DD285370A5

DD285370A5 - Verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen bzw. coimmobilisierung von mikroorganismen und enzymen

Info

Publication number: DD285370A5
Application number: DD33008589A
Authority: DD
Inventors: Horst Dautzenberg; Michael Foerster; Torsten Hoffmann; Alfred Schellenberger; Klaus-Peter Doepfer; Johanna Mansfeld; Gabriele Holzapfel; Brigitte Tiersch; Wolfgang Wagenknecht; Brigitte Lukanoff; Helmut Kluge; Joachim Roembach
Original assignee: Ingenieurtechnik Im Stammbetrieb Veb Kombinat Suesswaren,Dd; Institut Fuer Polymerenchemie "Erich Correns" Der Adw Der Ddr,Dd
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1990-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Einschlusz in Gelnetzwerke vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Enzyme an ein Traegermaterial gebunden und die Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in Gelnetzwerke eingeschlossen. Nach Separation und Sedimentation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme im Falle der Coimmobilisierung werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysatoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind. Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Ma/3e werden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der mikrobiellen Produktivität im Verhältnis zum Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine v/es-entliche Senkung des Aufwands zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht.

Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z. B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägermaterialien und die Verkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getostet worden.

Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5(10), 703 (1983)).

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Urn die Gefahr des Auswachsens vor. Zellen in das Medium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Prozesses zu vermeiden, wird in DE OS 34 32 932 ein Verfahren beschrieben, das das Auswachsen von Zellen auch bei Tiangzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zcllenfreie Schutzschicht aus einem vernetzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zellcnhaltigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkörper, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit ;.uf weisen. Für den beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.

In dieser Patentschrift wird zudem festgestellt, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatoraktivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert v/erden kann.

Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300, 355 (1933)) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen im Vergleich zum Einschluß in Netzwerken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, daß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Biomasse nach außen abgeben können.

In DE-OS 30 12 233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminogruppenhaltigen Polymer umgesetzt werden, se daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte [lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklumpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an der

Oberfläche führt.

In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtos Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weitorentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden. Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Substrate mit Hilfe der coimmobilisierten Enzyme in eine Form überführt werden, die vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt v/erden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese V/eise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden.

Nach einem Verfahren von B. Hägerdal und K. Mosbach (US 4,524,137 zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die rel'ativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem des Auswaschens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.

In Ε]? O 041 610 wird von C. H. Bochringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die meisten Mikroorganismen durch die Immobilisierungspr izedur •des Enzyms inaktiviert werden. Darüber hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß die Rückhaltung des Coimmobilisats in kontinuierlichen Fermentationsprozessen sehr schwierig ist.

Von V/. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 35 34 983 ein Verfahren zur Coimrncbilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, semipermeabler! Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationcn ins Medium auswachsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert werden, daß beim Eintropfen der

Mikroorganismen/Enzym/Alginatlösung in die Calciumchlorid/ Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporiert werden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmedium sein können. Bei den an dieser Stelle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im Falle des Geleinschlussos von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung sind stabil^ ankapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter oder coimir.obilisiertor Biokatalysatoren mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zu finden, das den Einbau der zu immobilisierenden Biokatalysatoren in die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoher Membranfestigkeit erzeugt.

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß das Enzym/die Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen an ein Trägermaterial gebunden v/erden, die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und Bakterien, bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in einer wäßrigen Losung aus gelierfähigen Materialien suspendiert werden, diese Suspension zum Gelieren gebracht wird, an schließend die sedimentierten und separierten Gelpartikel (Vorirnmobilisate) in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniurnchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren nach Abschluß des Einkapselungsprozesses in bekannter Weise abgetrennt und in ein für die Züchtung der Mikroorganismen geeignetes Milieu eingebracht werden.

Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen erfolgt die Bindung des Enzyms/der Enzyme entweder adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Losung bei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von

min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise GIutarclialdehyd mit einer Konzentration zwischen Ü, 1 bis 10 %, vorzugsweise jedoch 2,5 %. Ms unlösliches Trägermaterial werden vorzugsweise aminogruppenhaltige Polystyrencerivate mit einem Partikeldurchmesser von 5 bis 200 yum vorwendet.

Zur Vorimmobilisierung der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenon Enzyme im Falle der Coimmobilisierung werden sowohl GeIo, die durch Temperaturerniedrigung, beispielsweise Agar, Agarose, Gelatine, gebildet werden, als auch Gele, .die durch ionotrope Gelierung, beispielsweise Alginat, Carrageenan, Pullulan, Pektinat, mit Hilfe eines Vernetzungsmittels gebildet werden, verwendet.

Die Konzentration des gelier fähigen "jaterials liegt zwischen 1 und 100 g/l, bei Verwendung von Agar, Agarose und Alginat vorzugsweise bei 30 g/l.

Bei Einsatz ionotrop gelierender Materialien wird eine Vernetzerlösung mit 1 bis 100 g Vornetzungsmittel/l verwendet. Als Vernetzungsmittel kommen im Falle von Alginat Erdalkalisalzlösungen, vorzugsweise Calciumchlorid, und im Falle von Carrageenan Alkalisalzlösungen, vorzugsweise Kaliumchlorid, zum Einsatz .

Die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses durch ionotrope Gelierung reicht von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen und Enzyme. Bei Einsatz von Materialien, die durch Temperaturerniedrigung Gele bilden, v/ird das gelierfähige Material bei einer Temperatur von 29'3 bis 373 K gelöst, die Lösung bei-Einsatz von Temperaturen größer als 313 K auf 313 K abgekühlt und mit einer Suspension der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme versetzt. Durch Abkühlen der Suspension auf 273 bis 283 K v/ird das Vorimmobilisat erhalten.

Die Temperatur bei der sich anschließenden Einkapselung der sedimentierten und separierten Vorimmobilisate v/ird ebenfalls zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.

Die Cellulosesulfatkonzentration für die Einkapselung der Vorimrnobilisate liegt zwischen 5 und 100 g/l, die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-fjösung gleichfalls zwischen 5 und 100 g/l.

Die Verweilzeit der immobilisierten Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Cnzymc liegt zwischen 30 Sekunden und 12 Stunden. Nach. Abtrennung der orfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Diokatalysatorcn von der Pclydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt.

Somit liefert das erfindungsgemäße Verfahren immobilisierte Biokatalysatoren, die sich durch eine hohe Vitalität, Aktivität und Oporationsstabilität auszeichnen, die auch i:i Falle der Einkapselung vitaler, proliferiendor Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch Wachstums- und Zeil'ceilungssvorgänge derselben oder Auswaschen vermindert wird. Die Bindung des Snzyms/der Enzyme schützt dieses vor Abbauprozessen und Inaktivierung. Die Vorimmobilisierung gewährleistet, daß keine Mikroorganismen oder tragergebundenen Enzyme in die Kapselwand inkorporiert werden und die Oberfläche des immobilisierten Biokatalysators frei von Mikroorganismen und trägergebundenen Enzymen ist. Somit ist das Risiko des Auswachsens von Mikroorganismen in das Kulturmedium, das beim Einschluß von Mikroorganismen in Golnetzwerke nicht verhindert werden kann und zu Störuncjen des Prozesses führt, ausgeschlossen. Von Vorteil ist weiterhin eine erhöhte mechanische Stabilität der Biokatalysatoren gegenüber der von Gelnetzwerken .

Im Falle der Coimmobilisierung von Invertase und Yarrowia lipolytica-Zellen wird es möglich, Saccharose als Substrat einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet v/erden kann, jedoch ein wesentlich · preiswerteres Substrat als das eigentliche Substrat Glucose darstellt.

Das erfindungsgemäßo Verfahren soll anhand nachfolgender Beispiele erläutert werden.

Ausführungsbcispiele Seispiel 1

0,1 y Agar werden unter . Erwärmen auf 353 K in 10 ml V/asser gelöst. Nach Abkühlen auf 313 K wird 1 ml einer Zc.llsuspension der Hefe Yarrowia lipol tica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/mi zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser eingetropft, das eine Temperatur von 283 K aufweist. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wssser mit einer Temperatur von 283 K gegeben und nach bekannten Methoden auf eine Fartikelgröße von 100 bis 200 ρ zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, wie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet.

Beispiel 2

0,5 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml v/erden in 5 ml 3%iger Na-Alginöt-Lösung suspendiert. Durch Eintropfen der so erhaltenen Zell-Alginat-Suspension mit Hilfe üblicher Methoden in eine 2%ige Calciumchlorid-Lösung unter leichtem Rühren werden Gelperlen erhalten, die weitere 30 min in dieser Lösung gerührt v/erden. Die Gelperlen werden sediment.! er t und, wie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet.

Beispiel 3

Durch Lösen von 0,3 g Agaroso in 10 ml Kasser bei 373 K wird eine 3%ige Agarose-Lösung hergestellt. Mach Abkühlen der Lösung auf 313 K wird 1 ml einer ^ellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser mit einer Temperatur von 2S3 K eingetropft. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wasser mit einer Temperatur von 283 K ge-

geben und nach bekannten Methoden auf eine Partikelgröße von 100 bis 200 yiim zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, v/ie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet.

He ispiel 4

0,5 ml dos Sediments der vorimmobilisierton Hefe Yarrowia Iipolytica gemäß Beispiel 1, 2 und 3 werden in 5 ml 2,2%iger Celluloscsulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt.

Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2^?oigem Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillier ton Wasser gewaschen.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Formenter eingesetzt; Mach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde analog mit Bakterien der Species Pseuciomonas aerucjinosa ausgeführt.

Beispiel 5

0,2 g Polystyron Wofatit UF 93 (Partikeldurchmcsser 5 bis ICO um) werden mit 3 ml 2,5%iger Glutardialdehyd-Lösung in SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit V/asser bis zur völligen Entfernung des überschüssigen GIu-

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tardialdohyds gewaschen. Anschließend wird das aktivierte Polyscyren mit 800 U Invertaso in 3 ml SÖRENSEH-Phosphafcpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und danach mit 25 mM blatriumacetatpuf f er pil 5,0/1 M KaCl und 2 5 int'i Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasscr nachweisbar war.

Der Invertase-Polys tyren-Komolex wird, wie in 'Beispiel 7 bis 10 beschrieben, verwendet.

Beispiel G

0,2 g Pol^ytyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 p) werden mit 800 U Invertase in 3 ml SÖREiISEN-Phosphatpuff er pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25 mM Matriumacetatpuffer pH 5,0/1 W NaCl und 25 mW Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasscr nachweisbar war. Der Invertase-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 7 bis 10 beschrieben, verwendet.

Beispiel 7

0,1g Agar v/erden unter Erwärmen auf 353 K in 10 ml V/asser gelöst. Nach Abkühlen auf 313 K v/erden 1 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml und 0,5 ml Invertase-Polystyren-Komplex zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser eingetropft, das eine Temperatur von 283 K aufweist. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wasser mit einer Temperatur von 283 K gegeben und nach bekannten Methoden auf eine Partikelgröße von 100 bis 200 pm zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.

Beispiel 8

0,5 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml und 0,25 ml Invertase-Polysty-

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ren-Komplex werden in 5 ml 3%iger Na-Alginat-Lösung suspendiert. Durch Eintropfen der so erhaltenen Zcll-Alginat-iJuspension mit lixlfe üblicher Methoden in eine 2%ige Calciumchlorid-Lösung unter leichtem Rühren v/erden Gelporlen erhalhen, die v/eitere 30 min in dieser Lösung gerührt werden. Die Gelperlen werden sedimentiert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.

Beispiel 9

Durch Lösen von 0,3 g Agaroso in 10 ml Wasser bei 373 K wird eine 3%ige Agarose-Lösung hergestellt. Mach Abkühlen der Lösung auf 313 K werden 1 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit: einem Gehalt von 1 mg ΗΤίΊ/ml zu- und 0,5 ml Invertase-Polystyren-Komplex zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser mit einer Temperatur von 283 K eingetropft. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wasser mit einer Temperatur von 283 K gegeben und nach bekannten Methoden auf eine Partikelgröße von 100 bis 200 urn zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.

Beispiel 10

0,5 ml des Sediments der zusammen mit Invertase-Polystyren-Komplex vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 7, 8 und 9 werden in 5 ml 2,2%iger Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt. Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2%igem Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt. Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten !Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewaschen.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Formenter eingesetzt. Nach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zeil-

wachstum abcjeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmediui.i ist nicht getrübt, d. h. frei von Uefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion vor Citronensäure einge-

Beispiel 11

50 ml einer 2,2%igen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10 min bei 121 C autoklaviert. Dann Dann werden 0,5 ml des Sediments gemäß Beispiel 1, 2 und 3 bzw. 7, 8 und 9 in 5 ml des autoklavieren Cellulosesulfats suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension wird in 50 ml einer Lösung von 0,25 % Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80 min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt.

Mach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne weitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 4 und 10 beschrieben v/urde.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorcjonismon und Enzymen durch Geleinbettung und Polyolektrolytcinkapsolung, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismen bzw. die Mikroorganismen und das Enzym/die Enzyme, die an ein Trägermaterial gebunden wurden, zur Vorimmobilisierung in einer wäßrigen Lösung aus gelierfähigen Materialien suspendiert v/erden, diese Suspension zum Gelieren gebracht wird, anschließend die sedimentierten und separierten Gelpartikel (Vorimmo'oilisate) in einer wäßrigen Tiösung aus Cellulosesulfat .suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Tiösung eingetropft wird, und die immobilisierten Mikroorganismen bzw. die erhaltenen komplexen (coimuiobilisierten) Biokatalysatoren in bekannter Weise abgetrennt werden und in ein für die Züchtung der immobilisierten bzw. coimmobilisiertcn Biokatalysatoren geeignetes Milieu eingebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß das L'nzym/die Enzyme adsorptiv oder kovalont an einem Trägermaterial in einer wäßrigen Lösung bei pH-Werten zwischen 3,5 und S, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer vcn 30 min bis 24 Stunden gebunden v/erden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß zur kovalonten Bindung der Enzyme an das Trägermaterial vorzugsweise Glutardialdehyd als Kupplungsreagens verwendet wird .

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Glutardialdehyds 0,1 bis 10 %, vorzugsweise 2,5 % beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise ein unlösliches Trägermaterial zur Bindung der Enzyms verwendet wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 gekennzeichnet dadurch, daß als unlösliches Trägermaterial vorzugsweise Arninomethylpolystyren verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 gekennzeichnet dadurch, daß der Partikeldurchmesser der Polystyrenkugeln von 5 bis 200 yiim gewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Vorimmobilisierung der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme ein gelierfähiges Material, beispielsweise Alginat, Carrageenan, Pektinat, verwendet wird, das durch Einwirkung eines Vernetzungsmittels, beispielsweise Erdalkali- oder Alkalisalzlösungen, Gele bildet.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des gelier fähigen Materials zwischen 1 und 100 g/l liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, S und'9 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Vernetzungsmittols 1 bis 100 g/l beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und S bis 10 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.

12. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur VoL-o-mmobilisierung der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme ein gelierfähiges Material, beispielsweise Agar, Agarose, Gelatine verwendet wird, das durch Temperaturerniedrigung Gele bildet.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12 gekennzeichnet dadurch, daß das gelierfähige Material bei einer Temperatur von 293 bis 373 K gelöst wird, die Lösung bei Temperaturen von 320 bis 373 K auf 313 K abgekühlt wird, mit einer Suspension der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen

Enzyme versetzt wird und durch Abkühlen der Guspension auf 273 bis 23? K in die vorirnmobilisier te Form überführt wird.

14. Verfahren nach /Anspruch 1, 12 und 13 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des gelierfähigen Material von 3. bis 100 g/l beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration des CeI-lulosesulfats von 5 bis 100 g/l eingesetzt wird.

16. Vorfahren nach Anspruch 1 und 15 gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration dee Polydirnethylallylammoniumchlorids zwischen 5 und 100 g/l verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1, 15 und 16 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur bei der Einkapselung der Vorimmobilisate von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der einzukapselnden Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.

18. Verfahren nach Anspruch 1, 15 bis 17 gekennzeichnet dadurch, daß die Verweilzeit der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren in der Polydimothyldiallylammoniumchlorid-Iiösung von 30 Sekunden bis 12 Stunden gewählt wird.