AW254416, AI710614, AW254235, AI713621, AI713491, AA305194, AA429440, AI171010, AW358288, AW347356, AA990527, AW344462, AI205148, AA849418, AI806476, AI374746, AV168326, AI011502, AV325720, AI902420, AI919283, AI416381, AW484184, AW426087, AI794507, AI027708, H16294, AA135123, AA135236, R93263, AI760726, AA961632, AA559951, AI612798, AW404376, R76656, AI923037, AA370045, AI864137, AI201837, AA635636, C01543, T46994, AW345830, AI505116, AA623763, D21599, AW477674, AW476299, AI794507, AI559002, AA589864, AA105097, AA511916, AA510012, AA274717, W44097, AA371009, AA349120, AA310845, AA310224, F12570, R11972, R69553, H08524, AA796994, R61424, R18375, AA505159, AA448038, AW408260, AI752011, AI558552, AA542671, AI404829, AI295106, AI238160, AI221701, AI103093, AI045639, AA893761, AA891212, AA212991, AA512017, AW413387, AW408302, AW379003, AW144760, AI938734, AI900542, AI900402, AI713995, AI713415, AI710191, AI502255, AA565208.

Bei den vorgenannten EST-Sequenzen handelt es sich um Sequenzen, die eine gewisse Homologie zu Teilen der erfindungsgemäßen Sequenzen besitzen, deren Funktion aber unbekannt ist.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -1000 vor dem Startkodon oder 0 bis 2000 Basenpaare nach dem Stopkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft läßt sich die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder seine Homo logen aus eukaryontischen Organismen wie Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, dem Zebrafisch, Danio rerio, oder Mammalia wie der Ratte, der Maus oder dem Mensch isolieren. Bevorzugt lassen sich die Nukleinsäuresequenze(n) [der plural und singular sollen für die Anmeldung gleichbedeutend sein] aus Mammalia isolieren.

SEQ ID NO: 1 oder seine Derivate, Homologen oder Teile dieser Sequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridi sierungsverfahren oder der PCR-Technik aus Mammalia isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteil haft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispiels weise aus der cysteinreichen Region, die über Vergleiche mit den ähnlichen Metallothioneinen (= MT) in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispiels weise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Puffer lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridi sierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Tempe raturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Die se angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispiel haft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder deren Fragmente lassen sich zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening unter den oben genannten Hybridisierungs bedingungen verwenden.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt (= Expressions kassette) sind L100-Sequenzen wie SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 und seine Derivate und Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regula tionssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation aus geschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Die Expressionskassette kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder seine Homologen inseriert und der natür liche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Die Expressionskassette kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktio nell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vor teilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

In diesem Zusammenhang sind auch die besonders vorteilhaften Mammilia-Promotoren wie die Promotoren von CMV, RSV, SV40, EF-1α, CAM-Kinase II, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, β-Globin, GFAP, GAP443, Tyrosine Hydroxylase oder Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1 zu nennen. Es können auch künstliche Promotoren für die Regu lation verwendet werden.

Die Expressionskassette wird zur Expression in einem Wirts organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pA- CYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Für Mammalia vorteilhafte Vektoren sind beispielsweise pcDNA3.1, pci-neo, pRc/CMV2 oder pRc/RSV. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhafterweise enthält die Expressionskassette zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beein flussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regu latorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptions ebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor 5' up stream zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale wie Terminatoren, Polyadenylierungssignale, Enhancer können in der Expressionskassette Anwendung finden.

Vorteilhafterweise enthält die Expressionskassette noch weitere Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die mit L100 oder dessen Homologen interagieren. Beispiele für derartige Sequenzen sind die Sequenzen SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14.

Die rekombinante Expressionskassette bzw. das Nukleinsäurekon strukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind, wie oben beschrieben, dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York- Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Die vorliegende Nukleinsäuresequenz bzw. die Expressionskassette können in dem Fachmann bekannter Weise über Vektoren in geeignete Systeme eingebracht und exprimiert werden. Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, ihre Homologen, ihre funktionellen Äquivalente oder Derivate als rekombinante Expressionskassette bzw. als Vektor in einem geeigneten System eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorteilhaft dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden verwendet, um die genannten Nukleinsäuren in verschiedenen Expressionssystemen zur Expression zu bringen. Diese Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, ed. F. Ausubel et al. Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette oder der die erfindungs gemäßen Nukleinsäuren enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bestehen.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate oder des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9, HEK293 oder CHO-Zellen, besonders bevorzugt sind eukaryontische Wirtsorganismen, ganz besonders bevorzugt Mammalia oder Mammaliazellen wie Sf9, HEK293 oder CHO-Zellen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren z. B. Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden, bevorzugt sind transgene Tiere. Bei den transgenen Organismen kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere oder Pflanzen handeln.

Die erfindungsgemäßen rekombinanten prokaryontischer oder eukaryontischer Wirtsorganismus enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens eine Expressionskassette oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor.

Die Kombination aus dem Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispiels weise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen 1, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bilden ein Expressionssystem. Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressions systeme beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen wie CHO-Zellen und Vektoren wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetier zellen geeignet sind, zu verstehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Da die transkriptionelle Aktivierung von IEGs unter Abwesenheit von de novo Proteinsynthese erfolgen kann, müssen die Regu lationsproteine zur Induktion der IEGs in der nicht stimulierten Zelle bereits präsent und für eine Aktivierung bereit sein. Es wurde beobachtet, dass eine Stimulation von Zellen unter Anwesen heit von Cycloheximid, einem potenten Proteinsynthese-Inhibitor, zur Superinduktion von IEGs führt. Diese Beobachtung wurde auf zwei Effekte zurückgeführt, eine verlängerte Transkriptionsdauer sowie eine erhöhte mRNA Stabilität. AT-reiche Sequenzen im 3'-un translatiertem Bereich scheinen für die schnelle Degradation von mRNAs, die für IEGs und Cytokine kodieren, eine wichtige Rolle zu spielen. Ein AUUUA-Motiv wurde in fast allen IEG mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten identifiziert. Die Beobachtung, dass Inhibitoren der Proteinsynthese die mRNA von IEGs stabilisieren, kann mit verschiedenen Hypothesen erklärt werden. Neu synthetisierte oder labile RNasen sind für die Degradation erforderlich oder aber die Degradation der mRNA ist direkt an die Translation gekoppelt. Für beide Theorien gibt es experimentelle Indizien. Für das Gen c-myc wurde ein cytosolischer Faktor beschrieben, der c-myc mRNA nach Stimulation bindet und destabilisiert, und der bei Behandlung mit Cycloheximid nicht nachweisbar ist. Zahlreiche Studien haben ge zeigt, dass Translation eine Voraussetzung für mRNA Degradation ist [Rajagopalan et al., (1996), J. Biol. Chem. 271: 19871-19876]. Die mRNA der Ratten cDNA für L100 hat 5 AUUUA Motive. Damit lässt sich die schnelle Regulation der Degradation der L100 mRNA unter anderem mit den oben beschriebenen Mechanismen er klären.

Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung aus dem Mensch und der Maus sowie deren Homologen bilden eine bisher unbekannte Genfamilie, die in einer Domäne, die Homologie zu Metallothioneinen aufweist, und in einer putativen Kernlokali sationssequenz stark übereinstimmen (Fig. 1). Die RNA-Produkte werden beispielsweise nach maximalen Elektroschock im Gehirn von Ratten (Hippocampus) verstärkt exprimiert. Die funktionellen Daten deuten auf eine Beteiligung der Genprodukte bei neuronalem Zelltod hin. Die Expression der Gene läßt sich außer durch Elektroschock auch durch weitere Stimuli, die beispielsweise Stress hervorrufen, wie beispielsweise durch Kainat- und/oder Pentylentetrazol-Injektionen aktivieren.

Die konservierte, Cystein-reiche Region in den erfindungsgemäßen Proteinen ähnelt den Metallothioneinen (= MT), die Cystein- Cluster aufweisen, ein geringes Molekulargewicht besitzen und Metalle als Chelatkomplex binden können (Fig. 2) [Moffatt et al., (1997) Drug Metab. Rev. 29: 261-307]. In der Maus sind bisher 4 Metallothionein-Gene in einer 50 kb Region auf Chromosom 8 identifiziert worden, wohingegen beim Menschen mindestens 16 MT-Gene auf Chromosom 18 als Cluster vorliegen. Die Maus MT-I und II werden während der gesamten Entwicklung ubiquitär exprimiert und werden durch Metalle, Glucokorticoide und entzündliche Stress-Signale reguliert. MT-III wird vorwiegend neuronal expri miert. MT-IV wird in Epithelialzellen exprimiert. In Einzellern binden die MT vorwiegend Kupfer, in Säugetieren Zink, wobei Zink durch Kupfer- und Cadmiumionen ersetzt werden kann. Zelluläre Cadmiumresistenz wird durch eine Vervielfachung des MT-Locus erreicht. Funktionell dienen MT vermutlich als Chaperone für Metalloproteine, als Reservoir für Metalle und/oder verhindern die Toxizität von Metallen. MT-III Knockout-Mäuse zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Kainat-induzierten epileptischen Anfällen und eine erhöhte Neurotoxizität gegenüber Kainat in bestimmten Regionen des Hippokampus, wohingegen Mäuse durch die Überexpression von MT-III gegenüber Kainat-induzierten Zelltod geschützt werden [Erickson et al., (1997), J. Neurosci. 17: 1271-1281]. Die Überexpression von MT-I zeigt eine protektive Wirkung in bestimmten Tier-Modellen für Ischämie (van Lookeren Campagne et al., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 12870-12875). Metallothioneine werden hauptsächlich cytosolisch exprimiert und entfalten dort ihre protektive Wirkung.

Die Homologie zwischen der L100-Genfamilie und seinen Homologen und den Metallothioneinen beschränkt sich auf die kurzen Cystein- reichen Bereiche, so daß L100 und seine Homologen eine eigen ständige Familie bilden und nicht zu den Metallothioneinen ge zählt werden können. Homologievergleiche mit ESTs aus der Embl- Datenbank zeigen, daß L100 in Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster und Zebrafisch, Danio rerio exprimiert wird und in der Evolution vermutlich schon früh entstanden ist. Die Metallo thioneine haben eine Länge von etwa 60 Aminosäuren, wobei etwa 39% der Aminosäuren mit der L100-Consensus-Sequenz übereinstim men. Bei den L100-Homologen handelt es sich um Proteine von etwa 535 bis 589 Aminosäuren, so daß L100-Homologe eine eigenständige Familie bilden. Beim Menschen und in der Ratte lassen sich min destens 2 L100-Homologe nachweisen (Anlage 1: bekannte ESTs für L100 Homologe in der EMBL-Datenbank, Stand 14.3.00), die jedoch außer in der cysteinreichen Domäne keine Homologien zu bekannten Proteinen aufweisen.

Über die Beeinflussung der L100-Expression oder die Beeinflussung der biologischen Aktivität des L100-Proteins oder der Interaktion des L100-Proteins mit seinen in der Zelle vorhandenen Reaktions partnern über beispielsweise poly- und/oder monoklonale Anti körper oder niedermolekulare Substanzen können pathologische Prozesse im Tier oder im Mensch positiv beeinflußt werden. In vitro-Daten zeigen, daß L100-Überexpression zum Zelltod führt. Wie oben beschrieben, sind IEGs Gene, deren Expression sehr rasch durch einen Stimulus erhöht wird. In Neuronen sind sie funktionell bei Lernvorgängen, Gedächtnis, synptische Transmission und neuronaler Plastizität beteiligt.

Vorteilhafte erfindungsgemäße Nukleinsäuren kodieren beispiels weise für die humane oder murine Form von L100 oder für deren Homologe oder für Homologe in der Ratte.

Mit dem Two-hybrid-System wurde eine Interation des Aminoterminus von L100 (Ratte), der eine putative coiled coil Domäne enthält, mit der Proteinphosphatase 1 (Ratte), Septin oder Zink-Finger Proteinen sowie weiteren unbekannten ESTs festgestellt.

Transfektionen mit L100-Expressionskonstrukten zeigten kurz nach Transfektion eine Lokalisation des L100-Proteins im Zellkern und anschließend im Zytoplasma. Durch die Transfektion mit L100 wurde Apoptose in den bisher untersuchten Zellen ausgelöst. Des Weiteren wurde L100 in hippokampalen Neuronen nach Überexpression in Dendriten nachgewiesen.

Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, der Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt), des Vektors oder des entsprechenden Proteins können Proteine identifiziert werden, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Auch Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zum Protein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, lassen sich so identifizieren. Vorteilhafterweise werden hierzu das two- hybrid-System oder andere biochemische Verfahren allein oder in Kombination verwendet. Es lassen sich so Interaktionsdomänen des erfindungsgemäßen Proteins und damit pharmakotherapeutische Interventionspunkte identifizieren.

Daher ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung des two- hybrid Systems oder biochemischer Verfahren zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von L100 und die Verwendung zur pharmako therapeutischen Intervention.

Ein weiterer besonders vorteilhafter Erfindungsgegenstand sind Proteinkomplexe aus dem L100-Protein und mindestens einem weiteren mit L100 interagierenden Protein wie beispielsweise die Proteinphosphatase 1, Septin, Kelch- oder Zink-Finger-Proteine.

Über Strukturanalysen des erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt Substanzen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen.

Die beschriebenen Sequenzen von L100 ermöglichen, mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays, die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäuren einzugrenzen und Substanzen zu finden, mit denen die Interaktion zwischen den beiden Proteinen beeinflusst werden können.

Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist deshalb ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit der erfindungsgemäßen oben beschriebenen Aminosäuresequenz oder an einen erfindungsgemäßen Proteinkomplex binden, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung eines Proteins mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder eines Proteinkomplexes enthaltend das Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, der Expressionskassette oder des Vektors in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus,
b) Inkubation des erfindungsgemäßen Proteins mit der zu testenden Substanz oder den zu testenden Substanzen,
c) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz.

Die Detektion der Bindung erfolgt durch Messen der Antagonisie rung oder Agonisierung der L100-Aktivität oder durch Messen der physiologischen Wirkung von L100.

Diese Substanzen, die nach dem oben genannten Verfahren gefunden werden, sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung.

Weitere Ausgestaltungsformen der Erfindung sind ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Interaktion von Liganden mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Proteinkomplex (= Protein heteromer) oder den Proteinen mit der erfindungsgemäßen Amino säuresequenz hemmen oder verstärken oder ein Verfahren zum Auf finden von Substanzen, die die Interaktion der erfindungsgemäßen Proteine mit Proteinen wie beispielsweise der Proteinphosphatase 1 oder anderen Signaltransduktionsmolekülen hemmen oder ver stärken. Die Interaktion von Proteinen mit den erfindungsgemäßen Aminosäuren lässt sich mit Hilfe des Two-hybrid Systems detektieren.

Weiterhin lassen sich die Verfahren durch Expression der Proteine in eukaryotischen Zellen und Verknüpfung mit einem Reporter-Assay wie zum Beispiel mit dem gfp-Protein oder anderen Fluoreszenz assays für die Aktivierung des L100-Proteins durchführen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Proteinen mit der erfindungs gemäßen Aminosäuresequenz in einer biologischen oder sonstigen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

a) Inkubation einer biologischen oder sonstigen Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, der spezifisch gegen L100- Proteine oder Homologe gerichtet ist,
b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

Dabei wird die L100-Ligandenbindung zur Detektion ausgenutzt (siehe Beispiel 11).

Über Antikörper kann die Proteinaktivität oder Menge der L100-Proteine oder Homologe bestimmt werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Quanti fizierung der Proteinaktivität oder Menge eines Proteins.

Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nuklein säuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, die sogenannte locus control regionen, Silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression von diesem und/oder weiteren Genen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, neuronenspezifische Genexpression von Nukleinsäure konstrukten durchzuführen.

Um ein DNA Fragment zu isolieren, das die Bereiche enthält, die die Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen regulieren, wird zunächst der Bereich vor dem Transkriptionsstart mit einem Reportergen wie z. B. Galactosidase oder GFP (= green fluorescent protein = gfp) verknüpft und in Zellen oder in trans genen Tieren wie z. B. Mäusen daraufhin getestet, ob er zu dem für gemäß Anspruch 1 spezifischen Expressionsmuster führt (Ausubel et al., 1998). Da sich cis-regulatorische Sequenzen u. a. auch in sehr grosser Entfernung von der Startstelle der Transkription befinden können, ist es vorteilhaft, wenn man sehr grosse genomische Bereiche in die Analyse einschliesst. Zur Klonierung kann es vorteilhaft sein, Vektorsysteme mit sehr hoher Klonie rungskapazität, wie z. B. BACs oder YACs (Bacterial artificial chromosome, yeast artificial chromosome) zu benutzen. Dabei kann das Reportergen über homologe Rekombination in den Vektor inseriert werden und auf seine Expression hin untersucht werden (siehe z. B. Hiemisch et al., (1997), EMBO J. 16: 3995-4006). Mittels geeigneter Deletionen im Konstrukt und anschliessender Untersuchung der Auswirkungen auf die Expression des Reporter genes können wichtige regulatorische Elemente identifiziert werden (siehe z. B. Montoliu et al., (1996), EMBO J. 15: 6026-6034). Die regulatorischen Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere der Promotor, die Enhancer, locus control regions und silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon können für die gewebespezifische Expression von Sequenzen gemäß Anspruch 1 und weiteren Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Damit ergibt sich die Möglichkeit, neuronenspezifische Gen expression von Nukleinsäuren in vorteilhaften Konstrukten durch zuführen. Das Konstrukt mit den regulatorischen Sequenzen kann mit anderen cDNAs verknüpft werden, um Tiermodelle zu erstellen, in denen die jeweilige cDNA regionsspezifisch exprimiert wird (siehe beispielsweise Oberdick et al., (1990), Science, 248: 223-226). Dabei kann es sich beispielsweise auch um die Expression von Sequenz-spezifischen DNA-Rekombinasen wie CRE-Rekombinase, FLP-Rekombinase oder deren Derivate handeln.

Ausgehend von den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen können synthetische Peptide generiert werden, die als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden können. Es ist auch möglich, die gesamte Aminosäuresequenz oder Bruchstücke davon zur Generierung von Antikörpern einzusetzen. Unter Antikörpern sind beispielsweise polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper zu verstehen.

Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG-Subtypen IgG₁ oder IgG_2b. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörper fragmente mit einer oder zwei dem Antigen komplementären Bin dungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper ent sprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungs stelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrang fragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrang fragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc- Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nicht verkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden. Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in einer dem Fachmann bekannten Weise beispielsweise aus den Hybridomzellen isolieren (Ausubel et al., 1998). Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über bei spielsweise Zellaufschluss mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamyl alkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschliessend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch site directed mutagenesis, Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basen austausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganis men exprimiert werden. Bevorzugt werden bakteriellel pilzliche oder Hefe-Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae. Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine eignen sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika bei Krankheitsbildern, die u. a. durch Veränderungen von neuralen Zellen charakterisiert sind.

Weiterhin können die cDNA, die genomische DNA, die regula torischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinan ter oder nichtrekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Test systems verwendet werden. Dieses Testsystem ist geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Messmethoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm et al., (1996), "Wirkstoffdesign." Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebe nen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen oder biologischen Bibliotheken nach Substanzen, die agonistische oder antagonistische Wirkungen auf Proteine mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder den Proteinkomplex, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Protein sowie mindestens ein weiteres mit diesem Protein interagierendes Protein, haben.

Ein alternativer Weg zur Entwicklung von Wirkstoffen, die an L100 angreifen, besteht im rationalen Drug Design (Böhm et al., (1996), "Wirkstoffdesign." Spektrum-Verlag, Heidelberg). Hierbei wird die Struktur oder eine Teilstruktur des Proteins mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz, soweit sie vorliegt, oder ein von Computern erstelltes Strukturmodell, benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Strukturen zu finden, für die sich eine hohe Affinität an L100 vorhersagen lässt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und getestet. Hochaffine, selektive Substanzen werden auf ihre Verwendung als Medikamente gegen wie Epilepsien, Ischämie, Alzheimer und verwandte Dementia, Parkinson, Amyotrophe Lateral Sklerose, Huntington, Multiple Sklerose und andere neurodegenerative getestet werden.

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Erfassung der Prädisposition und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Des Weiteren kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure sequenz sowie ihrer genomischen DNA zu Aussagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen heran gezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA-Proben als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punktmutationen oder Deletionen/ Insertionen/Rearrangements.

Die vorliegende erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die Expressionskassette oder der Vektor sowie die funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate der Nukleinsäuren, das von ihr kodierte Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder das erfindungsgemäße Proteinheteromer (= Proteinkomplex) mit einem der in Beispiel 15 dargestellten Proteine sowie davon abgeleitete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) können zur Diagnose und Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden.

Weiterhin kann ein Monitoring der Behandlung von Erkrankungen durchgeführt werden. Dies betrifft z. B. die Verlaufsbeurteilung von Krankheiten, die Beurteilung von Therapieerfolgen und die Graduierung einer Krankheit.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfasst:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind oder Mi schungen davon,
b) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Standard bzw. Mengenstandard.

Ausserdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Protein heteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfasst:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen das Proteinheteromer oder gegen das erfindungsgemäße Protein gerichtet ist,
b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit der erfindungs gemäßen Aminosäuresequenz oder an einen Proteinkomplex, der mindestens ein erfindungsgemäßes Protein und mindestens ein weiteres Protein, das mit dem erfindungsgemäßen Protein interagiert, binden, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung eines Proteins mit der erfindungsgemäßen Amino säuresequenz oder eines erfindungsgemäßen Proteinkomplexes durch Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, einer Expressionskassette oder eines Vektors in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus,
b) Inkubation des erfindungsgemäßen Proteins oder des Protein komplexes mit der zu testenden Substanz oder den zu testenden Substanzen,
c) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz oder an den Proteinkomplex bzw. eines Effektes auf die Rezeptor funktion.

Ausserdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an das erfindungsgemäße Protein oder den Proteinkomplex binden und dadurch hemmende oder aktivierende funktionelle Effekte auf die L100-Signalweiterleitung in Neuronen hervorrufen.

In Situationen, in denen ein Mangel an der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins oder des Proteinkomplexes herrscht, können mehrere Methoden zur Substituierung eingesetzt werden. Zum einen kann das Protein, natürlich oder rekombinant direkt, oder durch geeignete Massnahmen in Form seiner kodierenden Nuklein säure (d. h. DNA oder RNA) appliziert werden. Dazu können sowohl virale, als auch nichtvirale Vehikel zum Einsatz kommen. Ein weiterer Weg bietet sich durch die Stimulation des endogenen, körpereigenen Gens durch geeignete Substanzen. Solche Substanzen lassen sich beispielsweise auffinden, indem man ihre Wirkung auf die Transkriptionselemente des L100-Genes ermittelt.

In Situationen, in denen ein Überschuss an Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins oder Proteinkomplexes herrscht, können spezifische, synthetische oder natürliche, kompetitive und nicht kompetitive Antagonisten gegen das Protein, Antikörper oder Anti körperfragmente gegen das Protein oder gegen das Proteinheteromer eingesetzt werden. Des Weiteren kann sowohl durch Antisense Mole küle oder Ribozyme oder Oligonukleotide als auch durch nieder molekulare Verbindungen eine Inhibition der L100-Aktivität bzw. der Aktivität des Proteins erreicht werden. Als Antisense Mole küle werden vorteilhaft kurze Nukleinsäurefragmente von 15 bis 100 Nukleotide, bevorzugt von 15 bis 40 Nukleotide, besonders bevorzugt von 15 bis 25 Nukleotide verwendet.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder daraus abgeleitete komplementäre Nukleinsäuresequenzen können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Genexpression von L100 positiv beeinflusst werden können, verwendet werden. Ebenso verwendet werden können erfindungsgemäße Proteine, Proteinfragmente oder Peptide oder Teile davon. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten oder Antikörpergemischen gegen das erfindungsgemäße Protein oder gegen das Protein heteromer zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von L100 Protein positiv beeinflusst werden können. Substanzen, die spezifisch an das erfindungsgemäße Protein bzw. die erfindungs gemäßen Proteine bzw. den Proteinkomplex binden, können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von L100 Protein positiv beeinflusst werden können, verwendet werden. Bei den genannten Krankheiten bzw. Erkrankheiten handelt es sich im weitesten Sinne um Krankheiten die mit Apoptose assoziiert sind und/oder um neurodegenerative Erkrankungen wie Epilepsie, Ischämie, Demenz, Parkinson, Huntington, Alzheimer oder ZNS Trauma. Bevorzugt handelt es sich um Krankheiten wie Epilepsie, Alzheimer, Ischämie, Schlaganfall oder ZNS Trauma.

Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen auch in Form therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert werden. Zur Isolierung des rekombinanten Proteins können vorteilhaft Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die einer einfach eren Reinigung dienen. Als solche Anker sind beispielsweise so genannte "Tags" in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger wie an einer polymeren Matrix, die beispiels weise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einen sonstigen Träger verwendet werden. Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können ausserdem übliche Marker wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reak tionsprodukt bilden, oder ein radioaktive Marker allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine ver wendet werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können auch als Marker für humane oder tierische Erbkrankheiten oder zur Gentherapie verwendet werden.

Die DNA bindende Eigenschaft von L100 als potentieller Transkriptionsfaktor kann in dem Fachmann bekannter Weise durch beispielsweise Bandshift-Assay [Synonyme: gelshift-, gel retardation-, electrophoretic mobility shift assay (= EMSA)] nachgewiesen werden.

Die Bindung des Proteins an die radioaktiv-markierte DNA führt zu einer Erhöhung des Molekulargewichts des Komplexes. Dies führt zu einer verlangsamten Laufgeschwindigkeit des Komplexes gegenüber der des einzelnen DNA-Moleküls (gel retardation) in einer Gel elektrophorese. Dies führt nach der Autoradiographie zu einem Verschieben der Bande (shift) hin zu höherem Molekulargewicht.

Als weiterer Nachweis kann der MCKay-Assay eingesetzt werden: Ein Antikörper, der die DNA Bindung des Proteins nicht beeinträch tigt, wird mit Zellkernextrakten und der radioaktiven DNA inku biert und dann immunpräzipitiert. Durch Phenolextraktion werden die Proteine entfernt und die verbleibende DNA elektrophoretisch ausgewertet. Die gemessene Radioaktivität ist ein Maß für die Affinität des Proteins zu der DNA. Affinitäten von Transkripti onsfaktoren zu ihrer Ziel-DNA betragen etwa 10⁸ bis 10¹⁴ M^-1. Wenn die Bindungsstelle für L100 auf der Ziel-DNA zu charakterisieren ist, werden DNA-footprinting Experimente durchgeführt. Das Prinzip der DNaseI-in-vitro-footprints besteht darin, dass DNA - an die ein Protein gebunden ist - vor dem Abbau durch DNaseI geschützt ist. Molekulare Analyse von Transkriptionsfaktoren ergab, daß diese aus einer Domäne bestehen, die für die sequenz spezifische Erkennung der DNA und Bindung an die DNA zuständig sind, und einer anderen Domäne, die das Zusammenspiel mit der basalen Transkriptionsmaschinerie bewirkt [Papavassiliou AG (1998), Mol. Med. Today 4: 358-365]. Wirksubstanzen können daher die Aktivität von Transkriptionsfaktoren unter anderem durch folgende Mechanismen modulieren:

Sie können deren Degradation oder die Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern verhindern; spezifisches Binden an den Transkriptionsfaktor könnte die Interaktion mit weiteren Faktoren im Zellkern verhindern; die Bindung an den Promotor von regulierten Zielgenen könnte verhindert werden [Papavassiliou AG (1997), Mol. Med. 3: 799-810, Papavassiliou AG (1998), Mol. Med. Today 4: 358-366, Papavassiliou AG (2000), J. Cancer Res. Clin. Oncol., 126: 117-118]. Die positive Modu lation von neurodegenerativen Prozessen könnte daher über die Regulation der transkriptionellen Aktivität erfolgen [Dai et al., (1999), Stroke 30: 2391-2398; discussion 2398-2399; Schatz et al., (1999), Exp. Brain Res. 127: 270-278; Skaper et al., (1998), Mol. Cell Neurosci. 12: 179-193; Lokensgard et al., (1998), Mol. Neurobiol. 18: 23-33; Grilli et al., (1996), Science 274: 1383-1385; 37; Lee et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 7207-7211].

Die Bestimmung von Menge, Aktivität und Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins oder seiner zugrundeliegenden mRNA im menschlichen Körper kann zur Diagnose, Prädisposition und zum Monitoring bei bestimmten Erkrankungen dienen. Desgleichen kann die Sequenz der cDNA sowie der genomischen Sequenz zu Aussagen über genetische Ursachen und Prädispositionen bestimmter Erkrankungen herangezogen werden. Dazu können sowohl DNA/RNA- Proben, sowie unnatürliche DNA/RNA-Proben, als auch Antikörper verschiedenster Art benutzt werden. Dabei dient die beschriebene Nukleotidsequenz oder Teile davon in Form geeigneter Proben zur Aufdeckung von Punktmutationen oder Deletionen/Insertionen.

Beschrieben werden in den folgenden Beispielen die humane Form von L100 [= SEQ ID NO: 1 (cDNA), SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz von humanem L100], die genomische Sequenz von L100 in der Maus, sowie die L100-Sequenz in der Maus und die korrespondierende Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4] und die L100 Homologen in Mensch und Ratte [SEQ ID NO: 6 = Homolog Human, SEQ ID NO: 7 Aminosäuresequenz Homolog Human, SEQ ID NO: 8 = Homolog Ratte, SEQ ID NO: 9 Aminosäuresequenz Homolog Ratte].

Beispiele

Soweit nicht anders angegeben wurde bei der experimentellen Durchführung entsprechend den Vorschriften in Ausubel et al., 1998 und Sambrook et al., 1989 verfahren.

Beispiel 1 Screeningverfahren zur Bestimmung der humanen L100 Sequenz SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 1 wurde durch wiederholtes Durchsuchen einer humanen Hippokampus Bank (oligodT und random geprimed) in Lambda ZAP (Stratagene) ermittelt. Als Sonde wurde eine cDNA (2.97 kb Länge) L100 aus Ratten (SEQ ID NO: 10) nach radioaktiver Markierung ver wendet (random primed labelling Kit von Roche Diagnostics). Die Hybridisierung erfolgte in 5 × SSC, 5% Denhardt's Lösung, 0,025% Natriumpyrophosphat, 0,1 mg/ml Hefe-tRNS und 50% Formamid-Lösung bei 40°C über Nacht. Gewaschen wurde mit 2 × SSC, 0.1% SDS-Lösung bei 60°C.

Beispiel 2 Screeningverfahren zur Bestimmung der genomischen Sequenz von L100 in der Maus

Das 2.97 kb Ratten-L100-Fragment (SEQ ID NO: 10) Fragment wurde radioaktiv markiert und zur Hybridisierung einer genomischen Cosmid-Bibliothek der Maus (129/Ola, RZPD, Berlin) eingesetzt. Von einem positiven Klon wurde Cosmid-DNA isoliert. Dieser Klon wurde als L100-positiv verifiziert mittels verschiedener Restriktionsverdaus und Hybridisierungen mit L100 Sonden (durch Vergleiche der erhaltenen Bandenmuster mit denen von genomischer DNA von Mäusen). Aus dem Cosmid wurden verschiedene Fragmente in einen Plasmidvektor subkloniert und mittels eines Transposon- Insertionsverfahrens (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA; USA) sequenziert, und die Sequenzen mit dem Programn SeqMan (Lasergene, Madison, WI, USA) assembliert.

Die genomische Sequenz von L100 der Maus ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt. Die aufgrund der Homologie zur Ratte erstellte cDNA von L100 der Maus ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Aus dem Ver gleich der genomischen Sequenz der Maus und der cDNA-Sequenz der Ratte geht hervor, dass der kodierende Bereich für das L100 Protein in der Maus durch Introns unterbrochen ist. Die genaue Exon/Intron Struktur ist in Fig. 16 dargestellt.

Beispiel 3 Screeningverfahren zur Bestimmung der Sequenz des Homologs von L100 im Menschen

Mit SEQ ID NO: 1 wurden mittels BLAST [BALSTN 2.0.11, Altschul et al., (1997), Nucleic. Acid Research., 25: 3389-3402] ver wandte ESTs in Ratte und Mensch ermittelt. Aus den ESTs AI205148 und AA305194 wurden Primer abgeleitet, Sonden aus Hippokampus cDNA (Mensch) amplifiziert, radioaktiv markiert und die in Bei spiel 1 verwendete humane Hippokampus Bank (oligodT und random geprimed, Stratagene) unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen durchsucht. Ein positiver Lambda Klon enthielt das offene Leseraster für SEQ ID NO: 6.

Beispiel 4 Screeningverfahren zur Bestimmung der Sequenz des Homologs von L100 in der Ratte

Durch wiederholtes Durchsuchen einer Ratten-Hippocampus Bank (oligo(dT) geprimed, in UniZAP, Stratagene), (Yamagata et al., 1993, Neuron 11: 371-386), die aus Ratten nach wiederholtem Elektroschock in der Gegenwart von Cycloheximid (20 mg/kg i. p.) hergestellt wurde, wurde mit SEQ ID NO: 6 als radioaktiv markierte Sonde, unter den Bedingungen wie in Beispiel 1 geschildert, die vollständige Sequenz SEQ ID NO: 8 ermittelt.

Beispiel 5 In situ Hybridisierungen von rat L100

Das offene Leserraster von Ratten L100 (SEQ ID NO: 10) und 300 Basenpaare aus dem 3' untranslatierten Bereich wurden in den Vektor pBS kloniert und das Plasmid im multicloning-site Bereich linearisiert. Von diesem Template wurden L100-spezifische sense und antisense cRNA Proben mit Hilfe von T3 RNA Polymerase und T7 RNA Polymerase, Digoxigenin-markierten UTP und Standard NTPs hergestellt. Eingefrorene Rattengehirne und -embryos wurden bei -20°C in 15 µm dicke Scheibchen im Cryostat (Leica GmbH) geschnitten, mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, in 0.2% Triton-X 100 permeabilisiert und mit antisense und sense L100 cRNA Proben bei 65°C über Nacht in 50% Formamid, 5 × SSC hybridisiert. Diese Schnitte wurden mit 0.2 × SSC bei verschiedenen Temperaturen gewaschen und das Dioxigeninlabel mit einem spezifischen Antikörper detektiert (Kuner et al., (1999), Science, 283, 74-77). Die sense Proben ergaben keine Signale, so dass bei den antisense Signalen von spezifischen L100 Signalen ausgegangen werden kann. Die Ratten-L100 mRNA ist ubiquitär und schwach im Rattenembryo exprimiert und stark in Leber, Lunge, Gehirn, Retina und in perpipheren Neuronen exprimiert (Fig. 3).

Die mRNA von Ratten L100 ist während der postnatalen Entwicklung des Gehirns stark exprimiert im Hippocampus, Kleinhirn, Bulbus olfactorius, Striatum, Cortex und der Amygdala (Tag 4 und 7). Im adulten Tier wird die Expression von L100 herunterreguliert, wenn die Entwicklung des Gehirns abgeschlossen ist.

L100 mRNA wird in sehr geringen Mengen in adulten Neuronen des Gehirns exprimiert und kann in Astrozyten nicht detektiert werden.

Beispiel 6 Expressionsanalyse von humanem L100

Das Fragment aus SEQ ID NO: 1 wurde mit dem random primed labelling Kit (Boehringer Mannheim) mit a-³²P-dCTP radioaktiv markiert. Mit der denaturierten radioaktiven Sonde wurde ein Northern Blot (je 10 µg Total-RNS von Mensch: Gehirn, Herz, Skelettmuskel, Dickdarm, Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und peripheren Blutleukozyten) in QuickHyb- Lösung (Stratagene) für eine Stunde bei 68°C hybridisiert und anschließend bei 60°C mit 0.1 × SSC-Lösung gewaschen. Nach einem Tag Auflegen eines Screens wurde im Phosphoimager FLA2000 von Fuji eine 3 kb Bande detektiert, die auf eine schwache konstitutive Expression von L100 im adulten Menschen in Herz, Skelettmuskel, Plazenta, Lunge und Leukozyten hinweist (ohne Abbildung).

Expressionsanalyse von L100 unter Stress Beispiel 7 Expression von L100 im Rattengehirn nach Krampf anfällen

Kainat-Injektionen stellen ein anerkanntes Tiermodell für frontal lobe Epilepsie dar. 1.5 Stunden nach intraperitonialer Injektion von Kainat (10 mg/kg in PBS i.p.) wurde L100 massiv im Kleinhirn, Hippocampus, Cortex und Thalamus hochreguliert. Eine maximale Hochregulation in Kleinhirnkörnerzellen und einigen Neuronen des entorhinalen, frontalen und orbitalen Cortex und Hippocampus konnte bis zu 6 Stunden nach Kainat-Injektion beobachtet werden (Fig. 4). Normalwerte wurden wieder 24 Stunden nach Injektion erreicht (Fig. 4). L100 Induktion konnte auch nach Pentylen tetrazolgaben (= PTZ, 50 mg/kg in PBS i.p.) beobachtet werden, durch die das inhibitorische wirkende GABAerge Neurotransmission gehemmt wird. Dadurch kommt es zu epileptischen Anfällen beim Tier. 20 Minuten nach PTZ-Gabe war die Expression von L100 in Kleinhirnneuronen erhöht, ebenso in Thalamus, Mittelhirnzell kernen sowie in parietalem und temporalem Cortex.

Zink-Neurotoxizität

Eine pathogene Rolle von Zink wird während selektivem Zelltod nach transienter, globaler Ischämie in der Fachliteratur diskutiert. Zink wird in glutamatergen, synaptischen Vesikeln im Gehirn gespeichert, während der synaptischen Aktivierung frei gesetzt und von postsynaptischen Neuronen im Cortex und Hippo campus aufgenommen. Eine Akkumulation von Zink nach Kainat- Injektionen in einigen neuronalen Populationen der äußeren Schicht des hippocampalen Gyrus dentatus, des entorhinalen Cortex und des Kleinhirns, sowie in einigen hippocampalen Pyrimidal zellen konnte gezeigt werden. Diese Zellpopulationen exprimieren gleichzeitig L100 mRNA (Fig. 8). Die schnelle Hochregulation von L100 in übererregten Neuronen, die während der Krampfphasen Zink akkumulieren, läßt auf eine entscheidende Rolle von L100 in exzitatorischen Signalkaskaden, die zu Zelltod führen, oder diesen zu verhindern suchen, schließen. Daher wurde getestet, ob L100 Zink binden kann, da metallbindende Motife wie die cystein reiche Domäne in L100 vorhanden sind.

Beispiel 8 L100 Hochregulation im Kindling Modell

Ein anerkanntes Tiermodell für die Epileptogenese ist das sogenannte Kindling Modell.

Nachdem festgestellt worden war, dass L100 mRNA im Hippocampus nach systemischer Verabreichung von akuten konvulsiven Dosen von Kainat induziert werden kann, sollte untersucht werden, wie sich die L100 mRNA Expression in einem Modell der Epileptogenese ver hält. Dazu wurde das sogenannte elektrische Kindling-Modell in der Ratte untersucht. Männlichen Sprague-Dawley Ratten (3 Monate alt) wurde in einer stereotaktischen Operation eine bipolare Elektrode in die rechte basolaterale Amygdala implantiert. Beginnend 2 Wochen nach der Operation wurden die Ratten einmal täglich über die Elektrode elektrisch stimuliert. Dabei handelte es sich um einen Impuls fixer Intensität (500 µA, 1 msec lange Rechteckimpulse von 50 Hz für 1 sec Dauer). Infolge der täglichen Wiederholung der Stimulation kam es zu dem sogenannten Kindling- Effekt, d. h. der gleichbleibend starke Stimulus rief Kramp fanfälle hervor, die in Dauer und Schweregrad mit fortlaufender Stimulation zunahmen. Dabei handelte es sich bei dem angewendeten Schema um progressiv entwickelnde fokale Krämpfe, die dann sekun där generalisieren. Die Bestimmung der Krampfschwellen erfolgte nach [Racine, R. J., (1972), Electroencephalogr. Clin. Neuro physiol., 32, 281-294]. Die Stimulation wurde durchgeführt bis zum Erreichen von Krampfstadium 2 (SS2; Facialklonus und/oder unwillentliches Nicken des Kopfes) bzw. bis zu 3 wiederholten Krämpfen des Stadium 5 (SS5; Aufrichten mit Verlust der Stell reflexe; generalisierte klonische Krämpfe). 2 Stunden nach der letzten Stimulation wurden die Tiere schmerzfrei durch Dekapita tion getötet und Gesamt-RNA vom ipsilateralen Hippocampus nach [Chomczynski et al., (1987), Anal. Biochem. 162, 156-159] ge wonnen. Als Kontrolle dienten Tiere, denen Elektroden implantiert worden waren, die aber nicht stimuliert wurden (sham). Das Kindling-Modell wurde in Kooperation mit der Gruppe von Prof. W. Löscher (Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt.

Pro experimenteller Gruppe wurde die RNA von 4 Tieren gepoolt. Es wurden 3 RNA-Pools für die weitere Untersuchung herangezogen. Fünf Mikrogramm Hippocampus Gesamt-RNA wurden in einer reversen Transkription mit einem T₁₈(G/A/C)N-Primer unter Verwendung von Superscript II (Life Technologies) nach Protokollen des Her stellers in Erststrang-cDNA umgeschrieben. Zur Messung der relativen Menge an L100 mRNA in den cDNAs wurden quantitative PCR-Reaktionen mit einem LightCycler (Roche) durchgeführt. Es handelt sich hierbei um ein PCR-Verfahren in Kapillaren, bei dem durch die online Detektion des interkalierten SYBR Green Fluoreszenzfarbstoffes die Amplifikation der DNS gemessen werden kann und quantitative Aussagen über die Anzahl der template Mole küle gemacht werden können. Die amplifizierten Produkte wurden mit SYBR Green (Molecular Probes) detektiert. Die PCR-Reaktionen wurden durchgeführt nach den Hinweisen in den Protokollen des Herstellers des DNA Master SYBR Green (Roche). Für die Ampli fikation von L100 wurden 60 Zyklen mit 65°C Annealing-Temperatur und einer Endkonzentration von 5 mM MgCl₂ unter Benutzung der folgenden Primer durchgeführt:

Primer 1: 5'-GACCATCGGTGATCAAAACTC-3'
Primer 2: 5'-ACATCAGCTAATGAAGGGCATA-3'

Zur Normalisierung wurde eine weitere PCR mit Primern für das ribosomale Protein S26, ein in seiner Expression nicht ver ändertes Gen, durchgeführt. Für die Amplifikation von S26 wurden 60 Zyklen mit 65°C Annealing-Temperatur und einer Endkonzentration von 5 mM MgCl₂ unter Benutzung der folgenden Primer durchgeführt:

Primer 1: 5'-AAGTTTGTCATTCGGAACATTGT-3'
Primer 2: 5'-CACCTCTTTACATGGGCTTTG-3'

In der quantitativen PCR wurden zwei Verdünnungen jedes cDNA Pools verglichen mit einer seriellen Verdünnung eines Standards, und so die relative Menge an L100- bzw. S26-cDNA in jedem Pool bestimmt. Es wurde sichergestellt, dass sich alle gemessenen Werte innerhalb des Konzentrationsbereiches der Standards befanden.

Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Dargestellt sind die Mit telwerte aller 3 Pools pro Gruppe mit ihrer Standardabweichung (als Verhältnis von L100 Konzentration zu S26 Konzentration). Es ist deutlich zu erkennen, daß die L100 mRNA Menge im ipsi- lateralen Hippocampus mit fortschreitender Dauer und Schwere der Anfälle korreliert. Dabei ist die Erhöhung 2 Stunden nach An fällen des Stadiums 5 gegenüber der nicht-stimulierten Kontrolle statistisch signifikant (n = 3; p < 0.05).

Beispiel 9 Hochregulation von L100 nach Glutamat-Applikation

Falls L100 ein Marker für überstimulierte Neurone ist, was von den Kainat-Injektionen und dem erhöhten Expressionslevel von L100 im Kindling Modell abgeleitet werden kann, würde man auch eine Hochregulation von L100 nach Glutamatrezeptoraktivierung erwar ten.

Daher wurden quantitative RT-PCR Studien mit differenzierten, corticalen Neuronen nach 14 Tagen in vitro Kultivierung durchge führt. Glutamat wurde in einer Konzentration von 100 µM in HSS für 5 Minuten auf die Neurone gegeben, wodurch ein exzitatorischer Zelltod nach 18-24 Stunden ausgelöst wird. Kontrollkulturen wurden mit HSS alleine behandelt. Alle Kulturen wurden danach gewaschen und das konditionierte Medium wurde gewechselt. Die RNA aus den Neuronen wurde 6 Stunden nach Glutamatgabe mit Hilfe von RNeasy Säulchen von Quiagen isoliert. Für die cDNA Synthese wurde 1 µg total RNA eingesetzt und diese mit reverser Transcriptase von Gibco BRL (Superscript II) und permutierten Hexameren als Primer umgeschrieben. Diese einzelsträngige cDNA wurde im Light- Cycler™, Roche Molecular Biochemicals als Template für die PCR benutzt. Als negative Kontrolle wurde der Ansatz ohne die reverse Transcriptase eingesetzt. Die gemessenen Werte für L100 wurden auf die Menge von Cyclophilin, einem Gen, dessen Expression durch Glutamatgabe nicht verändert wird, normalisiert. Für die L100-PCR wurde die optimale MgCl₂ Konzentration ermittelt und die cDNA 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4 und 1 : 8 verdünnt in H₂O eingesetzt. Die Primer L100sense GAA GAG GAA GTT TGA CCA GCT GGA und L100antisense AGT CCT CCT CTA CAG AAG CGT CAT sind im 5'-Bereich von L100 lokalisiert. Sie sind auf verschiedenen Exons in der genomischen DNA lokalisiert und durch durch ein 2.6 kb Intron getrennt ist. So kann durch die Wahl der Primer verhindert werden, daß genomische DNS Verunreinigungen der RNA-Präparation falsch positive Signale erzeugen. Bezogen auf Cyclophilin wurde L100 um den Faktor 1.8026+/-0.555 (N = 5) hochreguliert. Diese Resultate zeigen, daß L100 nach Stress und wahrscheinlich nach Glutamatrezeptor-Akti vierung in Neuronen noch vor dem Glutamat-induzierten Zelltod hochreguliert wird. Von den Immediate Early Genen Fos und Jun ist bereits bekannt, daß sie wichtige downstream Mediatoren von Langzeitwirkungen nach Glutamataktivierung sind. Daher vermag eventuell auch L100 eine wichtige Rolle bei pathophysiologischen Kaskaden der glutamatargen Aktivierung spielen.

Beispiel 10 Expressionsanalyse des L100 Homologs in der Ratte

Die in Beispiel 6 gewählten Bedingungen wurden ebenfalls für folgende Versuche angewandt. SEQ ID NO: 8 als Sonde wurde mit einem Northern Blot (je 10 µg Total-RNS aus dem Hippocampus mehr fach Elektroschocks ausgesetzten Ratten oder Kontrolltieren ohne Elektroschockbehandlung) für eine Stunde bei 68°C hybridisiert und bei 60°C mit 0.1 × SSC-Lösung gewaschen. Nach 24 Stunden Auflegen des Screens konnte durch den Phosphoimager FLA2000 von Fuji im Hippokampus eine um den Faktor 4 erhöhte Menge an mRNA nachge wiesen werden, nachdem die Tiere 4 Stunden nach dem letzten Elektroschock getötet wurden (Fig. 6). Auf einem Blot mit 10 µg Total-RNS von Rattengehirn, -leber, -herz, -niere, -hoden wurde eine gehirnspezifische Expression von SEQ ID NO: 8 nachgewiesen.

In situ Hybridisierungen von SEQ ID NO: 8 in Rattengeweben

Die mRNA für SEQ ID NO: 8 wurde mit Hilfe der oben beschriebenen in situ Hybridisierung im adulten Ratten-Gehirn nachgewiesen und ist gleichmäßig im Gehirn Verteilt, wobei im Kleinhirn, Cortex und Hippokampus stärkere Signale für die SEQ ID NO: 8 mRNA vor handen sind. Im Hippokampus und Gyrus dentatus wird SEQ ID NO: 8 besonders in CA3 und CA4 Regionen, nicht in der CA1 Sektion exprimiert. Nach 4 × MECS Behandlung ist eine moderate Hoch regulation von SEQ ID NO: 8 im Kleinhirn und Cortex zu erkennen (Fig. 7). Ein starkes Signal wurde nun im CA1 Sektor des Hippo kampus beobachtet. Keine Veränderung der Genexpression erfolgte in Ratten nach Kainat oder PTZ Behandlung.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß L100 und L100 Homologe nicht unbedingt essentiell für das Funktionieren des adulten Rattengehirns im normalen, physiologischen Zustand zu sein scheinen, aber eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Gehirns spielen und unter pathologischen Zuständen, die mit einer massiven, neuronalen Übererregung des Gehirns einhergehen, eine essentielle Bedeutung haben.

Beispiel 11 Metall bindende Eigenschaft von L100

Produktion und Isolation von N-terminalem GST-L100 Fusionsprotein wurde durch Klonierung des offenen Leserasters der SEQ ID NO: 10 ohne das erste Methionin von L100 in den pGEX-6P Vektor von erzielt. Das rekombinante Protein wurde in Protease-freien Bakterien (SG200.43 + pDMI.1) durch Zugabe von 200 µM IPTG für 3 Stunden induziert, das Bakterienpellet durch Zentrifugation bei 3000 xg für 20 min gewonnen und anschließend in PBS und 0.5% EDTA unter Zusatz eines Proteinaseinhibitor-Coktails von Roche Diagno stics sonifiziert und anschließend wieder bei 6000 xg für 10 min pelletiert. Der Überstand wurde erneut mit 10000 xg zentrifugiert und die L100-GST bzw. GST Proteinextrakte wurden über die Gluta thion-Sepharose Säule von Pharmacia Biotech affinitätsgereinigt. Die Elution erfolgte mit 10 mM Glutathion in 50 mM Tris-HCl unter Metall-freien Bedingungen. Der Proteingehalt wurde mit dem BCA Assay bestimmt und der Reinheitsgrad über Coomassie gefärbte Polyacrylamidgele bestimmt. Der Zinkgehalt von rekombinaten L100-GST oder GST wurde mit N-(6-Methaxy-8-Quinolyl)-p-Toluen Sulfonamid (TSQ, Molecular Probes) bestimmt. TSQ fluoresziert nur, wenn Zink komplexgebunden vorliegt und kann daher zum quantitaiven Nachweis von Zink verwendet werden. Gleiche Konzentrationen von L100-GST oder GST wurden auf Glas-Slides gedottet und mit 0.05% Lösung von TSQ (Molecular Probes) in Aceton behandelt, luftgetrocknet und unter dem Fluoreszenz mikroskop bei einer Anregung von 330 nm und einer Extinktion von 385 nm analysiert. TSQ alleine ergab kein fluoreszierendes Signal, GST Protein ein schwaches Signal und GST-L100 ein signifikant stärkeres Signal. Bei den schwachen Signalen von GST könnte es sich um Verunreinigungen mit metallbindenden Proteinen aus E. coli handeln, wobei das starke Signal von GST-L100 zeigt, daß L100 in E.coli als Zink-komplexierendes Protein gebildet wird (Fig. 9).

Beispiel 12 Subzelluläre Lokalisation von L100 in Säugetier zellen

Um eine immunzytochemische Detektion von L100 zu gewährleisten wurden das erste Methionin des offenen Ratten L100 Leserasters durch spezifische, stark antigene Tags ersetzt, nämlich:

Myc-(Met-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) oder Flag-(Met- Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-lys) Tag.

Heterologe Expressionsstudien von L100 Konstrukten mit einem aminoterminalen Flag oder Myc-Tag in Säugetierzellen wurden für subzelluläre Lokalisationsstudien eingesetzt. HEK293 Zellen wurden in Standard MEM Medium (Gibco BRL), 10% fötalem Kälber serum (Sigma Immunochemicals) auf 37°C, 5% CO₂ und 95%iger Luft feuchte inkubiert und gemäß der Kalziumphosphat-Methode mit L100 Plasmiden transfiziert. Zu verschiedenen Zeitintervallen nach Transfektion von HEK Zellen mit L100 Flag oder leerem Vektor als Kontrolle wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 2% Paraform aldehyd (Sigma Chemicals) und 0.2% Glutaraldehyd (Sigma Chemi cals) für 10 min fixiert, 5 min mit 0.2% Triton-X-100 (Sigma Chemicals) permeabilisiert und anschließend mit 4% natürlichem Ziegenserum, (NGS, Jackson Immunoresearch labs Inc.) 30 min ge blockt. Nach 2-3 stündiger Inkubation mit primären anti-Flag M2 Antikörper (Eastman Kodak Company) in 2% NGS auf Raumtemperatur wurden die Zellen mit 1% NGS in PBS dreimal je 10 min gewaschen, mit fluoreszenzmarkiertem Zweitantikörper (FITC-konjugierter anti-Maus Antikörper, 7.5 µg/ml in 2% NGS) 30 min inkubiert, zweimal je 10 min mit PBS und einmal mit 10 mM Tris-HCl, pH 7.6 gewaschen und die Coverslips anschließend mit wässrigem Mounting Medium (Sigma Chemicals) versiegelt. Die Präparate wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiophot) mit Standardfilterset untersucht. Hoechst 33342 (Molecular Probes) wurde als Farbstoff eingesetzt, um die Zellkerne anzufärben. Immunozytochemische Experimente in HEK293 Zellen ergaben eine Expression des markier ten Proteins im Zellkern, 6 bis 12 Stunden nach Transfektion. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Anwesenheit des Kern lokalisationssignals in der L100-Sequenz (Fig. 10). Der carboxy terminale Teil von L100 trägt eine hohe negative Ladung, welche als ein Kennzeichen für transcriptionelle Aktivatoren angesehen wird. Die Kernlokalisationssequenz und die negative geladenen Reste im C-Terminus sind evolutiv konserviert und lassen eine Funktion von L100 als Transkriptionsfaktor vermuten.

Zu späteren Zeitpunkten akkumulierte das L100-Protein im Cyto plasma der transfizierten HEK293 Zellen und war offenkundig in den Zellausstülpungen des Zellsomas zu erkennen, die im Aussehen apoptotischen Körperchen glichen. Zeitgleich konnte eine Konden sation des Chromatingerüstes in den L100 transfizierten Zellen beobachtet werden, die anschließend starben. Für den proapoptoti schen Phänotyp war es nicht von Bedeutung, ob L100 mit einem Tag versehen war oder nicht. Als negative Kontrolle wurden Zellen mit dem leeren Vektor oder Kontrollproteinen (GBR2-Flag, Kuner et al., (1999), Science, 283, 74-77) transfiziert (Fig. 11).

Um direkte Informationen über die subzelluläre Lokalisation und Funktion von L100 im Gehirn zu erhalten, wurden primäre Neuronen mit der markierten L100-Sequenz transfiziert. Diese Neuronen wurden aus Rattenhippocampi Embryonaltag 18-19 gewonnen, dissoziiert und auf Poly-L-lysine (Sigma Chemicals, 0.1%) und Laminin (Sigma chemicals, 1-2 µg/cm²) beschichteten Platten in einem Medium, das 1% Pferdeserum, 3% Glukose, Standardzusätze und Hormone enthält, bei 37°C, 5% CO₂ und 95% relativer Luftfeuchte kultiviert. Nach einem Tag in vitro entwickeln die Neurone Fort sätze und 8 bis 9 Tage später entwickeln sie Spines, die Synapsen enthalten. Für die Expressionsstudien wurden die Neurone 4 Tage in vitro kultiviert und danach mit Myc-L100-DNA oder Kontroll- DNA, welche mit dem lipophilen Agenz Effektine (Qiagen GmbH) komplexiert war, transfiziert. Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Myc-Epitop (Invitrogen, 4 µg/ml und einem anti-Maus FITC konjugierten Zweitantikörper (Jackson Immunoresearch Labs, 7.5 µg/ml) gefärbt, wie oben beschrieben wurde. 15 Stunden nach Transfektion wurde myc-L100 größtenteils im Zellkern und teil weise im Zytoplasma der Neurone lokalisiert (Fig. 12). Nach 18 Stunden wurde L100 hauptsächlich im Zytoplasma und den Neuriten detektiert. Die Kolokalisation mit dem synaptischen Marker Synaptotagmin (Fig. 13), (mit Kaninchen polyclonalem anti-Synaptotagmin Antikörper, Chemicon GmbH und TRITC-konjugier tem anti-Kaninchen-Antiserum, 7.5 µg/ml spezifisch gefärbt) wurde so nachgewiesen. Expression von L100 in den Neuriten und den Dendritic Spines könnte bedeuten, daß L100 eine wichtige Rolle in postsynaptischen Signalkaskaden innehat. Da L100 eine Kern lokalisationssequenz enthält, könnte L100 als ein Botenstoff von der Synapse zum Zellkern oder umgekehrt fungieren.

Beispiel 13 Charakterisierung von L100-produziertem Zelltod

Zur weiteren Charakterisierung des L100 induzierten Zelltodes, wurden HEK293 Zellen mit L100 oder Kontrollplasmid transfiziert und mit Flous-konjugiertem Annexin (Boehringer Mannheim), einem Farbstoff, der Phosphatidylserine färbt, die Bestandteil der Zellwand sind, gegengefärbt. Apoptotische Zellen exponieren im Gegensatz zu gesunden Zellen die Phosphatidylserine und werden mit Flous-Annexin gefärbt. Um Falsch-Positive ausschließen zu können, hervorgerufen durch einfache Zellwandzerstörung in nekrotischen Zellen, wurden die apoptotischen Zellen mit Propidiumiodid (Boehringer Mannheim) gegengefärbt. L100 Zellen waren meist Propidiumiodid negativ und zeigten eine stärkere Färbung mit Flous-Annexin (Fig. 14). Die negativen Kontrollen belegen nochmals eine Induktion von Apoptose durch heterologe Überexpression von L100 in Zellen.

Effekte von L100 Überproduktion in transfizierten, primären hippokampalen Neuronen:

Zellkernfärbungen wurden mit Höchstfarbstoff (33342, Molecular Probes) durchgeführt und zeigten 18 Stunden nach L100 Transfek tion eine Kondensation der DNA, ein Zeichen für Zelldegeneration (Fig. 15). Im Vergleich zum Kontrollvektor wurde durch L100 Zelltod ausgelöst, der durch die sog. TUNEL Färbung nachgewiesen wurde. Die Methode weist die freien 3'-OH Gruppen nach Frag mentierung der DNA nach. Die Neurone wurden mit dem L100-Myc-Tag Expressionsplasmid oder dem EYFP-Expressionsvektor von Clontech wie oben beschrieben transfiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und präinkubiert mit TUNEL Verdünnungspuffer (Roche Diagnostics, in 30 mM Tris-HCl, 140 mM Sodium cocodylate und 1 mM Cobalt chlorid) und weiter inkubiert mit Terminaler Desoxynucleotidyl Transferase (Roche Diagnostics) mit biotinylierten dNTPs im TUNEL Ver dünnungspuffer gemäß den Angaben des Herstellers für 60 min bei 37°C.

Die Zellen wurden dreimal mit PBS 5 min lang gewaschen, mit 10% NGS 15 min lang geblockt, mit TRITC-Streptavidin (Jackson Immunoresearch Labs) 25 min inkubiert, gegengefärbt mit Hoechst 33342, gewaschen 2 × 5 min mit PBS und versiegelt in wäßrigem Mounting Medium. Die Analyse unter dem Fluoreszenzmikroskop ergab blau gefärbte Zellkerne und die identifizierten L100-Myc-Tag oder EYFP transfizierten Neurone wurden in Hinsicht auf TUNEL-Färbung (rote Fluoreszenz) geprüft.

Ein progressiver Anstieg der TUNEL positiven Zellen konnte bei den L100 transfizierten Neuronen nachgewiesen werden (Fig. 17). Die Zahl der TUNEL positiven Zellkerne war bei L100 transfizier ten Neuronen höher als bei mit EYFP transfizierten Neuronen. Dies zeigt, daß die Überexpression von L100 den Zelltod 24 Stunden nach Transfektion von Neuronen induziert, nicht jedoch die Über expression eines Kontrollproteins.

Beispiel 14 Herstellung von L100-transgenen Tieren

Durch die zielgerichtete Mutation des L100 Genes in der Keimbahn der Maus und die Analyse des resultierenden Phänotypes kann man wichtige weitere Informationen über die (patho)-physiologischen Mechanismen gewinnen, in denen das L100-Gen beteiligt ist. Zur Herstellung einer sogenannten Knock Out Maus, d. h. einer Maus ohne funktionelles L100-Protein, wurde zunächst ein sogenannter Targeting-Konstrukt hergestellt. Dabei wurden zwei den kodieren den Bereich von L100 flankierende genomische Fragmente (ent sprechend Positionen 2866 bis 4083 und 9813 bis 13500 in der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO: 5) als Homologiearme für die homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (ES) in den Vektor pHM2 (Kaestner et al., (1994), Gene, 148, 67-70) kloniert. Dieser Vektor trägt eine Neomycin-Resistenzkassette und erlaubt das Einsetzen eines Reportergenes in das zu mutierende Allel. Dafür wurde das lacZ-Reportergen des Vektors mit dem 5'-untranslatierten Bereich von L100 fusioniert und war somit un ter der Kontrolle des endogenen L100-Promoters. Die lacZ Cassette ersetzt nun vollständig das offene Lesraster von L100 (Fig. 16). Nach Linearisierung des Targeting-Konstruktes soll die DNA in embryonale Stammzellen elektroporiert werden und G418-resistente Klone selektioniert werden. Von diesen Klonen soll genomische DNA isoliert werden und mittels sogenannter Nested PCR auf homologe Rekombination zwischen Targeting-Konstrukt und endogenem L100 Allel untersucht werden. Fig. 16 zeigt die genomische Struktur von L100 und die gewählten Homologiearme für die homologe Rekombination, sowie die Primer für den PCR Nachweis der Rekombination. Kontrollkonstrukte mit Primer 1 (2728-2749) und as (4064-4083), sowie Primer 2 (2767-2786) und as (4064-4083), wurden in pHM2 einkloniert, so daß die PCR mit Primer 1 oder 2 und antisense Primern aus dem lacZ Bereich getestet werden kann. Mit einer solchen PCR läßt sich mit genomischer DNA als template feststellen, ob die Rekombination in den ES-Zellen stattgefunden hat. Als Positiv-Kontrolle kann man in genomische DNA diese Plasmide einspiken und so die Sensitivität des PCR Verfahrens ermitteln.

Beispiel 15 Protein-Protein-Interaktionen von L100 Aminosäurestruktur von L100

L100 kodiert für ein Protein von 581 Aminosäuren. Das L100- Protein besitzt eine Cystein-reiche-Domäne (235-273), die 33% Identität zu Metallothioneinen aufweist, eine potentielle coiled- coil-Domäne (119-155), sowie eine Serin-reiche (18-42) und eine Glutamat-reiche (402-407) Region. Außerdem ist ein potentielles Kernlokalisationssignal (200-207) nachweisbar, das für den Transport von L100 in den Kern verantwortlich sein könnte (SEQ ID NO: 10) (Fig. 1).

Two-hybrid Suche mit dem Carboxy- und Amino-Termini von L100

Die für den Carboxyterminus des L100-Gens kodierende cDNA (SEQ ID NO: 11, Aminosäuren 407-581) wurde mit den spezifischen L100 Primern L100-5'-Y2H-407 (ACAGCGACGTCGACG-GAGGGAGTGTG GGCAACTT) und L100-3'Y2H-581 (ATAGTTTAGCGGCCGCTT-ACACAGGCA CAGGGTC) von der L100 rat cDNA in einer PCR (Polymerase-Ketten- Reaktion) amplifiziert, mit den Enzymen NotI und SalT einer Restriktion unterzogen und danach in den NotI/SalI vor geschnittenen Vektor pDBleu (Firma Gibco) kloniert. Das hieraus entstandene Konstrukt (L100-407-581) kodiert für ein Protein, in dem die Gal4-Bindungsdomäne mit dem C-Terminus des L100-Gens fusioniert ist.

Die für den Amino-Terminus des L100-Gens kodierende cDNA (SEQ ID NO: 11, Aminosäuren 2-315) wurde mit den spezifischen L100-Primern L100-5'-2-Y2H (CAAACGCGTCGACCGCTGGGATAC-AGAAGAAG) und L100-3'-315-Y2H (ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTCCTCCATGGG-GGACTC) von der L100 rat cDNA in einer PCR amplifiziert, und ebenfalls nach Restriktionsverdau mit den Enzymen NotI und SalI in den Vektor pDBleu (Firma Gibco) kloniert. Bei diesem Konstrukt (L100-2-315) wurde die Gal4-Bindungsdomäne mit dem N-Terminus von L100 fusioniert. Die Konstrukte L100-407-581 und L100-2-315 wurden in den Hefestamm Y190 transformiert.

Die hieraus resultierenden Hefestämme wurden auf Selbst aktivierung getestet und die Konzentration von 3-Aminotriazole (3AT), die für die basale HIS3-Expression erforderlich ist, bestimmt. HIS3 kodiert für die Imidazole Glycerol Phosphate Dehydratase, ein Enzym der Histidin-Biosynthese. Durch Bestimmung des Schwellenwertes für die 3-AT-Resistenz können schwache Protein-Protein-Interaktionen festgestellt werden.

Die Hefestämme wurden mit einer Ratten-Hippocampus cDNA Bank MECS induzierter Ratten transformiert, die in den Vektor pPC86 (Firma Gibco) kloniert ist. Es wurden 4.10⁶ Transformanden auf Trypto phan/Leucin/Histidin-Man 10593 00070 552 001000280000000200012000285911048200040 0002010019901 00004 10474gelmedium mit entsprechender 3-AT-Konzen tration (20 mM 3-AT) plattiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen Wachstum bei 30°C wurden Kolonien vereinzelt und einer XGAL-Färbung unterzogen. Insgesamt 19 Kolonien erwiesen sich für den L100-N-Terminus und 6 Kolonien für den L100-COOH-Terminus als His3 und lacZ positiv. Aus den positiven Hefekolonien wurde die pPC86-Plasmid-DNA auf gereinigt und zur Amplifikation in den E. Coli Stamm Xl1blue transformiert. Die erhaltene pPC86-DNA der positiven Kolonien wurde mit verschiedenen pDBleu-Konstrukten in den Hefestamm Y190 kotransformiert.

Nur in Kombination mit dem Konstrukt L100-2-315 konnte eine Akti vierung der Reportergene His3 und lacZ bei 3 der 19 Kolonien für den N-Terminus festgestellt werden. Für den C-Terminus zeigte 1 Kolonie Aktivierung der Reportergene His3 und lacZ in Kombination mit dem Konstrukt L100-407-581. Die positiven cDNAs aus dem Vektor pPC86 wurde mit den vektorspezifischen Primern pPC86a (GTATAACGCGTTTGGAATCAC) und pPC86b (GTAAATTTCTGGCAAGGTAGAC) amplifiziert und das erhaltene PCR-Fragment sequenziert.

Für den L100-N-Terminus konnten 3 Interaktionspartner ermittelt werden:

1. Protein Phosphatase 1 alpha (13 x, = PP1). PP1 ist ubiquitär exprimiert, in zahlreichen metabolischen Prozessen wie Muskelkontraktionen, Zellzyklus, Neurotransmission involviert (Ohkura et al., (1989), Cell 57: 997-1007; Kitamura et al., (1991), J. Biochem., 109: 307-310; Sasaki et al., Jpn. J. Cancer Res., (1990), 81: 1272-1280). Es gibt 2 Hauptiso formen, die PP1 alpha und delta, die fast identische kataly tische Domänen besitzen und sich nur in ihren NH₂- und COOH- Termini unterscheiden (Andreassen et al., (1998), J. Cell Biol., 14: 1207-1215). Desweiteren ist PP1 in den Dendriten angereichert und spielt u. a. bei der Aktivität der AMPA- Kanäle, bei der Dopaminregulation des Ca2+Stroms und der Neuropeptidregulation des K+Stroms eine Rolle [Smith FD. et al., (1999), J. Biol. Chem. 274, 28, 19894-19900; Yan et al., (1999), Nature neuroscience, vol. 2, no1; Allen PB. et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 9956-9961, Terry-Lorenzo et al., (2000), J. Biol. Chem., 275: 2439-2446; Strack et al., (1999), J. Comp. Neurol., 413: 373-384; Osterhout et al., (1999), J. Cell Biol. 145: 1209-1218; Schillace et al., (1999), Curr. Biol. 9: 321-324; Kasahara et al., (1999), J. Biol. Chem., 274: 9061-9067; Evans et al., (1999), Eur. J. Neurosci., 11: 279-292; Collins et al., (1998), Methods Mol. Biol., 93: 79 -102; Yan et al., (1997), Neuron 19: 1115-1126; Strack et al., (1997), Brain Res. Mol. Brain Res. 49: 15-28; 16; Fernandez- Sanchez et al., (1996), FEBS Lett. 398: 106-112; Younossi- Hartenstein et al., (1996), J. Comp. Neurol. 370: 313-329; Papasozomenos et al., (1995), J. Neurochem. 65: 396-406; Saito et al., (1995), Biochemistry 34: 7376-7384; Veeranna et al., (1995), J. Neurochem. 64: 2681-2690; Vickroy et al., (1995), Neurosci. Lett. 191: 200-204; da Cruz e Silva et al., (1995), J. Neurosci. 15: 3375-3389; Ouimet et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3396-3400; Hashikawa et al., (1995), Neurosci. Res. 22: 133-136; Surmeier et al., (1995), Neuron 14: 385-397; Kotter, R. (1994), Prog. Neurobiol. 44: 163-196; Ulloa et al., (1993), FEBS Lett. 330: 85-89]. SEQ ID NO: 12 gibt die Sequenz der Protein Phosphatase 1 alpha wieder.
2. Identifizierung eines L100-Bindungspartners mit Kelch-Motif.
Die Sequenz eines weiteren Bindungspartners ist bisher unbe kannt, sie enthält eine 55%ige Aminosäuresequenzidentität zu "Kelch"-Proteinen (Xue et al., 1993 Cell, 72 (5): 681-693) und eine 33%ige Identität zu dem Maus Zinkfinger Protein 151 (Jordan-Sciutto et al., (1999), J. Biol. Chem. 274: 35262-35268; Schulz et al., 1995, BIOCHEM. J. 311: 219-224). Die aus 50 Aminosäuren bestehenden Kelch-Repeats besitzen die Fähig keit Actin zu binden (Field et al., 1999, Trends Cell. Biol., 9 (10): 387-394; Kim et al., 1999, Gene, 228 (12): 73-83; Hernandez et al., 1997, J. Neurosci., 17 (9): 3038-3051). Kelch-Proteine können im N-Terminus eine POZ-Domäne besitzen, die u. a. an der Chromatinfaltung und der Organisation des Cytoskeletts in Gehirnzellen beteiligt ist (Ahmad et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95 (21): 12123-12128). Die identifizierte Sequenz besitzt 67,4% Nukleotidsequenz identität in 350 nt zu Mayven, einem Actin-bindenden Protein, das vorwiegend in primären Neuronen des Hippocampus expri miert ist. Mayven enthält eine BTB/POZ Domäne und Kelch- Repeats und ist mit Actinfilamenten in "Stress-fibers" und corticalen Actin-reichen Regionen der Zellgrenzen (cell margins) kolokalisiert (Soltysik-Espanola et al., 1999, Mol. Biol. Cell., 10 (7): 2361-2375). Die Sequenz des identifi zierten L100-Interaktionspartner mit Kelch-Repeat wird in Sequenz SEQ ID NO: 13 wiedergegeben.

Sequenzvergleich zu Kelch Drosophila melanogaster Ring canal protein (kelch protein)
Length = 689, Score = 130 bits (323), Expect = 3e-30, Identities = 63/114 (55%), Positives = 83/114 (72%)

Sequenzvergleich zu Maus Zinkfinger Protein 151
Length = 794, Score = 72.6 bits (175), Expect = 6e-13, Identities = 36/106 (33%), Positives = 63/106 (58%)

zur Übersicht: [Field et al., (1999), Trends Cell. Biol. 9: 387-394].

1. Die Sequenz des 3. Interaktionspartners für den L100-N- Terminus ist unbekannt, es konnte keine Homologie zu Protein bindungsmotifen nachgewiesen werden. Die Sequenz weist Homo logie zu einer humanen Sequenz auf Chromosom 17 auf (homo sapiens chromosome 17, clone hRPK.2).
Identities = 134/146 (91%)
Für den L100-COOH-Terminus konnte ein Interaktionspartnern identifiziert werden. Dieses Gen zeigt 95% Sequenzidentität (605 bp) zu Septin 6 (Kinoshita, M., "Identification of mouse Septin6 gene and its product", die Sequenz ist in der EMBL- Datenbank, das Paper dazu ist noch nicht veröffentlicht). Septin 6 soll zu der Familie der Septine gehören. Hierbei handelt es sich um GTPasen, die Plasmamembran-assoziierte Filamente bilden können. Septin Komplexe können eine wichtige Rolle beim Vesikeltransport und bei der Organisation der Proteine an der Plasmamembran von Neuronen spielen [Hsu et al., (1998), Neuron 20: 1111-1122]. Septine sind u. a. bei der Zytokinese und der Organisation des Zytoskeletts be teiligt und kommen in neurofibrillären Tangles bei Alzheimer Patienten vor [Kinoshita et al., (1998), Am. J. Pathol. 153: 1551-1560]. SEQ ID NO: 14 zeigt die Nukleinsäuresequenz von Septin 6. [Fung et al., (1999), FEBS Lett. 451: 203-208; Kinoshita et al., (1998), Am. J. Pathol. 153: 1551-1560; Caltagarone et al., (1998), Neuroreport 9: 2907-2912; Hsu et al., (1998), Neuron 20: 1111-1122; Fares et al., (1995), Mol. Biol. Cell. 6: 1843-1859].

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Apoptaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäure sequenzen codieren und mindestens 90% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellte Sequenz.

4. Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder Teile dieser Nukleinsäuresequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz in Antisense oder Sense mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4.

6. Rekombinanter prokaryontischer oder eukaryontischer Wirts organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz ge mäß Anspruch 1 oder mindestens ein Expressionskassette gemäß Anspruch 4 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Rekombinanter prokaryontischer oder eukaryontischer Wirts organismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Organismus um einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.

8. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder Peptid fragmenten davon als Antigen zur Erzeugung von spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörpergemischen gerichtet gegen Proteine gemäß Anspruch 2.

9. Polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Antikörper gemische, die spezifisch Proteine nach Anspruch 2 erkennen.

10. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening.

11. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 als Marker für humane Erbkrankheiten.

12. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 2, einer Expressionskassette gemäß Anspruch 4 oder eines Fragments von diesen zur Gentherapie.

13. Proteinkomplex aus mindestens einem Protein mit einer Amino säuresequenz gemäß Anspruch 2 und mindestens einem weiteren Protein.

14. Proteinkomplex nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das weitere Protein Proteinphosphatase 1, Septin, ein Kelch- oder Zink-Finger-Protein ist.

15. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder an einen Proteinkomplex gemäß Anspruch 13 binden, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung eines Proteins mit einer Aminosäure sequenz gemäß Anspruch 2 oder eines Proteinkomplexes nach Anspruch 13 durch Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, einer Expressionskassette gemäß Anspruch 4 oder eines Vektors gemäß Anspruch 5 in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus,
b) Inkubation des Proteins gemäß Anspruch 2 oder des Proteinkomplexes gemäß Anspruch 13 mit der zu testenden Substanz oder den zu testenden Substanzen,
c) Detektion der Bindung der zu testenden Substanz an das Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder an den Proteinkomplex gemäß Anspruch 13.

16. Substanzen gefunden nach einem Verfahren gemäß Anspruch 15.

17. Substanzen, die die Interaktion von assoziierten Proteinen mit Proteinen der Aminosäuresequenzen gemäß Anspruch 2 hemmen oder verstärken.

18. Verwendung der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder der Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 für Computergestützte Modellierung zum Auffinden und zum gezielten Design von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zu einem Protein nach Anspruch 2.

19. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 geeignet sind oder Mischungen davon,
b) Nachweis der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation,
c) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder an durch PCR Amplifikation gewonnener Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 mit einem Standard.

20. Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Nachweis eines Proteins gemäß Anspruch 2 oder eines Proteinkomplexes gemäß Anspruch 13 in einer biologischen Probe, das einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:

a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 9, der spezifisch gegen Proteine gemäß Anspruch 2 oder Proteinkomplexes gemäß Anspruch 13 gerichtet ist,
b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes,
c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard.

21. Verfahren zur Quantifizierung der Proteinaktivität oder Menge eines Proteins gemäß Anspruch 2, über Antikörper gemäß Anspruch 9.

22. Verwendung von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1, oder daraus abgeleiteter komplementärer Nukleinsäuresequenzen zur Her stellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Genexpression von L100 positiv beeinflusst werden können.

23. Verwendung von Proteinen gemäß Anspruch 2 oder Fragmenten dieser Proteine zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behand lung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von L100-Protein positiv beeinflusst werden können.

24. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 9 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von L100-Protein positiv beeinflusst werden können.

25. Verwendung von Substanzen gemäß Anspruch 16 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Modulation der Aktivität oder Menge von L100-Protein positiv beeinflusst werden können.