DE10013514A1 - Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) oder deren Copolymeren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein enzymatisch-chemisches Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA), insbesondere von Polyhydroxybutryrat (PHB), oder deren Copolymeren aus Biomasse, das eine chemische Behandlung der Biomasse mit einem Mittel, das die Nicht-PHA-Zellenteile der Biomasse reduziert, beinhaltet, wobei die chemische Behandlung vor und/oder nach einem enzymatischen Zellaufschluss erfolgt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, im Gegensatz zu anderen Zellaufschlüssen, auch die Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten aus Biomassen mit relativ geringen PHA-Gehalten (z. B. < 60%), ohne dadurch die Polymereigenschaften oder -reinheit drastisch zu verändern bzw. zu verschlechtern.

Description

Die Erfindung betrifft ein enzymatisch-chemisches Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA), insbesondere von Polyhydroxybutyrat (PHB), oder deren Copolymeren aus Biomasse, das eine chemische Behandlung der Biomasse mit einem Mittel, das die Nicht-PHA-Zellanteile der Biomasse reduziert, beinhaltet, wobei die chemische Behandlung vor und/oder nach einem enzymatischen Zellaufschluss erfolgt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, im Gegensatz zu anderen Zellaufschlüssen, auch die Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten aus Biomassen mit relativ geringen PHA-Gehalten (z. B. < 60%), ohne dadurch die Polymereigenschaften oder -reinheit drastisch zu verändern bzw. zu verschlechtern.

Für die mikrobielle Herstellung der PHA-Polyester, deren bekanntester Vertreter das Polyhydroxybutyrat (PHB) ist, bzw. für die Herstellung von PHA-Copolymeren sind eine Reihe von Verfahren bekannt, die in zahlreichen Dokumenten des Standes der Technik beschrieben sind, denn PHB und andere PHA gewinnen als biologisch voll abbaubare Polymere mit thermoplastischen Eigenschaften zunehmend wirtschaft­ liche Bedeutung. So ist die mikrobielle Produktion von PHB aus Methanol z. B. in EP 0 015 669 A2 dargestellt, die Gewinnung von Copolymeren kann z. B. EP 0 304 293 A2 und EP 0 069 497 A2 entnommen werden. Hierbei kommen beispielsweise Glucose/Propionsäure als Substratgemisch zum Einsatz.

Weitere Verfahren zur Gewinnung von PHB mit einem guten Ertragskoeffizienten und Saccharose als Substrat sind z. B. EP 0 149 744 A1 oder zur Herstellung von PHB und deren Copolymeren DE 196 19 084 C2 zu entnehmen.

Nach dem Stand der Technik erfolgt die Aufarbeitung PHA- haltiger Biomasse entweder durch Extraktion einer getrockneten Biomasse mit entsprechenden PHB/PHA- Lösungsmitteln, chemisch durch Zugabe zellzerstörender Substanzen oder enzymatisch.

Die chemische Extraktion wird in der Regel mit halogenierten Lösungsmitteln durchgeführt. Zur Anwendung kommen Lösungsmittel, die relativ viel PHA zu lösen vermögen (wie z. B. Chloroform) oder Lösungsmittel mit denen sehr reine PHA gewonnen werden kann, da sich in diesen nur geringe Mengen an anderen Zellbestandteilen lösen (wie z. B. in Dichlorethan). Beispielsweise sei EP 0 015 669 A2 genannt, in dem verschiedene Methoden zur Zellzerstörung und eine daran sich anschließende PHB-Extraktion aus den zerstörten Zellen durch halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan und 1,2- Dichlorpropan) dargestellt sind. Der Einsatz von halogenierten Lösungsmitteln wird auch in zahlreichen anderen Druckschriften (z. B. US-A 3,275,610 - Chloroform, 1,2-Dichlorethan in EP 0 014 490 A und EP 0 015 123 A) beschrieben.

Um die gesundheitsgefährdenden halogenierten Lösungsmittel zu umgehen, sind auch andere Verfahren, die unbedenklichere Lösungsmittel verwenden, entwickelt worden. So ist z. B. die Verwendung von cyclischen Kohlensäureestern bekannt (US-A 410533) oder die Verwendung von Ethyl- bzw. Methyllactat (DE 27 01 278 A1, DE 195 33 459 C1 und DE 196 23 778). Auch die Verwendung von Essigsäure oder Essigsäureanhydrid als Lösungsmittel seien erwähnt (DE 197 12 702 A1, DD 229 428 A1).

Die einzelnen Verfahrensschritte bei PHA-Extraktionen können dabei wie folgt dargestellt werden:

Die mikrobielle Biomasse wird zunächst von der Kulturflüssigkeit durch Filtration, Separation oder Zentrifugation abgetrennt (sofern es sich nicht um gentechnisch veränderte, pflanzliche Biomasse handelt), wobei sich ggf. - je nach Effizienz - ein mechanischer Zellaufschluß (z. B. mittels Kugelmühle) zur Steigerung von Extraktionsausbeuten anschließt. Die Biomasse-Trocknung erfolgt z. B. durch Gefrier- bzw. Sprühtrocknung.

Aus der getrockneten Biomasse wird die PHB, PHA bzw. deren Copolymere mit einem geeigneten Extraktionsmittel gewonnen. Durch Vorextraktionen der Biotrockenmasse unter Verwendung von Lösungsmitteln, die nicht die Polyester lösen, kann die Reinheit der gewonnenen Polymere noch erhöht werden.

So beschreibt z. B. EP 0 124 309 A1 die Vorextraktion der Biomasse mit Aceton, während in EP 0 058 480 A1 Methanol verwendet wird.

Neben der häufig notwendigen Vorextraktionen und aufgrund der allgemein relativ schlechten Löslichkeit von PHB bzw. vor allem der sogenannten short-side-chain-/ssc-PHA müssen generell große Mengen an Extraktionsmittel verwendet werden. Daneben bereitet die Abtrennung der hochviskosen Polymerlösung von den restlichen Zellbestandteilen Schwierigkeiten. Zusätzlich stehen viele der verwendeten PHB-/PHA-Lösungsmittel, insbesondere die halogenierten, im Verdacht, starke gesundheitsschädigende Wirkungen zu haben. Auch die Verwendung, Handhabung und Lagerung von großen Mengen an Lösungsmitteln stellt im allgemeinen ein ökonomisches wie auch ökologisches Problem dar.

Aus diesem Grund sind auch Verfähren entwickelt worden, die lösungsmittelfrei oder -arm arbeiten. Mit solchen Verfahren werden nicht die Polymergranula physikalisch aufgelöst, sondern die sogenannten NPCM-Zellbestandteile (non-PHA- cell-matter) werden mit Ausnahme der intrazellulären Granula chemisch oder enzymatisch soweit wie möglich wasserlöslich gemacht. Die Granula können dann von der wässrigen Lösung auf bekannte Weise abgetrennt werden.

Zu den am längsten bekannten Verfahren der PHB-/PHA- Gewinnung gehört zum Beispiel der chemische Zellaufschluss mittels Hypochlorid. Mit diesem Verfahren können nahezu alle Zellbestandteile mit Ausnahme der Polymergranula oxidativ zerstört werden. Das Verfahren hat jedoch auch Nachteile. So bleibt die äußere Form der Granula bei dieser Methode zwar erhalten, jedoch die Makromoleküle werden ebenfalls teilweise geschädigt. Sowohl durch die starke Herabsetzung der Molmasse der Polymere, als auch durch die Freisetzung umweltgefährdender Abwässer ist diese Methode auf den Laborbereich im Kleinmaßstab beschränkt.

Ein anderes oxidatives Verfahren ist in DE 694 07 177 T2 dargestellt. Die Gewinnung von PHA, speziell von Polyhydroxybutyrat-hydroxyvalerat-Copolymeren (PHBHV) erfolgt entweder mittels Wasserstoffperoxid (bevorzugt) oder mit Peressigsäure, Perborat, Percarbonat bzw. mit Chlor und Chlorhaltigen Oxidationsmitteln in Gegenwart von Chelatbildnern. Die Wirkung der Oxidationsmittel zur PHA- Gewinnung, v. a. von Peroxiden wird auch ausführlich in EP 0 669 970 A2 beschrieben.

Durch die oxidativen Methoden werden jedoch nicht nur unerwünschte Zellbestandteile, wie z. B. Nukleinsäuren und Zellwandpolymere, abgebaut, sondern die durchschnittliche Molmasse der PHA-Polymere wird ebenfalls in unerwünschter Weise herabgesetzt. Diese PHB/PHA-Gewinnung ist deshalb ebenfalls nicht ohne Qualitätseinbußen des gewünschten Polymerwerkstoffes durchführbar. Ein besonderer Nachteil ist dies verständlicherweise bei Biomassen mit geringerem PHA-Gehalt, denn je geringer der PHA-Gehalt ist, desto stärker muß oxidiert werden und um so wahrscheinlicher ist die Schädigung der Polyester. Außerdem können die Makro­ moleküle auch durch Radikalbildung (z. B. am Methin- Kohlenstoff eines Poly-β-hydroxyalkanoats) miteinander vernetzt werden. Diese teilweise Vernetzung verursacht eine Herabsetzung der Löslichkeit in PHA-Lösungsmitteln, bis das Polymer nur noch quellfähig ist. Für Anwendungen, bei denen eine Weiterverarbeitung der Polymerlösung vorgesehen ist, macht sich diese Vernetzung negativ bemerkbar. Darüber hinaus reduziert eine partielle Vernetzung die biologische Abbaubarkeit, die Bioresorbierbarkeit, sowie die Biokompatibilität und mindert damit wichtige Eigenschaften der Polyhydroxyalkanoate.

Bekannte Verfahren, die diese Nachteile vermeiden, lysieren die unerwünschten Zellbestandteile mit Hilfe von Enzymen. So beschreibt EP 0 145 233 A2 den Einsatz von proteolytischen Enzymen, teilweise im Zusammenwirken mit einer Phospholipase und/oder mit oberflächenaktiven Substanzen. In einem Verfahren nach DE 693 11 738 T2 werden Wärmeeinwirkung, evtl. Nucleasen, proteolytische Enzyme und/oder Phospholipasen und/oder Lysozym, Chelatbildner, oberflächenaktive Substanzen und oxidative Nachbehandlung bzw. Lösungsmittelumfällung kombiniert. Nach KR 9502866 werden z. B. lediglich Vorextraktionsmitteln eingesetzt, wie heißes Wasser oder Aceton, sowie eine Protease unter stark alkalischen Bedingungen.

Die in den beschriebenen enzymatischen Zellaufschlüssen eingesetzten Mikroorganismen [größtenteils Ralstonia eutrophus (früher: Alcaligenes eutrophus), Alcaligenes latus, diverse Pseudomonas-Stämme u. ä.] sind sämtlich als PHA-Produzenten mit hohem PHA-Gehalt bekannt - ca. 60-80% in Trockenmasse, und diese Verfahren wurden oft mehr oder weniger in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen entwickelt. Aus Mikroorganismen mit relativ hohem PHA- Gehalt oder besonderen Lyse-Eigenschaften sind zudem bekanntermaßen die Polymergranula leicht, z. B. unter Anwendung weniger Schritte, isolierbar. Oft genügt der Einsatz von einem bis zwei Enzymen, oberflächenaktiven Substanzen und evtl. Chelatbildnern zur Gewinnung der Polymere. Teilweise genügt ein oxidatives Verfahren, um eine Reinheit von 90 bis ca. 98% zu erreichen, insbesondere wenn Mikroorganismen eingesetzt werden können, deren PHA- Gehalt schon im Vorfeld relativ hoch ausfällt, z. B. 70-80%.

Die Gewinnung von PHA aus Biomasse mit einem geringeren PHA-Gehalt von beispielsweise 30-60% ist dagegen nur mit höherem Aufwand (d. h. mit mehreren Schritten) möglich. Der Aufwand ist um so höher, je niedriger der PHA-Gehalt der Biomasse ist. Bisher bekannte Verfahren sind nicht oder nur bedingt für die Gewinnung von PHA aus Mikroorganismen mit geringem PHA-Gehalt geeignet.

Es hat sich nämlich herausgestellt, dass die an sich übliche, sofortige Zellwandlyse in einem ersten Schritt (z. B. mit Lysozym) nicht unbedingt die beste Möglichkeit ist, den NPCM-Anteil der Biomasse auszuwaschen. Dies gilt besonders für PHA-Produzenten mit niedrigerem PHA-Gehalt. Eine oft auftretende unvollständige Lyse und Agglomeration der Biomasse, einschließlich der PHA können dann die weitere Reinigung der PHA-Granula durch Einschluss von Verunreinigungen deutlich erschweren.

Bei der Auswahl der Mikroorganismen zur PHA-Gewinnung stand bisher deren Akkumulationsfähigkeit für hohe PHA-Gehalte im Vordergrund. Aufgrund der Änderung der Anwendungsgebiete, vom früher angestrebten Massenprodukt zum heutigen Spezialprodukt aus PHA, kommt es vor, dass ein Mikroorganismus mit einem relativ niedrigen Polymer-Gehalt zu bevorzugen ist, der andere Vorteile aufweist. Dies können z. B. herausragende mechanische Eigenschaften der PHA, hohe Molmassen etc. sein, sowie eine schnelle, kostengünstige Kultivierung des Stammes (z. B. keine Sterilisation der Geräte nötig, etc.)

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Verfahren zur PHA-Homo- und Copolymeren-Gewinnung aus Biomasse, insbesondere mit geringeren PHA-Gehalten, bereitzustellen, das einfach und zuverlässig zu handhaben ist, welches ohne oder mit geringen Mengen an PHB/PHA-Lösungsmitteln auskommt und bei dem eine gesundheitliche Belastung für den Verarbeiter bzw. negative Auswirkungen auf die Umwelt praktisch auszuschließen sind. Dennoch sollte die Qualität und Ausbeute der gewonnenen PHA mindestens mit denen der bekannten Extraktionsverfahren vergleichbar sein.

Es wurde nun gefunden, dass unter Anwendung eines chemisch- enzymatischen Verfahrens die PHA in hoher Ausbeute und guter Qualität aus einer Biomasse gewonnen werden kann, auch wenn diese relative geringe PHA-Gehalte, z. B. Gehalte < 60% aufweist. Dabei ist es unerheblich, wann ein Zusatz des/der erfindungsgemäßen chemischen Mittel(s) erfolgt, welches überraschend die Nicht-PHA-Zellanteile (NPCM) der Biomasse in einem erheblichen Ausmaß reduziert und somit den PHA-Gehalt erhöht. Unter chemischen Mitteln werden im Sinne der Erfindung Reduktionsmittel verstanden, die die Fähigkeit zur Spaltung und zum Abbau von Proteinen, Nukleinsäuren und Polysacchariden (Zellwandspaltung) aufweisen. Die Reduktionsmittel können gegebenenfalls in Kombination mit Tensiden eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird in Kombination mit einem enzymatischen Zellaufschluss als chemisches Mittel ein Dithionit-Salz angewendet oder die reduzierenden Eigenschaften von Wasserstoffperoxid in sauren Lösungen genutzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft im einzelnen wie folgt, wobei die Reihenfolge der einzelnen Schritte austauschbar ist. So kann der als Verfahrensschritt 3 bezeichnete Schritt vor Schritt 2 erfolgen oder Schritt 1 sich auch noch einmal nach Schritt 3 anschließen. Ebenso werden bei Bedarf andere Schritte wiederholt oder weggelassen. Die zeitliche Anordnung hängt sowohl von der Biomasse und/oder ihrem PHA-Gehalt ab, wie auch von der späteren Anwendung und gewünschten Reinheit der PHA.

Erfindungswesentlich ist dabei die mindestens einmalige Durchführung der chemischen Behandlung der Biomasse zur Entfernung von NPCM, wie in Verfahrensschritt 1 beschrieben.

In einer bevorzuten Ausführungvariante der Erfindung erfolgt vor dem eigentlichen chemisch-enzymatischen Aufschluss der Biomasse eine Vorbehandlung der Biomasse mit dem Ziel der vermehrten Bildung von Agglomeraten zur schnelleren und leichteren Abtrennung der Biomasse von der Kulturflüssigkeit durch Sedimentation, Filtration, Sepa­ ration und/oder Zentrifugation. Die Wahl dieser Abtrennmethode ist weitgehend abhängig vom eingesetzten Mikroorganismus.

Gemäß vorliegender Erfindung wird eine Agglomeration dadurch erreicht, dass der pH-Wert der Biomasse unter den ursprünglichen Wert, auf jeden Fall unter den Neutralpunkt in den sauren Bereich verschoben wird. Bevorzugt sind pH- Werte von 2 bis 6,5, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von 2,5 bis 5,5 eingestellt. Die kurzzeitige, d. h. 5 bis 60 minütige Einwirkung höherer Temperaturen auf die Biomasse- Suspension zwischen 30 und 140°C, bevorzugt zwischen 30 und 90°C wirken sich günstig auf die Partikelvergrößerung aus. In einer Ausführungsvariante zur Agglomerisation wird der pH-Wert der Biomasse vor der Säuerung kurzzeitig für max. 5-30 Minuten bei stufenweise eingestellten Temperaturen zwischen 30 und 140°C auf 7 bis 12 eingestellt. Besonders bevorzugt auf einen Wert von 8 bis 9.

Zur erhöhten Agglomerat-Bildung in der Biomasse, und um eine gleichzeitige Zellwandschädigung und Reduzierung des Proteingehaltes herbeizuführen, werden ggf. zusätzlich Chelatbildner und/oder proteolytische Enzyme eingesetzt. Bei der Flockung der Mikroorganismen im Sauren hat sich der gleichzeitige Einsatz von Pepsin als besonders vorteilhaft herausgestellt.

Im Anschluß daran werden die noch festen, geflockten Biomasse-Bestandteile in bekannter Weise von der Flüssigkeit abgetrennt. Dies kann zum Beispiel durch Filtration, Separation, Zentrifugation oder Sedimentation, z. B. in einem Schrägklärer, erfolgen.

Verfahrensschritt 1

Sofern die Biomasse in Form von fester Biofeuchtmasse oder Biotrockenmasse vorliegt, wird sie soweit mit Wasser verdünnt, dass die entstehende Suspension gerührt werden kann. Eine effektive Reduzierung der Nicht-PHA-Zellanteile erreicht man durch Reaktion der Biomasse mit geeigneten chemischen Reduktionsmitteln. Dafür kommen theoretisch alle Reduktionsmittel in Frage, die in einem wässrigen Medium einsetzbar sind und keine Schädigungen oder Verunrei­ nigungen an der PHA hervorrufen, also ihre Eigenschaften drastisch verschlechtern. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß der Einsatz eines Dithionit-Salzes, vorzugsweise Natriumdithionit, welches auf Nicht-PHA- Zellbestandteile (partiell) reduzierend wirkt und/oder deren Hydrolyse fördert. Überraschenderweise ist die deutliche Verringerung der Nicht-PHA-Zellanteile größer, als durch die chemische Reduktion von bestimmten funktionellen Gruppen zu erwarten wäre.

Je nach Art der Biomasse und deren PHA-Gehalt werden 1- 200 g, bevorzugt 10-100 g, besonders bevorzugt 20-80 g Dithionit-Salz pro Kilogramm Biotrockenmasse verwendet. Das Verfahren mit Dithionit-Salz wird unter neutralen bis alkalischen Bedingungen, vorzugsweise bei pH-Werten von 7 bis 10, besonders bevorzugt bei pH-Werten von 8 bis 9, durchgeführt. Temperaturen zwischen 20 bis 110°C, bevorzugt zwischen 40 bis 90°C, sind vorteilhaft.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsvariante kann alternativ Wasserstoffperoxid im sauren Bereich als eine Nicht-PHA-Zellanteile-reduzierende Substanz eingesetzt werden.

Zur Destabilisierung der Zellwände werden ggf. weitere Zusatzstoffe wie z. B. Chelatbildner und/oder Tenside zugegeben. Geeignete Chelatbildner sind z. B. EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 1,2-Bis(2-aminoethoxy)- ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure, Citronensäure, Weinsäure, Polyphosphate u. a. Als Tenside werden bevorzugt nicht-ionische oder anionische Tenside eingesetzt.

Nach dieser Behandlung wird die Suspension aus PHA, Roh-PHA oder PHA-haltige Biomasse auf bekannte Weise (z. B. durch Zentrifugation oder (Querstrom-)Filtration) von der Flüssigkeit abgetrennt, welche nunmehr die solubilisierten Nicht-PHA-Zellanteile enthält. Anschließend wird die PHA- haltige Feuchtmasse in zumindest einem oder auch mehreren Schritten mit, vorzugsweise 40 bis 100°C heißem, besonders bevorzugt 60 bis 80°C heißem, deionisiertem, tensidhaltigem Wasser gewaschen, bis keine solubilisierten Nicht-PHA- Zellanteile mehr ausgewaschen werden können.

Verfahrensschritt 2

(optional je nach Restgehalt an Nicht- PHA-Zellanteilen u. Reinheitsanforderungen - kann auch Schritt 1 sein):

Zur weiteren Solubilisierung von Nicht-PHA-Zellanteilen wird die Feuchtmasse resuspendiert und mit proteolytischen Enzymen behandelt. In Frage kommen Pancreatin oder die darin enthaltenen Einzelenzyme Trypsin, Chymotrypsin, sowie Papain, Bromelain, Ficin, Rennin, Subtilisin u. a. bzw. deren Mischungen, sofern kein deutlicher, gegenseitiger Abbau erfolgt. Vorteilhaft ist weiterhin der Einsatz von Esterasen, wie z. B. (Triacylglyceryl-)Lipase(n) entweder als Bestandteil des Pancreatin-Gemisches oder als Einzelenzym bzw. andere Esterasen, sofern sie die Esterbindung der PHA nicht spalten. Dadurch wird z. B. die Solubilisierung von Fetten und Lipiden, v. a. des Lipopolysaccharid-Anteils der Zellwand gram-negativer Bakterien erleichtert. Zur Entfernung der freiwerdenden Fettsäuren wird die Suspension mit entsprechenden Tensiden versetzt. Nach dieser Behandlung werden die Partikel auf bekannte Art von der Flüssigkeit abgetrennt und die erhaltene Feuchtmasse zumindest einmal oder mehrmals mit deionisiertem, tensidhaltigem Wasser gewaschen.

Verfahrensschritt 3

(optional je nach Restgehalt an Nicht- PHA-Zellanteilen und Reinheitsanforderungen):

Die Feuchtmasse oder deren Suspension wird zur Entfernung des (teilweise) verbliebenen Peptidoglykans mit Lysozymen, wie z. B. Mureinase, und evtl. mit Cellulasen zur Unterstützung der Spaltung der β-1,4-Bindung, behandelt. Nach der Behandlung werden die Partikel aus der Suspension abgetrennt und die Feuchtmasse wie schon beschrieben gewaschen. Falls nicht schon in einem vorherigen Schritt erfolgt, wird nun die erhaltene PHA auf bekannte Weise getrocknet. Bei genügend hohem PHA-Gehalt erfolgt die Trocknung durch die hydrophobe Eigenschaft der PHA relativ schnell und kann bereits bei Raumtemperatur beobachtet werden.

Verfahrensschritt 4

(optional je nach Restgehalt an Nicht- PHA-Zellanteilen und Reinheitsanforderungen):

Die trockene Masse aus PHA-Granula wird ggf. zur Entfernung von restlichen Verunreinigungen, insbesondere von Lipiden, mit Nicht-PHA-Lösungsmitteln nachgereinigt. Besonders geeignet sind dazu Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Propanole, Ketone wie Aceton oder Ethylmethylketon, Ester wie Methyl- und Ethylacetat, sowie Alkane wie Pentan, Hexan, Heptan bzw. Gemische aus allen beschriebenen Lösungsmitteln bzw. Gemische mit Wasser.

Eine andere Möglichkeit zur Nachreinigung ist die Umfällung der PHA mittels PHA-Lösungsmitteln, wobei die PHA-Lösung zuvor von evtl. unlöslichen Verunreinigungen z. B. durch Filtration gereinigt wird.

Eine Reinigung der bereits erhaltenen relativ reinen PHA kann ebenfalls in einem weiteren Schritt durch eine erneute Behandlung mit dem reduzierenden Mittel, wie z. B. dem Dithionit u. a., erfolgen.

Der große Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in seiner vereinfachten Abtrennung der Biomasse aus der Kulturflüssigkeit durch eine eventuelle Vorbehandlung (Agglomeration) und der Sedimentation der (partiell abgebauten) Mikroorganismen bzw. der Polymergranula, sowie die sofortige Weiterbehandlung ohne - wie oft bei der Lösungsmittel-Extraktion - einen langwierigen Trocknungs­ schritt während der Aufarbeitung durchführen zu müssen. Darüber hinaus wird der mechanische Zellaufschluß durch die zeitlich kürzere und effektivere chemisch-enzymatische Behandlung ersetzt. Besonders hervorzuheben ist die effiziente Reduzierung der Nicht-PHA-Zellanteile aus der Biomasse durch den chemischen Schritt, vor allem in Verbindung mit enzymatischen Schritten. Überraschend war dabei insbesondere die deutliche Reduzierung der Nicht-PHA- Zellanteile durch den chemischen Schritt, ohne starke Qualitätseinbußen der Polymer-Eigenschaften, so dass die Methode besonders die Gewinnung von PHA aus Biomassen mit relativ geringem PHA-Gehalt erlaubt.

Die erzielten Ausbeuten liegen deutlich höher als bei Verwendung üblicher PHA-Extraktionsmittel, da die Zellmasse mit den Polyestern praktisch immer in denselben Gefäßen verbleibt und daher Materialverluste gering sind. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können mindestens etwa 75%, vorzugsweise bis mehr als 95% der in der Biomasse vorhandenen PHB bzw. deren Copolymere gewonnen werden.

Auch die gesundheitliche Belastung ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als äußerst gering anzusehen, besonders im Vergleich zu Extraktionen mit (halogenhaltigen) Extraktionsmitteln, die zum Teil nachgewiesener Maßen Leberschäden oder sogar Krebs hervorrufen. Auch für die Umwelt sind die Gefahren als sehr gering einzuschätzen, da als Lösungsmittel hauptsächlich Wasser verwendet wird. Die eingesetzten Chemikalien und Enzyme werden nur in relativ geringen Mengen eingesetzt und sind praktisch biologisch abbaubar. Für eine eventuelle Nachextraktion eingesetzte Lösungsmittel sind relativ ungiftig und recyclebar.

Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungs­ beispielen näher beschrieben werden, ohne sie darauf zu beschränken:

Beispiel 1 Gewinnung von PHB aus einer Methylocystis-Biomasse

Als Rührkesselablauf wurden 6,5 Liter einer, durch Separation eingedickten Suspension des PHB-Produzenten Methylocystis spec. GB 25, mit einer Biomassekonzentration von 138,5 g/l verwendet (d. h. insgesamt 900 g Biotrockenmasse). Der PHB-Gehalt betrug zu Beginn 55,3%, bezogen auf Biotrockenmasse. Die Gewinnung der PHB erfolgte in einem üblichen Doppelmantel-Reaktionsgefäß mit Rührer.

In Schritt 1 wurde der pH-Wert der Suspension von anfangs 5,1 mit Natronlauge auf 8,5 erhöht. Dazu kamen 1,8 g (0,2% bezogen auf Biotrockenmasse) nichtionisches Tesid und 4,5 g (0,5%) Ethylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz. Schließ­ lich wurden 90,0 g (10,0%) Natriumdithionit (mit iodometrisch gemessen 87% Dithionit-Gehalt) zugegeben und unter Rühren und Schutzatmosphäre innerhalb einer Stunde von 20°C auf 80°C erwärmt. Nach einer halben Stunde bei 80°C wurde die Suspension auf 60°C abgekühlt und warm zentrifugiert (ca. 20000 × g). Daran wurden die Feuchtmasse- Pellets in demineralisiertem Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die auf diese Weise einmal gewaschene Feuchtmasse wurde für Schritt 2 erneut auf das ursprüngliche Volumen resuspendiert.

In Schritt 2 wurde der pH-Wert kontrolliert, er lag wie gefordert bei 8,5. Die leicht alkalischen Bedingungen sind für das pH-Optimum der folgend zugesetzten Enzym-Mischung Triacylglyceryl-Lipase (1,8 g bzw. 0,2%) und Pancreatin (1,8 g bzw. 0,2%) wichtig. Dazu wurde erneut 1,8 g nichtionisches Tensid zugesetzt. Die Einwirkungsdauer betrug 12 h unter Rühren und Schutzgas bei 40°C. Im Anschluß erfolgte wieder die Abtrennung der Partikel durch Zentrigugation, eine Wäsche, sowie die Resuspendierung auf das Ausgangsvolumen.

In Schritt 3 wurde der pH-Wert mittels verdünnter Schwefel­ säure von mittlerweile 7,5 auf 5,0 abgesenkt und 1,8 g (0,2% auf die ursprüngliche Biotrockenmasse) Lysozym (Mureinase) zugesetzt. Die Einwirkung dauerte 4 h bei 40°C unter Rühren und Schutzatmosphäre. Im Anschluß kamen 1,8 g Papain dazu und die Suspension wurde 2 h bei 60°C belassen. Am Ende erfolgte Zentrifugation und 3 weitere Wäschen mit deionisiertem Wasser. Zur Trocknung bei Raumtemperatur wurde die feuchte Masse aus PHB in flacher Form ausgebreitet. Die so gewonnene PHB enthielt noch Verunreinigungen, v. a. freie Fettsäuren (Analyse mittels GC-MS), welche mit einer Nachextraktion mit dem Nicht-PHB- Lösungsmittel Ethylacetat entfernt werden konnten (Schritt 4). Es wurden bei einer Ausbeute von ca. 95%, insgesamt 472 g PHB gewonnen. Die gaschromatographische Untersuchung der Reinheit der PHB lieferte am Ende der Aufarbeitung einen Durchschnittsgehalt von 99,5%.

Diagramm 1 zeigt die Anreicherung des PHB-Gehaltes während der Aufarbeitung. Hier zeigt sich auch deutlich der Effekt des erfindungsgemäßen, chemischen Zusatzes von Dithionit.

Beispiel 2 Gewinnung von PHB aus einer Paracoccus-Biomasse

Als Rührkesselablauf wurden 15 Liter einer durch Flockung und Dekantieren eingedickten Suspension des PHB-Produzenten Paracoccus denitrificans verwendet. Die Biotrockenmasse betrug insgesamt 5848 g, d. h. es lag eine Biomassekonzentration von 390 g/l vor. Der PHB-Gehalt betrug zu Beginn 54,0%, bezogen auf die Biotrockenmasse. Die Gewinnung der PHB erfolgte wieder im Doppelmantel- Reaktionsgefäß mit Rührer.

In Schritt 1 wurde der pH-Wert der Suspension von anfangs 4,8 mit Natronlauge auf 8,5 erhöht. Dazu kamen 11,5 g (ca. 0,2% bezogen auf Biotrockenmasse) nichtionisches Tensid und 30,0 g (0,5%) Ethylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz. Schließlich wurden 180,0 g (3,0%) Natriumdithionit zugegeben und unter Rühren und Schutzatmosphäre innerhalb einer Stunde von 20°C auf 80°C erwärmt. Nach einer halben Stunde bei 80°C wurde die Suspension auf 60°C abgekühlt und warm zentrifugiert (ca. 20000 × g). Daran schloß sich die Resuspendierung der Feuchtmasse-Pellets in demineralisiertem Wasser und eine weitere Zentrifugation an. Die auf diese Weise einmal gewaschene Feuchtmasse wurde für Schritt 2 erneut auf das ursprüngliche Volumen resuspendiert.

In Schritt 2 wurde der pH-Wert kontrolliert und von 7,2 mit Natronlauge erneut auf 8,5 eingestellt. Wie in Beispiel 1 wurde jetzt die Enzym-Tensid-Mischung aus Triacylglyceryl- Lipase, Pancreatin und Tensid zugesetzt. Die Einwirkungsdauer betrug 12 h unter Rühren und Schutzgas bei 40°C. Im Anschluß erfolgte wieder die Abtrennung der Partikel durch Zentrigugation, eine Wäsche, sowie die Resuspendierung auf das Ausgangsvolumen.

In Schritt 3 wurde der pH-Wert mittels verdünnter Schwefelsäure auf 5,5 abgesenkt und Lysozym zugesetzt. Die Einwirkung dauerte 4 h bei 40°C unter Rühren und Schutzatmosphäre. Im Anschluß kamen Papain dazu und die Suspension wurde 2 h bei 60°C belassen. Am Ende erfolgten wie in Beispiel 1 Zentrifugation und 3 Wäschen mit deionisiertem Wasser. Die erhaltene PHB-Masse wurde flach ausgebreitet und bei Raumtemperatur getrocknet. Wie in Beispiel 1 enthielt die PHB wieder Verunreinigungen wie freie Fettsäuren und Indolverbindungen (GC-MS-Analyse), welche mittels Nachextraktion mit Ethylacetat entfernt wurden (Schritt 4). Es wurden bei einer Ausbeute von ca. 85%, insgesamt 2653 g PHB gewonnen.

Diagramm 2 zeigt die Anreicherung des PHB-Gehaltes während der Aufarbeitung. Auch hier zeigt sich der Effekt des erfindungsgemäßen, chemischen Zusatzes von Dithionit.

Vergleichsbeispiel 3

Aus üblicherweise zur Verfügung stehenden PHA-Produzenten mit einem durchschnittlichen PHB-Gehalt von 45% konnten zum Beispiel durch alleinige Oxidation mittels Wasserstoffperoxid im Alkalischen in Anlehnung an DE 694 07 177 T2 nur eine 80%-ige Roh-PHB erhalten werden.

Auch eine alleinige stufenweise enzymatische Behandlung mit drei proteolytischen Enzymen (Papain, Pepsin, Bromelain), Tensiden und Chelatbildnern, sowie einer sich anschließenden Behandlung mit einer Mureinase erbrachte nur einen maximalen PHB-Gehalt von 88%.

Diagramm 1

Diagramm 2

Claims (11)

1. Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von Homo- oder Copolymeren von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) aus Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse vor und/oder nach dem enzymatischen Aufschluss mindestens einmal mit einem chemischen Mittel behandelt wird, welches die Nicht-PHA-Zellanteile der Biomasse reduziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung mit einem Dithionit-Salz durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei einem pH-Wert von 7 bis 10 und einer Temperatur von 20 bis 110°C gearbeitet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung mit Wasserstoffperoxid bei einem pH-Wert im sauren Bereich durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die aufzuschließende Biomasse zur vermehrten Bildung von Agglomeraten vorbehandelt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bildung von Agglomeraten der pH-Wert der Biomasse in den sauren Bereich verschoben wird, vorzugsweise auf pH-Werte von 2 bis 6,5.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Entfernung von Restverunreinigungen die gewonnene PHA mit Nicht-PHA-Lösungsmitteln, vorzugs­ weise Wasser, Alkohole, Ketone, Ester, Alkane oder deren Gemische nachextrahiert wird und/oder dass die PHA mit PHA-Lösungsmitteln umgefällt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische und enzymatische Behandlung und ggf. die Vorbehandlung in einem Reaktionsgefäß erfolgen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Biomasse mit einem PHA-Gehalt < 60 Gew.-% eingesetzt wird.

10. Verwendung von chemischen Mitteln zur Reduzierung der Nicht-PHA-Zellanteile (NPCM) bei der enzymatischen Gewinnnung von Homo- oder Copolymeren von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) aus Biomasse, bevorzugt aus Biomasse, welche einen relativ geringen PHA-Gehalt von < 60%, aufweist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Dithionit-Salz oder Wasserstoffperoxid als chemisches Mittel eingesetzt wird.