DD273450A5

DD273450A5 - Verfahren zur gewinnung neuer polysaccharide

Info

Publication number: DD273450A5
Application number: DD88319607A
Authority: DD
Inventors: Serge Carel; Yves-Marie Page; Christine Vanderhoven; Norman Murray; Michel Monsigny; Francis Delmotte; Anne-Claude Roche; Claire Petit
Original assignee: ��@��@��@��k��
Priority date: 1987-09-08
Filing date: 1988-09-07
Publication date: 1989-11-15
Also published as: PT88439A; FR2620130A1; IL87681A0; NO883967L; NO883967D0; DK497088D0; FR2620130B1; OA08948A; ZA886623B; AU609173B2; MA21370A1; TNSN88092A1; HUT47643A; NZ226041A; DK497088A; JPH01104182A; PT88439B; EP0308279A1; AU2107788A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide, die fuer die Verwendung in der Humanmedizin und Veterinaermedizin fuer therapeutische Zwecke zu Praeparaten verarbeitet werden. Das erfindungsgemaesse Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide aus einem Bakteriophagen-Lysefiltrat einer Kultur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Filtrat konzentriert und gleichzeitig einer Molekuelselektion durch Fuehren auf Membranen mit selektiver Permeabilitaet unterzieht, dann die Loesung der extrahierten Polysaccharide durch Chromatographie behandelt, die erste Fraktion gewinnt, dialysiert, die Loesung konzentriert und durch Chromatographie erneut fraktioniert, die erste Fraktion gewinnt und trocknet.

Description

Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide

Anwendungsgebiet der Erfindung 5

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Polysaccharide können für die Verwendung in der Humanmedizin und Veterinärmedizin zu immunmodulierenden Präparaten verarbeitet werden

10

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bestimmte Extrakte von Enterobakterien, besonders Glykoproieine von Klebsieila pneumoniae sind durch die europäischen Patentanmeldungen 0 049 181, 0 049 182 und 0 115 988 bekannt. In der europr.schen Patentanmeldung 0 139 551 sind Verfahren zur Herstellung immunstimulierender Wirkstoffe beschrieben, die man durch die Wirkung von Bakteriophagen auf verschiedene Bakterien erhält.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Gewinnung neuer Polysaccharide mit" immunmodulierenden Eigenschaften

25

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide mit immunmodulierenden Eigenschaften und ausgezeichneter Verträglichkeit. Das Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide aus einem Bakteriophagen-Lysefiltrat einer Kultur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae ist dadurch gekennzeichnet, daß man das Filtrat konzentriert und gleichzeitig einer Molekülselektion durch Führen auf Membranen mit selektiver Permeabilität unterzieht, dann die Lösung der extrahierten Polysaccharide durch Chromatographie behandelt, die erste Fraktion gewinnt, dialysiert, die Lösung konzen-

triert und durch Chromatographie erneut fraktioniert, die erste Fraktion gewinnt und trocknet.

Die Polysaccharide nach der Erfindung sind ausgestattet mit sehr interessanten pharmakologischen und therapeutischen Eigenschaften. Sie sind insbesondere mit immunmodulierenden Eigenschaften versehen. Sie zeigen beim Menschen eine ausgezeichnete Verträglichkeit.

Diese neuen Polysaccharide finden als Arzneimittel beispielsweise ihre Verwendung bei der Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, d.e von einer Störung des Immunsystems stammen, beim Menschen oder Tier, bei der Verhinderung oder Behandlung von infektiösen Bakterien-, Viren-, PiIz- oder Parasitenangriffen, sowie in der Rheumatologe, in der Wundheilung und in der Onkologie.

Die erfindungsgemäße Verbesserung der eingangs genannten bekannten Verfahren erlaubt es, neue wasserlösliche Polysaccharide zu erhalten, die 65 bis 75 % neutrale Ösen, 18 bis 27 % Uronsäuren, 5 bis 9 % Pyruvsäure in der Form von Pyruviliden, weniger als 1 % Proteine und weniger als 0,5 % Osamine enthalten und ein Molekulargewicht über 50 000 haben.

Man bezeichnet als neutrale Ösen insbesondere Hexosen, wie Glukose, Galactose oder Mannose, und als Uronsäuren insbesondere Galacturonsäure und als Osamine insbesondere Gluosamine .

Das Molekulargewicht von Polysacchariden wurde durch Messung des Sedimentationskoeffizienten beim analytischen Ultrazentrifugieren und durch Molekularsiebung bestimmt.

Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Polysaccharide können aus verschiedenen Bakterien- oder Mikroorganismenstämmen ohne irgendeine Beschränkung extrahiert werden. Man nimmt indessen ganz besonders jene, die aus Stämmen von Escherichia coli und Klebsieila pneumoniae stammen, welch

Ι beim Institut Pasteuer von Paris hinterlegt sind, besonders unter den Nummern 62.23 und 58.5.

Das Studium der Struktur dieser Polysaccharide mit Hilfe verschiedener Techniken, wie der Chromatographie in Gasphase, der Massenspektrometrie, der Elektrophorese, der Aminosäurenautoanalyse, der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, der kernmagnetischen Resonanz und der analytischen Ultrazentrifugieren, gestattete es, die Zusammensetzung, wie sie oben erwähnt wurde, zu präzisieren. Es ist festzustellen, daß die Peptidunterfraktion nicht für die pharmakologischen Aktivitäten dieser Polysaccharide verantwortlich ist.

Die molekulare Zusammensetzung der neuen Polysaccharide enthält pro Galactosemolekül 0,2 bis 0,4 Glukosemoleküle, 2 bis 2,5 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsäuremolekul und 1 Pyruvsäuremolekül.

Die wasserlöslichen Polysaccharide werden aus Bakteriophagen-Lysaten einer Kulcur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae isoliert. Diese verschiedenen Lysate können nach einer besonders in der europäischen Patentanmeldung 0 139 551 beschriebenen Technik hergestellt werden. Das Verfahren zur Gewinnung dieser Lysate vom bakteriellen Lysetyp beruht auf einer Folge von wenigstens zwei unerläßlichen Stufen, nämlich einer Bakteriophagen-Lyse, dann der Beseitigung der nichtlysierten Bakterien und der Bakterienbruchscücke durch Filtration, Zentrifugieren usw. Dieses Verfahren kann ausgehend von einem Bakterium oder auch unter Benutzung aufeinanderfolgender Bakterien unterschiedlicher Arten oder sogar unter gleichzeitiger Benutzung von Bakterien unterschiedlicher Arten durchgeführt werden.

Es wurde gefunden, daß es möglich ist, das Verfahren zu verbessern, indem man das chemisch nicht definierte Kulturmedium durch ein synthetisches definiertes, vollständig dialysierbaras Medium, wie die Zusammensetzungen des angereicherten Mediums M_g nach Adams (M. H. Adams, Bacteriophages Interscience New York, Seite 446, 1959) oder das Medium nach Rogers (H. J. Rogers, Infect. Immuno., Seite 4445, 1973) ersetzt .

Dieses Medium kann dann vorteilhafterweise durch Benutzung von Vorrichtunger, mit selektiver Molekülpermeabilität beseitigt werden. Die Benutzung dieser Vorrichtungen gestattet eine Konzentrierung der Lysefiltrate und erleichtert das Arbeiten mit geringen Volumina. Das Ultrafiltrat kann beispielsweise durch Lyophilisieren zur Trockene gebracht werden .

Die Technik der Molekülselektion gestattet es, das Kulturmedium besonders durch Benutzung von Membranen mit selektiver Permeabilität, insbesondere? von Ultrafiltern, zu entfernen, und ebenso wird nach der gleichen Methode die Konzentrierung von Lysefiltraten realisiert. Die Membranen mit selektiver Permeabilität können unterschiedlicher Natur sein, wie beispielsweise aus Celluloseacetat, auf der Basis von Polysulfönen, aromatischer Polymere, Vinylchlorid- und Acrylnit.ri].-mischpolymere und auf der Basis von Polysulfonen auf I'ciyethylenträgern. Diese Membranen können in ebener Form, Röh·- renform oder außerdem in der Form von Hohlfasern oder Spiralen vorliegen. Die Membranen gestatten eine Konzentrierung von Molekülen eines Molekulargewichts oberhalb oder gleich 10 000 und so eine Beseitigung des Kulturmediums von Molekülen geringen Molekulargewichts durch Dialyse. Es ist erwünscht, eine Konzentrierung von etwa dem 30fachen zu erhalten .

Nach einer Variante kann man mit einer vorausgehenden Reinigungsphase durch Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Alkanol mit geringem Molekulargewicht, wie Ethanol, Methanol

1 oder Isopropanol, arbeiten.

Dann wird das Konzentrat durch Chromatographie auf einer Säule gereinigt. Mehrere Chromatographietypen sind für die Verwendung des Verfahrens geeignet und lassen sich mit ausgezeichneten Resultaten durchführen.

Diese Chromatographie kann vom Molekularsiebtyp sein, indem man aufeinanderfolgende Durchgänge auf Gelen benutzt, die in einer ersten Stufe den Ausschluß von Molekülen mit geringem Molekulargewicht und in einer zweiten Stufe die Abtrennung von Molekülen mit hohem Molekulargewicht gestatten.

Diese Chromatographien können vom Af finitätschromatographietyp sein, ^i dem man auf Gel unlöslich gemachte Lektine oder auf Gel unlöslich gemachce Antikörper vom Typ IgG oder IgM benutzt. Die Antikörper können aus Serum von gegen die gesuchten Polysaccharide immunisierten Wirbeltieren stammen, insbesondere von Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und Mäusen. Die Antikörper können polyklonalen oder monoklonalen Ursprungs sein und nach den für den Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Lektine und die Antikörper werden auf d^n inerten Gelen vom Agarosetyp oder vom PoIyacrylamidtyp unlöslich gemacht, die vorher mit bekannten Techniken, wie beispielsweise mit Paranitrophenylchlorformiat, aktiviert wurden.

Diese Chromatographien können vom Ionenaustauschchromatographietyp sein. Die benutzten Träger können beispielsweise Polyacrylamidgele oder durch Diethylaminoethylgruppen substituierte Cellulosegele oder substituierte Polystyrol-Divinylbenzolharze sein.

Die erste Trennung durch Chromatographie kann vorteilhafterweise vom Affinitätstyp mit auf inertem Gel immobilisierten Antikörpern oder vom Ionenaustauschtyp sein.

Die zweite Trennung durch Chromatographie ist vorzugsweise

ο- 2 73 4 5

vom Ionenaustauschtyp.

Die diversen Chromaiiographieoperafcionen erfolgen mit Hilfe üblicher Verfahren, insbesondere unter Verwendung der Differentialrefraktometrie, der Spektrophotometrie, der Spektrofluorometrie oder der Analyse neutraler Hexosen nach der Schwefelsäure-Resorcin-Methode.

Die Fraktion, die den bei der Erfindung gesuchten Polysacchariden entspricht, kann sodann dialysiert oder ultrafiltriert und nach Verfahren wie Zerstäubung oder Lyophiiisierung getrocknet werden.

Die Arzneimittel nach der Erfindung können mit einer antibiotischen Substanz, wie Tetracyclines einer Antivirussubstanz, v/ie synthetischen Nukleotiden, die die Virusnukleinsäuresynthese überlagern, mit einer Antipilzsubstanz, wie Buclosamid, oder einer Anciparasitensubstanz, wie C>.' ~.rochin, kombiniert werden

20

Bei einer anderen Ausführungsform können die Arzneimittel nach der Erfindung mit anderen Produkten und pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie einem Antitumormittel (cytostatischem Mittel), einem Immunsuppre^risivum (Ciclosporin, anti-

7 3 4 5

lymphocytären Aminoglobulinen), einem antimitotischen Mittel, wie den Persäurederivaten, oder einem entzündungshemmenden Mittel, wie Indomethacin, vereinigt werden.

Die Arzneimittel nach der Erfindung können auch mit makromolekularen Trägern gekoppelt werden, die ihre biologische Verfügbarkeit oder ihre Zielwirkung verbessern oder ihre Toxizität vermindern. Beispielsweise, aber nicht beschrär.kend können diese Träger Liposomen, Antikörper, Proteine oder andere Makromoleküle sein.

Die angewendete Dosierung unterliegt großen Veränderungen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Arzneimittels, der vorgeschriebenen Indikation, der Verabreichungsform und des Alters des behandelten Patienten. Die Bestimmung der verwendeten Dosierungen bleibt der Beurteilung des Arztes oder des Tierarztes überlassen, wie es übliche Praxis bei den Behandlungen von Modulationen der Immunantwort ist.

Beispielsweise kann die Dosierung Dosen von 50 pg/Tag b.^; ö 50 mg/Tag auf oralem Weg beim Menschen bei der Verhinderung oder Prophylaxe von Infektionen oder postoperativen infektiösen Komplikationen, bei den Behandlungen chronischer oder ' rezidivierender Infektionen der Atemwege oder Harnwege zulassen. Die übliche Dosis auf parenteralem Weg kann je nach dem behandelten Patienten und' der fraglichen Erkrankung 50 μτη bis bis 50 mg/Tag beim Menschen betragen.

Als Arzneimittel können die Polysaccharide nach der Erfindung auf oralem, perlingualem, parenteralem, transkutanem, perkutanem oder örtlichem Weg oder über die Luftwege verabreicht werden.

Die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können fest oder flüssig sein und in gewöhnlich in der Human- oder Veterinärmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorliegen, wie beispielsweise als die einfachen oder dragierten Tabletten, die Retardtabletten, die Pastillen, die Granalien, die Pulver, die Lösungen, die Sirupe, die Suppositorien,

-ΙΟΙ die lyophilisierten oder nichtlyophilisierten injizierbaren Präparate, die Kapseln, die Cremes, die GnIe, die Salhen, die Lotionen, die Tropfen, die Augentropfen oder die Aerosole. Die Wirkstoffe können in Trägerstoffe eingearbeitet werden, die üblicherweise in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen benutzt werden, wie Talkum, Magnesiumstearat, kolloidale Kieselsäure, Saccharose, Sorbit, Mannit, die wäßrigen oder nichtwäßrigen Vehikel, die Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, die Paraffinderivate, die GIykole, die verschiedenen Befeuchtungs- oder Emulgiermi '.el und die Konservierungsmittel.

Ausfuhrungsbeispiele Beispiel 1

rien_der_Gattung_Klebsiella_und Escherichia

Das Bakterium der Gattung Klebsiella, Art pneumoniae, ist vom Serotyp K 68, hinterlegt beim Institut Pasteur in Paris unter der Nummer 58.5.

Das Bakterium der Gattung Escherichia, Art coli, ist vom Serotyp 0119: B 14, hinterlegt beim Institut Pasteur in Paris unter der Nummer 62.23.

Der Phage, homolog zu Klebsiella, gehört zu der morphologischen Gruppe C. (Nomenklatur des Unterkomitees für Taxonomie der Bakteriophagen des Internationalen Komitees für Virustaxonomie der I. A. M. S.), er hat einen icosaedrischen Kopf, einen kurzen Schwanz, ist schwierig sichtbar zu machen, die Hülse und die Endscheibe sind nicht feststellbar. Auf Gelosemedium nehmen die Lysebereiche 0,5 bis 3 mm ein und haben sehr unregelmäßige Form mit verwischten Konturen und einem klaren Zentrum. Die Klone sind selten.

. Der Coliphage gehört zu der morphologischen Gruppe C. (No-

menklatur des Unterkomitees für Taxonoinie der Bakteriophagen des Internationalen Komitees für Virustaxonomie der I. A. M. S.), er hat einen isometrischen Kopf, einen sehr kurzen Schwanz, ist schwierig sichtbar zu machen, seine Hülse und seine Endscheibe sind nicht feststellbar. Auf Gelosemedium haben die Lysebereiche einen Durchmesser von 1 bis 1,5 mm, eine runde Form, regelmäßige Konturen, ein verschleiertes

r+ Zentrum und zerfließende Klone

Die beiden Bakterienstä'mme werden mit Hilfe einer Gärvorrichtung in einem vollständig dialysierbaren synthetischen Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

180,00 mg

417,00 mg

104,00 mg

22,00 mg

47,00 mg

68,00 mg

0,50 mg

1,00 mg

0,50 mg

	NH₄Cl	1,00	g	L-Argmin
15	KH₂PO₄	3,00	g	L-Glutamin
	Na₂PO₄-12H₂O	6,00	g	L-Lysin . HCl
	MgSO₄-7H₂Q	4,55	g	L-Methionin
	D-Glukose	140,00	g	L-Phenylalanin
				L-Threonin
20	L-Leucin	78,00	mg	Folsäure
	L-Histidin			Inositol
	HCl	60,00	mg	Nicotinamid
	L-Isoloucin	78,00	mg	Pyridoxal . HCl
	L-Valin	67,00	mg	Panthotenat
25	L-Tryptophan	15,00	mg	Cholinchlorid
				Thiamin . HCl

Das Medium wird mit einem Inoculum von Klebsiella pneumoniae beimpft, das sich in stationärer Wachstumsphase befindet. Die Anfangsdichte beträgt 1 . 10 Bakterien je Milliliter. Die Kultur wird bei 37 ⁰C unter mäßigem Rühren gehalten.

Am Ende der Latenzphase, d. h. etwa 60 min nach der Beimpfung, werden die Bakterien durch ihre homologen Phagen infiziert, wobei die optimale Infektionsanzahl 0,03 ist.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe eines Zellzählers verfolgt. Wenn weniger als 10 Bakterien je Milliliter ver-

blieben sind, wird das Medium erneut mit einem Inokulum von Escherichia beimpft, das sich in stationärer Wachstumsphase befindet. Die Anfangsdichte dieser neuen Kultur ist 5 . 10 Escherichia je Milliliter

5

Am Ende der Latenzphase, d. h. unter diesen experimentellen Bedingungen 20 min nach der zweiten Beimpfung, werden die Bakterien durch die Coliphagen infiziert. Die Infektionsanzahl ist optimal 0,1.

Die Entwicklung der Lyse wird mit Hilfe eines Zellzählers verfolgt. Wenn weniger als 10 Escherichia je Milliliter .verblieben sind, wird die Kultur angehalten, indem sie durch eine sterilisierende Filtermembran von 0,22 μπι geführt wird.

Das Filtrat wird sodann dialysiert und durch tangentiale Ultrafiltration konzentriert. Die resultierende Lösung kann durch Lyophilisieren getrocknet oder direkt auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5 cm und einem Gehalt von 1 1 DEAE Trisacryl aufgegeben werden. Die Entwicklung erfolgt durch einen Gradienten einer Natriumphosphatlösung, deren Konzentration von 50 bis 650 mM variiert. Der pH-Wert dieser Lösung ist 7,5. Die der ersten Elutionsspitze entsprechenden Fraktionen (Feststellung neutraler Hexosen nach der Schwefelsäure-Resorcinmethode) werden vereinigt und gegen eine Natriumphosphatlösung von 10 mM und pH 7,5 dialysiert. Die erhaltene Fraktion wird dann auf eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einem Gehalt von 500 ml DOWEX-Harz 50-X2^(R) von 100 bis tes Wasser) aufgeben.

50-X2^(R) von 100 bis 200 Maschen (Eluiermittel: destillier-

Die der ersten Elutiorsspitze entsprechenden Fraktionen (Feststellung durch Refraktometrie oder neutrale Hexosen nach der Resorcinmethode) werden mit Soda IN oder 5 %igem Ammoniak neutralisiert, vereinigt und lyophilisiert. Man erhält die gereinigten gesuchten Polysaccharide, deren molare Zusammensetzung folgende ist: pro 1 Galactosemolekül 0,2 Glukosemoleküle, 2,2 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsauremole-

kül und 1 Pyruvsäuremolekül in der Form von Pyruviliden

Beispiel 2

Die Polysaccharide werden nach der Arbeitsweise des Beispieles 1 erhalten, wobei man nur das üakterium des Stammes Klebsiella pneumoniae verwendet. Die Zusammensetzung der erhaltenen Polysaccharide ist folgende: 69 % neutrale Hexosen, 0,25 % Glukosamin, 7 % Pyruvsäure, 22,7 % Galacturonsäure und 0,86 5 Proteine.

Beispiel 3

Das Lysefiltrat der Bakterienstämme Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae, erhalten gemäß dem Verfahren des Beispiels 1, wird gegen einen Natriumphosphatpuffer mit 150 mM und pH 7,4. dialysiert. Das Filtrat wird sodann auf eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm und einem Gehalt von 500 ml GF 2000 Trisacryl -Gel aufgegeben, auf welchem in kovalenter Weise 1,5 mg spezifische Antikörper je Milliliter Gel fixiert sind. Nach 1 h Inkubation wird die Säule mit dem Vierfachen ihres Volumens eines Phcsphatpuffers mit 150 mM bei pH 7,4 gewaschen. Die E.lution erfolgt mit einer Lösung des gleichen Puffers mit einem Gehalt von 2 M Magnesiumchlorid. Eine Fraktion gleich dem 2fachen Volumen der Säule wird zurückgehalten und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Diese Fraktion wird lyophilisiert und enthält die Polysaccharide mit folgender molarer Zusammensetzung: je 1 Galactosemolekül 2,5 Mannosemolekülse, 0,3 Glukosemoleküle, 1 Galacturonsauremoiekul, 1 Pyruvsäuremolekül in der Form von Pyruviliden.

Pharmakologische Untersuchungen

Die Aktivitäten der Polysaccharide nach der Erfindung beim Tier und beim Menschen wurden mit den nach den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Produkten getestet.

-14-Aktivierung von alveolaren Makrophagen-Murcincn

Dieser Test verdeutlicht das Phänomen einer Aktivierung von Makrophagen aufgrund ihrer cytostatischen oder cytotoxischen Aktivität: gegen Tumorzellen.

Die phagocytären Leukocyten der Klasse der Monocyten-Makrophagen können einem Aktivierungsprozeß unterliegen» der sich durch Eigenschaften, wie die Steigerung der Phagocytose, die Steigerung der proteolytischen Enzymsekretion, der Sauerstoff metaboliten, wie des Superoxidanions oder von Wasserstoffperoxid, und cytotoxischer Faktoren zeigt.

Diese Prozesse haben teil an einer Zunahme der bakteriziden und tumoriziden Fähigkeit dieser Zellen.

Ferner gestattet es dieser Aktivierungsprozeß diesen Zellen, ihre Fähigkeit einer Präsentation verschiedener Antigene gegenüber zusammenwirkenden Lymphocyten T zu steigern. Schliei3lich gestattet das Phänomen der Makrophagenaktivierung die Sekretion von Monoklinen, wie den Interferonen oder des Interleukins, die an dem Prozeß der Immunantwort teilhaben.

Der Test der Maßnahme der Makrophagenaktivierung besteht darin, eine alveolare oder peritoneale Makrophagenkultur der Ratte oder der Maus oder menschliche Monocyten mit Dosen von Polysacchariden nach der Erfindung, die von 0,001 bis 50 μg/ ml variieren, zu behandeln. Dies wird folgendermaßen realisiert:

10 Makrophagen der Maus vom Stamm Bald c, Swiss C 57/B 16 oder DBA/2 oder der Ratte vom Stamm Kyoto oder Wistar werden in einer Mikrotitrationsplatte in ein Kulturmedium gegeben, das gegebenenfalls durch ein künstliches Serum von 1 bis 10 μΓη/ml Polymyxin ergänzt wurde.

Man setzt dip Polysaccharide . nach der Erfindung oder den

273 4 s

entsprechenden Puffer ohne Polysaccharide als negative Kontrolle zu. Die Zellen werden 24 h bei 37 ⁰C inkubiert. Man entfernt sondann das oben Schwimmende und wäscht die Zellen mit Kulturmedium

5

Sodann setzt man die gezielten Tumorzellen L 1210 oder P 815 einem vollständigen Medium zu. Das Verhältnis von Makrophagen zu Zielzellen ist 10. Man inkubiert sodann die Kultur während 24 h bei 37 ⁰C. Dann gibt man ein- bis zweimal 10E4B Bq mit tritium markiertes Thymidin je Vertiefung zu. Die Zellen werden nach 4 h Inkubation bei 37 ⁰C auf einem Filter aus Glasfasern gewonnen. Nach dem Trocknen der Filter wird die Radioaktivität in Gegenwart eines scintillierenden Gemisches gemessen.

Die Resultate entsprechen einem Mittel von drei Messungen. Der Aktivi.erungsprozentsatz wird folgendermaßen ausgedrückt:

A % = χ 100 κ

R: durch die in Gegenwart von Bezugsmakrophagen gezüchteten Tumorzellen eingeführte Radioaktivität,

S: durch die in Gegenwart stimulierter Mäkrophagen gezüchteter Tumorzellen eingeführte Radioaktivität,

Die in der Tabelle I aufgeführten Ergebenisse zeigen die Aktivität der Produkte nach den Beispielen 1 und 3.

-16-Tabelle I

2734

50

5 Getestetes Produkt

Polysaccharide von Beispiel 1 Beispiel 3

Muramyldipeptid (MDB) positive Bezugsprobe

15 Placebo

Dosis

% der Aktievierung von alveolaren Makrophagen von Kyoto-Ratten

ο,	Oi	Mg/ml	58 %
0,	1	Mg/ml	62 %
1		Mg/ml	6C %
10		Mg/ml	86 %
0,	01	Mg/ml	28 %
1		Mg/ml	90 %
10		Mg/ml	92 ft
			0 %

Induzierende Interferonaktivität in vivo beim Menschen

Die Interferone sind eine Gruppe von Molekülen Proteinur-Sprungs, die Antiviruseigenschaften und immunmodulierende Eigenschaften zeigen. Unter normalen Bedingungen gestattet der schnelle Ausscheidungskoeffizient des Seruminterferons keine direkte Dosierung in menschlichem Serum. Es ist zur Überwindung dieser Schwierigkeit möglich, die Aktivität eines durch das Interferon induzierten Enzyms: der 2',5'-0Iigoisoadenylatsynthetase zu messen. Man konnte demonstrieren, daß dieses Enzym ein gutes Markierungsmittel des Interferons (siehe L. J. Z. Penn und B. R G. Williams, J. Virol., 49, 1984, Seiten 748 bis 753) bei den gesunden Patienten ist; seine Aktivität in den Lymphocyten des peripheren Blutes ist konstant. Im Gegensatz dazu nimmt es im Falle einer Virusinfektion oder bei · Verabreichung von exogenem Interferon stark zu.

Die Wirkung einer einzigen oralen Verabreichung mit erhöhter Dosis an Polysacchariden nach der Erfindung wurde bei 10 freiwilligen Patienten getestet.

Eine Gruppe von 5 Patienten erhielt ein Placebo, während die andere Gruppe von 5 Patienten eine einzelne Dosis von 2 mg Polysacchariden nach der Erfindung, hergestellt nach Beispiel 1, erhielt

5

Blutentnahmen erfolgten vor der Verabreichung des Produktes sowie 24 und 48 h danach. Die peripheren Leukocyten wurden isoliert und lysiert. Die Aktivität der 2 ' ,5'-Oligoisoadenylatsynthetase wurde in diesen Lysaten gemessen.

Die in der Tabelle II aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß eine einzelne Dosis von 2 mg der Produkte eine signifikante Steigerung der Aktivität der 2',5'-Oligoisoadenylatsynthetase induzierte, insbesondere 48 h nach der oralen Verabreichung.

Tabelle II

Änderung der Aktivität der 2 ' ,5'-Oligoisoadenylatsynthetase. Die Anfangswerte wurden

mit 100 % angenommen.

0 h 24 h 48 h

Placebo 100 82 109

2 mg des Produktes des Beispiels 1 100 145 208

Induktion von Inhibitorfaktoren für die Leukocytenwanderung (MIF-LIF)

Eine Untersuchung gegenüber Placebo wurde mit zwei Gruppen von freiwilligen Patienten durchgeführt, die ein Placebo oder eine einzelne Dosis des Produktes gemäß Beispiel 1 auf oralem Wege mit einer einzelnen Dosierung von 2 mg erhielten. Die Verabreichung erfolgte in willkürlicher Weise im Doppelblindversuch.

Blutabnahmen erfolgten 0 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h nach der Produktverabreichung.

Die in der Tabelle III beschriebenen Ergebnisse zeigen klar, daß das Produkt eine signifikante Hemmung der Leukocytenwanderung gegenüber dem Placebo induzierte.

Tabelle III 0_h 24 h 48 h 96 h

Placebo O 0 3 3

2 mg des Produktes

des Beispiels 1 0 8 22 28

Die Ergebnisse sind als Prozente der Hemmung der Wanderung ausgedrückt.

Die Induktion solcher löslicher Faktoren demonstiert die Wirkung der Polysaccharide nach der Erfindung auf die Mechanismen der Immunantwort.

Das Interesse der Indu ^tion dieser Faktoren wird durch die nachfolgend beschriebenen kliniachen Versuche erläutert. 25

Verhinderung und Behandlung chronischer und rezidivierender Infektionen der Atemwege

Drei Experimentatoren untersuchten klinisch die Polysaccharide nach der Erfindung gemäß Beispiel 1 mit einer Gruppe von Patienten mit chronischer Bronchitis. Diese Patienten hatten wenigstens zwei infektiöse Episoden während der 12 Monate vor dem Versuch. Man schloß die Patienten aus, die schwere Störungen der Leberfunktionen, Nierenfunktionen oder Herzfunktionen hatten. Auch erhielten diese eine systematische Antibiotherapie, eine immunmodulierende Behandlung oder eine Corticotherapie.

46 Patienten, die diese Kriterien hatten, wurden mit einer oralen Gabe von 0,06 mg Polysacchariden oder einem Placebo morgens nüchtern 20 aufeinanderfolgende Tage je Monat während drei Monaten behandelt.

Die Untersuchung wurde als Doppelblindprobe durchgeführt. Die Patienten wurden während der neun Monate beobachtet, die auf den Beginn der Behandlung folgten.

Die in der Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse zeigen die Wirkung des Produktes während der drei auf die Behandlung folgenden Monate.

Tabelle IV

Produkt

nach der Prozentuale Statistische

Erfindung Placebo Verminderung Signifikanz

Anzahl der infektiösen

Episoden 0,57 0,91 37,4 % ρ < 0,05 Dauer der infektiösen

Episoden

(Tags) 5,91 11,96 50,6 % ρ < 0,05

Dauer der

Antibiothe-

rapie (Tage) 6,04 10,17 40,6% p<0,05

Diese Ergebnisse zeigen klar eine signifikante Verminderung der infektiösen Episoden, der Dauer dieser Episoden und der Antibiotherapie bei den Patienten, die mit den Polysacchariden nach der Erfindung gemäß Beispiel 1 behandelt wurden.

Verhinderung postoperativer infektiöser Komplikationen

Die Senkung der . Immunität durch Zelleinwirkup.g (DTH) nach

einem operativen Schock ist ein wohlbekanntes Phänomen. Drei Untersuchungen hatten die Wirkung einer oralen Behandlung mit den Polysacchariden nach Beispiel 1 auf das Auftreten von postoperativen infektiösen Komplikationen zum Gegenstand.

58 Patienten wurden während der Dauer von 7 Tagen vor und nach dem chirurgischen Eingriff behandelt. Die Behandlungen erfolgten durch orale Verabreichung von 0,06 mg je Tag nach einer willkürlichen Doppelblindprobenmethode. Die Immunität durch Zellvermittlung wurde 7 Tage vor dem Eingriff, am Tag des Eingriffes und 7 h danach durch Messung der Hautreaktion bewertet, die als Reaktion auf 7 Antigene erhalten wurde, die eine zelluläre Immunantwort (System IMC-Test von Biomerieux) zur Folge hatten.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V 20

Polysaccharide des Beispiels 1 Placebo

Punktzah¹unterschied im IMC-Test zwischen

T 7 und Tag 0 -6,3 mm -11,9 mm

Statistische

Signifikanz ρ < 0,01 ρ < 0,001

Die Erniedrigung der Immunität durch Zellvermittlung, hervorgerufen durch den chirurgischen Eingriff, ist deutlich weniger groß bei den mit dem Produkt behandelten Patienten als bei den mit Placebo behandelten Patienten. Andererseits hat während der 7 Tage nach der chirurgischen Handlung das Produkt nach der Erfindung eine viel schnellere Rückgewinnung der normalen Werte der Zellimmunität gegenüber dem Placebo zur Folge.

Da die infektiöse Gefahr direkt proportional zur Punktzahl der Zellimmunität ist (siehe J. I. Gallin und Λ. S. Fauci, Advances in Host Defense Mechanisms, Herausgeber Raven Press, New York, 1986, Band 6) kann das Produkt nach der Erfindung als wirksam zur Verhinderung und zur Behandlung postoperativer infektiöser Komplikationen angesehen werden.

Toxikologische Studien Spitzentoxizität

Eine Toxizität der Polysaccharide nach der Erfindung (Mortalität, makroskopische Untersuchung der Organe) bei der Ratte nach einer oralen Verabreichung der 20 OOOfachen Menge der therapeutischen Dosis wurde nicht beobachtet.

Chronische Toxizität

Eine chronische Toxizität während 4 Monaten Behandlung der Ratte und des Hundes für eine orale Tagesdosis der Polysaccharide nach der Erfindung bis zum 1800fachen der therapeutischen Dosis wurde nicht beobachtet.

Miitagenizität 25

Die Bakterientests nach Arnes demonstrierten eine Abwesenheit von Mutagenfähigkeit der Polysaccharide nach der Erfindung.

Toleranz

Die Polysaccharide nach der Erfindung, dreimal nacheinander in der therapeutischen Dosis von 0,06 mg/Tag verabreicht, wurden sehr gut toleriert. Die Prüfung der biologischen Toleranz während verschiedener klinischer Versuche zeigten überhaupt keine anomal Veränderung der folgenden Parameter: Blutzusammensetzung, Hämoglobin, Elektrolyten, Harnstoff, Glykämie, Serumproteine, Creatinin, Harnsäure, Gesamtcholesterin, ALAT, ASAT, CK, alkalische Phosphatasen und

1 Bilirubin. Die Toleranz wurde von den praktischen Ärzten und den Patienten als ausgezeichnet beurteilt.

Claims

-1-

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Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Gewinnung neuer Polysaccharide aus einem Bakteriophagen-Lysefiltrat einer Kultur wenigstens einer Bakterienart vom Typ Er.cherichia coli oder Klebsielle pneumoniae, gekennzeichnet dadurch, daß man das Filtrat konzentriert und gleichzeitig einer Molekülselektion durch Führen auf Membranen irit selektiver Permeabilität unterzieht, dann die Lösung der extrahierten Polysaccharide durch Chromatographie behandelt, die erste Fraktion gewinnt, dialysiert, die Lösung konzentriert und durch Chromatographie erneut fraktioniert, die erste Fraktion

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gewinnt und trocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die erste Chromatographie vom Affinitätstyp mit immobilisierten Antikörpern oder vom Ionenaustauschtyp ist, die zweite Chromatographie vom Ionenaustauschtyp ist und die Fraktion, welche die Polysacharide enthält, durch Lyophilisieren getrocknet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man das Bakterienlysefiltrat unter gleichzeitiger Benutzung von Bakterien der Arten Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae erhält.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeich net dadurch, daß man Polysaccharide gewinnt, die 65 bis 75 % neutraler Ösen, 18 bis 27 % Uronsäuren, 5 bis 9 % Pyruvsäure in der Form von Pyruviliden, weniger als 0,5 % Osamine und weniger als 1 % Proteine enthalten und ein Molekulargewicht oberhalb 50 000 besitzen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man Polysaccharide gewinnt, die 65 bis 75 % Hexosen, wie' Glukose, Galactose oder Mannose, 18 bis 27 % Uronsäure, wie Galacturonsäure, 5 bis 9 % Pyruvsäure, weniger als 1 % Proteine und weniger als 0,5 % Glukosamin enthalten.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß man Polysaccharide gewinnt, die je Galactosemolekül 0,2 bis 0,4 Glukosemoleküle, 2 bis 2,5 Mannosemoleküle, 1 Galacturonsäuremolekül und 1 Pyruvsäuremolekül enthalten..
7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man wenigstens einen Stamm extrahiert, der unter den Stämmen Klebsiella pneumoniae K 68 und Escherichia coli 0119, hinterlegt beim Institut Pasteur mit den Nummern 58.5 und 62.23, ausgewählt ist.