DE10014674A1 - Verbessertes Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin aus P. amaru. Das Verfahren umfaßt, die trockenen Blätter zu pulverisieren, die pulverisierten Blätter mit Calciumcarbonat zu mazerieren, die pulverisierten Blätter unter Verwendung einer Mischung von organischen Lösemitteln zu perkolieren, die Lösemittel durch Destillation zu entfernen, Fette durch eine Kombination von organischen Lösemitteln zu präzipitieren und dann die Präzipitate durch Filtration zu entfernen, die n-Hexan-Fraktionen abzutrennen und die Fraktionen im Vakuum zu entfernen, um einen an Phyllanthin reichen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wird dann einer Kieselgelsäulenchromatographie für eine Fraktionierung unter Verwendung von Lösemittel und Lösemittelmischungen von ansteigenden Polaritäten unterworfen. Die entsprechenden, an Phyllanthin reichen Fraktionen werden vereinigt und kristallisiert, um reines Phyllanthin zu erhalten.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die Ex­ traktion und Isolierung von Phyllanthin. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin aus reichen natürlichen Quel­ len, wie Phyllanthus amarus.

Phyllanthin ist eine aktive leberschützende Verbindung und wird üblicherweise aus Phyllanthus amarus extrahiert. Das bit­ tere Hauptphyllanthin aus Phyllanthus amarus Schum & Thonn (syn. Phyllanthus niruri auct. Non. Linn) aus der Familie Eu­ phorbiaceae wurde zuerst in 1891 von Ottawa isoliert, obwohl es erst in 1964 durch L. R. Row et al. [Tetrahedron Lets. 1557 (1964)] charakterisiert worden ist. Phyllanthin ist ein Lignan, das an die Kohlenstoffatome 8, 8' von zwei Zimtsäure­ resten gekoppelt ist (Diarylbutanlignan). Das durch das Ver­ fahren der Erfindung erhaltene Phyllanthin hat die nachfolgen­ de Molekülstruktur 1.

Die Pflanze Phyllanthus amarus ist über Jahrhunderte hinweg in indischen Systemen der Medizin für die Behandlung von Gelb­ sucht verwendet worden. Aufgrund ihrer weiten Verbreitung so­ wohl in tropischen als auch subtropischen Gebieten ist Phyl­ lanthus amarus eine der am weitverbreitetsten verwendeten Pflanzen der Gattung Phyllanthus in der Volksmedizin der Welt. In der Volksmedizin wird P. amarus als nützlich bei der Be­ handlung von Urogenitalinfektionen, Hepatitis B-Virus, Atem­ wegserkrankungen und Diabetes angesehen (Glossary of Indian Medicinal Plants, CSIR, New Dehli, 1956; L. M. Perry und J. Metzger, Medicinal Plants of East and Southeast Asia: Attribu­ ted properties and uses, MIT Press, Cambridge, MA, 1980, S. 149-151). In Indien ist er üblicherweise als Bhumya malki, Ta­ malaki, Hazardana oder Jarmala bekannt. Die Pflanze wird über­ all innerhalb der Ebenen von Indien und in den Hügeln in einer Höhe von bis zu 3000 Fuß gefunden. Er ist ein Wildkraut der Regenzeit in Brachlandgebieten und im Schatten. Die gesamte Pflanze von P. amarus wird als einer der Inhaltsstoffe in meh­ rere Kräuter umfassenden Formulierungen, die in Indien für die Behandlung von Gelbsucht vertrieben werden, verwendet und als Ergebnis besteht im Handel ein großer Bedarf an dieser. Es wird berichtet, daß die Blätter und oberirdischen Teile von P. amarus Lignane, Flavonoide, Triterpenoide, Tannine, Alkaloide und Glykoside enthalten. Klinische Studien, die mit P. amarus ausgeführt worden sind, ergaben, daß die verschiedenen Extrak­ te von Menschen gut vertragen wurden. Sein Extrakt unterdrückt auch das HBV-Oberflächenantigen und zeigte schützende Wirkung gegen einen durch CCl₄ und Paracetamol induzierten Leberschaden in Ratten und Mäusen. Es wurde gezeigt, daß unter den isolier­ ten Verbindungen das Hauptlignan Phyllanthin eine ausgeprägte antihepatotoxische Aktivität gegen durch CCl₄ und Galactosamin induzierte Zytotoxizität in Rattenhepatozyten in Primärkultur ausübte [J Ethnopharmacol. 14, 41 (1985)]. Die obigen Fakten erklären seine traditionelle Verwendung bei der Behandlung von Gelbsucht. Phyllanthin lag als einer der Bestandteile von des­ sen Extrakten vor [U.S.-Patent Nr. 4,673,575 (1987)].

Allopathische Systeme der Medizin haben praktisch kein Heil­ mittel für Hepatitis. Chronische virale Hepatitis B ist ein weitverbreitetes Problem in der ganzen Welt und ist für chro­ nisch-persistierende Hepatitis und primäres hepatozelluläres Karzinom verantwortlich. Ein weitverbreitetes Auftreten von Hepatitis in Indien und anderen Ländern, das zur Mortalität von Millionen von Menschen geführt hat, gab einen Anstoß, ein neues Extraktionsverfahren für die Isolierung von Phyllanthin in größeren Mengen (0,6%) zu entwickeln. Die leberschützende Verbindung liegt in Phyllanthus amarus in einer höheren Kon­ zentration vor.

In einem der Verfahren, über die im Stand der Technik berich­ tet worden ist, wurden sonnengetrocknete Blätter (1 kg) mit gelöschtem Kalk im Verhältnis 10 : 3 gemischt und 24 h getrock­ net. Dies wurde dann mit Petrolether mittels achtfachem Sipho­ nieren extrahiert. Nach Entfernung des Lösemittels wurde ein gelber Halbfeststoff mit Alkohol gekocht und abgekühlt und filtriert. Das Verfahren wird zweimal wiederholt und auf ¼ seines ursprünglichen Volumens konzentriert. Weiteres Wachs wird durch Filtration entfernt. Das Filtrat lieferte nach Ver­ dampfung von Lösemittel einen blaßgelben Feststoff. Das Ver­ fahren wurde wiederholt, bis der Rückstand weiß ist. Der Rück­ stand wurde des weiteren einer Chromatographie über Aluminium­ oxid unterzogen, wodurch Phyllanthin ausgehend von Benzol- Petrolether- und Benzol-Elutionsmitteln erhalten wurde. Die Ausbeute an Phyllanthin beträgt 0,11% [Tetrahedron, 22, 2899 (1996)]. Dieses Verfahren ist zeitaufwändig und umfaßt eine Anzahl von Schritten mit schlechter Ausbeute (0,11%). Es ist aus dieser Offenbarung auch nicht klar, ob der weggelassene Extraktionsrückstand nach der Hexanextraktion Phyllanthin ent­ hält oder nicht. Das Verfahren verwendete auch das kanzerogene Lösemittel Benzol und führt folglich zu Zweifeln an seiner kommerziellen Durchführbarkeit.

In einem anderen Verfahren wurden die Blätter von Phyllanthus amarus (10 kg) pulverisiert und sukzessive mit n-Hexan ohne Mischen mit Kalk extrahiert. Aus dem n-Hexan-Extrakt erhalte­ nes Öl wurde an Kieselgel adsorbiert und in einer Kieselgel­ säule einer Chromatographie unterzogen, wobei nacheinander mit n-Hexan, n-Hexan : Benzol in unterschiedlichen Anteilen und Ben­ zol eluiert wurde. Phyllanthin wurde in 0,03% aus n-Hexan : Ben­ zol (1 : 1)- und n-Hexan : Benzol (3 : 1)-Elutionsmitteln isoliert. Das Verfahren leidet unter einer geringen Ausbeute (0,03%) und ist nur von akademischer Bedeutung, da es die Isolierung von neuen Verbindungen beschrieb [Tetrahedron, 47, 8931 (1991)]. Das Verfahren widmet sich nicht dem weggelassenen Extraktions­ rückstand hinsichtlich der Anwesenheit von Phyllanthin nach einer n-Hexan-Extraktion. Das Verfahren verwendet ebenfalls Benzol als Lösemittel. Benzol ist als kanzerogene Substanz wohlbekannt und ist in mehreren europäischen Ländern verboten. Aus diesem Grund ist das Verfahren dieser Offenbarung nicht kommerziell durchführbar.

Bislang ist kein geeignetes Verfahren für die Isolierung von Phyllanthin in der Literatur verfügbar. Unter Berücksichtigung der reichlichen Verfügbarkeit von Phyllanthus amarus als ein Wildkraut der Regenzeit in Indien ist ein verbessertes Verfah­ ren für die Isolierung der leberschützenden Verbindung Phyl­ lanthin aus den Blättern von Phyllanthus amarus entwickelt worden. Die Blätter der Pflanze sind einer neuen Technik von Extraktion und Isolierung, die zu der Rückgewinnung von Phyl­ lanthin in 0,6% auf einer Trockengewichtsbasis führt, unter­ worfen worden. Das Pflanzenmaterial ist auf dem indischen Markt leicht verfügbar und ist sehr billig. Wenn es ausgereift ist, machen die Blätter nahezu 30% des trockenen Krauts aus.

GEGENSTÄNDE DER ERFINDUNG

Es ist ein Gegenstand der Erfindung, ein verbessertes Verfah­ ren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin, einer leberschützenden Verbindung, aus einer reichen natürlichen Quelle, wie Phyllanthus amarus, von dessen unterschiedlichen Extrakten berichtet wird, daß sie für die Hemmung einer HBV- Infektion der Leber wirksam sind, bereitzustellen.

Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung ein verbessertes Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin, das einfach, billig und verschmutzungsfrei ist, bereitzustel­ len.

Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin bereitzustellen, das zu einer hohen Ausbeute von reinem Produkt führt.

Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin, das zu der Er­ zeugung eines Produkts mit hoher Stabilität für eine lange Zeitdauer führt, bereitzustellen.

Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin ohne eine Ver­ wendung von kanzerogenem Lösemittel Benzol, und das frei von Gesundheitsrisiken ist, bereitzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Dementsprechend betrifft die Erfindung ein verbessertes Ver­ fahren für die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin aus. P. amarus, umfassend Pulverisierung der trockenen Blätter, Ma­ zerierung der pulverisierten Blätter mit Calciumcarbonat in dem Verhältnis, das zwischen 19 : 1 und 7 : 3 liegt, Perkolation der pulverisierten Blätter unter Verwendung einer Mischung or­ ganischer Lösemittel, wie hier beschrieben, in einem Verhältnis, das zwischen 9 : 1 und 1 : 1 liegt, für eine Zeitspanne, die zwischen 10 und 30 h liegt, bei einer Temperatur, die zwischen Raumtemperatur und 80°C liegt, gefolgt von einer Entfernung von Lösemitteln durch Destillation, Präzipitation von Fetten durch die Kombination von organischen Lösemitteln und darauf­ folgende Entfernung von Präzipitaten durch Filtration, Abtren­ nung von n-Hexan-Fraktionen und dessen Entfernung im Vakuum, um einen an Phyllanthin reichen Rückstand zu erhalten, Unter­ werfen des an Phyllanthin reichen Rückstands einer Kieselgel­ säulenchromatographie für eine Fraktionierung unter Verwendung von Lösemittel und Lösemittelmischungen ansteigender Polaritä­ ten, Vereinigen der entsprechenden, an Phyllanthin reichen Fraktionen und Kristallisieren von diesem in n-Hexan, Cyclo­ hexan oder Methanol, um reines Phyllanthin zu erhalten.

In einer Ausführungsform der Erfindung kann das für eine Per­ kolation verwendete organische Lösemittel Hexan, Chloroform, Ethylacetat, Ethanol, Methanol oder Toluol in unterschiedli­ cher binärer Kombination sein.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das für eine Perkolation ausgewählte Lösemittel eine Kombination von n-Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 2 : 1.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Ent­ fernung von Fetten mit einer Mischung von n-Hexan und Methanol in einem Verhältnis von 2 : 1 bis 1 : 2 ausgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird bei der Säulenchromatographie n-Hexan als mobile Phase verwendet.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde eine Lö­ semittelmischung ansteigender Polaritäten, wie 1 bis 50% Ethylacetat in n-Hexan, für eine Säulenchromatographie verwen­ det.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Lösemittelentfernung durch Vakuumdestillation.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der n- Hexan-Anteil von Methanol durch Verteilen abgetrennt.

In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung liegt die Extraktionstemperatur zwischen 25°C und 80°C.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Extraktion und Iso­ lierung von Phyllanthin aus einer reichen natürlichen Quelle, wie P. amarus, durch ein Mehrschrittverfahren. Die trockenen Blätter der Pflanze werden zuerst pulverisiert. Die pulveri­ sierten Blätter werden dann mit Calciumcarbonat in einem Ver­ hältnis, das zwischen 19 : 1 und 7 : 3 liegt, mazeriert. Die maze­ rierten Blätter werden mit einer Mischung von organischen Lö­ semitteln, wie n-Hexan und Ethylacetat, in einem Verhältnis, das zwischen 9 : 1 und 1 : 1 liegt, 10 bis 30 h perkoliert, wobei die Extraktionstemperatur zwischen Raumtemperatur und 80°C liegt.

Die Lösemittel werden durch Destillation entfernt und die Fet­ te durch eine Kombination von organischen Lösemitteln, wie n- Hexan und Methanol, vorzugsweise in einem Verhältnis von 2 : 1 bis 1 : 2 präzipitiert, gefolgt von einer Entfernung der Präzi­ pitate durch Filtration. Die n-Hexan-Fraktionen werden abge­ trennt und im Vakuum entfernt, wodurch ein an Phyllanthin rei­ cher Rückstand erhalten wird. Der Rückstand wird einer Kiesel­ gelsäulenchromatographie für eine Fraktionierung unter Verwen­ dung von Lösemittel und Lösemittelmischungen ansteigender Po­ laritäten unterworfen. Die entsprechenden, an Phyllanthin rei­ chen Fraktionen werden dann vereinigt und in n-Hexan, Cyclohexan oder Methanol kristallisiert, um reines Phyllanthin zu erhalten.

Die für den Perkolationsschritt verwendeten organischen Löse­ mittel sind binäre Kombinationen von einem oder mehreren her­ kömmlichen organischen Lösemitteln, wie Hexan, Chloroform, Ethylacetat, Ethanol, Methanol oder Toluol. Die Lösemittel werden in einem Verhältnis von 9 : 1 bis 1 : 1 verwendet. Die Ent­ fernung von Fetten wurde mit einer Mischung von zwei organi­ schen Lösemitteln, wie n-Hexan und Methanol, in einem von de­ nen Fett begrenzt löslich war, ausgeführt. Das bevorzugte Ver­ hältnis der Lösemittel für den Schritt der Fettentfernung ist 2 : 1 bis 1 : 2.

Während einer Säulenchromatographie umfaßt die mobile Phase n- Hexan und Lösemittelmischung ansteigender Polaritäten, wie 1% bis 50% Ethylacetat in n-Hexan.

Das Verfahren der Erfindung erfolgt vorzugsweise durch folgen­ de Schritte, wie sie detailliert nachfolgend erläutert werden:

• 1. Mahlen der Blätter von P. amarus zu Pulver.
• 2. Pulverisierte Blätter wurden mit Calciumcarbonat gemischt (5% bis 30% pulverisierte Blätter).
• 3. Extraktion der pulverisierten Blätter durch Perkolation unter Verwendung einer Mischung von organischen Lösemit­ teln, wie n-Hexan-Ethylacetat 9 : 1 bis 1 : 1, für 10 bis 30 h.
• 4. Temperatur von Extraktionen liegen zwischen Raumtemperatur und 80°C.
• 5. Entfernung des Lösemittels durch Vakuumdestillation bis zu erhaltenem lösemittelfreiem Extrakt.
• 6. Entfernung von Fetten durch Präzipitation mit Mischung von Lösemitteln, wie n-Hexan-Methanol (2 : 1).
• 7. Abtrennung von n-Hexan-Anteil von Methanol durch Vertei­ lung.
• 8. Entfernung von n-Hexan durch Destillation, um einen an Phyllanthin reichen Rückstand zu erhalten.
• 9. Abtrennung von Phyllanthin von dem Rückstand durch Säulen­ chromatographie unter Verwendung von Kieselgel (stationäre Phase) und n-Hexan (mobile Phase). Die Polarität wurde durch nacheinander erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht.
• 10. Fraktionen entsprechend Phyllanthin (überwacht durch Dünn­ schichtchromatographie) wurden vereinigt und die organi­ schen Lösemittel wurden durch Vakuumdestillation entfernt. Organische Lösemittel, wie Hexan und Methanol, wurden für eine Kristallisation von Phyllanthin verwendet.

Folgende Beispiele werden zur Veranschaulichung angegeben und sollten nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung ver­ standen werden.

Beispiel 1

Blätter von P. amarus (500 g) wurden pulverisiert und in 3 l Mischung von Lösemitteln [Ethylacetat-n-Hexan (3 : 1)] bei Raum­ temperatur eingeweicht. Nach 8 h ließ man das Lösemittel ab­ laufen und es wurde unter verringertem Druck destilliert. Das rückgewonnene Lösemittel kann zweimal nacheinander für ein Si­ phonieren des restlichen Pflanzenmaterials wiederverwendet werden. Der nach Entfernung von Lösemitteln so erhaltene ver­ einigte Rückstand wurde durch Zugabe von 50% Methanol (300 ml) verdünnt und dann abfiltriert. Er wurde dann nacheinander ei­ ner Verteilung mit n-Hexan und Ethylacetat unterworfen. Der halbfeste Rückstand von n-Hexan-Extrakt bestand aus Phyllan­ thin (13 g). Der Rückstand wurde dann einer Chromatographie über Kieselgel (260 g) unter Verwendung von n-Hexan unterwor­ fen. Die Polarität von Elutionsmitteln wurde durch nacheinander erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht. Phyllanthin entsprechende Fraktionen (überwacht durch Dünn­ schichtchromatographie) wurden vereinigt, um einen Feststoff zu erhalten, der in Methanol kristallisiert wurde, wodurch man weiße Nadeln von reinem Phyllanthin (0,48%) erhielt.

Beispiel 2

Blätter von P. amarus (100 g) wurden pulverisiert und in 500 ml n-Hexan-Ethylacetat im Verhältnis 1 : 1 bei Raumtempera­ tur eingeweicht. Nach 10 h ließ man das Lösemittel ablaufen und es wurde unter verringertem Druck destilliert. Das rückge­ wonnene Lösemittel wurde weitere zwei Mal für ein Siphonieren des restlichen Pflanzenmaterials wiederverwendet. Der nach Entfernung von Lösemitteln so erhaltene vereinigte Rückstand wurde durch Zugabe von 300 ml 70% Methanol verdünnt und dann abfiltriert. Er wurde dann nacheinander einer Verteilung mit n-Hexan und Ethylacetat unterworfen. Der halbfeste Rückstand (5 g) von n-Hexan-Extrakt bestand aus Phyllanthin. Der Rück­ stand wurde dann einer Chromatographie über Kieselgel (150 g) unter Verwendung von n-Hexan unterworfen. Die Polarität von Elutionsmitteln wurde durch nacheinander erfolgendes Hinzufü­ gen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht. Phyllanthin entsprechende Fraktionen (überwacht durch Dünnschichtchromatographie) wurden vereinigt, um einen Feststoff zu erhalten, der in Cyclohexan kristallisiert wurde, wodurch man weiße Nadeln von reinem Phyllanthin (0,49%) erhielt.

Beispiel 3

Blätter von P. Amarus (500 g) wurden mit 50 g Calciumcarbonat mazeriert und 6 h aufbewahrt. Es wurde dann in 3 l einer Kom­ bination von Lösemitteln [n-Hexan-EtOAc (2 : 1)] bei 60°-80°C 10 h perkoliert. Extrakt wurde konzentriert, um rohen Rück­ stand (25 g) frei von organischen Lösemitteln zu erhalten. Der Rohextrakt wurde in 100 ml n-Hexan-Methanol (2 : 1) gelöst und Rückstand abfiltriert. Rückstand wurde mit 30 ml n-Hexan gewa­ schen. Der n-Hexan-Anteil wurde abdestilliert, wodurch man ei­ nen Halbfeststoff erhielt. Der Halbfeststoff (10 g) wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel (300 g, stationäre Phase) unter Verwendung von n-Hexan, Ethylacetat und deren Mi­ schung (mobile Phase) in der Reihenfolge ansteigender Polari­ täten gereinigt. Die Polarität von Elutionsmitteln wurde durch nacheinander erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan er­ höht. Phyllanthin entsprechende Fraktionen (überwacht durch Dünnschichtchromatographie) wurden vereinigt, wodurch man ei­ nen Feststoff erhielt, der in n-Hexan kristallisiert wurde, wodurch man farblose Nadeln von reinem Phyllanthin erhielt (0,6%).

Das Verfahren der Erfindung kann für den gesamten oder einen beliebigen Teil von P. amarus, entweder frisch oder trocken, verwendet werden.

Das Verfahren der Erfindung hat folgende Vorteile:

• 1. Das Ausgangsmaterial, wie Phyllanthus amarus, ist reich­ lich in der ganzen Welt, einschließlich Indien, verfügbar. Die neue Kombination der organischen Lösemittel, wie n- Hexan-Ethylacetat (2 : 1), führt zu der Extraktion einer le­ berschützenden Verbindung Phyllanthin mit maximaler Aus­ beute (0,6%).
• 2. Aufgrund der Anwesenheit von Ölen und Fetten in großer Menge in den Blättern von P. amarus erfordert das herkömm­ liche Verfahren viele Schritte, die zeitaufwändig, kompli­ ziert, kommerziell unrentabel und vor allem kostspielig bei niedriger Ausbeute sind. Dieses Verfahren der Erfin­ dung minimiert alle obigen Faktoren und ist dementspre­ chend kommerziell rentabel. Das Verfahren ist einfach, billig und verschmutzungsfrei.
• 3. Das Verfahren benötigt keinerlei anspruchsvolle Ausrü­ stung. Es benötigt nur einen Perkolator, eine Säule und eine Destillationseinheit. Das Verfahren benötigt minima­ len Raum.
• 4. Direkt von der Extraktion bis zur Isolierung von reiner Verbindung wurden nicht teure organische Lösemittel, wie n-Hexan, Ethylacetat und Methanol, verwendet. Diese Löse­ mittel können auch in nachfolgenden Chargen wiederverwen­ det werden, wodurch das Verfahren billiger gemacht wird.
• 5. Die leberschützende Verbindung, die durch das Verfahren erhalten wird, kann für eine lange Zeitdauer ohne irgend­ einen Stabilitätsverlust gelagert werden.
• 6. Das Verfahren involviert keinerlei kanzerogene Lösemittel, wie Benzol, und ist frei von Gesundheitsrisiken.
• 7. Die Ausbeute an Phyllanthin (0,6%) durch das vorliegende Verfahren ist fünffach verglichen mit jenen, über die in der Literatur berichtet wird.

Claims (10)

1. Ein verbessertes Verfahren für die Extraktion und Isolie­ rung von Phyllanthin aus P. amarus, wobei das Verfahren ein Pulverisieren der trockenen Blätter, Mazerieren der pulveri­ sierten Blätter mit Calciumcarbonat in einem Verhältnis, das zwischen 19 : 1 und 7 : 3 liegt, Perkolieren der pulverisierten Blätter unter Verwendung einer Mischung von organischen Löse­ mitteln in einem Verhältnis von 9 : 1 bis 1 : 1 für 10 bis 30 h, wobei die Extraktionstemperatur zwischen Raumtemperatur und 80°C liegt, Entfernen der Lösemittel durch Destillation, Prä­ zipitieren von Fetten durch eine Kombination von organischen Lösemitteln und darauffolgendes Entfernen der Präzipitate durch Filtration, Abtrennen der n-Hexan-Fraktionen und Entfer­ nen der Fraktionen im Vakuum, um einen an Phyllanthin reichen Rückstand zu erhalten, Unterwerfen des Rückstands einer Kie­ selgelsäulenchromatographie für eine Fraktionierung unter Ver­ wendung von Lösemittel und Lösemittelmischungen ansteigender Polaritäten, Vereinigen der entsprechenden, an Phyllanthin reichen Fraktionen und Kristallisieren von diesem in n-Hexan, Cyclohexan oder Methanol, um reines Phyllanthin zu erhalten, umfaßt.

2. Ein Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das für eine Perkolation der pulverisierten Blätter ausgewählte Lösemittel eine Kombination von n-Hexan-Ethylacetat im Ver­ hältnis 2 : 1 ist.

3. Ein Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Entfernung von Fetten unter Verwendung einer Mischung von organischen Lösemitteln, in einem von denen Fett begrenzt lös­ lich ist, ausgeführt wird.

4. Ein Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Verhältnis der organischen Lösemittelmischung, die für eine Fettentfernung verwendet wird, 2 : 1 bis 1 : 2 ist.

5. Ein Verfahren, wie in Ansprüchen 4 beansprucht, wobei die für die Entfernung von Fetten verwendeten organischen Lösemit­ tel eine Mischung von n-Hexan und Methanol in einem Verhältnis von 2 : 1 ist.

6. Ein Verfahren, wie in Ansprüchen 1 beansprucht, wobei das n-Hexan als mobile Phase in einer Säulenchromatographie ver­ wendet wird und ein Laufmittel eine Lösemittelmischung von an­ steigenden Polaritäten umfaßt.

7. Ein Verfahren, wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die Lösemittelmischung von ansteigenden Polaritäten 1 bis 50% Ethylacetat in n-Hexan umfaßt.

8. Ein Verfahren, wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei Ethyl­ acetat n-Hexan zu 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% zugesetzt wird.

9. Ein verbessertes Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei eine Lösemittelentfernung durch Vakuumdestillation be­ wirkt wird.

10. Ein Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Extraktionstemperatur zwischen 25°C und 80°C liegt.