DD161185A3 - METHOD FOR THE FLUOROGRAPHIC RADIOACTIVITY DETERMINATION OF MARKED MACROMOLECULES AND CELLS - Google Patents
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Abstract
Die fluorografische Radioaktivitaetsbestimmung markierter Makromolekuele und Zellen ist in der medizinischen und veterinaermedizinischen Diagnostik sowie der molekularbiologischen und biochemischen Forschung anwendbar. Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch eine Vorrichtung und ein technisch einfach durchzufuehrendes fluorografisches Verfahren die Routinediagnostik oekonomischer zu gestalten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu entwickeln, die eine quantitative Bestimmung der Radioaktivitaet von in waessrigen Suspensionen vorliegenden markierten Makromolekuelen, Viren und Zellen mittels Fluorografie zulassen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, indem eine Vorrichtung, bestehend aus Grundplatte, Membranfilter mit Stuetzschicht sowie einer Auftrageschablone mit 25 Bohrungen von einem Rahmen umgeben ist, wobei Auftrageschablone und Grundplatte mittels zweier Bolzen verbunden sind. Die gesamte Vorrichtung sitzt mit der Grundplatte auf einem evakuierbaren Behaelter auf. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Makromolekuele als kreisfoermige Flecken auf einem Filterabschnitt fixiert und als Filmschaerzung nachgewiesen werden.The fluorographic radioactivity determination of labeled macromolecules and cells is applicable in medical and veterinary medical diagnostics as well as in molecular biological and biochemical research. The object of the invention is to make routine diagnostics more economical by means of a device and a fluorographic procedure which is technically easy to carry out. The invention has for its object to develop a device and a method which allow a quantitative determination of the radioactivity of present in aqueous suspensions labeled macromolecules, viruses and cells by fluorography. According to the invention the object is achieved by a device consisting of base plate, membrane filter with support layer and a job template with 25 holes is surrounded by a frame, wherein application template and base plate are connected by two bolts. The entire device sits with the base plate on an evacuable container. The method is characterized in that the labeled macromolecules are fixed as kreisfoermige spots on a filter section and detected as Filmschaerzung.
Description
Titel der ErfindungTitle of the invention
Verfahren zur fiuorografischen Radioaktivitätsbestimmung markierter Makromoleküle und ZellenMethod for the fiuorographic radioactivity determination of labeled macromolecules and cells
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung bezieht eich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von in wäßrigen Lösungen bzw. Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern (z. B. 3H, 14C) radioaktiv markierten biologischen (Nukleinsäuren, Proteinen) und anderen Makromolekülen, Viren sowie verschiedensten Zellen und Mikroorganismen.The invention relates to a method for the quantitative determination of the activity of aqueous (or 3H, 14C) radiolabelled biological (nucleic acids, proteins) and other macromolecules, viruses, as well as various viruses present in aqueous solutions or suspensions Cells and microorganisms.
Das Verfahren ist in der medizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik sowie der molekularbiologischen und biochemischen Forschung einsetzbar.The method can be used in medical and veterinary diagnostics as well as molecular biological and biochemical research.
Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich so z.B. beim Nachweis und der quantitativen Erfassung von Viren mit assoziierten Polymerasen, von Immunkomplexen, von biologischen bzw. enzymatischen Vorgängen, bei denen Makromoleküle synthetisiert, modifiziert oder abgebaut werden.Applications arise, for example, in the detection and quantitative detection of viruses with associated polymerases, of immune complexes, of biological or enzymatic processes in which macromolecules are synthesized, modified or degraded.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Zur Bestimmung der Radioaktivität von mit schwachen ß-Strahlern markierten Makromolekülen oder Zellen werden diese als unlösliche Präzipitate durch Filtration auf Papier-, Glasfaser- oder Membranfilter fixiert und durch Waschen von nicht eingebauter und daher löslicher Radioaktivität befreit. Für die Messung der Radioaktivität der Präzipitate sind Flüssigkeitsszintillationszähler mit speziellen Küvetten erforderlich. Diese Geräte sind sehr kompliziert und teuer. Deshalb ist die Anschaffung meist nur größeren Forschungseinrichtungen und Kliniken möglich. Außerdem ist die Meßkapazität begrenzt und die Geräte benötigen eine qualifizierte Wartung. Schließlich fallen radioaktive und brennbare Lösungsmittelabfälle an.To determine the radioactivity of macromolecules or cells marked with weak .beta.-irradiators, they are fixed as insoluble precipitates by filtration on paper, glass fiber or membrane filters and freed by washing of non-incorporated and therefore soluble radioactivity. To measure the precipitate radioactivity, liquid scintillation counters with special cuvettes are required. These devices are very complicated and expensive. Therefore, the acquisition is usually possible only larger research institutions and clinics. In addition, the measuring capacity is limited and the devices require qualified maintenance. Finally, radioactive and combustible solvent waste accumulates.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist die quantitative Bestimmung der Radioaktivität von in wäßrigen Lösungen oder Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern (3H, 14C u.a.) markierten Makromolekülen, Viren und verschiedensten Zellen mit Hilfe eines generell anwendbaren und technisch einfach durchführbaren fiuorografischen Verfahrens, welches in derThe aim of the invention is the quantitative determination of the radioactivity of present in aqueous solutions or suspensions, with weak ß-emitters (3H, 14C, etc.) labeled macromolecules, viruses and various cells using a generally applicable and technically easy to carry out fiuorografischen method, which in the
Routinediagnostik einsetzbar ist. Damit wird die Auswertung vieler Tests und analytischer Methoden, die aufRoutine diagnostics can be used. Thus, the evaluation of many tests and analytical methods based on
Radioaktivitätsmessungen basieren, wesentlich vereinfacht und kostengünstiger gestaltet.Radioactivity measurements are based, much simpler and cheaper.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zu entwickeln, das eine quantitative Bestimmung der Radioaktivität von in wäßrigen Lösungen oder Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern markierten Makromolekülen, Viren und verschiedensten Zellen mittels Fluorografie zuläßt.The object of the invention is to develop a method which allows a quantitative determination of the radioactivity present in aqueous solutions or suspensions, with weak beta-emitters marked macromolecules, viruses and various cells by fluorography.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können derartige Materialien, die als Flecken auf Membranfilterfolien oder Glasfaserfilter fixiert sind, fluorografisch als Filmschwärzung nachgewiesen werden.With the methods according to the invention, such materials, which are fixed as spots on membrane filter films or glass fiber filters, can be detected fluorographically as film blackening.
Dazu werden die Proben direkt oder deren unlösliche Präzipitate mittels einer geeigneten Filtrationsvorrichtung in Form kleiner, kreisförmiger Flecken auf einem quadratischen Glasfaser- oder Membranfilter fixiert. Der Durchmesser dieser Flecken muß relativ gering sein (etwa 6mm), um eine örtlich hohe Konzentration der Radioaktivität und damit eine möglichst starke Filmschwärzung und hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Wegen des kleinen Fleckendurchmessers ist es weiterhin möglich, sehr viele Proben (25 Oder mehr) auf einem Filterabschnitt gleichzeitig auszuwerten. Nach dem Fixieren der Proben wird der Filter mit einer geeigneten Szintillatorsubstanz imprägniert.For this purpose, the samples are fixed directly or their insoluble precipitates by means of a suitable filtration device in the form of small, circular spots on a square glass fiber or membrane filter. The diameter of these spots must be relatively small (about 6 mm) in order to achieve a locally high concentration of the radioactivity and thus the strongest possible film blackening and high sensitivity. Because of the small spot diameter, it is still possible to simultaneously evaluate a large number of samples (25 or more) on a filter section. After fixing the samples, the filter is impregnated with a suitable scintillator substance.
Der fluorografische Nachweis der Radioaktivität erfolgt in modifizierter Form zu der in der Literatur beschriebenen Auswertung von Acrylamid-Elektrophoresegelen und dünnschichtchromatografischen Platten.The fluorographic detection of the radioactivity is carried out in modified form to the literature described in the review of acrylamide Elektrophoresegelen and thin-layer chromatographic plates.
Durch visuellen Vergleich mit einer Standardreihe (Schwärzungsskala) ist eine halbquantitative Auswertung derBy visual comparison with a standard series (blackening scale) is a semiquantitative evaluation of the
Filmschwärzung möglich, die für die meisten Zwecke der Routinediagnostik ausreicht. Eine quantitative Bestimmung kann mit einem Densitometer durchgeführt werden. Das fluorografische Verfahren ist sehr empfindlich, relativ einfach und erfordert im Gegensatz zur Flüssigkeitsszintillationszählung weder kostspielige Geräte noch speziell ausgebildetes Personal und Serviceleistungen.Film blackening possible, which is sufficient for most purposes of routine diagnostics. A quantitative determination can be carried out with a densitometer. The fluorographic process is very sensitive, relatively simple and, unlike liquid scintillation counting, does not require expensive equipment or specially trained personnel and services.
Ausführungsbeispielembodiment
Das Verfahren wird nachfolgend am Beispiel der Bestimmung von Viren mit assoziierten Polymerasen (z.B. bovines Leukämievirus (BLV), Hepatitis B-Virus [HBV]) erläutert. Zur radioaktiven Markierung werden die Viren mit einer der üblichen Methoden angereichert (z.B. Ultrazentrifugation oder Polyethylen-Glykolfällung), die Polymerasereaktion unter Zusatz eines 3H- oder ,4C-markierten Nukleosidtriphosphates in 100μΙ Testansätzen durchgeführt und die Reaktionsprodukte mit ΙΟΟμΙ eiskalter 10%iger Trichloressigsäure ausgefällt.The method is explained below using the example of the determination of viruses with associated polymerases (e.g., bovine leukemia virus (BLV), hepatitis B virus [HBV]). For radioactive labeling, the viruses are enriched by one of the customary methods (for example ultracentrifugation or polyethylene glycol precipitation), the polymerase reaction is carried out with addition of a 3H- or 4C-labeled nucleoside triphosphate in 100 μl test mixtures and the reaction products are precipitated with ΙΟΟμΙ of ice-cold 10% trichloroacetic acid.
Erfindungsgemäß werden dann 25 Testansätze zu je 200 μΙ mittels einer geeigneten Filtrationsvorrichtung auf einem 60 x 60 mm Cellulosenitrat-Membranfilter abgesaugt.According to the invention, 25 test mixtures of 200 μΙ each are then aspirated by means of a suitable filtration device on a 60 × 60 mm cellulose nitrate membrane filter.
Der Filter wird zur Entfernung löslicher radioaktiver Produkte etwa 10mal mit kalter 5%iger Trichloressigsäure gewaschen, aus der Apparatur entnommen und kann nach Trocknen bei etwa 60°C fluorografisch ausgewertet werden. Der Membranfilter wird dazu mit der Lösung einer Szintillatorsubstanz (z.B. 2,5 Diphenyloxazol, PPO; 10g in 20ml Toluol) getränkt, getrocknet und zur besseren Handhabung auf Karton befestigt. 60mm breite Röntgenfilmstreifen (HS 11; ORWO Wolfen) werden in Röntgenfilmkassetten mit den so behandelten Filtern, je nach der aufgetragenen Aktivität, zwischen 6 Stunden und 5 Tagen bei -78°C (Trockeneis) exponiert.The filter is washed to remove soluble radioactive products about 10 times with cold 5% trichloroacetic acid, removed from the apparatus and can be evaluated by drying at about 60 ° C fluorographically. The membrane filter is soaked with the solution of a scintillator substance (e.g., 2.5% diphenyloxazole, PPO, 10g in 20ml toluene), dried and mounted on cardboard for ease of handling. 60 mm wide X-ray film strips (HS 11, ORWO Wolfen) are exposed in X-ray film cassettes with the filters thus treated, depending on the applied activity, between -6 hours and 5 days at -78 ° C. (dry ice).
Eine Exposition bei -30°C (Tiefkühlschrank) ist auch möglich, erfordert aber längere Expositionszeiten.Exposure to -30 ° C (freezer) is also possible, but requires longer exposure times.
Der Film wird mit Röntgenentwickfer (TR 30 + TS 30; ORWO Wolfen) unter üblichen Bedingungen entwickelt. Bei einer Exposition von 120Std. bei -78°C liegt die Nachweisgrenze bei etwa 1,7 Bq (100dpm) 3H bzw. 0,17 Bq (10dpm) ,4C. Zur Anfertigung der Standardreihe (Schwärzungsskala) werden 3H-DNA-Verdünnungen in logarithmischen Stufen im Bereich von 1,7 bis 3400 Bq (100 bis 10*dpm) verwendet.The film is developed with X-ray developer (TR 30 + TS 30; ORWO Wolfen) under usual conditions. At an exposure of 120h. at -78 ° C, the detection limit is about 1.7 Bq (100 dpm) 3H or 0.17 Bq (10 dpm), 4C. Standard series (blackening scale) are prepared using 3H DNA dilutions in logarithmic increments ranging from 1.7 to 3400 Bq (100 to 10 * dpm).
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1981
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