DE10003811A1 - Verfahren zur Herstellung eines serumhaltigen Kulturmediums für Zellen sowie dessen Verwendung - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines serumhaltigen Kulturmediums für Zellen, insbesondere Human- und Tierzellen, beschrieben, bei dem das Kulturmedium und/oder das Serum mittels einer Ultrafiltrationsmembran gefiltert wird. Vorzugsweise wird die Abreicherungsrate der Filtrationsmembran mittels Viren der Familie Leviviridae bzw. vergleichbar kleiner Bakteriophagen bestimmt. Das so erhaltene Kulturmedium wird zur Kultivierung von natürlichen und rekombinanten Zellen sowie von Hybridomazellen, sowie zur Herstellung von diagnostischen Kontrollseren, insbesondere zur Herstellung von pharmazeutischen und/oder diagnostischen Präparaten verwendet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von serumhaltigen Kulturmedien für Zellkulturen sowie deren Ver­ wendung zur Kultivierung von Zellen und zur Herstellung von pharmazeutischen und diagnostischen Präparaten.

Mit der fortschreitenden Entwicklung der Molekularbiologie und Gentechnik nimmt die Zahl der aus natürlichen oder künstlich manipulierten Zellen gewinnbaren Substanzen, wie pharmazeu­ tisch wirksamen Substanzen sowie diagnostische Reagenzien, insbesondere Antikörper, immer weiter zu. Für ihre Gewinnung ist es nötig, die jeweiligen Zellen in Kulturen zu züchten. Zur Verbesserung des Wachstums derartiger Zellkulturen ist es notwendig, ein entsprechendes Kulturmedium zuzusetzen. Derar­ tige Medien weisen in der Regel eine äußerst komplexe Zusam­ mensetzung auf. Zur Förderung der Zellproliferation enthält ein derartiges Kulturmedium üblicherweise Serum als Additiv, wie beispielsweise ein fetales Kälberserum.

Diese Seren werden normalerweise aus dem Blut von Schlachttie­ ren gewonnen. Dabei wird nach erfolgter Blutgerinnung der fe­ ste agglutinierte Teil (Blutkuchen) abgetrennt, wobei die flüssige, wässrige Phase das Serum bildet. Serum enthält da­ her, im Gegensatz zu Blutplasma, kein Fibrinogen. Es besteht im wesentlichen aus hochmolekularen Proteinen wie Albumin, welches mit 35-55 g/l die Hauptklasse der Serumbestandteile darstellt sowie weitere Transportproteine, Immunglobuline, En­ zyme, wie Cholinesterase oder Enzyminhibitoren oder auch Lipoproteine, die dem Lipidtransport dienen. In niedrigem Anteil sind Hormone (z. B. Insulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfakto­ ren) und Wachstumsfaktoren (Z. B. Erythropoietin) enthalten. Nicht alle sind im molekularen Detail aufgeklärt und rekombi­ nant verfügbar. Fetale Seren enthalten einen besonders hohen Anteil von Faktoren mit wachstumsfördernden Eigenschaften, weshalb diese bevorzugt werden. Ein ausreichendes Anwachsen bzw. eine ausreichende Proliferation von menschlichen und tie­ rischen Zellen in Kulturen ist ohne den Zusatz von derartigen Seren nur schwer möglich. Da diese Seren aus tierischen Pro­ dukten gewonnen werden, besteht bei ihrer Verwendung die Ge­ fahr, daß die Zellkulturen mit Viren und/oder Bakterien konta­ miniert werden. Darüber hinaus besteht bei der Verwendung von Rinderseren, wie beispielsweise dem fetalen Kälberserum, zu­ sätzlich die Gefahr der Verunreinigung mit Prionen.

Zur Vermeidung dieser Probleme ist es daher bereits versucht worden, Serumersatzstoffe zu entwickeln, die jedoch meist nicht gleich gut wirken wie die originalen Human- oder Tierse­ ren. Darüber hinaus sind solche Ersatzstoffe häufig nur für ausgewählte Zelltypen verwendbar.

Für die Verwendung von mit Human- und/oder Tierzellen gewonne­ nen pharmazeutischen Präparaten bzw. diagnostischen Mitteln stellt daher die Verwendung von Seren ein Sicherheitsproblem dar. Da in Zellbänken gelagerte Produktionschargen nach dem Auftauen aus flüssigem Stickstoff üblicherweise ohne die Zuga­ be eines geeigneten Serums, insbesondere fetalen Kälberserums (FKS) nicht anwachsen, ist praktisch jede in einer Zellbank aufbewahrte Zellinie mit entsprechenden Seren in Kontakt ge­ kommen.

Aus diesem Grund, insbesondere auch wegen der BSE-Problematik sowie der Maul- und Klauenseuche, werden von vielen nationalen Arzneimittelbehörden, wie beispielsweise der amerikanischen FDA, nur noch Seren zugelassen, die nicht aus Europa stammen und deren genaue Herkunft nachgewiesen ist.

Aus der EP-B 0 514 421 der gleichen Anmelderin ist es bekannt, Viren und andere Pathogene mittels einer Ultrafiltrationsmem­ bran zu entfernen, deren Abreicherungsrate zuvor mittels Viren der Familie Leviviridae oder anderer vergleichbar kleiner Bak­ teriophagen ermittelt wurde.

In der EP-B 0 776 212 ist beschrieben, daß sich mit einer der­ artigen Ultrafiltration auch Prionen, wie beispielsweise die Erreger der spongiformen Enzephalopathie (BSE) vollständig entfernen lassen.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein Kulturmedium für das Zellwachstum, insbesondere von natürlichen und synthetischen bzw. rekombinanten menschlichen und tierischen Zellen bereit­ zustellen, welches die zuvor geschilderten Probleme überwindet und welches mehr oder weniger frei ist von den zuvor erwähnten pathogenen Substanzen bzw. diese bis zur Unbedenklichkeit ab­ gereichert sind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Seren auch dann noch ihre Wirksamkeit auf das Zellwachstum aufweisen, wenn diese zuvor ein oder mehrere Male über eine Ultrafiltra­ tionsmembran gefiltert wurden. Dies ist umso überraschender, da fast alle wesentlichen Bestandteile des Serums sehr große Molekulargewichte aufweisen, so daß sie bei einer Ultrafiltra­ tion zurückgehalten werden. Daher weist das auf diese Weise gewonnene Filtrat keine dieser wesentlichen hochmolekularen Proteine mehr auf.

Darüber hinaus war es überraschend, daß sich solche Seren pro­ blemlos durch eine Ultrafiltrationsmembran leiten lassen ohne diese zu verstopfen, da bereits ihre Filtration mittels eines 0,22 µm Sterilfilters zu einer Verstopfung des Filters führt.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von serumhaltigen Kulturmedien für Zellkulturen, indem das Serum mittels einer Ultrafiltrationsmembran gefiltert wird.

Vorzugsweise wird hierfür eine Ultrafiltrationsmembran verwen­ det, deren Abreicherungsrate zuvor ermittelt wurde.

Ein Verfahren zur Bestimmung der Abreicherungsrate ist bei­ spielsweise in der EP-B 0 514 421 beschrieben. Danach wird zur Bestimmung des Ultrafilters bzw. der Ultrafiltrationseinheit mit Viren der Familie Leviviridae oder anderer vergleichbarer kleiner Bakteriophagen beaufschlagt und der Titer der Viren vor und nach der Abreicherung bestimmt. Aus dem Verhältnis der so bestimmten Titer läßt sich die Abreicherungsrate ermitteln. Bevorzugte Testviren sind MS2, F2, F4, Qβ, Vk, ST oder R17, die bei H. Fraenkel, Konrad, "The Viruses Catalogue, Characteriza­ tion and Classification", Plenum Press New York, 1982 be­ schrieben sind. Besonders bevorzugt wird der Bakteriophage fr als Testvirus verwendet, der bei ATCC unter der Nr. 15767-B1 hinterlegt ist und der in "Virology", Band 123, Seiten 271-273 (1964), Knolle & Hoffmann-Berling beschrieben ist.

Vorzugsweise wird die Ultrafiltration mit einer Spiralpatrone durchgeführt. Die Patronen werden dabei über eine Pumpe be­ schickt. Vor Einsatz der Filtrationspatronen wird der Virus- Abreicherungsfaktor mit dem Testvirus ermittelt. Die Testlö­ sung, die die Testviren in bekannter Menge enthält, wird über die Patrone im Tangentialfluß filtriert, und zwar unter genau definierten Druckbedingungen. Im Filtrat wird dann, nach be­ kanntem Verfahren, der Virustiter bestimmt. In einer bevorzug­ ten Ausführungsform wird danach die Filtrationsmembran einem Druckhaltetest unterzogen, wie er beispielsweise in der EP-B 0 599 981 beschrieben ist. Danach wird das Serum in derselben Patrone unter Einhaltung der gleichen Bedingungen filtriert und anschließend ein weiterer Druckhaltetest durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Integrität der Membran erhalten ist. Derartige Membranen sind nämlich sehr empfindlich und bei der Handhabung können mikroskopisch kleine Löcher bzw. Poren ent­ stehen, welche das Ergebnis der Filtration beeinträchtigen. Durch die zweite Anwendung des Druckhaltetestes ist sicherge­ stellt, daß die Membran ihre mit dem Testvirus ermittelte Ab­ reicherungsrate beibehalten hat.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Filtrationsmem­ bran einem sogenannten Precoating unterzogen, d. h. daß über sie eine proteinhaltige Lösung filtriert wird. Vorzugsweise ist die proteinhaltige Lösung die gleiche Lösung, welche spä­ ter filtriert werden soll. Die Filtrationslösung des Precoa­ tings wird üblicherweise verworfen. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, nach dem Precoating die Filtrationsmembran mit einem Liter eines üblichen Puffers, vorzugsweise eines Phosphatpuf­ fers zu spülen.

Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäß erhältliche Kulturme­ dium ein tierisches Serum, wie Humanserum, ein Pferdeserum, ein Rinderserum, insbesondere ein Kälberserum, wobei fetales Kälberserum ganz besonders bevorzugt ist.

Bevorzugte Membranen weisen einen Ausschluß von ≦ 100 KD, ins­ besondere ≦ 50 KD auf, wobei 40-20 KD und hierbei 30 KD ganz besonders bevorzugt ist. Erfindungsgemäß hat es sich sogar er­ wiesen, daß Membranen mit einer Ausschlußgröße von 20 KD durchaus noch verwendbar sind.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines derartigen Mediums zur Kultivierung von Zellen, insbesondere zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten und/oder diagnostischen Präparaten.

Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung betrifft die Herstel­ lung von diagnostischen Kontrollseren. Derartige Kontrollseren werden in Labors, insbesondere in medizinischen diagnostischen Labors zur Kalibrierung und zur Kontrolle von Analyseverfahren und Analysegeräten verwendet. Dabei werden die zu analysieren­ den Werte in den Kontrollseren zuerst mittels Referenzverfah­ ren bestimmt (z. B. Enzymkonzentrationen, diagnostische Protei­ ne, wie Tumormarker, etc.) und dann mit denjenigen im jeweili­ gen Analyseverfahren bzw. mittels dem automatischen Analysege­ räten erhaltenen Werten verglichen. Solche Kontrollseren sind üblicherweise gepoolte Seren von Blutspendern, welche potenti­ ell infektiös sind, da sie vor allem in den USA aus gepooltem Plasma von solchen Spendern hergestellt werden, die ein hohes Risiko an Infektionserkrankungen aufweisen. Um das mit derar­ tigen Seren arbeitende Laborpersonal zu schützen, ist auch hier eine Sicherheit gegenüber Viren und anderen pathogenen Substanzen erwünscht. Dies gilt ganz besonders für humanes Se­ rum, welches aufgrund der Pathogenezität der innewohnenden Er­ reger eine besondere Gefahr für das Laborpersonal darstellt. Aus diesem Grunde werden auch immer wieder besondere Warnhin­ weise zur Handhabung solcher Seren gegeben. Die Erfindung be­ trifft somit auch die Verwendung von mittels dem erfindungsge­ mäßen Verfahren gereinigten dekontaminierten Kontrollseren.

Die Erfindung soll an den folgenden Beispielen näher erläutert werden.

1. Ultrafiltration

Je ein Ultrafilter vom Typ S1Y30 mit einer Ausschlußgröße von 30 KD (Ser. Nr. 06759018) sowie vom Typ S1Y100 mit einer Ausschlußgröße von 100 KD (Ser. Nr. 32369021), beide von Amicon, wurden zuerst mit 0,1 NaOH und dann mit Ampuwa (Ampullenwasser für Infektionszwecke, erhältlich von Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) bis zur Neutralität gespült. Dabei wurde ein Druck von 1,5 Bar verwendet. Anschließend wurde mit 0,5 l PBS (319 mOsm/kg) gespült. Über den so vorbehandelten Filter wurde 0,5 l eines fetalen Kälberserums (FKS) filtriert (Precoating) und anschließend mit 1 l PBS gespült. Über die so behandelte Membran werden anschließend 2 l FCS filtriert. Der gesamte Vorgang wurde an beiden Membranen viermal wiederholt. Auf die­ se Weise wurden filtrierte FCS-Lösungen erhalten, die einmal bzw. fünfmal einer Ultrafiltration unterzogen wurden.

2. Proliferationstest

Die so erhaltenen Seren wurden an der humanen B-Zelllinie (BM92) sowie mit X63 Ag8-Zellen getestet. BM 92 ist eine huma­ ne B-Zelllinie, die ursprünglich von Prof. Walter Bodmer, In­ ternational Cancer Research Fund, London, UK kultiviert wurde. X63 Ag8 ist eine Maus Myelomzellinie, die bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, GB unter der Hinterlegungsnummer ECACC 85 011 420 hinterlegt wur­ de, die üblicherweise zur Herstellung von B-Zellhybridomen bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet wird. (Beide Zelllinien wurden freundlicherweise von Frau Dr. Corne­ lia Carstens, Abteilung für Immunbiologie der Universität Bonn, zur Verfügung gestellt.) Als Proliferationsmedium wurde RPMI 1640 (Basismedium für Zellkulturen, entwickelt am Roose­ velt Park Memorial Institute und kommerziell erhältlich z. B. bei Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Karlsruhe oder auch bei Biochrom, Berlin oder Sigma, Deisenhofen, beide in Deutsch­ land) verwendet.

Die Proliferation der B-Zellen sowie der Myelomzellen wurde anhand ihres Einbaus von radioaktiven [³H]-Thymidin bestimmt.

Dabei wurden die Zellen dreimal mit FCS-freiem Medium gewa­ schen und 2 × 10⁴-Zellen in 200 µl Kulturen (Triplikate) in 96- Lochplatten mit den zu prüfenden ein- bzw. fünffach filtrier­ ten FCS-Lösungen versetzt (10% Testlösung in RPMI1640). Die Zellen wurden dann 48 Stunden im CO₂-Brutschrank kultiviert. In den letzten 18 Stunden der Kulturdauer wurde pro Versuchsan­ satz 1 µCi [³H]-Thymidin zugesetzt und nach Ende des Experi­ ments wurden die Zellen mit Hilfe eines Zell-Harvesters geern­ tet und das eingebaute radioaktive Thymidin mit Hilfe eines β- Counters bestimmt. Hierbei zeigte es sich, daß die Wirksamkeit von FKS durch mehrmalige Filtration nicht eingeschränkt wird, wie dies den folgenden Fig. 1 und 2 zu entnehmen ist.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung eines serumhaltigen Kulturmediums für Zellen, insbesondere Human- und Tierzellen, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Kulturmedium und/oder das Serum mit­ tels einer Ultrafiltrationsmembran gefiltert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß fe­ tales Kälberserum verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlußvolumen von 30 KD verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsmembran einem Pre­ coating unterworfen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Precoating mit Serum durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abreicherungsrate der Filtrations­ membran mittels Viren der Familie Leviviridae bzw. ver­ gleichbar kleiner Bakteriophagen bestimmt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Integrität der Ultrafiltrationsmem­ bran mittels einem Druckhaltetest bestimmt wird.

8. Verwendung eines nach den Ansprüchen 1 bis 7 erhaltenen serumhaltigen Kulturmediums zur Kultivierung von natürli­ chen und rekombinanten Zellen sowie von Hybridomazellen, sowie zur Herstellung von diagnostischen Kontrollseren.

9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Herstellung von pharmazeuti­ schen und/oder diagnostischen Präparaten, sowie zur Her­ stellung von diagnostischen Kontrollseren.

10. Verwendung von nach Anspruch 8 erhaltenen Kontrollseren zum Kalibrieren und zur Kontrolle von diagnostischen Verfahren.