DD295849A5

DD295849A5 - Neuartige 5,11-dihydo-6h-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]diazepin-6-one und thione und ihre anwendung bei der verhuetung bzw. behandlung von aids

Info

Publication number: DD295849A5
Application number: DD90342100A
Authority: DD
Inventors: Guenther Schmidt; Wolfhard Engel; Guenter Trummlitz; Wolfgang Eberlein; Karl D Hargrave
Original assignee: ��@��@��@��Kk��; ��K@��@��@��@��@��@��k��
Priority date: 1989-06-28
Filing date: 1990-06-26
Publication date: 1991-11-14
Also published as: KR910000727A; DE69007891D1; HUT55017A; NO174468B; DE69007891T2; OA09741A; AP189A; IE65247B1; FI92828B; FI92828C; HU206504B; HU904021D0; NZ234261A; AP9000188A0; ES2063202T3; CA2019812A1; KR0160285B1; IL94883A; RU2024522C1; FI903225A0

Abstract

Erfindungsgemaesz werden neue 5,11-Dihydro-6H-dipyrido * und -thione der allgemeinen Formel hergestellt, in der beispielsweise bedeuten: Z Sauerstoff oder Schwefel; R1 Wasserstoff, Alkyl, Fluoralkyl, Alkenyl, Alkynyl, 2-Halo-propen-1-yl, Arylmethyl, R2 Wasserstoff, Alkyl, Fluoralkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkoxyalkyl, Alkylthioalkyl, Alkanoyl, Hydroxyalkyl, Arylmethyl, R3 bis R8 jeweils Wasserstoff oder eines von R3 bis R8 Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Alkoxycarbonyl, Hydroxyalkyl, Alkanyl oder R3, R4 und R5 unabhaengig voneinander Wasserstoff oder Alkyl, unter der Bedingung, dasz mindestens einer davon Wasserstoff ist oder eines von R3, R4 und R5 Butyl ist, und R6, R7 und R8 unabhaengig voneinander Wasserstoff oder Alkyl unter der Bedingung, dasz mindestend einer davon Wasserstoff ist oder eines von R6, R7 und R8 Butyl ist waehrend die uebrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind. Formel{Hemmnung der HIV-I Revetase; Verhuetung bzw. Behandlung von AIDS; Anwendung als Arzneimittel}

Description

b) eine Nitrogruppezu einer Aminogruppehydrolisiert wird,

c) eine Aminogruppe acyliert wird, um eine Alkanoylaminogruppe zu bilden,

d) eine Amino- oder Aminoalkylgruppe alkyliert wird, um eine Mono- oder Dialkylaminogruppe zu bilden,

e) das Stickstoffatom der 11-Stellung in einer Verbindung der Formel I acyliert wird, in der R² Wasserstoff ist; dies sollte am besten im Anschluß an Prozeß E erfolgen,

wonach die Verbindung der Formel I an sich oder als ihr pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz isoliert wird.

6. Methode zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats, dadurch gekennzeichnet, daß eine nach einem der Ansprüche 1 bis 3 definierte bzw. mittels einer der Methoden nach Anspruch 6 hergestellte Verbindung mit einem aus pharmazeutischer Sicht akzeptablen Träger- oder Bindemittel gemischt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neuartige 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-one und -thione sowie deren aus pharmazeutischer Sicht akzeptablen Säureadditionssalze, Methoden zur Herstellung dieser Verbindungen, die Anwendung dieser Verbindungen bei der Verhütung bzw. Behandlung von AIDS sowie pharmazeutische Präparate, in denen solche Verbindungen enthalten sind.

Vorgeschichte der Erfindung

Die AIDS-Krankheit (erworbene Immunschwäche) wird durch das HIV-Virus (Human Immunodeficiency Virus) verursacht, insbesonderte durch den als HIV-1 bekannten Stamm.

Wie auch andere Viren kann sich das HIV-1 nicht reduplizieren, ohne den biosynthetischen Apparat der infizierten Wirtszelle in Beschlag zu nehmen. Es veranlaßt diesen Appart, die Struktureiweiße zu produzieren, die die virale Nachkommenschaft darstellen. Den Code für diese Proteine trägt das im infizierenden Viruspartikel—dem Virion - enthaltene genetische Material. Da es sich beim HIV um eine Retrovirus handelt, besteht allerdings das genetische Material aus RNA und nicht wie im Genom der Wirtszelle aus DNA. Somit muß die virale RNA erst in DNA umgewandelt und dann in das Genom der Wirtszelle integriert werden, damit die Wirtszelle die angestrebten viralen Proteine erzeugt. Die Umwandlung von RNA in DNA erfolgt mittels Enzym-Revertase (RT), die zusammen mit der RNA im infizierenden Virion enthalten ist. Die Revertase hat drei enzymatische Funktionen; sie fungiert als RNA-abhängige DNA-Polymerase. Indem sie zuerst als RNA-abhängige DNA-Polymerase, als Ribonuclease und als DNA-abhängige DNA-Polymerase fungiert, stellt die RT eine einsträngige DNA-Kopie der viralen RNA her. Danach fungiert RT als Ribonuclease und löst die gerade hergestellte DNA vom Original - der viralen RNA- ab, woraufhin sie die ursprüngliche RNA zerstört. Zuletzt stellt die erneut als DNA-abhängige DNA-Polymerase wirkende RT einen zweiten, komplementären DNA-Strang her, wobei sie den ersten DNA-Strang als Matrize benutzt. Die beiden Stränge bilden dann eine DNA-Doppelhelix, die durch ein anderes, Integrase genanntes Enzym in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Verbindungen, die die enzymatischen Funktionen der HIV-1 -Revertase hemmen, hemmen also auch die Replikation von HIV-1 in infizierten Zellen. Derartige Verbindungen sind somit bei der Verhütung bzw. Behandlung der HIV-1-Infektion beim Menschen von Nutzen.

Beschreibung der Erfindung

Was die stoffliche Zusammensetzung der Erfindung anbetrifft, so besteht ein Aspekt darin, daß sie 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-one und -thione der Formel

R" V M \nt

umfaßt, bei denen

Z Sauerstoff oder Schwefel ist;

R¹ Wasserstoff, Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl oder Alkynyl mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, 2-Halo-propen-1 -yl, Arylmethyl (wobei die Arylkomponente Phenyl, Thienyl oder Furanyl ist, das entweder nichtsubstituiert oder durch Methyl, Methoxy oder Halogen substituiert ist), Alkanoyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, oder Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen ist;

R² Wasserstoff, Alkyl oder Fluoralkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl oder Alkynyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkanoyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Arylmethyl (wobei die Arylkomponente Phenyl, Thienyl oder Furanyl ist, das entweder unsubstituiert oder

durch Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxyl oder Halogen substituiert ist). Phenyl (das entweder unsubstituiert oder durch Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy oder Halogen substituiert ist) oder Alkoxycarbonylmethyl ist, wobei die Alkoxykomponente 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält; und R³ bis R⁸ jeweils Wasserstoff sind; oder eines von R³ bis R⁸ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkoxy oder Alkylthio mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkoxycarbonyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Hydroxyalkyl mit 1 bis4 Kohlenstoffatomen; Alkanoyl mit 2 bis4 Kohlenstoffatomen; Alkanoyloxy mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkanoylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Aminoalkyl mit1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkoxycarbonylalkyl, wobei die Alkoxy-und Alkylkomponenten jeweils 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthalten; Carboxyalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Mono- oder Di-alkylamino, wobei jede Alkylkomponente 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthält; Cyan-, Nitro-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Mono- oder Di-Alkylaminoalkyl, wobei jede Alkylkomponente 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthält; Azido oder Halogen, wobei die anderen fünf Substituenten Wasserstoff sind; ist, oder

R³, R⁴ und R⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, unter der Bedingung, daß mindestens eine dieser Substituenten Wasserstoff ist, oder eines von R³, R⁴ und R⁶ Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind, oder eines von R³, R* und R⁵ Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind; und

R^e, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist, oder eines von R⁶, R⁷ und R⁸ Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind, unter der Bedingung, daß, wenn Z Sauerstoff ist und R¹ und R² gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, mindestens eines von R³ bis R⁸ kein Wasserstoff ist.

Ein subgenerischer Aspekt der Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel I, bei denen Z Sauerstoff oder Schwefel ist;

R' Wasserstoff, Alkyl oder Fluoralkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Trihalomethyl, Alkenyl oder Alkynyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, 2-Halo-propen-1-yl oder Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen ist; R² Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkenyl oder Alkynyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkanoyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylmethyl (wobei die Arylkomponente Phenyl oder Thienyl ist, das entweder nichtsubstituiert oder durch Methyl, Methoxy, Hydroxyl oder Halogen substituiert ist), Phenyl (das entweder nichtsubstituiert oder durch Methyl, Mehtoxy, Hydroxyl oder Halogen substituiert ist) oder Alkoxycarbonylmethyl, wobei die Alkoxykomponente 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, ist;

R³, R⁴ und R^s unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist oder R⁵ Ethyl, Propyl oder Butil ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind;

R⁶, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist oder R⁶ Ethyl, Propyl oder Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind.

Ein spzieller subgenerischer Aspekt der Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel I, bei denen Z Sauerstoff oder Schwefel ist; R¹ Wasserstoff, Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Allyl ist; R² Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl oder Benzyl ist; und R³ bis einschließlich R⁹ jeweils Wasserstoff sind.

Die Verbindungen der Formel I können mit Hilfe bekannter Methoden bzw. sich anbietender Abwandlungen selbiger hergestellt werden. Die nachfolgend beschriebenen Methoden A, B, C, D und E sollen in diesem Zusammenhang zur Illustration dienen.

Methode A

Verbindungen der allgemeinen Formel I a

(la)

bei denen R¹ und R³ bis R⁸ wie oben definiert sind und R²' mit Ausnahme des Wasserstoffs dieselbe Definition wie R² hat, können durch Cyclisierung von Carbonsäureamiden der allgemeinen Formel Il hergestellt werden,

R⁴ R⁵ , R⁶ R⁷ R¹O

bei der R¹, R³ bis R⁸ und R²' genauso definiert sind wie bei Formel I a und Hai für Fluor, Chlor, Brom oder Iod steht. Die Cyclisierung erreicht man am günstigsten durch die Umwandlung der Verbindungen der allgemeinen Formel Il in ihre Alkalimetallsalze und nachfolgender Kondensation bei Temperaturen zwischen 0°C und dem Siedepunkt des Reaktionsgemische. Ist R¹ bei den Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel Il kein Wasserstoff, so wird für die Metallierung mindestens 1 Mol des Metallisierungsmittels benötigt. Handelt es sich aber bei R¹ um Wasserstoff, so sind mindestens 2 Mole dieses Mittels zu verwenden. Bei der Metallierung finden vorzugsweise Lithium-, Natrium-und Kaliumhydride, Lithiumalkylewiez.B. n-Butyllithium Anwendung.

Die Reaktion wird normalerweise in inerten Lösungsmitteln durchgeführt, so z.B. in Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Glycoldimethylether, Diethylenglycoldimethylether.Triethylenglycoldimethylether, Dimethylformamid, Benzen oder Anisol. Die Cyclisierung erreicht man auch durch Erhitzen von Carboxylsäureamiden der allgemeinen Formel Il in dipolaren aprotischen Lösungsmitteln, vorzugsweise in Sulfolan oder Dimethylsulfon. Katalytische Mengen an starken Säuren, z.B. Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure oder p-Toluensulfonsäure haben sich als günstig erwiesen. Die erforderliche Reaktionstemperatur liegt normalerweise zwischen 110 und 22O⁰C, wobei der günstigste Temperaturbereich der zwischen 130 und 170⁰C ist.

Methode B

Verbindungen der allgemeinen Formel Ib

(Ib)

R'

bei der R¹ und R³ bis R⁸ wie oben definiert sind, können durch hydrolytische Aufspaltung der Arylmethylgruppe in Verbindungen der allgemeinen Formel III hergestellt werden,

(III)

bei der R¹ und R³ bis R⁸ wie oben definiert sind und Ar zum Beispiel eine Phenyl-oder 4-Methoxyphenylgruppe sein kann. Die Hydrolyse wird durch mittelstarke bis starke Säuren oder Lewis-Säuren bei Temperaturen zwischen -20 und +150⁰C herbeigeführt. Möglich sind beispielsweise Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Trifluoressigsäure,Trifluormethansulfonsäure, Phosphor- oder Polyphosphorsäure. Bei Verwendung von Phosphor- oder Polyphosphorsäure hat sich die Zugabe von Lösungsmitteln wie Benzen, Toluen, Phenol, Anisol oder Veratrol bewährt.

Werden Lewis-Säuren wie z. B. Aluminiumchlorid oder -bromid verwendet, um die Arylmethylgruppe zu eliminieren, so sind als Lösungsmittel z. B. aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzen, Toluen, Anisol oder entsprechende Mischungen mit Dichlormethan geeignet. Dem Fachmann ist natürlich klar, daß Methode B in den Fällen, in denen R¹ oder eines von R³ bis R⁸ leicht hydrolysierbare Substituenten sind, in denen also z. B. R¹ Alkanoyl oder eines von R³ bis R⁸ Alkanoylamino oder Alkoxycarbol sind, Methode B nicht die Methode der Wahl ist. In den Fällen, in denen beispielsweise R¹ Alkanoyl oder eines von R³ bis R⁸ Alkoxycarbonyl ist, wäre die oben beschriebene Methode A zu bevorzugen; ist R¹ Wasserstoff, so sind zwei Basenäquivalente zu verwenden. Ist eines von R³ bis R⁸ z. B. Alkylamino, so führt man die Hydrolyse (und nachfolgende Acylierung) am besten mit dem entsprechenden Nitroderivat durch und reduziert dann die Nitrokomponente auf das Amin, worauf die Acylierung erfolgt, die das gewünschte Produkt hervorbringt.

Methode С

Verbindungen der allgemeinen Formel Ic

R⁵ ^ ,? R* и 1 ,N-

(Ic)

bei der R¹ mit der Ausnahme von Wasserstoff dieselbe Definition hat wie R¹ und R² bis R⁸ wie oben definiert sind, können hergestellt werden, indem man ein 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on der Formel IV

(IV)

bei dem R² bis R⁸ wie oben definiert sind, in die entsprechenden 5-Alkali- oder Erdalkalimetallverbindung umwandelt und dann die Alkalimetallverbindung mit einer Verbindung der Formel V zur Reaktion bringt,

R¹X (V)

bei der R¹' dieselben Bedeutungen hat wie in Formel Ic und X das Radikal eines reaktionsfähigen Esters, ein Halogenatom, die Gruppe OSO₂OR¹, die Methansulfonyloxy- oder Ethansulfonyloxygruppe oder eine aromatische Sulfonyloxygruppe ist. Anstatt die Verbindung der allgemeinen Formel IV im ersten Schritt in ihr entsprechendes Alkalimetallsalz umzuwandeln, erreicht man die Alkylierung einer Verbindung dieser Formel auch durch eine Reaktion mit einer Verbindung der Formel V in Gegenwart von Aminen wie z. B. Triethylamin, Oiazabicycloundecen oder 4-(Dimethylamino)pyridin, von Alkalicarbonaten oder von Bicarbonaten wie Natrium- und Kaliumcarbonate oder Natriumbicarbonat.

Die Umwandlung einer Verbindung der allgemeinen Formel IV in das entsprechende Alkalimetall oder Erdalkalimetall ist möglich durch Reaktion einer Verbindung der Formel IV mit einem Alkalimetall oder Erdalkalimetallhydroxid wie z. B. Lithiumhydroxid, Bariumhydroxid, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, mit einem Alkalimetallalkoholat wie z.B. Natriummethanolat oder Kalium-tert-Butoxid, mit einem Alkalimetallamid wie z. B. Natriumamid oder Kaliumamid oder mit einem Alkalimetallhydrid wie z. B. Natriumhydrid oder Kaliumhydrid. Am günstigsten ist es, die Reaktion bei erhöhter Temperatur und unter Verwendung eines geeigneten organischen Lösungsmittels durchzuführen. Inerte organische Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran oder Glycoldimethylether sind zu bevorzugen, wenn als Metallierungsmittel Alkalimetallhydride verwendet werden; wird aber ein Alkali-oder Erdalkalimetallhydroxid verwendet, so kann man auch eine wäßrige Mischung mit einem organischen Lösungsmittel wie z. B. Methanol oder Tetrahydrofuran einsetzen. Um das so hergestellte alkali-oder erdalkalimetallsubstituierte 5,11-Dihydro-6H-Dipyrido[3,2-b:2',3'-e]I1,4]diazepin-6-on in eine Verbindung der allgemeinen Formel Ic umzuwandeln, wird die Lösung oder Suspension der Alkali- oder Erdalkalimetallverbindung direkt, d. h. ohne Isolation, mit einer Verbindung der Formel V zur Reaktion gebracht; dies geschieht bei -20⁰C oder bei erhöhter Temperatur bis hin zum Siedepunkt entweder des Lösungsmittels oder des Reaktionsmittels-je nachdem, welches Mittel diesen Punkt zuerst erreicht. Die Substitution erfolgt fast ausschließlich am Stickstoffatom in der 5-Stellung des Dihydrodipyridodiazepinons, auch wenn R² im Ausgangsmaterial der Formel IV ein Wasserstoffatom ist; vorausgesetzt, daß ein Basenäquivalent und ein Äquivalent einer Verbindung der Formel V verwendet werden. Dem Fachmann ist natürlich klar, daß die Gegenwart nuclephiler Substituenten in Verbindungen der Formel Ic die Anwendung einer Zwischenverbindung der Formel I с erfordern kann, welche Substituenten aufweist, die im Gegensatz zum Stickstoff der 11-Stellung nicht nucleophil sind, aus denen man aber durch Derivatbildung die gewünschte Gruppe herstellen kann. Das Vorhandensein von Amino- oder Monoalkylaminosubstituenten an irgendeiner Stelle von R³ bis R⁸ erreicht man beispielsweise am besten durch Alkylierung oder Acylierung einer Zwischenverbindung der Formel Ic, die an irgendeiner Stelle von R³ bis R⁸ eine Nitrogruppe enthält; und die anschließende Reduzierung der Nitrogruppe sowie gegebenenfalls Alkylierung führt zum Endprodukt.

Methode D

Eine Verbindung der allgemeinen Formel Id.

,5 ; о

(ld).

bei der R²" mit Ausnahme von Alkanoyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxycarbonylmethyl dasselbe bedeutet wie R² und bei der R¹ und R³ bis R⁸ für die obengenannten Gruppen stehen, können hergestellt werden, indem man eine 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2—b:2',3'-3][1,4]diazepin-6-on der allgemeinen Formel Ib in das entsprechende Metallsalz der allgemeinen Formel Vl a oder - falls R¹ in der Verbindung der Formel I b Wasserstoff ist - in eine Verbindung der Formel Vl b umwandelt,

5 ^Rl

R⁵

(VIa)

2M⁺

bei der M für ein Alkalimetall wie z. B. Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium oder Cäsium steht oder aber die Gruppe MgHaI+ repräsentiert, wobei Hai ein Chlor-, Brom- oder lodatom ist, und anschließend mit einer Verbindung der allgemeinen Formel VII alkyliert,

wobei R²" und X wie zuvor definiert sind.

Die Umwandlung einer Verbindung der allgemeinen Formel I b in die entsprechende Alkalimetall verbindung der Formeln Vl d und IVb kann man herbeiführen, indem man eine Verbindung der Formel tb mit einem Lithiumalkyl (z.B. n-Butyllithium oder t-Butyllithium) zur Reaktion bringt, und zwar fakultativ in Gegenwart von Tetramethylethylendiamin, eines Lithiumdialylamids (z.B. Lithiumdiisopropylamid, Lithiumdicyclohexylamid und Lithiumisopropylcyclohexylamid), eines Lithiumaryls (z. B. Phenyllithium), eines Alkalimetallhydroxide (z.B. Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid), eines Alkalimetallamids (z. B. Natrium- oder Kaliumamid) oder eines Grignardschen Reagens (z. B. Methylmagnesiumiodid, Ethylmagnesiumbromid oder Phenylmagnesiumbromid). Für die Bildung von Verbindungen der Formel Vl a wird ein Basenäquivalent benötigt, für Verbindungen der Formel IVb braucht man zwei Basenäquivalente. Die Metallierung führt man am besten in einem inerten organischen Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen-78°C und dem Siedepukt des entsprechenden Reaktionsgemischs durch. Verwendet man für die Metallierung ein Lithiumalkyl, Lithiumdialkylamid oder ein Grignardsches Reagens, so sind die geeignetsten Lösungsmittel Ether-z.B. Tetrahydrofuran, Diethylether oder Dioxan -, und zwar fakultativ in einer Mischung mit aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Hexan oder Benzen; die Temperaturen können dabei zwischen und +80⁰C liegen. Wird die Metallierung mit einem Alkalimetallamid durchgeführt, kommen außer den genannten Lösungsmitteln auch Xylen, Toluen, Acetonitril, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid in Frage; wird ein Alkalimetallhydroxid verwendet, sind auch Alkohole wie Ethanol, Methanol und aliphatische Ketone wie Aceton sowie Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser einsetzbar.

Zur Umwandlung des so hergestellten Alkalimetallsalzes in eine Verbindung der Formel Id bringt man die Lösung oder Suspension der Alkalimetallverbindung direkt, d.h. ohne Isolierung des Reaktionsproduktes, mit einer Verbindung der Formel VII zur Reaktion, und zwar bei —20⁰C oder erhöhter Temperatur, vorzugsweise am Siedepunkt des Lösungs- oder Suspensionsmittels bzw. der Verbindung VII-je nachdem, welcher Siedepunkt am niedrigsten ist. Dem Fachmann ist natürlich klar, daß die Anwesenheit nucleophiler Substituenten in Verbindungen der Formel Id die Anwendung einer Zwischenverbindung der Formel Id erfordern kann, welche Substituenten aufweist, die im Gegensatz zum Stickstoff der 11-Stellung nicht nucleophil sind, aus denen man aber durch Derivatbildung die gewünschte Gruppe herstellen kann. Das Vorhandensein von Amino- oder Monoalkylaminosubstituenten an irgendeiner Stelle von R³ bis R⁸ erreicht man beispielsweise am besten durch Alkylierung oder Acylierung einer Zwischenverbindung der Formel I c, die an irgendeiner Stelle von R³ bis R⁸ eine Nitrogruppe enthält; und die anschließende Reduzierung der Nitrogruppe sowie gegebenenfalls Alkylierung führt zum Endprodukt.

Die als Ausgangsmaterial dienenden Carbonsäureamide der allgemeinen Formel Il erhält man beispielsweise durch Aminierung von 2-Chlornicotinsäureamiden der allgemeinen Formel VIII,

Hal Cl

bei der R¹ bis R⁸ und Hai wie zuvor definiert sind, mit primären Aminen der allgemeinen Formel IX,

H₂N-R²' (IX)

wobei R² wie zuvor definiert ist. Die Reaktion kann auch in Gegenwart anorganischer oder organischer Hilfsbasen wie z. B. Triethylamin, Ν,Ν-Dimethylamin oder Natrium- bzw. Kaliumcarbonat erfolgen. Zur Durchführung der Reaktion wird nicht unbedingt ein Lösungsmittel benötigt; es bringt jedoch einige Vorteile, wenn man inerte organische Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen 0°C und 150⁰C, am besten bei Rückflußtempertur, anwendet. Geeignete inerte Lösungsmittel sind beispielsweise ein Überschuß an dem primären Amin der allgemeinen Formel IX, offenkettige oder cyclische Ether wie z. B. Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Glycoldimethylether, Diehtylenglycoldimethylether; aromatische Kohlenwasserstoffe wie z.B. Benzen, Toluen, Xylen, Chlorbenzen oder Pyridin; Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol, Isopropanol; polare aprotische Lösungsmittel wie Dimethylformamid; 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon, 1,3-Dimethyl-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon und Sulfolan. Ausgangsmaterial der allgemeinen Formel VIII, wobei R¹ kein Wasserstoff ist, kann aus 2-Chlornicotinsäureamiden der allgemeinen Formel X hergestellt werden.

Hal Cl

und zwar durch Reaktion mit Alkylierungsmitteln der allgemeinen Formel V in Gegenwart von Protonennehmern, zum Beispiel von Aminen wie Triethylamin, Diazabicycloundecen oder 4-(Dimethylamino)pyridin, von Alkali- und Erdalkalimetallhydroxiden wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Calciumhydroxid, von Alkalicarbonaten, Erdalkalimetallcarbonaten oder Hydrogencarbonaten wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Kaliumhydrogencarbonat. 2-Chlornicotinsäureamide der allgemeinen Formel X erhält man durch Kondensation von 2-Chlornicotinsäurechlorid mit З-Атіпо-3-halopyridinen unter den allgemein bekannten Reaktionsbedingungen. Alle anderen Ausgangsstoffe sind aus der Fachliteratur bekannt, sie können entweder käuflich erworben oder mittels gängiger, in der Fachliteratur geschilderter Verfahren hergestellt werden.

Methode E

Bei Methode E gewinnt man eine Verbindung der Formel I, bei der Z Schwefel ist, indem man eine Verbindung der Formel I, in der Z Sauerstoff ist, mit einem schwefelnden Mittel zur Reaktion bringt, so zum Beispiel 2,4-Bis(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid; Bisftricyclohexyltinl-diphosphetan^-disulfid; Bis(tricyclohexyltin)sulfid; Bis(triphenyltin)sulfid; Bis(trimethylsilyl)sulfid oder Phosphorpentasulfid. Die Durchführung der Reaktion erfolgt in einer inerten organischen Lösung wie z. B. Kohlendisulfid, Benzen oder Toluen bei Zimmer- oder höherer Temperatur, am besten bei erhöhter Temperatur bis hin zum Siedepunkt des Reaktionsgemischs sowie unter wasserfreien Bedingungen. Bei Verwendung der obengenannten Zinnoder Silylsulfide ist es günstiger, die Schwefelungsreaktion in Gegenwart einer Lewis-Säure wie z.B. Bortrichlorid durchzuführen.

Dem Fachmann ist natürlich klar, daß die Gegenwart einer weiteren Carbonylkomponente in einer Verbindung der Formel I гит Beispiel einer Verbindung, bei der Z Sauerstoff und irgendeine Stelle von R³ bis R⁸ Alkanoyl ist - es erforderlich macht, das Ketoncarbonyl vor Beginn der Schwefelungsreaktion mittels bekannter Methoden durch eine geeignete Schutzgruppe zu schützen; wenn dann nach der Entschwefelung der Schutz wieder aufgehoben wird, erhält man die gewünschte Verbindung.

Auch wenn z. B. R² Alkanoyl ist, liegt es auf der Hand, daß die Schwefelungsreaktion vor der Acylierung des Stickstoffs in 11 Stellung erfolgen muß. In den Fällen, in denen dieSubstituenten an irgendeiner Stelle von R³ bis R⁸ von Nitro abgeleitet werden können (z.B. Alkanoylamino), kann die Schwefelungsreaktion mit dem entsprechenden Nitroderivat durchgeführt werden; und durch anschließende (bekannte) Reduktion und Acylierung erhält man das gewünschte Produkt.

Verbindungen der Formel I können je nach Wunsch mittels konventioneller Methoden in ihre ungiftigen, aus pharmazeutischer Sicht akzeptablen Säureadditionssalze umgewandelt werden; so zum Beispiel durch Auflösung einer Verbindung der Formel I in einem geeigneten Lösungsmittel und Ansäuerung der Lösung mit einem bzw. mehreren Moläquivalenten der gewünschten Säure. Die Erfindung umfaßt auch derartige Salze.

Als Beispiele für anorganische und organische Säuren, die mit einer Verbindung der Formel I ungiftige, für pharmazeutische Zwecke geeignete Säureadditionssalze bilden können, sind zu nennen: Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Weinsäure, Citronensäure, Methansulfonsäure und dergleichen. Verbindungen der allgemeinen Formel I bilden die Säureadditionssalze für gewöhnlich mit einem Moläquivalent der Säure.

Die beschriebenen Verbindungen der Formel I besitzen eine Hemmwirkung in bezug auf die HIV-1-Revertase. Bei richtiger Dosierung sind sie von Nutzen bei der Verhütung bzw. Behandlung von AIDS, ARC und ähnlichen Krankheiten, die sich aus einer HIV-Infektion ergeben. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist also eine Methode zur Verhütung bzw. Behandlung der HIV-1 Infektion, die darin besteht, daß einer mit HIV-1 in Berührung kommenden oder infizierten Person eine prophylaktisch bzw. therapeutisch wirksame Menge der oben beschriebenen neuartigen Verbindung der Formel I verabreicht wird.

Die Verbindungen der Formel I können in Einzel-oder geteilten Dosen oral, parenteral oder topisch angewendet werden. Die orale Dosis für eine Verbindung der Formel I läge etwa zwischen 10 und 500mg täglich. Bei parenteral zu verabreichenden Produkten könnte die geeignete Dosis etwa 1 bis 50mg besagter Verbindungen enthalten; während bei topischer Anwendung Produkte mit einem Wirkstoffgehalt zwischen 0,01 und 1 % zu bevorzugen sind. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, daß die Art der Verabreichung von Patient zu Patient unterschiedlich sein wird und daß die Festlegung der Dosis für einen bestimmten Patienten letztendlich dem Arzt obliegt, der dabei Größe und Zustand des Patienten sowie dessen Reaktion auf das Medikament in Betracht zieht.

Erfindungsgemäße Verbindungen, die für die orale Anwendung vorgesehen sind, können als Medikamente in Form pharmazeutischer Präparate verabreicht werden, in denen sie zusammen mit einem verträglichen pharmazeutischen Trägermaterial enthalten sind. Dazu kann ein inertes organisches oder anorganisches, für die orale Anwendung geeignetes Trägermaterial dienen. Beispiele für solche Trägermaterialien wären Wasser, Gelatine, Talkum, Stärke, Magnesiumstearat, Gummiarabikum, pflanzliches Öl, Polyalkylenglycole, Rohvaseline und dergleichen.

Die pharmazeutischen Präparate können auf herkömmliche Weise hergestellt werden, und die Endprodukte können entweder in fester Form (Tabletten, Dragees, Kapseln usw.) oder in flüssiger Form (Lösungen, Suspensionen, Emulsionen usw.) bereitgestellt werden. Bei diesen pharmazeutischen Präparaten können gängige pharmazeutische Verfahrensweisen wie z. B. Sterilisation angewendet werden. Die pharmazeutischen Präparate können auch herkömmliche Zusatzstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Geschmacksverbesserer, Benetzungsmittel, Puffer, Salze zum Variieren des osmotischen Drucks und dergleichen enthalten. Als festes Trägermaterial kommen zum Beispiel Stärke, Lactose, Mannitol, Methylcellulose, Talkum, Siliciumdioxid, Dicalciumphosphat und Polymere mit hoher relativer Molekülmasse (wie Polyethylenglykol) in Frage.

Bei parenteralen Anwendung kann eine Verbindung der Formel I in einer wäßrigen oder nichtwäßrigen Lösung, Suspension oder Emulsion in einem aus pharmazeutischer Sicht akzeptablen Öl oder Flüssigkeitsgemisch gereicht werden, wobei letzteres bakteriostatische Mittel, Antioxidationsmittel, Konservierungsstoffe, Puffer oder andere gelöste Stoffe zur Erzeugung von Isotonie in bezug auf das Blut, Eindickmittel, Suspendiermittel oder andere aus pharmazeutischer Sicht akzeptable Zusätze enthalten kann. Beispiele für derartige Zusatzstoffe sind Tartrat-, Citrat- und Acetatpuffer, Ethanol, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Komplexbilder (z. B. EDTE), Antioxidationsmittel (z. B. Natriumhydrogensulfid, Natriumdisulfit und Ascorbinsäure), Polymere mit hoher relativer Molekülmasse (z.B. flüssige Polyethylenoxide) zur Viskositätsregelung und Polyethylenderivate von Sorbitolanhydriden. Bei Bedarf können auch Konservierungsstoffe wie Benzoesäure, Methyl- oder Propylparaben, Benzalkoniumchlorid und andere quartäre Ammoniumverbindungen zugesetzt werden.

Es ist auch möglich, die erfindungsgemäßen Verbindungen nasal in Form von Lösungen zu verabreichen, die außer den erfindungsgemäßen Verbindungen geeignete Puffer, Tonizitätsangleicher, Konservierungsmittel zum Schutz von Mikroben, Antioxidationsmittel sowie Mittel zur Erhöhung der Viskosität in wäßriger Bindemittellösung enthalten können. Beispiele für Mittel zur Erhöhung der Viskosität sind Polyvinylalkohol, Cellulosederivate, Polyvinylpyrrolidon, Polysorbate oder Glycerin.

Konservierungsmittel zum Schutz vor Mikroben sind zum Beispiel Benzalkoniumchlorid, Thimerosal, Chlorobutanol oder Phenylethylalkohol.

Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Form von Suppositorien verabreicht werden.

Wie bereits gesagt, hemmen die erfindungsgemäßen Verbindungen die enzymatische Aktivität von HIV-1 -RT. Mit diesen Verbindungen durchgeführte Tests, die weiter unten beschrieben werden, haben ergeben, daß sie die HIV-RT in deren Wirkung als RNA-abhängige DNA-Polymerase hemmen. Andere, hier nicht geschilderte Tests lassen vermuten, daß sie die HIV-RT auch in deren Wirkung als DNA-abhängig DNA-Polymerase hemmen.

Mit Hilfe des nachstehend beschriebenen Revertase (RT)-Tests können Verbindungen auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, die Wirkung der HIV-RT als RNA-abhängig DNA-Polymerase zu hemmen. Auf diese Weise wurden auch die bestimmten spezifischen Verbindungen getestet, die in den untenstehenden Beispielen aufgeführt sind. Die Testergebnisse sind unten in Tabelle I aufgeführt.

REVERTASE (RT)-TEST

Theoretische Grundlagen dieses Tests:

Zu den Enzymen, deren Code der HIV-1 in sich trägt, gehört eine Umkehrtranskriptase (1) — so genannt, weil sie eine DNA-Kopie von einer RNA-Matrize anfertigt. Diese Aktivität ist durch einen an anderer Stelle bereits beschriebenen zellfreien Enzymtest (2) quantitativ meßbar, welcher auf der Beobachtung beruht, daß die Revertase in der Lage ist, mit Hilfe einer synthetischen Matrize [poly r(C) mit oligo d(G) als Starter] einen radioaktiv markierten, säuregefällten DNA-Strang zu transkribieren, wobei ³H-dGTP als Substrat genutzt wird.

Material:

a) Vorbereitung des Enzyms

Revertase-Enzym aus dem LAV-Stamm des HIV-1 (1) wurde aus dem Bakterienstamm JM109 isoliert (3), wobei der DNA-Klon pBRTprt 1 + ausgepreßt wurde (2), der unter Kontrolle des Lac-Promotors im Expressionvektor Pl-Bl 21 steht (4). Eine über Nacht in 2XYT-Medium (37°C, 225 Umdrehungen pro Minute) gezüchtete Kultur (5), ergänzt durch 100цд/тІ Ampicillin zur positiven Selektion, wurde in einer Verdünnung von 1:40 in M 9-Medium geimpft, dem zusätzlich 10 цд/ті Ampicillin beigegeben wurden (5). Die Kultur wurde bebrütet (37"C, 225 Umdrehungen pro Minute), bis sie einen OD540 von 0,3-0,4 erreichte. An diesem Punkt wurde der Repressor-Inhibitor IPTG (lsopropyl-b-D-thiogalactopyranosid) zu 0,5 mM zugegeben und weitere 2 Stunden bebrütet. Die Bakterien wurden pelletiert, in einem Puffer aus 5OmM Tris, 0,6mM EDTA, 0,375M NaCI erneut suspendiert und durch Zugabe von Lysozom (1 mg/ml) 30 Minuten lang auf Eis aufgeschlossen. Die Zellen wurden mittels Zugabe zu 0,2% NP-40 aufgelöst und auf 1 M NaCI eingestellt.

Nachdem der unlösliche Debris durch Zentrifugieren entfernt wurde, wurde das Eiweiß durch Zugabe von 3 Volumen gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfats ausgefällt. Das Enzym wurde pelletiert, in RT-Puffer (5OmM Tris pH 7,5,1 mM EDTA, 5mM DTT, 0,1 % NP-40,0,1 M NaCI und 50% Glycerol) erneut suspendiert und dann bei -70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

b) Zusammensetzung des konzentrierten 2X-Standard-Reaktionsgemischs

Standardreagens Konzentration des2X-Gemischs

1 M Tris pH 7,4 10OmM

1 M Dithiothreitol 4OmM

1MNaCI 12OmM

1%Nonidetp-40 0,1%

1MMgCI 4mM

[poly r(C)/oligod(G)] (5:1) 2pg/ml

³H-dGTP'(8iMM) 0,6 μΜ

Testverfahren:

Das konzentrierte 2 X-Standard-Reaktionsgemisch wird aliquotiert und bei —20 °C gelagert. Die Mischung ist stabil und wird bei jedem Test vor Verwendung aufgetaut. Dieser Enzymtest ist für ein Mikrotiter-Plattensystem mit 96 Vertiefungen ausgelegt, das bereits an anderer Stelle beschrieben wurde (6). Trispuffer (5OmM, pH 7,4), Bindemittel (Verdünnungsgrad der Lösung entspricht dem der Verbindung) oder Verbindungen in Bindemittellösung werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gegeben (ΙΟμΙ/Bohrung; 3 Vertiefungen/Verbindung). Das HIV-RT-Enzym wird aufgetaut, in 5OmM Tris (pH 7,4) verdünnt, so daß 15 μΙ des verdünnten Enzyms 0,001 Einheit enthalten (eine Einheit ist die Menge an Enzym, mit der 1 Mikromol Substrat pro Minute bei 25°C umgewandelt wird), und 15 μΙ werden in jede Vertiefung gegeben. In die ersten drei Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden zusätzlich 20 μΙ 0,12-0,5 EDTA gegeben. EDTA geht eine Chelatbindung mit den vorhandenen Mg⁺⁺ ein und verhindert die Umkehrtranskription. Diese Gruppe dient als Hintergrundpolymerisation, die von allen anderen Gruppen subtrahiert wird. 25 μΙ des 2X-Reaktionsgemischs werden in alle Vertiefungen gegeben, und die Probe wird 60 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Zum Abschluß des Versuchs wird die DNA in jeder Vertiefung mit 50 μΙ zehnprozentiger Trichloressigsäure (TCA) in einprozentigem Natriumdiphosphat ausgefällt. Die Mikrotiterplatte wird 15 Minuten lang bei 4°C bebrütet, und der Niederschlag wird auf Glasfaserpapier Nr. 30 (Schleicher & Schuell) fixiert, wobei ein halbautomatisches „Skatron"-Erntegerät verwendet wird. Danach werden die Filter zusätzlich mit fünfprozentiger TCA, die einprozentiges Natriumdiphosphat enthält, gewaschen; mit siebzigprozentigem wäßrigen Ethanol gespült; getrocknet und auf Szintillationsphiolen übertragen (6). Jede Phiole wird mit 2 ml Szintillationscocktail gefüllt und in einem Beckman-Beta-Zähler gezählt

Prozentuale Berechnungen der Inhibition werden wie folgt vorgenommen:

,, ... . . CPM mittl. Testwert - CPM mittl. Kontrollwert X100 % Inhibition =

CPM mittl. Kontrollwert

Quellennachweis:

1. Benn,S.,u.a.,Science230:949,1985

2. Farmerie.W.G.,u.a.,Science236:305,1987

3. Yanisch-Perron, C, Viera, J., und Messing, J„ Gene 33:103,1985

4. International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT 06535

5. Maniatis,T., Fritsch, E.F., und Sambrook, J., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982

6. Spira,T., u.a., J. Clinical Microbiology, 25:97,1987

Um zu bestätigen, daß die im RT-Versuch aktiv werdenden Verbindungen auch in der Lage sind, die HIV-Replikation in einem lebenden System zu hemmen, wurden erfindungsgemäße Verbindungen außerdem im nachfolgend beschriebenen Versuch mit menschlicher T-Zellkultur getestet. Die Testergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

TEST MIT MENSCHLICHERT-ZELLKULTUR

Theoretische Grundlagen dieses Tests:

Die Bildung von Synzytien ist ein Merkmal von In-vitro-Kulturen von CD4+ T-Zellen, die mit HIV-1 infiziert sind. Bei diesem Test werden T-Zellen mit einer vermutlich die Replikation hemmenden Verbindung behandelt und dann mit HIV-1 infiziert. Nach der Inkubation wird die Kultur auf die Bildung von Synzytien hin überprüft. Die Abwesenheit von Synzytien oder Reduzierung ihrer Anzahl zeigt an, inwieweit die getestete Verbindung in der Lage ist, die HIV-Replikation zu hemmen.

Testmethode:

Die als C8166 bezeichneten Targetzellen sind ein Subklon menschlicher Lymphomzellen, die von T-Zellen abstammen, und werden mit einer Ausgangsdichte von 5 χ 10* pro 100 μΙ in einem Nährmedium aus RPM11640 (+ 10%iges fötales Rinderserum) in flache Schalen mit 96 Vertiefungen gegeben. Von der zu testenden Verbindung wird eine bestimmte Menge, in DMSO aufgelöst, hinzugegeben. Nach 24 Stunden impft man jede Kultur mit 50-100 TCID⁶⁰ (diejenige Dosis, die bei 50% der Testkulturen einen induzierten Effekt hervorruft) des HTLV-IIIB-Stammes des HIV-1 (2). Den Kontrollkulturen wird nur die Verbindung oder nur das Virus beigegeben. Vier Tage nach dem Virus-Reiz werden die Kulturen visuell auf Häufigkeit und Verteilung der durch das Virus hervorgerufenen Riesenzellsynzytien hin untersucht. Durch Vergleich mit den Kontrollwerten wird dann die Inhibition - prozentual ausgedrückt - festgestellt. Die Bestätigung dessen, ob tatsächlich eine Virusreplikation stattgefunden hat, erhält man, indem man die zellfreien Kulturflüssigkeiten aller Versuchsgruppen erntet, um das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein infektiöser Nachkommenschaft anhand der Induktion einer Synzytienbildung in sekundären Kulturen menschlicher T-Zellen nach 3 Tagen zu bestimmen.

Quellennachweis:

1. M.Somasundaran und H.L.Robinson, Science 242,1554 (1998)

2. G. M. Shaw, R. H. Hahn, S. K. Arya, J. E.Groopman, R. C. GaIIo und F.Wong-Staal, Science 226,1165 (1984)

Um die Spezifität der enzymhemmenden Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen zu beurteilen, wurde bei einigen von ihnen mit Testmethoden, die an sich bekannt sind, die Fähigkeit zur Inhibierung einer vom Katzenleukämievirus abgeleiteten Revertase und einer vom Kalbsthymus abgeleiteten DNA-alpha-Polymerase untersucht. Bei keiner der so getesteten Verbindungen wurde eine inhibitorische Aktivität gegenüber den genannten Enzymen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen an, daß sich die enzymhemmende Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen speziell gegen HIV-RT richtet. Zum Zwecke einer Grobeinschätzung der Zytotoxizität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden einige von ihnen im nachstehend beschriebenen MTT-Test der zellulären Zytotoxizität getestet. Die Testergebnisse sind in Tabelle I (siehe unten) dargelegt. Verbindungen mit relativ hohem EC⁵⁰ werden bevorzugt.

MTT-TEST DER ZELLULÄREN ZYTOTOXIZITÄT

Theoretische Grundlagen des Tests:

Der MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5Diphenyltetrazolbromid]-Test beruht auf der Aufspaltung von Tetrazolbromid durch metabolisch aktive Zellen, die zu einer hochquantitativen Blaufärbung führt. Dieser Test wurde bereits an anderer Stelle (1) beschrieben, jedoch für den hier geschilderten Versuch optimiert.

Testmethode:

Die H9-Zellinie (2), eine anerkannte Suspensionszellinie menschlicher Lymphomzellen, die in RPM11640 unter Zugabe von zehnprozentigem fötalem Rinderserum gezüchtet wird, dient bei diesem Versuch als Targetzellinie. Die Zellen (1 ΟΟμΙ) werden in die Vertiefungen von Mikrotestplatten gegeben, und zwar in einer Konzentration von 10⁶ Zellen pro ml, wobei der Inhibitor in unterschiedlicher Konzentration hinzugefügt wird. Die Zellen werden bei 37°C in einem befeuchteten CO²-lnkubator bebrütet. Fünf Tage später werden in jede Vertiefung 20 μΙ MTT (5 mg/ml in RPM11640, beschallt, auf 0,2 Mikron filtriert und bei 4 "C gelagert) gegeben. Nach weiterer vierstündiger Inkubation bei 37°C werden 60μΙ Triton-X in jede Vertiefung gegeben und gründlich untergemischt, um die Löslichkeit der Kristalle zu verbessern. Absolutes Ethanol (5 μΙ) wird 30 Minuten lang bei 60⁰C inkubiert und bei einer Wellenlänge von 570 nm sofort auf einem Plattenleser (Dynotech) gelesen. Die Angaben aus diesem Test werden für eine nichtlineare Regressionsanalyse verwendet, die ein EC⁵⁰ ergibt.

Quellennachweis:

1. Mosmann,Tim, J. Immunol. Methods, 65:55,1983.

2. Jacobs, J. P., J. Natl. Cancer Inst., 34:231,1965.

Tabelle I

Verbindung	RT-lnhibi-%	T-Zellen-	Zytotoxizi-
von Beisp.	10μg/ml	Kultur-Test	tätstest
Nr.		%lnhb.	(EC₆₀)
		Зμg/ml

1 100 100 NG

Anmerkung: NG = nicht getestet

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Illustration der vorliegenden Erfindung und ermöglichen der Fachwelt ein noch besseres Verständnis. Es ist jedoch zu beachten, daß sich die Erfindung nicht auf die unten angegebenen Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

5-11 -Dihydro-11 -ethy l-5-methy l-6H-dipyrido[3,2-b: 2',3',-e][1,4]diazepin-6-thion Eine Mischung von 2,66g (0,01 mol) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-6H-dipyridoI3,2-b:2'3'-e]l1,4]diazepin-6-on und 2,10g (0,005mol) Lawesson-Reagens (2,4-Bis[4-methoxyphenyl[-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid) in 50ml Toluen wurden 2,5 Stunden lang unter Rückflußkühlung erhitzt. Danach wurden das Lösungsmittel in vacuo entfernt und dem Rückstand Wasser zugesetzt. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet (wasserfreies Natriumsulfat) und in vacuo konzentriert. Die Reinigu ng erfolgte über eine Kieselgelsäure, wobei das Eluent zuerst Methylenchlorid, gefolgt von Ethylacetat/ Hexan (1:4), verwendet wurde. Die Entfernung des Lösungsmittels in vacuo ergab 2,20g (74% des theoretischen Wertes) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-thion in Form eines gelben Pulvers, das aus 10%igem Hexan/Ethylacetat wieder herauskristallisiert wurde und 1,1 g gelber Nadeln ergab. Schmelzpunkt 157-158X.

Herstellung der Ausgangsverbindung

5,11 -Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-eJ[1,4]diazepin-6-on

a) 2-Chloro-N-(2-chloro-3-pyridinyl)-3-pyridinecarboxamid

In einen Dreihalsrundkolben, der mit einem starken Rückflußkühler, mechanischen Rührwerk und Tropftrichter ausgestattet war, wurden 215g (1,672mol) З-Атіпо-2-Chlorpyridin-aufgelöst in einer Mischung aus 400ml Dioxan, 500ml Cyclohexan und 130ml Pyridin-gegeben. Eine Lösung aus 299,2g (1,7mol) frisch zubereitetem 2-Chlor-pyridin-3-carbonsäurechlorid in 200ml Dioxan wurde so hinzugegeben, daß die lebhafte Reaktion immer unter Kontrolle blieb. Danach ließ man das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur abkühlen, und der entstehende kristalline Niederschlag wurde abfiltriert und nacheinander mit Cyclohexan und Ether gewaschen.

Das dunkelbraune Produkt wurde in 51 einer 3%igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Die entstandene Lösung wurde mit Holzkohle behandelt, vakuumgefiltert und das Filtrat durch Zugabe von 50%iger wäßriger Essigsäure angesäuert. Der entstandene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und gründlich mit Wasser gewaschen. Nachdem das fast farblose Produkt über Nacht unter einem Stickstoffstrahl bei Zimmertemperatur getrocknet worden war, hatte es einen Schmelzpunkt von 156-159°C und war rein genug für weitere Reaktionen. Die Ausbeute betrug 376,0g (84% des theoretischen Wertes).

b) N-(2-chloro-3-pyridinyl)-2-t[(4-methoxyphenyl)methyl]amino]-3-pyridincarboxamid

13,4g (0,05 mol) des bei Schritt a) gewonnenen Produkts wurden in 20 ml Xylen aufgelöst, und der entstandenen Lösung wurden 13,8g (0,1 mol) p-Methoxybenzylamin zugesetzt. Danach wurde das Gemisch zwei Stunden lang unter Rückflußkühlung erhitzt. Dann ließ man das Reaktionsgemisch in vacuo verdampfen, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (0,2-0,5mm) gereinigt, wobei Dichlormethan/Ethylacetat als Eluent diente. Farblose Kristalle, die bei 122-124⁰C schmolzen (nach Rekristallisation aus Acetonitril). Die Ausbeute betrug 17,2g (93% des theoretischen Wertes).

c) 5,11 -Dihydro-11 -[(4-methoxyphenyl)methyl]-6H-dipyrido-[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on

16,7 g (0,0453 mol) des bei Schritt b) gewonnenen Produkts wurden in 150 ml absolutem Dioxan aufgelöst, und der entstandenen Lösung wurden 6,7g (0,14mol) einer 50%igen Dispersion von Natriumhydrid in Mineralöl zugesetzt. Danach wurde das durch einen schwachen Stickstoffstrom vor der Außenatmosphäre geschützte Gemisch unter Rückflußkühlung erhitzt, bis kein Ausgangsmaterial mehr durch DC nachweisbar war. Der Überschuß an Natriumhydrid wurde durch vorsichtige Zugabe von 10ml eines Gemische aus Methanol und Tetrahydrofuran (50/50 v/v) abgebaut. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von Essigsäure neutralisiert und dann in vacuo eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (0,2-0,5 mm) gereinigt, wobei nacheinander Dichlormethan/Ethylacetat 1/1 (v/v) und Dichlormethan/Ethylacetat 1/1 (v/v) als Eluenten genutzt wurden. Das durch Verdampfung geeigneter Fraktionen gewonnene kristalline Produkt wurde aus Acetonitril und 2-Propanol wieder auskristallisiert. Das Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 213-215°C und wurde als 5,11-Dihydro-11[(4-methoxyphenyl)methyl]-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-{1,4]diazepin-6-on identifiziert. Die Ausbeute betrug 10,3g (68% des theoretischen Wertes). Rp 0,7 (Macherey-Nagel, Polygram® SIL G/UV₂₆₄, vorbeschichtete Plastikfolien für die DC; Dichlormethan/Ethylacetat 1/1 v/v).

d) 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on

10,0g (0,3mol) des in Schritt c) gewonnenen Produkts wurden in 50 ml Trifluoressigsäure aufgelöst, wodurch sich das Gemisch leicht erwärmte. Danach wurde das Reaktionsgemisch bei 60⁰C eine Stunde lang gerührt. Zu diesem Zeitpunkt war durch DC kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar. Die Mischung wurde daraufhin in vacuo eingedampft. Der gewonnene Rückstand wurde mit 0,5%igem wäßrigem Ammoniak gründlich durchgerührt und dann vakuumgefiltert. Das Rohprodukt wurde aus 150 ml Dimethylsulfoxid wieder herauskristallisiert; es entstanden farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 340⁰C. Die Ausbeute betrug 4,8g (75% des theoretischen Wertes)

Das Produkt wurde als 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on identifiziert.

e) Nach Schritt c) können anstatt dessen auch 10g der gewonnenen Verbindung mit Trifluoressigsäure zur Reaktion gebracht und eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt werden, woraufhin die Säure in vacuo entfernt und der Rückstand eine Stunde lang mit 0,3%igem Ammoniak gerührt werden. Der Feststoff wurde gefiltert und getrocknet und ergab 6,7 g des 5-methylsubstituierten Derivats.

2,0g einer 50%igen Dispersion von NaH in Mineralöl wurden zu 5,75g des 5-Methyl-Derivats in 100ml Dimethylformamid hinzugegeben. Nachdem die Wasserstoffentwicklung aufgehört hatte, wurde das Gemisch 30 Minuten lang auf 50⁰C erhitzt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Überschüssiges Natriumhydrid wurde durch die Zugabe von Eis, gefolgt von Wasser, abgebaut. Das Produkt wurde mit Ether extrahiert, getrocknet (wasserfreies Natriumsulfat) und eingedampft, was 4,5g 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-6-H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on mit einem Schmelzpunkt von 130-132⁰C ergab.

Beispiel A

Kapseln oder Tabletten

A-1 Bestandteile

A-2 Menge Bestandteile

Menge

aktive Verbindung Stärke

Mikrokris. Zellulose Natriumstärkeglucolat Magnesiumstearat Geräuchertes kolloides Siliciumdioxid

50 mg aktive Verbindung 50 mg

160 mg Dicalciumphosphat 160 mg

90 mg Mikrokris. Zellulose 90 mg

10 mg Stearinsäure 5 mg

2 mg Natriumstärkeglycolat 10 mg

1mg Geräuchertes kolloides Siliciumdioxid 1mg

Die Verbindung von Beispiel 2 wird mit den oben angegebenen vorgemischten Materialien - mit Ausnahme des Schmiermittels -zu einer Pulvermischung verarbeitet. Danach wird das Schmiermittel untergemengt und die entstandene Mischung zu Tabletten gepreßt oder in harte Gelatinekapseln gefüllt.

Beispiel B

Lösungen zur parenteralen Anwendung

Bestandteile

Menge

aktive Verbindung Weinsäure Benzylalkohol Wasserzur Injektion

500 mg

1,5g

0,1 % Masseanteil

q. s. ad 100 ml

Die Bindemittel werden mit dem Wasser vermischt, wonach die aktive Verbindung zugesetzt wird. Es wird so lange gemischt, bis die Lösung klar ist. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 3,0 eingestellt, danach wird sie in die entsprechenden Phiolen oder Ampullen gefiltert und im Autoklaven sterilisiert.

Beispiel C

Lösungen zur nasalen Anwendung

Bestandteile

Menge

aktive Verbindung Citronensäure Benzalkoniumchlorid EDTA

Polyvinylalkohol Wasser

100 mg

1,92 g

0,025% Masseanteil

0,1% Masseanteil

10% Masseanteil

q. s. ad 100 ml

Die Bindemittel werden mit dem Wasser vermischt, wonach die aktive Verbindung zugesetzt wird. Es wird so lange gemischt, bis die Lösung klar ist. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 4,0 eingestellt; danach wird sie in die entsprechenden Phiolen oder Ampullen gefiltert.

Claims

1. Verbindung der Formel

R¹

dadurch gekennzeichnet, daß Z Sauerstoff oder Schwefel ist; R¹ Wasserstoff, Alkyl oder Fluoralkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Trihalomethyl, Alkenyl oder Alkynyl mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, 2-Halo-propen-i-yl, Arylmethyl (wobei die Arylkomponente Phenyl, Thienyl oder Furanyl ist, das entweder nichtsubstituiert oder durch Methyl, Methoxy oder Halogen substituiert ist), Alkanoyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, oder Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen ist;

R² Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl oder Alkynyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkanoyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Arylmethyl (wobei die Arylkomponente Phenyl, Thienyl oder Furanyl ist, das entweder unsubstituiert oder durch Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxyl oder Halogen substituiert ist), Phenyl (das entweder unsubstituiert oder durch Alkyl oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxy oder Halogen substituiert ist) oder Alkoxycarbonylmethyl ist, wobei die Alkoxykomponente 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält; und

R³ bis R⁸ jeweils Wasserstoff sind; oder eines von R³ bis R⁸ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkoxy oder Alkylthio mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkoxycarbonyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Hydroxyalkyl mit 1 bis 4Kohlenstoffatomen; Alkanoyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkanoyloxy mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkanoylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Aminoalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Alkoxycarbonylalkyl, wobei die Alkoxy- und Alkylkomponenten jeweils 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthalten; Carboxyalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen; Mono- oder Dialkylamino wobei jede Alkylkomponente 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthält; Cyan-, Nitro-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Mono- oder Di-alkylaminoalkyl, wobei jede Alkylkomponente 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthält; Azido oder Halogen, wobei die anderen fünf Substituenten Wasserstoff sind; ist, oder

R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist, oder eines von R³, R⁴ und R⁵ Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind; und R⁶, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist, oder eines von R⁶, R⁷ und R⁸ Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind, unter der Bedingung, daß, wenn Z Sauerstoff ist und R¹ und R² gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff oder geradekettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind, mindestens eines von R³ bis R⁸ kein Wasserstoff ist,

oder ein aus pharmazeutischer Sicht akzeptables Säureadditionssalz davon.

Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z Sauerstoff ist oder Schwefel ist;

R¹ Wasserstoff, Alkyl oder Fluoralkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Trihalomethyl, Alkenyl oder Alkynyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, 2-Halo-propen-1-yl oder Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen ist;

R² Alkyl oder Fluoralkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkenyl oder Alkynyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl oder Alkylthioalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkanoyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylmethyl (wobei die Arylkomponente Phenyl oderThienyl ist, das entweder unsubstituiert oder durch Methyl, Methoxy, Hydroxyl oder Halogen substituiert ist).

Phenyl (das entweder nichtsubstituiertoder durch Methyl, Methoxy, Hydroxyl oder Halogen substituiert ist) oder Alkoxycarbonylmethyl, wobei die Alkoxykomponente 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, ist;

R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist oder R⁵ Ethyl, Propyl oder Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind; und

R⁶, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, unter der Bedingung, daß mindestens einer dieser Substituenten Wasserstoff ist oder R⁶ Ethyl, Propyl oder Butyl ist, während die übrigen beiden Substituenten Wasserstoff sind; oder ein aus pharmazeutischer Sicht akzeptables Säureadditionssalz davon.

3. Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z Sauerstoff oder Schwefel ist;

R¹ Wasserstoff, Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Allyl ist; R² Alkyl oder Fluoroalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Allyl oder Benzyl ist; und R³ bis einschließlich R⁹ jeweils Wasserstoff sind;
oder ein aus pharmazeutischer Sicht akzeptables Säureadditionssalz davon.

4. Pharmazeutisches Präparat zur Verhütung bzw. Behandlung der НІѴ-1-lnfektion, dadurch gekennzeichnet, daß es eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1,2 oder 3 sowie ein aus pharmazeutischer Sicht akzeptables Trägermittel enthält.

5. Methode zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch die Ausführung einer der folgenden Methoden;

A. zur Herstellung von Verbindungen gemäß Formel 1, bei denen R² kein Wasserstoff ist, durch Cyclisierung eines Carbonsäureamids der allgemeinen Formel Il

R⁶ R

Hal HN

2'

bei der R¹ und R³ bis R⁸ dieselben Bedeutungen wie in Formel I und R² dieselbe Definition wie R², mit der Ausnahme von Wasserstoff, haben,
B. zur Herstellung von Verbindungen gemäß Formel 1 b.

bei denen R¹ und R³ bis R⁸ dieselbe Bedeutung wie in Formel I haben, durch hydrolytische Aufspaltung der Arylmethylgruppe in eine Verbindung der allgemeinen Formel III,

III

bei der R¹ und R³ bis R⁸ wie oben definiert sind und Ar eine Phenyl- oder 4-Methoxyphenylgruppe ist,

C. zur Herstellung von Verbindungen gemäß Formel I, bei denen R² bis R⁸ wie in Formel I definiert sind und R¹ kein Wasserstoff ist, durch Umwandlung eines 5,11-Dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ons der Formel IV

(IV)

bei dem R² bis R⁸ wie oben definiert sind, in die entsprechenden 5-Alkali- oder Erdalkalimetallverbindung umwandelt und dann die Alkalimetallverbindung der mit einer Verbindung der Formel V zur Reaktion bringt.

R¹X

(V)

bei der R¹ dieselben Bedeutungen hat wie in Formel I с und X das Radikal eines reaktionsfähigen Esters, ein Halogenatom, die Gruppe OSO₂OR¹, die Methansulfonyloxy- oder Ethansulfonyloxygruppe oder eine aromatische Sulfonyloxygruppe ist,

C. zur Herstellung von Verbindungen gemäß Formel I₁ bei denen R² bis R⁸ wie in Formel I definiert sind und R¹ kein Wasserstoff ist, durch Reaktion einer Verbindung der Formel IV laut obiger Definition mit einer Verbindung der Formel V laut obiger Definition in Gegenwart eines Amins oder eines Alkalicarbonats bzw. -bicarbonate,

D. zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, bei der R₂ kein Alkanoyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxycarbonyl ist und R¹ sowie R³ bis R⁸ wie in Formel I definiert sind, durch Umwandlung einer Verbindung der Formel I, bei der R² Wasserstoff ist, in das entsprechende Metallsalz der allgemeinen Formel IVa oder, wenn R¹ Wasserstoff ist, der Formel IVb,

¹¹ ©.О

2M'

VIa

VIb

bei der R¹ vorstehende Definition hat und M entwederfür ein Alkalimetall oderfürdie Gruppe MgHaI steht, bei der Hai ein Chlor-, Brom- oder lodatom ist, und anschließende Alkylierung mit einer Verbindung derallgemeinen Formel VIII,

R^2-X

VIII

bei der R mit Ausnahme von Alkanoyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxycarbonyl ebenso definiert ist wie R² und X wie oben definiert ist,

E. zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, bei der Z Schwefel ist und R¹ bis R⁸ wie in Formel I, bei der Z Sauerstoff ist, mit einem Schwefelungsmittel,

wobei jede Reaktivgruppe in jedem der vorangegangenen Prozesse je nach Wunsch und Notwendigkeit geschützt werden kann,
worauf je nach Wunsch
a) der Schutz einer solchen Gruppe wieder aufgehoben wird,