DD246702A5 - Verfahren zur herstellung eines arzneimittels auf basis von proteinen mit beschleunigter absorbierbarkeit - Google Patents

Abstract

Es wird ein Arzneimittel hergestellt, mit Hilfe dessen die Absorptionsrate von Proteinen mit pharmazeutischen Eigenschaften in das Blut bei intramuskulaerer Verabreichung des Proteins durch einen Absorptionsbeschleuniger, beispielsweise Hydroxylamin oder ein Salz desselben gesteigert wird.

Description

Die vorliegende Anmeldung schließt die folgenden Anmeldungen durch Bezugnahme ein: WO86/01118 „Einleiten der Reperfusions-Behandlung bei Auftreten von Herzanfall-Symptomen", WO86/01114 „t-PA-Zusammensetzung und Verfahren zum Einbringen in den Blutstrom" und WO 86/01109 „Absorptionsbeschleuniger für Proteine". Die vorstehend genannten Anmeldungen wurden jeweils am 27.2.1986 veröffentlicht.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels geschaffen, das bei intramuskulärer Injektion von Proteinen mit pharmazeutischen Eigenschaften schnell zu hohen Konzentrationen des injizierten Proteins in dem zirkulierenden Plasma führt und die schnelle Auswirkung der therapeutischen Effekte erlaubt, ohne daß intravenöse Injektion oder Infusion erforderlich ist. In einer als Beispiel dienenden Ausführungsform wird ein Träger (Vehikel) für das Protein geschaffen, der eine die Absorption beschleunigende Verbindung, beispielsweise Hydroxylamin oder dessen Salz, wie das Hydrochlorid umfaßt, und die Permeation des Proteins in den Gefäßraum deutlich erhöht. Wie in den nachfolgend wiedergegebenen Versuchen gezeigt wurde, führt das erfindungsgemäße Mittel innerhalb weniger Minuten nach intramuskulärer Injektion zu hohen Konzentrationen des Proteins im Blut.

Die Erfindung basiert zum Teil auf der in der Basisanmeldung 708854 offenbarten Erfindung, welche die Behandlung von Herzkranzgefäß gefährdeten Individuen während der mit einem vermuteten Myokardialinfarkt einhergehenden Schmerzen betrifft, um die Schädigung des Herzmuskels zu minimieren und Verbesserungen bei der Behandlung zu schaffen, so daß diese zu dem frühest möglichen Zeitpunkt und sogar bevor eine direkte qualifizierte persönliche Versorgung des Individuums möglich ist, begonnen werden kann.

Wenn sich ein Gerinnsel in einem Blutgefäß bildet, so ist die Blutversorgung des von diesem Gefäß versorgten Organs gefährdet oder gänzlich unterbrochen. Abhängig von dem Blutgefäß, in welchem dies geschieht, ist die Gefahr für das Leben des Individuums entweder gering oder wie bei den nachfolgend behandelten Umständen sehr groß. Die Gerinnselbildung in einem Gefäß wird als Thrombose bezeichnet. Substanzen, die Thrombi auflösen, werden als thrombolytische Substanzen bezeichnet. Wird ein Gerinnsel in einer Koronararterie aufgelöst, so wird die resultierende Wiederherstellung des Blutdurchflusses zum Herzen als „Reperfusion" bezeichnet.

Beispiele für lebensgefährliche oder sehr ernste Gerinnselbildung in Arterien sind Cerebral-Thrombose, Augenarterien-Thrombose und, sehr wichtig, Koronar-Thrombose. In etwa 85 bis 90% der Fälle von akutem Myokardialinfarkt (Koronar-Herzanfall) wird ein Thrombus in den Koronararterien gefunden, der verhindert, daß das Blut zum Herzmuskel (Myokardium) fließt und dieses mit dem essentiellen Sauerstoff und anderen Nährstoffen versorgt. Als Konsequenz der Thrombus-oder Gerinnselbildung in einer Koronararterie ist das Myokardium (das Blut pumpende Herzmuskelgewebe) in Gefahr. Der von der

Blutversorgung abgeschnittene Herzmuskel stirbt nicht sofort ab, aber der Prozeß des Absterbens beginnt sehr schnell. Das Ausmaß der Schädigung des Herzmuskels ist daher eine Funktion der Zeit, während deren die Blutversorgung der Infarktzone durch den Thrombusverschluß unterbunden ist.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisher wurden die Maßnahmen zur Herbeiführung der Reperfusion in die Infarktzone im allgemeinen in.einem Hospital oder einer äquivalenten Umgebung vorgenommen. Die sogenannte „Prehospital-Behandlung" war im allgemeinen daraufgerichtet, deri Patienten am Leben zu erhalten und ihn sobald als möglich in ein Hospital zu bringen, um die Behandlung zum Minimieren der Herzmuskelschädigung durchführen zu können.

Die im Krankenhausbereich durchgeführte Behandlung schließt bestimmte Maßnahmen zum Einleiten der Reperfusion in die Infarktzone des Patientenherzens ein. Ist ein sofortiger chirurgischer Eingriff nicht eindeutig indiziert, so wird die Reperfusion durch Maßnahmen eingeleitet, die den Verschluß öffnen. Die zur Verfügung stehenden Maßnahmen schließen mechanisches Katheterisieren und die Verabreichung thrombolytischer Mittel ein. Die bekannten thrombolytischen Mittel wie Streptokinase oder Urokinase mußten intrakoronar infundiert werden oder langsam durch einen Katheter in das Gefäß am Verschlußort eingeleitet werden. In kurz zurückliegenden Jahren wurde die Wirksamkeit der intravenösen Infusion von Streptokinase gezeigt.

In jüngerer Zeit wurde eine als Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tissue type plasminogen activator) odert-PA bezeichnete Substanz experimentell verwendet, vergl. The New England Journal of Medicine, 310, Seiten 609-613 (1984). Im Unterschied zu anderen Plasminogen-Aktivatoren wie Streptokinase oder Urokinase wirkt t-PA, das nur in kleinen Mengen im Körper gefunden wird, spezifisch auf Gerinnsel und nicht auf andere relevante Proteine im Blut, wenn die Konzentration in geeigneten und wirksamen Grenzen gehalten wird.

In einer Kommentierung in Biochemical Pharmacology, 33, Seiten 1831-1838 (1984) mit dem Titel „Coronary Thrombolysis: Pharmacological Considerations with Emphasis on Tissue-Type Plasminogen Activator (t-PA)" wird das folgende Ergebnis festgehalten:

„Die Auswahl des pharmakologischen Wirkstoffes zur Induktion von Koronarthrombolyse ist weitgehend durch die Verfügbarkeit bestimmt worden. Unglücklicherweise induzieren sowohl Streptokinase als auch Urokinase systemisch einen lytischen Zustand mit Verarmung an zirkulierenden Fibrinogen, Plasminogen unda-2-Antiplasmin und mit Akkumulation von Fibrinabbauprodukten. Alle diese Faktoren wirken zusammen, um einen hämorrhagischen Zustand mit dem Risiko ernsthafter Blutungen herbeizuführen. Die intravenöse Verabreichung dieser Wirkstoffe wird durch eine geringere Erfolgsquote limitiert, zum Teil deswegen, weil die obere Dosisgrenze durch das Risiko bestimmt wird, systemisch einen schweren lytischen Zustand herbeizuführen.

Die Wahrscheinlichkeit, daß die fortschreitende Technologie der rekombinanten DNA zu einer weitgehenden Verfügbarkeit von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tissue-type plasminogen activator) führen wird, ist wegen der gerinnselspezifischen Eigenschaften von t-PA besonders interessant. Für die Koronarthrombolyse sind die folgenden potentiellen Vorteile gegeben: Sicherheit und Wirksamkeit der intravenösen Verabreichung hoher Dosen, wirksame Gerinnsellysis ohne Induktion eines systemisch lytischen Zustandes, schnelle Durchführbarkeit ohne die Notwendigkeit der ausführlichen Charakterisierung der Koagulations- und fibrinolytischen Systeme jedes Patienten vor oder während der Therapie, Vermeiden von spotanen allergischen Reaktionen oder Variationen des Dosisresponsverhältnisses aufgrund von Immunkomplexbildung, leichte Einstellung winziger Dosismengen und bei Bedarf schnelle Beendigung der Fibrinolyse wegen der kurzen biologischen Halbwertszeit von t-PA und der fehlenden Induktion eines systemisch lytischen Zustandes." Die vielversprechenden Aussichten im Zusammenhang mit der t-PA-Appiikation wurden anläßlich eines Treffens der American Heart Association auf einer Neuigkeiten-Konferenz diskutiert und am 16. November 1983 von der New York Times unter dem Titel „Protein of Cancer Cells used to haltCoronaries" berichtet. Der Artikel bezieht sich auf die Injektion von t-PA und stellt folgendes fest: „Das Protein t-PA kann einfach in die Armvene eines Patienten injiziert werden, der an einem Myocardikalinfarkt oder Herzanfall leidet und es verbreitet sich mit dem Blut, um das Gerinnsel in ähnlicher Weise aufzulösen, wie ein Abflußreiniger ein verstopftes Rohr öffnet."

Der Artikel berichtet ferner unter der Überschrift „Hopes for future Application", daß zahlreiche Ärzte ein starkes Interesse an Untersuchungen betreffend die Verwendung von t-PA zur Behandlung von Herzanfällen zum Ausdruck gebracht haben, weil sie hoffen, daß es eines Tages in Notstationen und Ambulanzen verwendet werden kann, um Herzanfälle im Frühstadium zum Stillstandzubringen, bevor sie den Tod oder Dauerschäden herbeiführen. Unter der Überschrift „Hopes for future Application", findet sich auch der folgende Absatz: „Einer der Forscher, Dr. Burton E.Zobel von der Washington Universität, hofft, daß Patienten eines Tages eine Ampulle bei sich tragen werden, so daß das Arzneimittel unmittelbar nachdem sie Brustschmerzen oder andere Frühsymptome eines Herzanfalles bemerken, injiziert werden kann".

In der medizinischen Sprache ist eine Ampulle ein Behälter für eine Menge eines flüssigen Arzneimittels oder Verdünnungsmittels, welcher mit einem von einer hypodermischen Nadel einer Spritze durchstechbaren Gummistopfen versehen ist, durch den eine vorbestimmte Dosis der Flüssigkeit aus der Ampulle entnommen werden kann. Im Falle von t-PA könnte bei der zur Zeit üblichen Verwendungsweise die Dosis anschließend in den Behälter mit Mutterlösung einer Infusionsvorrichtung injiziert werden. Die Notwendigkeit, den Wirkstoff durch intravenöse Infusion oder durch intravenöse Injektion zu applizieren, bildet aus praktischen Gesichtspunkten ein erhebliches Hindernis für die Selbstapplikation, insbesondere wenn man die erschwerenden Umstände berücksichtigt, denen jemand mit den Symptomen eines Myokardialinfarktes ausgesetzt ist.

Ziel der Erfindung

Die Entwicklung eines effektiven Verfahrens zur Selbstapplikation von t-PA, das von einem Patienten mit Neigung zum Herzanfall unmittelbar nach Einsetzen der Symptome selbst angewendet werden kann, würde die potentielle Wirksamkeit von t-PA als thrombolytischem Wirkstoff wesentlich steigern; die Anwendung wäre zu dem frühest möglichen Zeitpunkt und oftmals vor Eintreten irreversibler Herzmuskelschäden gewährleistet und gleichzeitig wäre eine Behandlungsmöglichkeit geschaffen, die vor Einlieferung in das Hospital oder vor ambulanter Behandlung einsetzen könnte und zum ersten Mal direkt die Minimierung der mit dem Myokardialinfarkt einhergehenden Herzmuskelschädigung herbeiführen könnte.

Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, ein selbstapplizierbares Mittel für eine derartige Behandlung zu schaffen, das in weiten Bereichen zur Anwendung kommen kann.

Zahlreiche Proteine mit lebensrettenden, therapeutischen Eigenschaften müssen gegenwärtig ausschließlich intravaskulär verabreicht werden, um therapeutische Blutspiegel zu erreichen. Beispiele hierfür sind Aktivatoren des gerinnsellösenden, fibrinolytischen Systems einschließlich Streptokinase und Urokinase, die zur Behandlung fortgeschrittener Herzanfälle verwendet werden sowie Bestandteile des Gerinnungssystems, wie Anti-Hämophilie-Globulin (Faktor VIII), das die Blutung bei Hämophilen zum Stillstand bringt. In vielen Fällen müssen andere Proteine, wie das Insulin zur Behandlung des diabetischen Komas, intravenös verabreicht werden, um Konzentrationen zu erhalten, die genügend hoch sind, um die gewünschten therapeutischen Wirkungen innerhalb der durch medizinische Notfälle vorgegebenen Zeit schnell genug herbeizuführen. Wie oben ausgeführt, wurde die Auflösung von Herzanfälle auslösenden Gerinnseln in den Koronararterien bei Versuchstieren und Patienten erreicht, indem man Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) intravenös applizierte. Hierbei handelt es sich um ein Protein, das in der Lage ist, das fibrinolytische System an der Oberfläche des Gerinnsels zu aktivieren, ohne den Patienten für Blutungen zu prädisponieren. Da die Zirkulations-Halbwertszeit von t-PA sehr kurz ist, war kontinuierliche intravenöse Infusion erforderlich, um das schnelle Verschwinden des Proteins aus dem Kreislauf und die daraus resultierenden subtherapeutischen Konzentrationen zu vermeiden. Ferner wurde die intravenöse Verabreichung als erforderlich angesehen, weil schnelle Gerinnselauflösung dringend erforderlich ist, um den fortschreitenden Herzanfall zum Stillstand zu bringen, bevor ein wesentlicher Teil des Herzmuskels abgestorben war. ·

Darlegung des Wesens der Erfindung

In Anbetracht der oben erläuterten Umstände wurde erfindungsgemäß ei η Mittel geschaffen, dessen primäreAufgabeesist, die Absorption von Proteinen, beispielsweise t-PA und anderen großen Proteinen in das Blut bei intramuskulärer Injektion zu beschleunigen. Das Mittel wird durch Solubilisieren des Proteins in einem Träger hergestellt, der mit einem Absorptionsbeschleuniger für das Protein in das Blut angereichert ist, welcher eine schnelle Permeation des Proteins in den zirkulierenden Blutpooi bewirkt. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, die Absorption über einen Zeitraum von 30 bis 60 Min. zu verbessern, so daß therapeutische Blutspiegel unter Notfall-Bedingungen aufrechterhalten werden können. Die Permeation der untersuchten Proteinein den.Intravaskularraum führte innerhalb von 2 Min. nach Injektion des erfindungsgemäßen Mittels zu hohen Blutspiegeln. Der erfindungsgemäß geschaffene Träger erleichtert die Absorption bei sämtlichen der vier Proteinein den nachfolgend beschriebenen Versuchen und übte keine nachteiligen Wirkungen auf die funktioneilen Eigenschaften der beiden untersuchten Proteine mit Gerinnsel lysierenden Eigenschaften aus. Die Erfindung ist nicht auf die in den speziellen Beispielen verwendeten Proteine beschränkt, sondern sie ist auch auf andere Proteine wie beispielsweise Insulin anwendbar. Die Erfindung schließt Packungen von t-PA (und anderen Proteinen mit medizinischen Eigenschaften) und einem Absorptionsbeschleuniger für t-PA in das Blut ein. Der bevorzugte Beschleunigerist Hydroxylaminhydrochiorid. Es kann beispielsweise eine bekannte automatische Injektionsvorrichtung für Notfälle verwendet werden und das Verfahren schließt das Injizieren der beiden Medikamente in das Muskelgewebe ein, beispielsweise nach telefonischer Anweisung von qualifizierter Stelle und zu einem früheren Zeitpunkt als direkte qualifizierte persönliche Versorgung eingeleitet werden kann. t-PA ist ein großes Protein. Es ist nicht zu erwarten, daß nennenswerte Mengen in den Blutstrom aufgenommen werden. Extravaskuläre Konzentrationen des Proteins betragen etwa Vio des intravaskulären Proteins. Es wird angenommen, daß dies darauf beruht, daß die Capillarporen, durch die der Transport des Proteins stattfindet, im Verhältnis zu der Molekülgröße des Proteins klein sind und den Proteintransport wegen der elektrischen Ladung limitieren. Es war daher außerordentlich problematisch, ob ein so großes Protein wie t-PA bei intramuskulärer Applikation, d.h. außerhalb der Blutgefäße, seinen Weg in nennenswerten Mengen schnell in den Blutstrom finden würde. Applikationsversuche haben tatsächlich gezeigt, daß t-PA alleine nach intramuskulärer Injektion nicht in therapeutisch signifikanten Mengen schnell in den Blutstrom aufgenommen wird.

Bei der Applikation des Systems muß daher intramuskuläre Injektion eines die Absorption beschleunigenden Mittels gleichzeitig oder im wesentlichen gleichzeitig mit der intramuskulären Injektion des Proteins, beispielsweise t-PA, einhergehen. Die Steigerung der Absorption topisch·, subkutan oder intramuskulär applizierter Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht wurde mit Trägern wie Dimethylsulfoxid (DMSO) und durch Steigerung der Skelettmuskeldurchblutung und des Lymphflusses erreicht.

DMSO hat sich jedoch als Absorptionsbeschleuniger für t-PA und andere Proteinmoleküle als unwirksam erwiesen. Die Absorptionsrate von t-PA und anderen Proteinen in das Blut wird erfindungsgemäß gesteigert, indem man mit der Dosis von t-PA oder eines anderen Proteins eine Dosis eines Absorptionsbeschleunigers für t-PA oder ein anderes Protein, beispielsweise Hydroxylaminhydrochiorid, verwendet. Vorzugsweise wird der Absorptionsbeschleuniger wie Hydroxylamin mit der Dosis des t-PA oder des anderen Proteins vermischt, um eine einzige Mischdosierung zu erhalten, die dann intramuskulär (i. m.) injiziert wird. Erfindungsgemäß kann der Absorptionsbeschleuniger jedoch auch getrennt innerhalb des gleichen Bereichs wie dast-PA oder das andere Protein (beispielsweise US-PS 4394863) injiziert werden. Die Menge des Absorptionsbeschleunigers wie Hydroxylaminhydrochiorid, die wie zuvor angegeben mit t-PA oder einem anderen Protein kombiniert werden kann, beträgt von 0,1 bis 85, beispielsweise 0,1 bis 40 oder 1 bis 85mg je kg Körpergewicht.

Das Hydroxylamin wird als Absorptionsbeschleuniger vorzugsweise als nicht-toxisches wasserlösliches Salz verwendet. Anstelle des Hydroxylamins können daher beispielsweise Salze wie Hydroxylaminhydrochlorid, Hydroxylaminhydrobromid, Hydroxylaminhydrojodid, Hydroxylaminsulfat, Hydroxylarninnitrat, Hydroxylaminacetat und Hydroxylaminpropionat verwendet werden. In am meisten bevorzugter Weise wird Hydroxylaminhydrochlorid verwendet. Als Absorptionsbeschleuniger für t-PA oder andere Proteine können erfindungsgemäß auch Verbindungen wie Ammoniumhydroxid, Ammoniumcarbonat und andere Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Ammoniumbromid und Ammoniumsulfat, Harnstoff, Mono- und Dialkylhamstoffe, beispielsweise Methylharnstoff, Ethylharnstoff, Propylharnstoff, Butylhamstoff, N,N-Dimethylhamstoff, Ν,Ν-Diethylharnstoff, N,N-Diisopropylhamstoff, Mono- und Diarylharnstoffe, beispielsweise Phenylharnstoff, p-Tolylhamstoff, Ν,Ν-Diphenylharnstoff, Ν,Ν-di-p-Tolylharnstoff, Thioharnstoff, Hydantoin, 5-substituierte Hydantoine, beispielsweise 5-Alkyl-, 5-Aralakyl- und 5-Arylhydantoine und 5,5-Dialkyl- und 5,5-Diarylhydantoine, beispielsweise 5-Methylhydantoin, 5-Ethylhydantoin, 5,5-Dimethylhydantoin, 1,5-Trimethylenhydantoin, 1,5-Tetramethylenhydantoin, 5-Phenylhydantoin, 5-p-Tolyl-Hydantoin und 5,5-Diphenylhydantoin, Guanidin, Methylguanidin, Hydrazin, Alkyl- und Arylhydrazine, beispielsweise Methylhydrazin, Ethylhydrazin, Butylhydrazin, Phenylhydrazin und Diphenylhydrazin, Alkyl- und Arylhydroxylamine, beispielsweise Methylhydroxylamin, Ethylhydroxy.lamia und Phenylhydroxylamin. Die substituierten Harnstoffe, Hydrazine und Hydroxylamine können in gleicherweise als Salze, beispielsweise als Hydrochloride verwendet werden. Ebenso können andere Amine als Absorptionsbeschleuniger verwendet werden, beispielsweise Alkylamine und Dialkylamine wie Niedrigalkyl- und -dialkylamine, beispielsweise Methylamin, Dimethylamin, Ethylamin, Diethylamin, Isopropylamin, sekundäres Butylamin, Diisopropylamin, Propylamin, n-Butylamin, Aralkylamine, beispielsweise Phenylethylamin, Hydroxylaralkylamine, beispielsweise Epinephrin und Tyramin, Hydroxylalkylamine, beispielsweise Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Propanolamin und andere Amine wie Methoxyamin, Alkyienpolyamine, beispielsweise Ethylendiamin und Diethylentriamin. Diese Amine können ebenfalls als Salze nicht toxischer Säuren verwendet werden, beispielsweise als Hydrochloride. GJucoseoxim kann ebenfalls verwendet werden.

Methylamin und Dimethylamin haben ferner den Vorteil, daß sie keine Methhämoglobinämie induzieren. Dies wurde an Kaninchen nachgewiesen, denen (a) 0,63 molares Methylaminhydrochlorid und (b) 0,63 molares Dimethylaminhydrochlorid zusammen mitt-PA in einer Menge von 1 mg/kg Körpergewicht injiziert wurden. In beiden Fällen betrug die Injektionsmenge 1 ml und der pH-Wert der Lösungen 6,5. Bei Verwendung von Methylamin (als Hydrochlorid) lag der t-PA-Spiegel im Bereich von 220 .bis230ng/pro ml. Mit Dimethylamin lagen diet-PA-Spiegel etwas niedriger, aber waren gegenüber der Verabreichung von t-PA ohne Absorptionsbeschleuniger noch immer erhöht. Methoxiamin (als Hydrochlorid) erhöhte unter den gleichen Bedingungen ebenfalls den t-PA-Spiegel, aber verursachte Methhämoglobinämie. Der zeitliche Ablauf der Erhöhung von t-PA während 30 M in. war mit Methylaminhydrochlorid im wesentlichen der gleiche wie mit Hydroxylaminhydrochlorid. Die Konzentrationen lagen mehr als 10fach höher als die Plasma-t-PA-Konzentrationen in Abwesenheit des Absorptionsbeschleunigers. Obgleich das Mittel zur gleichzeitigen Verabreichung von t-PA oder anderen Proteinen mit Absorptionsbeschleunigern in erster Linie für den Menschen vorgesehen ist, kann es erfindungsgemäß auch anderen Säugetieren wie beispielsweise Hunden, Katzen, Rindern und Pferden verabreicht werden. Der Muskel kann am Injektionsort in an sich bekannter Weise elektrisch stimuliert werden, während gleichzeitig ein Absorptionsbeschleuniger, insbesondere Hydroxylaminhydrochlorid, wie in einigen der nachfolgend beschriebenen Beispiele, in der Injektionsflüssigkeit für die intramuskuläre Injektion verwendet wird. Die elektrische Stimulierung fördert und beschleunigt die Absorption des erfindungsgemäßen Absorptionsbeschleunigers. Obgleich, wie in der ältesten Basisanmeldung beschrieben, eine automatische Injektionsvorrichtung verwendet werden kann, die für die intramuskuläre Selbstapplikation von t-PA oder anderen Proteinen geeignet ist, wurden die nachfolgend beschriebenen Beispiele durchgeführt, indem man das t-PA oder ein anderes Protein und Hydroxylaminhydrochlorid enthaltende Mittel direkt mit einer herkömmlichen Nadel oder Spritze in den Muskel applizierte. Die Verabreichung des Mittels miteinerautomatischen Injektionsvorrichtung führt jedoch zu noch höheren Blutspiegeln als sie mit manueller Injektion erzielbar sind.

Nachdem die intramuskuläre Injektion von t-PA in Kombination mit Hydroxylamin (als Hydrochlorid) und elektrischer Stimulierung des Skelettmuskels am Injektionsort bei Kaninchen zu Peaks der t-PA-Blutkonzentration geführt hatten, die vergleichbar oder höher waren als diejenigen, die bekanntermaßen nach intravenöser Infusion von t-PA bei Hunden und bei Patienten Koronarthrombolyse bewirken, wurde ein entsprechender Versuch bei Hunden mit Koronoarthrombose durchgeführt. Bei diesen Pilotexperimenten wurde gefunden, daß die beschleunigte Absorption von t-PA nach intramuskulärer Injektion sowohl die Koronarthrombolyse bewirkt als auch therapeutische Blutspiegel von t-PA herbeiführt. Wegen der begrenzten Löslichkeit von t-PA in herkömmlichen Puffern wurden große Volumina an Injektionsflüssigkeit verwendet. Um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten wurden die verwendeten Volumina bei den Kaninchen so ausgewählt, daß sie mit den für die Hunde geplanten übereinstimmten (1 bis 1,5ml je Injektionsart für Kaninchen bzw. Hunde), obgleich es sich hierbei in bezug zur Kaηinchenmuskeimasse um große Volumina handelte. Auf diese Weise wurde die gleiche Konzentration an Absorptionsbeschleuniger je ml Injektionsflüssigkeit in beiden Spezies verwendet, obgleich dies zu dem Ergebnis führte, daß bei den Kaninchen erheblich größere Mengen von Hydroxylamin je kg Körpergewicht und eine 10fach geringere Konzentration von t-PA in der Injektionsflüssigkeit im Vergleich zu den Hunden appliziert wurde, es wurde jedoch eine vergleichbare Menge t-PA je kg Körpergewicht bei beiden Spezies verabreicht. Konzentrieren des t-PA vorzugsweise mit Solubilisierungsmitteln wie Thiocyanat läßt eine erhebliche Reduzierung der Volumina zu.

Für die Kaninchenversuche wurde das verwendete t-PA entweder aus dem Überstand von Melanomzellfraktionen (mt-Pa) gewonnen, wie von Bergmann in Sience. 220,1181-1183 (1983) beschrieben, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt, wie von Van der Werf in Circulation 69, 605-610 (1984) beschrieben (rt-PA, Genentech Corp. Lot BH 004DAX). Die Ergebnisse der beiden Präparate waren nicht zu unterscheiden und die Präparate wurden daher miteinander vereinigt. Es wurden Konzentrationen von 0,5mg t-PA je ml Puffer (0,3M NaCL, 0,01 %Tween 80, 0,01 M KalumphosphatpufferpH 7,5) verwendet. Fürdie Untersuchungen an Hunden wurde rt-Pa (Genentech Lot TE 031 A) mit einem Amicon Membranfiltersystem 20fach konzentriert. ' .

DMSO wurde in 1 oder 3V7V%igen Lösungen in vitro und in Injektionsflüssigkeiten verwendet. Hydroxylaminhydrochlorid wurde in Konzentrationen von 43,75 mg/ml t-PA-Lösung verwendet. Diese Konzentration entsprach einer Hydroxylaminhydrochlorid-Gesamtdosisvon etwa 14mg/kg und wurde physiologisch gut vertragen. Um zu bestimmen, in welchem Umfang die untersuchten Absorptionsbeschleuniger auf das t-PA einwirkten, wurden Lösungen von rt-Pa (0,015 bis 50ng/ml) bei 37°C^reine Stunde lang nach Zugeben von 1 % und 3% DMSO, oder 175mg/ml Hydroxylamin (als Hydrochlorid) oder sowohl DMSO als auch Hydroxylamin (als Hydrochlorid) inkubiert. Bei immunoradiometrischer oder funktioneller Analyse des t-PA waren keine Wirkungen auf das untersuchte t-PA nachweisbar.

Die Untersuchungen wurden an 56 nicht nüchternen, weißen männlichen Neuseeland-Kaninchen mit einem Körpergewicht von etwa 2 kg durchgeführt. Endogenes t-PA dieser Tiere reagiert nicht mit Antikörpern gegen menschliches t-PA und stört daher den immunoradiometrischen Nachweis nicht, der zur Bestimmung der Blutkonzentrationen von exogen appiiziertem t-PA verwendet wurde. Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital (24mg/kg) anästhesiert und mit 95% Sauerstoff beatmet, der durch Tracheostomie mit einer Rate von 2 l/min verabreicht wurde. Der Skelettmuskel (vastus medialis) wurde am Injektionsort bilateral freigelegt, und Serienblutproben wurden durch einen Verweilkatheter der Femoralvene entnommen. Um den Blut- und Lymphfluß des Skelettmuskels am Injektionsort zu steigern, wurde der Muskel 2,0mSek. lang bei 14V mit 5 Impulsen je Sek. mit 2 rostfreien Stahlnadeln (6,86 μ,ηη, 1,27 cm) stimuliert. Es wurde ferner eine einzelne negative distale Elektrode verwendet. Es wurden insgesamt 1 mg t-PA/kg Körpergewicht unterteilt in 1-ml-Teilmengen manuell in jeden von insgesamt 4 Orten injiziert. Be.i nüchternen anästhesierten Hunden mit einem Körpergewicht von etwa 23kg wurde Koronarthrombose induziert, vergl. Bergmann, Science 220,1181-1183 (1983). Innerhalb 5 bis 10Min. bildete sich ein Verschlußthrombus, der angiographisch bestätigt wurde. Durch einen Verweilkatheter in der Vena cava inferior wurden Serienblutproben von venösem Blut entnommen. Elektrische Stimulierung am Injektionsort wurde mit 3 rostfreien Stahlnadeln (6,86/nm) vorgenommen, wobei eine als negative Referenzelektrodediente. Die Parameter stimmten mit den bei den Kaninchen verwendeten überein. t-PA wurde in 1,5 ml Teilmengen je Injektionsort direkt in den freigelegten Sartoriusmuskel injiziert, so daß die Gesamtdosis 3 mg/kg Körpergewicht und das Gesamtvolumen der Injektionsflüssigkeit zusammengenommen 6ml für jeden Hund betrug.

Bei den Untersuchungen an den 56 Kaninchen war der primäre Meßparameter für die Experimente die t-PA-Aktivität im Blut. t-PA-Antigenspiegel wurden serienmäßig durchgeführt, wie von Bergmann, s. o., und Van der Werf No. Engl. 2, Med. 310, 609-613 (1984) beschrieben. Die funktionell t-PA-Aktivität wurde ebenfalls bestimmt, wie von Bergmann, s.o., und Tiefenbrunn, Circulation 71,110-116 (1985) beschrieben. Blutproben wurden vor intramuskulärer Injektion von t-PA oder Träger allein, unmittelbar nach Injektion und anschließend in bestimmten Abständen innerhalb 1 bis 60 Min. bei 0 bis 4⁰C in Natriumeitrat „Vacutainer"-Röhrchen gewonnen.

Für die Brauchbarkeitsuntersuchungen an Hunden diente die angiographisch dokumentierte Koronarthrombolyse als zusätzlicher Meßparameter. Blutdruck, Puls, das Elektrokardiogramm, arterielle Blutgase und pH-Werte, Hämoglobin und Hämoglobinsauerstoffsättigung wurden aufgezeichnet.

Bei den Versuchen mit beiden Spezies wurde eine grobe Abschätzung der potentiellen Muskelverletzung an den Injektionsorten durch allgemeine Inspektion vorgenommen. Zusätzlich wurden Blutprobenserien spektrofotometrisch auf Plasmakreatinkinaseaktivität (CK) untersucht, vergl. Klein, Cardiovasc. Res. 7,412-418 (1973), da bekanntlich eine schnelle und deutliche Freisetzung von CK in den Blutkreislauf stattfindet, wenn Skelettmuskel verletzt wird.

Serielle Veränderungen der Blutkonzentrationen von t-PA wurden bei 56 Kaninchen in mehreren Gruppen ausgewertet. Die Blutspiegel wurden vor und in bestimmten Zeitabständen nach intramuskulärer Injektion von Puffer mit oder ohne Absorptionsbeschleuniger allein, oder t-PA in Puffer, in Puffer mit DMSO, in Puffer mit Hydroxylamin (als Hydrochlorid), oder in Puffer mit DMSO und Hydroxylamin (als Hydrochlorid) bestimmt.

Die gleichen Kombinationen wurden mit und ohne gleichzeitige elektrische Stimulierung des Muskels am Injektionsort während des Blutentnahmeintervalls ausgewertet. Nachdem es sich gezeigt hatte, daß Hydroxylamin die Absorption von t-PA erleichterte, wurden Versuche durchgeführt, um das Dosisrespons-Verhältnis für die Absorption von t-PA als Funktion dert-PA-Konzentration und der Hydroxylamin-Konzentration in der Injektionslösung zu definieren. Mögliche systemische Effekte von Hydroxylamin auf 'die Absorption von t-PAwurdenhei Kaninchen geprüft, indem man an 2 Injektionsorten Hydroxylamin ohne t-PA und 2 weiteren Orten t-PA ohne Hydroxylamin applizierte.

Die Untersuchungen an Hunden wurden durchgeführt, nachdem an Kaninchen nachgewiesen war, daß therapeutische Blutspiegel mit Mengen von t-PA/kg Körpergewicht (1 mg/kg) in der gleichen Größenordnung induziert werden konnten, wie dies zuvor bei intravenöser Applikation von t-PA bei Patienten (0,5 bis 0,75 mg/kg) der Fall war.

t-PA wurde mit Hydroxylamin (als Hydrochlorid) innerhalb von 5 bis 45 Min. nach angiographischer Dokumentation der Bildung eines Verschlußgerinnsels in der linken absteigenden Arteria coronaris anterior intramuskulär verabreicht, wobei dies im allgemeinen innerhalb 7 bis 10 Min. nach Einbringen derthrombogenen Spirale in das Gefäß eintrat. Serielle Artiographie wurdeetwa im Abstand von jeweils 15 Min. durchgeführt. Die Auswirkungen von t-PA auf die Koronarthrombi korrelierten mit den t-PA-Plasma-Spiegeln. Nach Auflösung des Gerinnsels (etwa 15 Min. nach Injektion von t-PA) wurde Heparin (500 U/kg Körpergewicht) gegeben, um einen erneuten Verschluß zu verhindern. Ohne die exogene Aktivierung des fibrinolytischen Systems blieben Gerinnsel, die durch die thrombogene Verbleibspirale in der Koronararterie induziert worden waren, ohne Unterschied trotz der Heparingabe(n = 40 Hunde) bestehen. Statistische Vergleiche wurden durch Varianzanalyse mit kritischen Grenzen nach Bonferroni oder mit dem t-Test nach Students für gepaarte Daten ermittelt. Die Werte werden als Mittelwerte ±SE ausgedrückt.

Wirkung der absorptionsbeschleunigenden Mittel auf die t-PA-Aktivität in vitro:

Weder Hydroxylamin (als Hydrochlorid, 175mg/ml), 1%iges DMSO, 3%iges DMSO noch gleichzeitig verabreichtes Hydroxylamin (als Hydrochlorid) und DMSO modifizierten das immunoradiometrisch nachweisbare t-PA oder funktionell nachweisbare t-PA-Aktivität in Proben, die 0,015 bis 50 ng rt-PA enthielten und eine Stunde lang bei 37⁰C inkubiert waren.

Blutkonzentrationen von t-PA:

Vor intramuskulärer Injektion von rt-PA war im Plasma keines der Kaninchen Human-T-PA immunoradiometrisch nachweisbar. In Plasmaproben, die mit dem funktionellen Fibrinplattentest untersucht wurden, war bei keinem der vier untersuchten Kaninchen trotz des kleinen chirurgischen Eingriffes und der 60 Min. langen elektrischen Stimulierung des Muskels endogene t-PA-Aktivität nachweisbar. Es war kein Human-t-PA nach Injektion irgendeiner der untersuchten Trägerkombinationen nachweisbar, wenn kein exogenes t-PA in der Injektionsflüssigkeit enthalten war. Kein immunoradiometrisch nachweisbares' t-PA war in Plasmaproben von scheinoperierten Hunden während einer Entnahmezeit von 60 Min. mit oder ohne intramuskuläre Injektion von insgesamt 262mg/ml Hydroxylamin als Hydrochlorid verabreicht an unterschiedlichen Orten vorhanden. Die im Fibrinplattentest nachweisbare funktioneile Aktivität bei scheinoperierten Hunden lag im Bereich von 10 bis 53IU/ml und stieg bei keinem der 4 untersuchten Tiere während des 60 Min. langen Intervalls der Probenentnahme nach elektrischer Stimulierung und.intramuskulärer Injektion von Hydroxylaminhydrochlorid in Puffer ohne t-PA an.

In Kontrollversuchen mit Hunden, denen 262mg Hydroxylamin allein intramuskulär injiziert worden war, lagen die Gipfel der Methhämoglobinspiegel im Bereich von 11 bis 13% und traten innerhalb von5bis15Min.nach intramuskulärer Injektion auf (n = 3). Die artielle Sauerstoffspannung sankaufein Minimum von 93 mm Hg. Die Sauerstoff Sättigung des Hämoglobins sank auf ein Minimum von 81 %. Abgesehen von einer vorübergehenden Beschleunigung der Herzschlagrate zeigten die mit Hydroxylaminhydrochlorid mit oder ohne t-PA behandelten Hunde keine signifikanten hämodynamischen oder elektrokardiographischen Abweichungen.

Erläuterung der Zeichnungen:

In Figur 1 ist die immunoradiometrisch nachweisbare und die funktionell aktive Plasma-t-PA-Aktivität in Plasmaproben von Kaninchen graphisch dargestellt, die mit 2mg t-PA in Puffer mit 43,75mg/ml Hydroxylaminhydrochlorid (Gesamtvolumen der Injektionsflüssigkeit = 4ml verteiltauf 4 Orte) und nachfolgender elektrischer Stimulierung der Injektionsorte während des Zeitraums der Probenentnahme behandelt wurden. Sowohl die Immun reaktion als auch die funktionell t-PA-Aktivität erreichten kurz nach intramuskulärer Injektion des Mittels mit Absorptionsbeschleuniger den Gipfel.

In Figur 2 ist die Abhängigkeit der max. Konzentration im Plasma von immunoradiometrisch nachweisbarem t-PA von der Konzentration des Hydroxylamins in der Injektionslösung graphisch dargestellt. Die Bedingungen waren die gleichen wie zu Figur 1 angegeben, mit dem Unterschied, daß die Hydroxylaminmengen in dem Gesamtvolumen der Injektionslösung von 4ml wie in der Figur angegeben,.variiert wurden.

Figur 3 ist ein Diagramm, das die max. t-PA-Aktivität im Plasma als Funktion der intramuskulär verabreichten t-PA-Mengen bei 6 Kaninchen zeigt. Die Bedingungen waren die gleichen wie zu Figur 1 angegeben, mit dem Unterschied, die verabreichte t-PA-Gesamtmenge wie angegeben variiert wurde. Die Fläche A gibt die immunoradiometrisch nachweisbare Aktivität wieder, die Fläche B zeigt die funktioneile amidolytische Aktivität. Die dosisabhängigen Differenzen während der Meßdauer von 1 Std. waren für den gesamten Zeit-Aktivität-Ablauf (n = 30 Bestimmungen) signifikant, nachgewiesen durch Varianzanalyse (p< 0,001).

Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Änderung dert-PA-Plasmakonzentrationen kurz nach beschleunigter Absorption von intramuskulär verabreichtem t-PA bei jedem von 3 Kaninchen. Die Bedingungen waren die gleichen wie zu Figur 1 angegeben. Darstellung der seriellen Veränderungen der immunoradiometrisch nachgewiesenen t-PA-Plasmakonzentrationen bei einem Hund, bei dem Koronarthrombose erzeugt worden war. Die Thrombose wurde mit einer thrombogenen Spirale induziert, die an der Spitze eines Koronarkatheters in die linke absteigende Arteria coronaris anterior eingeführt wurde. Die Koronarthrombolyse wurde durch beschleunigte Absorption von intramuskulär verabreichtem t-PA induziert. (Die thrombogene Spirale bewirkte die Bildung eines Gerinnsels, wie durch das Ausbleiben der Füllung mit aniographischem Färbemittel im distalen Bereich sowie fehlende Füllung des proximal zur Spirale gelegenen Gefäßes mit Kontrastmittel, das als helles Rechteck erscheint, nachgewiesen wurde). 15 Min. nach intramuskulärer Verabreichung von t-PA (3 mg/kg in dem gesamten Injektionsvolumen von 6 ml verteiltauf 4 Orte) und elektrischer Stimulierung des Muskels an dem Injektionsort war Lysis des Gerinnsels proximal und distal der Spirale mit angiographisch nachweisbarer Wiederherstellung der Durchgängigkeit erkennbar. Wie ersichtlich, wurde der Gipfel der Plasma-t-PA-Aktivität schnell nach beschleunigter Absorption von intramuskulär verabreichtem t-PA erreicht. Während des Zeitraums der Probenentnahme blieben erhöhte Spiegel bestehen. Ein sekundärer Gipfel wurde bei jedem der 3 Hunde beobachtet.

Figur 6 ist eine graphische Darstellung des Effektes der Verabreichung von Hydroxylaminhydrochlorid zusammen mit Rinderserumalbumin und der Verabreichung von Rinderserumalbumin allein. Das Rinderserumalbumin wurde mit Jod¹²⁵ bestrahlt. In einem ersten Versuch wurde es Kaninchen intramuskulär injiziert. Den Kaninchen wurden von Zeit zu Zeit Plasmaproben entnommen und die Counts je Min. (cpm) des radioaktiven Jods bestimmt. In der graphischen Darstellung ist diese Kurve mit—HA gekennzeichnet. In einem zweiten Versuch wurde Rinderserumalbumin markiert mit radioaktivem Jod in der gleichen Menge durch intramuskuläre Injektion an Kaninchen verabreicht und gleichzeitig Hydroxylaminhydrochlorid intramuskulär injiziert. Plasmaproben wurden von Zeit zu Zeit entnommen und die cpm des'radioaktiven Jods bestimmt. In der graphischen Darstellung ist diese Kurve mit +HA gekennzeichnet. Wie aus der graphischen Darstellung hervorgeht, wurde das Rinderserumalbumin in Gegenwart von Hydroxylaminhydrochlorid schneller absorbiert, und die Absorptionsebene lag noch nach 30Min. mehr als 5fach höher als bei dem Rinderserumalbumin allein.

t-PA-Blutspiegel nach intramuskulärer Injektion bei Kaninchen.

Aus der Sicht der Ergebnisse bei Versuchstieren und Patienten, denen t-PA durch kontinuierliche intravenöse Infusionen appliziert worden war, mußte die t-PA-Konzentration im Blut 50 mg/ml Plasma übersteigen, um therapeutische Effekte herbeizuführen.

Wie in Tabelle 1 wiedergegeben, steigerte die Injektion von t-PA in Puffer aIlein den Biutspiegel nur sehr gering. Die Zugabe von DMSO zu der Injektionslösung steigerte die t-PA-Konzentrationen im Plasma nicht. Im Gegensatz dazu erhöhte Hydroxylaminhydrochlorid die Absorption von t-PA und bewirkte 5 Min. nach Injektion Gipfelwerte, die etwa 40 oder sogar 50fach höher lagen als in seiner Abwesenheit. Es wurde eine etwa 10%ige Absorption des verabreichten Proteins innerhalb von 30 Min. nach intramuskulärer Injektion mit beschleunigter Absorption beobachtet. Während des 1 stündigen . Beobachtungszeitraumes wurden Konzentrationen innerhalb des therapeutischen Bereiches aufrechterhalten (Tabelle 1). Ein Beispiel der seriellen Änderungen der immunoradiometrisch und funktionell mit Fibrinplatten nachgewiesenen t-PA-Aktivität nach intramuskulärer Absorption von t-PA, die durch Zugabe von Hydroxylamin zu der Injektionslösung und elektrische Stimulierung des Muskels an dem Injektionsort beschleunigt wurde, ist in Figur 1 gezeigt.

Tabelle 1

Immunoradiometrisch nachweisbares t-PA im Plasma (ng/ml) nach intramuskulärer Verabreichung von t-PA.

Zeitabstand	t-PA in Puffer	t-PA in Puffer	t-PA in Puffer
nach Injektion	allein (n = 6)	+3%DMSO	+ Hydroxylaminhydrochlorid
(Min.)		(n = 5)	(n=15)
0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
5	8 +1-2	11+/-4	431+/-52*
15	9+/-2 '	8+/-2	146+/-16*.
30 '	9+/-2	9+/-1	,. 85+/-17*
60	10+/-3	10+/- i	- 53+/-11*

Die Werte sind Mittelwerte +/-SE. Alle Injektionslösungen enthielten 2mg t-PA in insgesamt 4ml (1 ml je Ort). Die. Hydroxylaminhydrochloridkonzentration betrug 43,75 mg/m I. Al Ie angegebenen Versuche wurden mit elektrischer Stimulierung des Muskels am Injektionsort durchgeführt.

* P < 0,01 im Vergleich zu t-PA im Puffer allein oder im Puffer + DMSO.

Um zu untersuchen, ob die Erhöhung der Muskeldurchblutung durch elektrische Stimulierung die Absorption des intramuskulär verabreichten t-PA steigern würde, wurden Versuche mit und ohne elektrische Stimulierung nach Injektion von t-PA im Puffer allein, t-PA in Puffer ergänzt mit DMSO und t-PA in Puffer ergänzt mit Hydroxylaminhydrochlorid durchgeführt. Die bei Verabreichung von t-PA ohne Hydroxylamin beobachteten sehr niedrigen Blutspiegel wurden durch elektrische Stimulierung (n = 11 Tiere) nicht wesentlich modifiziert. Bei Tieren, denen t-PA mit Hydroxylaminhydrochlorid (n = 15) verabreicht wurde, steigerte die Stimulierung die Gipfelkonzentrationen jedoch durchschnittlich um 258 +/- 32% ohne den zeitlichen Absorptionsverlauf oder die Clearance von t-PA zu ändern.

Wie in Figur 2 gezeigt, waren die immunoradiometrisch nachweisbaren t-PA-Gipfelkonzentrationen im Blut der Hydroxylaminhydrochloridmenge in der Injektionsflüssigkeit proportional. Fügte man der mit Hydroxylaminhydrochlorid angereicherten Injektionslösung 1- oder 3%ige DMSO zu, so steigerte dies die Gipfelkonzentrationen von t-PA im Vergleich zu den Ergebnissen mit Hydroxylaminhydrochlorid allein nicht, wenn die t-PA-Menge konstant gehalten wurde. Sowohl das immunoradiometrisch nachweisbare als auch das funktionell aktive t-PA nach Applikation von exogenem t-PA waren über einen 4fachen Bereich proportional zu der t-PA-Konzentration, wenn Menge und Konzentration des Hydroxylaminhydrochlorids in der Injektionslösung konstant gehalten wurden (Figur 3). Wie Figur 4 zeigt, stiegen die Blutspiegel schnell an und erreichten 4-5 Min. nach Injektion das Maximum. Nennswerte t-PA-Konzentrationen waren in jedem Falle bereits eine Min. nach intramuskulärer Injektion vorhanden.

Die Steigerung des t-PA-Gipfels im Plasma nach beschleunigter Absorption mit Hydroxylaminhydrochlorid wurde nicht lediglich durch den erniedrigten pH-Wert in der Injektionsflüssigkeit herbeigeführt. Bei 2 Tieren wurde jeweils der pH-Wert der Injektionsflüssigkeit ohne Hydroxylamin auf 5,9 titriert. Diet-PA-Plasmakonzentration betrug 5 Min. nach Injektion nur 6 ng/ml. Anschließend trat keine signifikante Steigerung auf. Der mit Hydroxylaminhydrochlorid beobachtete Zuwachs war nicht lediglich auf systemische Effekte des Hydroxylaminhydrochlorid zurückzuführen. Bei 2 Tieren, denen jeweils Hydroxylamin in den rechten und t-PA in Puffer in den linken Hüftmuskel injiziert wurden, überschritten die Gipfelkonzentrationen im Blut die Konzentrationen nicht, die in Tabelle 1 für die Injektion von t-PA in Puffer allein angegeben sind.

Obgleich die bei Kaninchen verwendeten Mengen des Absorptionsbeschleunigers je kg Körpergewicht erheblich größer waren als diejenigen, die bei Hunden verwendet wurden oder die letzten Endes für mögliche klinische Untersuchungen vorgesehen waren, wurden die außerordentlich großen Mengen verwendet, um zu untersuchen, ob hohe Konzentrationen in der Injektionsflüssigkeit den Skelettmuskel schädigen würden. Bei Kaninchen unterschied sich der Plasma-CK-Gehalt 30 Min. nach dem chirurgischen Eingriff, der Injektion von t-PA mit Hydroxylaminhydrochlorid und elektrischer Stimulierung nicht wesentlich von den Werten nach Injektion von Puffer allein unter den gleichen Bedingungen (690 +/- 82 in Vergleich zu 696 +/-63IU/I). Bei Hunden, denen 175 mg Hydroxylaminhydrochlorid mit oder ohne t-PA appliziert worden war, stieg der Plasma-CK-Gehalt bei Abschluß der Untersuchungen um weniger als 18% über die Basislinie. Bei makroskopischer Untersuchung waren keine Hämatome zu erkennen. Die lichtmikroskopische Untersuchung von Abschnitten aus dem Injektionsort, die 2 Stunden nach Injektion entnommen waren; ließ nur geringe interstitieJle Blutungen und Entzündung erkennen.

Effekte der beschleunigten Absorption von intramuskulär verabreichtem t-PA auf die Koronarthrombolyse bei Hunden.

Nachdem sich gezeigt hatte, daß die beschleunigte Absorption von t-PA bei Kaninchen mit Hydroxylaminhydrochiorid in der Injektionsflüssigkeiterreichtwerden konnte, wurden Pilotuntersuchungen bei Hunden durchgeführt, um zu untersuchen, ob das erfindungsgemäß hergestellte Mittel Koronarthrombolyse verursachen konnte. Der artielle Blutdruck nach intramuskulärer Injektion von Hydroxylaminhydrochiorid mit (n = 3) oder ohne (n = 3) t-PA sank nur mäßig (von durchschnittlich 166/120 mm Hg auf 144/104) und erreichte 2 Min. nach Injektion ein Minimum. Der Herzschlag steigerte sich vorübergehend um durchschnittlich 32% und erreichte 2 Min. nach Injektion ein Max. Ventrikelarrythmien traten mit Hydroxylaminhydrochiorid allein nicht auf. Intramuskulär verabreichtes t-PA (3mg/kg) gefolgt von elektrischer Stimlierung löste innerhalb 15 Minuten Koronarthrombolyse aus, die durch Reperfusions-Arrythmien angekündigt wurde. Übereinstimmende Ergebnisse wurden bei jedem der drei untersuchten Tiere erhalten. Die Plasma-t-PA-Werte folgten dem gleichen Zeitverlauf, lagen jedoch niedriger als diejenigen, die bei Kaninchen beobachtet worden waren. Die Unterschiede können auf Species-Verschiedenheiten bei der Absorption oder Clearance von Human-rt-Pa oder das größere Verhältnis von Injektionsvolumenzu Muskelmasse bei Kaninchen zurückzuführen sein. Ferner trat wie in Figur 5 gezeigt ein Sekundär-Peak des immunoradiometrisch nachweisbaren t-PA auf, der bei jedem Hund etwa 40Min. nach dem ersten Peak begann und möglicherweise mit später Freisetzung aus dem Muskeldepot aufgrund von Veränderungen der Durchblutung oder langsamem lymphatischem Transport von t-PA in den Kreislauf zusammenhängt.

Es wurde also gefunden, daß therapeutische Blutkonzentrationen von funktionell aktivem t-PA erreicht werden können und daß Koronarthrombolyse durch beschleunigte Absorption von intramuskulär injiziertem Material herbeigeführt werden kann. Die Plasmaaktivität erreichte innerhalb von 5 Min. nach Injektion einen Gipfel und fiel anschließend in Übereinstimmung mit der kurzen Halbwertszeit von t-PA im Kreislauf schnell ab. Die erhaltenen Blutkonzentrationen reichten aus, um bei Hunden innerhalb von 5 Min. Koronarthrombolyse zu induzieren, trotz der weiteren Anwesenheit einer thrombogenen Verbleibspirale in der Koronararterie. Die Absorption von t-PA wurde durch Einschließen von Hydroxylamin in die Injektionsflüssigkeit und durch Anregung der Skelettmuskeldurchblutung durch elektrische Stimulierung gesteigert. Größere Verletzungen des Skelettmuskels traten nicht auf.

Da aus den Ergebnissen von'in vitro-Untersuchungen zu schließen ist, daß niedrige Konzentrationen von t-PA im Plasma geeignet sein können, um die Gerinnsellysis nascenterThrombi zu induzieren und da die biologische Halbwertszeit von fibringebundenem t-PA wesentlich länger ist als die Halbwertszeit von zirkulierendem t-PA, vgl. Brommer. f hromb. Res. 34, 109-115 (1984),Tran-Thang, Blood 63,1331-1337 (1984), Bergmann, Circulation 7011,108 (Abstract) (1984), wird davon ausgegangen, daß in vivo die Koronarthrombolyse kurz nach Einsetzen der Thrombose mit geringeren Mengen von t-PA, Hydroxylaminhydrochiorid oder beiden erreichtwerden kann, als in den oben beschriebenen Versuchen verwendet wurden. Die Reduktion des Injektionsvolumens würde die erforderliche Dosis von Hydroxylamin oder anderen Absorptionsbeschleunigern senken und die potentielle Verletzung des Muskels am Injektionsort miniijiieren.

Bisher sind t-PA und andere Aktivatoren des fibrinolytischen Systems nur durch direkte Injektion in den Blutstrom appliziert worden. Die vorliegende Erfindung schafft ein alternatives Mittel zur Applikation von t-PA, das so eingestellt werden kann, daß es schnell durch medizinisches Hilfspersonal oder durch telefonisch angewiesene Risikopatienten ausgeübt werden kann, die zuvor in Selbstmedikationsverfahren unterwiesen worden sind.

Hydroxylamin wurde verwendet, nachdem zahlreiche Versuche mit anderen Absorptionsbeschleunigern für andere Verbindungen mitt-ΡΑ nicht zu den gewünschten Ergebnissen führten. Seine hauptsächliche Nebenwirkung, die Induktion von Methhämoglobinämie, verhindert die Sauerstoffversorgung des Gewebes bei den verwendeten Dosismengen nicht. Wenn die Hydroxylaminkonzentration in der Injektionsflüssigkeit die kritische Determinante für die Absorption von t-PA ist, wie aus den gegenwärtig vorliegenden Ergebnissen zu schließen ist, so ist die beim Menschen erforderliche Gesamtdosis von Hydroxylamin vermutlich so niedrig, daß induzierte Methhämoglobinämie auch bei Patienten mit Herzischämie nur ein triviales Ausmaß hat, insbesondere wenn das Injektionsvolumen durch Steigerung dert-PA-Konzentration weiter reduziert werden kann. In denjenigen Fällen, bei denen die mit der Verwendung des erfindungsgemäßen Absorptionsbeschieunigers einhergehende Methhämoglobinämie als zu schwerwiegend anzusehen ist, als daß sie zu akzeptieren wäre, können zusätzliche Maßnahmen wie die gleichzeitige Verabreichung von Methylenblau oder Glutathion vorgenommen werden, um das Problem zu minimieren oder zu verhindern, vgl. Layne, J. Pharmacol., Exp. Therap. 165, 35-55 (1969).

Methylamin ist ein nicht toxisches Mittel. Es wurde als Hydrochlorid verwendet, um die Absorption von t-PA bei Kaninchen zu beschleunigen. Die Absorption wurde nach intramuskulärer Injektion von 2-3 mg von konzentriertem t-PA (50 mg/ml) gemessen. Methylaminhydrochlorid (0,63 Molar) + elektrische Stimulierung führten innerhalb von 5 Min. nach intramusku-lärer Injektion von rt-PA Blutkonzentrationen von rt-PA herbei, deren funktioneile und immunologische Aktivitäten mit denjenigen übereinstimmte, die mit Hydroxylamin (als Hydrochlorid) erhalten wurden (insbesondere 129 vs. 137mg/m!/mg rt-PA). Bei der Verwendung von Methylenhydrochlorid traten weder Methhämoglobinämie noch hämodynamische Verschiebungen auf, die Sauerstoffsättigung blieb unverändert und nur mäßige lokale Entzündungen und interstitielle Blutungen wurden nach 48Std. mikroskopisch am Injektionsort gefunden. Vasodilatoren, hypertonische Mittel, reduzierte Mengen Hydroxylhydrochlorid oder rt-PA allein führten zu sehr viel niedrigeren rt-Pa-Spiegeln im Blut (jeweils 14, 65, 46 oder4ng/ml/mg rt-PA). Mit den erfindungsgemäß erhaltenen Blutspiegeln vergleichbare t-PA-Konzentrationen induzieren bei Versuchstieren und Patienten Koronarthrombolyse ohne einen systemisch lytischen Zustand herbeizuführen, der für Blutungen prädesponiert. Der Zeitveriauf der Erhöhung des Plasma-t-PA nach beschleunigter intramuskulärer Absorption ist insbesondere wegen des scharfen Peaks besonders günstig. Bei der beabsichtigten Anwendung einer geeigneten Applikationsform, wären die Betroffenen bald nach der Selbstmedikation mit einem automatischen Injektor oder nach Behandlung durch Verwandte oder paramedizinisches Personal unter direkter medizinischer Versorgung. Da die Blutkonzentrationen schnell abnehmen, nachdem intramuskulär

verabreichtest-PA gegeben wurde, können intravenöse Infusionen zusammen mit Antikoagulahtien begonnen werden öderes können andere Maßnahmen vorgenommen werden, um den Wiederverschluß zu verhindern, während genaue diagnostische Informationen gesammelt werden.

Die Möglichkeit, daß die durch beschleunigte Absorption intramuskulär verabreichtem t-PA induzierte Myokardialreperfusion zu Reperfusionsarrythmien führt, kann leicht in einem Hertkatheterlabor oder einer Koronarbetreuungsstation unter Kontrolle gehalten werden, sie kann jedoch bei einem medizinisch unversorgten Patienten gefährlich sein. Es ist daher vorteilhaft, gleichzeitig ein antifibrillatorisches oder antiarrythmisches Mittel wie Lidocain oder einen a-adrenergischen Blocker zu verabreichen, wie dies in der Basisanmeldung beschrieben ist.

Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, daß man zur Vermeidung von Wiederverschluß oder Plättchenaggregationen vorzugsweise die folgenden Maßnahmen ergreifen sollte:

1. Hemmung der Synthese vonThromboxan A (Thromboxan A2) mit einem Thromboxansynthetasehemmer, beispielsweise einem Imidazol wie4-[2-(1H-!mdidazol-1-yl)ethoxy]-benzoesäure Hydrochlorid (Dazoxiben).

2. Einführen eines Antagonisten für den Thromboxan A (Thromboxan A2) Rezeptor wie [1a, 2/3 (5Z), 3/3(1 E), 4a]-7-[3-(3-Cyclohexyl-3-hydroxy-1-propenyl)-7-oxabicyclo-[2.2.1]hept-2-yl]-5-Heptensäure) (SQ27,427).

3. Einführen eines anderen Inhibitors der Plättchenaggregation, beispielsweise Aspirin, Indometacin, Naproxin und Sulfinpyrazon.

Das Mittel zum Verhindern von Wiederverschlüssen oder Plättenaggregationen kann gleichzeitig oder getrennt in jeglicher Reihenfolge bezüglich des t-PA und des Absorptionsbeschleunigers wie beispielsweise Hydroxyiaminhydrochlorid verabreicht werden. Das Mittel zum Verhindern von Wiederverschlüssen oder Plättenaggregationen kann in herkömmlicher Weise verabreicht werden, beispielsweise intramuskulär, intravenös oder sogar oral.

Der Rezeptorantagonist oder das sonstige Mittel zur Verhinderung von Plättchenverschlüssen kann beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden.

Wie zuvor ausgeführt, ist die Erfindung ebenfalls geeignet, die Absorption anderer Proteine mit medizinischen Eigenschaften durch intramuskuläre Verabreichung zu beschleunigen. Derartige Proteine schließen beispielsweise Rinderserumalbumin, menschliches Serumalbumin und Insulin ein. Dies wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert:

Zwei Proteine, nämlich Rinderserumalbumin (BSA) und Humanserumalbumin (HSA) wurden mit JoÖ-125 (¹²⁵I) markiert, um die Absorption in den Kreislauf durch Nachweis der Radioaktivität in den Trichloressigsäureniederschlägen des Plasmas zu charakterisieren.

BSA- und HSA-Proteine wurden nach dem Verfahren von Boiton und Hunder radioaktiv mit Jod-125 markiert, um einen Radioligangen des Thyrosinanteils zu bilden. Um die Unabhängigkeit der Ergebnisse von der Natur des verwendeten Radioliganden nachzuweisen, wurde ein zweites Verfahren verwendet, indem ein ¹²⁵l-Glycokonjugat hergestellt wurde. Es wurde ein radioaktivmarkiertes Protein erhalten, dessen radiomarkiertes Thyramin an Kohlenhydrat gebunden ist, das seinerseits kovalent an das Protein gebunden ist. Dieser Radioligandentyp ist gegenüber lysosomalen Enzymen oder sauren Bedingungen stabil. Darüber hinaus ändert er die funktionalen Eigenschaften des markierten Proteins nicht. Für die Markierung wurde zunächst Dilactitolthyramin (10n Mol in 24μ.Ι0,5Μ Kaliumphosphat, pH 7,7) mit radioaktivem Jod markiert, indem man es in ein Jodogen (Pierce Chemical Company, Rockford, III.) beschichtetes Röhrchen mit Na¹²⁵I (1 mCi in ΙΟμΙ, Amersham) überführte. Man ließ das Reaktionsgemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln stehen. Der Inhalt des Röhrchens wurde in ein anderes Röhrchen überführt, das Galactoseoxidase (4 Einheiten in 2μΙ, Sigma) enthielt und 45Min. lang bei 37°C inkubiert. Zu dem Röhrchen wurden dann Natriumcyanoborohydrid (3μΙ einer 1 M Lösung in Kaliumphosphatpuffer) und 2mg Rinder- oder Humanserumalbumin (Fraktion 5, Sigma) in 200/ti physiologischer Kochsalzlösung gegeben und anschließend weitere 45Min. lang bei 37⁰C inkubiert.

Nach der Inkubation wurden 50 μΙ einer 1 M-Ammoniumbicarbonatlösung in das Röhrchen gegeben. ¹²⁵l-Dilactitol-Thyramin-Albumin wurde von ¹²⁵l-Dilactitol-Thyramin auf einer 0,9 χ 30,0cm Chromatographiesäule mit Sephacryl S300 getrennt und anschließend gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert. Das gekoppelte Protein wurde mit Aquacid konzentriert und durch Filtration durch einen 0,45μ Membranfilter sterilisiert. Eine Teilmenge wurde für die Bestimmung des Proteingehaltes, der spezifischen Radioaktivität und Fällung mit Trichloressigsäure entnommen.

Messung der Absorption des Proteins nach intramuskulärer Injektion mit oder ohne den Absorptionsbeschleuniger:

Radioaktiv markiertes BSA und HSA in Plasma wurden durch Bestimmung der Radioaktivität von Teilmengen des Plasma in einem Näpfchenzähler gemessen, das in bestimmten Abständen nach Injektion entnommen und durch Ansäuern mit 4 Teilen 10%iger Trichloressigsäure (TCE) gefällt war. Die Beschleunigung der Absorption von BSA und HSA-Proteinen nach intramuskulärer Injektion wurde an Neuseeland-Kaninchen gezeigt. Die Proteinlösungen wurden manuell durch eine 6,35/i.m Nadel in den Skelettmuskel der Hüfte injiziert, der unter leichter Narkose der Tiere freigelegt worden war.

Beschleunigung der Absorption:

Dasradiomarkierte Albumin wurde den Kaninchen in Teilmengen von 1 ml mit 163,4 bis 289>9 Mill. Counts je Min. (cpm) assoziiert mit Mikrogramm Mengen von Protein (spezifische Radioaktivität = 1,74 bis 3,02 mCi/mg) verabreicht. Die Proteine wurden entweder in 0,9%iger NaCI-Lösung oder einer absorptionsbeschleunigenden Lösung von 0,9% NaCI angereichert mit Hydroxyiaminhydrochlorid in Konzentrationen von 43,75 bis 175mg/ml verabreicht.

Die Beschleunigung der Absorption des Proteins war auch mit radioaktiv markiertem Rinderserumalburnin nachweisbar (24 Bestimmungen). Der Radioaktivitätsgipfel in denTCE-Präzipitaten aus Plasma betrug durchschnittlich nur3204CPM/ml, wenn das Protein den Kaninchen in der Salzlösung allein intramuskulär injiziert wurde. Im Gegensatz dazu erreichte die TCA-fällbare Radioaktivität durchschnittlich 16580cpm/ml Plasma, wenn die Absorption durch Hydroxyiaminhydrochlorid beschleunigt wurde, wobei 80% der Gipfelwerte 5 Min. nach intramuskulärer Injektion erhalten wurden. In gleicherweise betrug dieTCA-fällbare Radioaktivität nach Injektion von radiomarkiertem Humanserumalbumin nur4156cpm/ml Plasma, während der ersten 30 Minuten nach intramuskulärer Injektion ohne Absorptionsbeschleuniger. Im Gegensatz dazu betrug die TCA-fällbare Radioaktivität durchschnittlich 32868cpm/ml Plasma, während der ersten 30 Min. nach intramuskulärer Injektion mit beschleunigter Absorption durch Zugeben von 43,8 mg Hydroxylaminhydrochlorid/ml Injektionsflüssigkeit (12 Bestimmungen).

Ferner waren 75% der max. Radioaktivität 5 Min. nach Injektion nachweisbar. Die weitere Zunahme der Plasma radioaktivität im Anschluß an die ersten 5 Min. war darauf zurückzuführen, daß das radioaktiv markierte Albumin kontinuierlich mit einer Rate absorbiert wurde, die schneller war als die langsame Rate der Clearance aus dem Kreislauf.

Sicherheit der Absorptionsbeschleuniger:

Die intramuskuläre Applikation von Hydroxylaminhydrochlorid erzeugte keine makroskopischen oder mikroskopischen Anzeichen für eine irreversible Muskelverletzung am Injektionsort oder eine Steigerung des Plasmakreatininkinase-Spiegels, einer Leitsubstanz für Muskelverletzungen, auf mehr als den erhöhten Wert als er bei Verwendung von Salzlösung allein als Injektionsflüssigkeit bei Kaninchen gefunden wurde. Bei Hunden, denen 175mg Hydroxylaminhydrochlorid in Salzlösung mit oder ohne Protein intramuskulär injiziert worden war, stieg die Plasmakreatinkinase weniger als 18% über die Basislinie und es waren makroskopisch keine Hämatome am Injektionsprt erkennbar. Lichtmikroskopische Untersuchungen von Abschnitten aus den Injektionsorten 2Std. nach Injektion zeigten nur mäßige interstitielle Entzündung. Die Applikation des Absorptionsbeschleunigers bei Hunden bewirkte nur einen mäßigen Abfall des systemischen arteriellen Blutdrucks (von 166/121 mm/Hg auf 144/104), wobei die max. Wirkungen 2 Min. nach Injektion beobachtet wurden und die Werte innerhalb weniger Minuten auf die Basislinie zurückkehrten. Der Herzschlag erhöhte sich vorübergehend um durchschnittlich 32%, wobei der max. Effekt 2 Min. nach Injektion beobachtet wurde und eine schnelle Rückkehr auf die Basislinie stattfand. Es ist bekannt, daß Hydroxylamin Methhämoglobinämie induziert. In den Mengen, in denen es für die Beschleunigung der Absorption von Protein verwendet wurde, gefährdete es die Sauerstoffbeladung im Blut jedoch nicht. Der Methhämoglobingipfel lag bei Hunden 2Min. nach Injektion bei 8% und die arterielle Sauerstoffspannung fiel um nicht mehr 7%.

Die Erfindung ist insbesondere geeignet für die Applikation von Proteinen mit kurzen biologischen Halbwertszeiten. So konnte die Aufrechterhaltung therapeutisch wirksamer Konzentrationen von Proteinen mit kurzen biologischen Halbwertszeiten, die durch intramuskuläre Injektion mit beschleunigter Absorption durch Verwendung von Hydroxylaminhydrochlorid verabreicht worden waren, für 30 bis 60Min. durch Induktion der Koronarthrombolyse mit beschleunigt absorbiertem intramuskulär verabreichtem t-PA gezeigt werden, das im Kreislauf eine Halbwertszeit von 5 bis 8MJm aufweist.

Claims (11)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung eines intramuskulär verabreichbaren Arzneimittels für Säugetiere und Menschen mit einem Gehalt an einem pharmazeutisch wirksamen Protein, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein mit einer die Absorption des Proteins in das Blut beschleunigenden Verbindung kombiniert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein und die die Absorption des Proteins in das Blut beschleunigende Verbindung in einem physiologisch verträglichen.Träger miteinander vermischt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein und die die Absorption des Proteins in das Blut beschleunigende Verbindung getrennt voneinander in einer einzigen therapeutischen Packung kombiniert.
4. 4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als die Absorption des Proteins in das Blut beschleunigende Verbindung Hydroxylamin, ein Niedrigalkylamin, ein Diniedrigalkylamin oder ein nicht-toxisches SgIz derselben verwendet. ,- . . .
5. 5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Hydroxylaminhydrochlorid verwendet.
6. 6. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Methylamin, Dimethylamin oder ein nicht-toxisches Salz derselben verwendet.
7. 7. Verfahren nach Punkt 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Methylaminhydrochlorid oder Dimethylaminhydrochlorid verwendet.
8. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein mit kurzer biologischer Halbwertszeit verwendet.
9. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protein Gewebe-Plasminogen-Aktivator ' (t-PA) verwendet.
10. 10. Verfahren nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Protein und der die Absorption des Proteins in das Blut beschleunigenden Verbindung ferner ein antifibrillatorisches oder ein antiarrythmisches Mittel hinzufügt.
11. 11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein und die die Absorption des Proteins in das Blut beschleunigende Verbindung in zur Aufrechterhaltung der pharmazeutischen Wirksamkeit des Proteins im Blut über einen Zeitraum von 30Min. ausreichenden Mengen miteinander kombiniert.

    Hierzu 6 Seiten Zeichnungen