DD159507A3 - Stabilisator fuer ein naehrmedium - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Stabilisator für ein Nährmedium für die Sterilkultur in hochviskoser Form zur Anzucht, Vermehrung und Erhaltung von Kulturpflanzen und Mikroorganismen. Sie bezweckt, durch Einsatz eines modifizierten Naturstoffes von gleichbleibender bzw. durch die gezielte Steuerung der Herstellungsweise gleichzuhaltender Qualität eine Stabilisator zu schaffen, der es gestattet, stets unter gleichen Bedingungen zu arbeiten, der universell einsetzbar und im Wasser dispergierbar ist sowie rückstandsfrei von den kultivierten Organismen getrennt werden kann. Dies wird durch eine Kombination von Agar-Agar und mikrokristalliner Cellulose erreicht.

Description

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Stabilisator für ein Nährmedimn

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft einen Stabilisator für ein Nährmedium für die Sterilkultur in hochviskoser Form zur Anzucht, Vermehrung und Erhaltung von Kulturpflanzen und Mikroorganismen.

Charakteristik der bekannten Lösungen

Die Sterilkultur ist eine Technik zur schnellen und genetisch identischen Vermehrung von Kulturpflanzen, bei der in bekannter Weise unter sterilen Bedingungen aus regenerationsfähigen Pflanzenteilen (z.B. Sproßspitzen) Jungpflanzen herangezogen werden«

TJährmedien für diese Sterilkultur enthalten Salze der Makronährelemente, Salze bestimmter Mikronährelemente, verschiedene Mono- bzw. Disaccharide, Vitamine und eventuell, natürliche oder synthetisch erzeugte Pflanzenhormone. Diese Komponenten werden in wäßriger Lösung geboten.

Zusätzlich enthalten die Nährmedien Stoffe, die das Medium verfestigen (sogenannte Stabilisatoren). Durch Einstellen einer bestimmten Mindestviskosität wird erreicht, daß aufgesetzte kleine Pflanzenteile nicht in den-Nährboden einsinken, wo sie sonst von der Atmosphäre und damit von notwendigen Gasaustausch abgeschnitten wären, was zum Absterben der Explantate führen kann.

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Gleichzeitig muß das Medium eine Konsistenz besitzen, die es den gebildeten Wurzeln ermöglicht, leicht das Substrat zu durchdringen und so der wachsenden Pflanze die im Medium verteilten Nährstoffe zuzuführen. Die Wurzeln müssen sich im Kulturmedium ausreichend gut verankern können, damit die Pflanze auch in späteren Wachstumsstadien eine ausreichende Standfestigkeit erhält, denn auch in diesem Entwicklungsabschnitt könnte das Versinken in das Nährmedium Ursache dafür sein, daß Pflanzen absterben. Schließlich muß sich das. Substrat nach Beendigung der in-vitro-Kultur leicht, vollständig und mit geringem Aufwand von den Wurzeln entfernen lassen. Als Stabilisator wird gewöhnlich Agar-Agar verwendet, der die oben angeführten sich teilweise widersprechenden Bedingungen weitgehend erfüllt.

Zur Herstellung der Nährmedien geht man so vor, daß o,g« Komponenten der Nährlösung einzeln oder in Gruppen in entionisiertem Wasser gelöst, in bestimmtem Verhältnis gemischt und mit entionisiertem Wasser auf ein vorgegebenes Volumen aufgefüllt werden. Diese Lösung wird bis zur vollständigen Auflösung des Agars erhitzt und dann flüssig in die Kulturgefäße dosiert. Die Nährmedien werden nach der Abfüllung in die Kulturgefäße in bekannter Weise sterilisiert und dienen als Substrat, auf dem unter sterilen Bedingungen in üblicher Weise aus regenerationsfähigen Pflanzenteilen Jungpflanzen angezogen bzw. Kulturen von Mikroorganismen vermehrt werden.

Agar-Agar besitzt jedoch teilweise unerwünschte Eigenschaften. Aufgrund seines chemischen Aufbaus auf Polysaccharidbasis kann er gewissen Abbauerscheinungen durch ausgewählte Stämme von-Mikroorganismen unterliegen,- Außerdem ist' das Produkt für'· den bei Vermehrung von acidophilen Mikroorganismen und Explantaten vorliegenden pH-Bereich nicht stabil, so daß Veränderungen im viskosimetrischen Verhalten auftreten können. Das Wasserrückhaltevermögen ist von begrenzter Dauer, so daß es zu Austrocknungserscheinungen kommen kann.

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Das Entnehmen der bewurzelten Pflanzen vom Agar-Nährboden wird durch die ' Gelkonsistenz des Substrats häufig erschwert,, Um zu vermeiden, daß die Wurzeln bei diesem Vorgang abbrechen, muß zunächst das Agar-Medium durch vorsichtiges Erwärmen wieder verflüssigt werden« Dieses Ver~ fahren ist zeitaufwendig and muß mit außerordentlicher Sorgfalt durchgeführt werden, da die Pflanzen sonst thermisch geschädigt werden könnten.

Erschwerend kommt außerdem hinzu, daß er als Naturprodukt von Organismen kurzlebiger Natur jahreszeitlichen und'

Λ, klimatischen Schwankungen besonders stark unterworfen ist.,

so daß die Qualität und das Angebot erheblichen Beeinfiussun-" gen unterliegen kann.

Aus DE-AS 2 551 155 ist die Verwendung eines wasseradsobierenden Tons als Stabilisator für ein Nährmedium bekannt, welches die Nachteile des Agar-Agar ausschaltet. DB-OS 2 β34 392 gibt als Stabilisator lösliche Zellulosederivate wie z«B, Karboxymethylzellulose an. Diesen Stoffen haftet jedoch der Nachteil an, daß sie aufgrund ihres Ionengehaltes nicht universell einsetzbar sind. Darüber hinaus bereitet es Schwierigkeiten, das Nährmedium nach Beendigung der Kultur restlos von den kultivierten Organismen zu trennen. Des weiteren ist es nachteilig, daß diese Stoffe im

' ) V/asser nur schwer zu lösen sind.

Die resultierenden Materialien erfüllen die nachstehenden Forderungen für den Einsatz als Substrate: sie enthalten anorganische Ionen nicht oder nur in Spuren; sie enthalten nur indifferente organische Bestandteile; . .- sie enthalten keine Bestandteile, die die osmotischen Werte- ; ^: '" der Lösungen verändern;

sie sind inert gegenüber Salzen und pH-V/ert-resistent; sie sind in herkömmlicher Weise sterilisierbar (Hitzesterilisation).

Infolge der Tatsache, daß die Stabilität der Dispersion in viskosimetrischer Hinsicht auf anderen Paktoren, beruht, als

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bei Gelen aus Agar-Agar und kein Zustand einer optimalen Quellung vorliegt, ist es möglich, die Kulturpflanzen besser von den anhaftenden Teilen des Substrats zu befreien, da bei Zusatz von Wasser ohne Hachquellung ein rapider Abfall der Viskosität auftritt, der zu einer einfachen Ablösung der Dispersion von den Kulturpflanzenteilen, Sprossen und Wurzeln führt.

Ziel der Erfindung ν

Das Zielder Erfindung besteht darin, durch Einsatz eines modifizierten Haturstoffes von gleichbleibender bzw. durch die gezielte Steuerung der Herstellungsweise gleichzuhaltender Qualität einen Stabilisator für ein Nährmedium für die Anzucht von Kulturpflanzen und Mikroorganismen zu schaffen, der es gestattet, stets unter gleichen Bedingungen die Testungen und Vermehrungen vorzunehmen, der universell einsetzbar ist und rückstandsfrei von den kultivierten Organismen getrennt werden kann sowie in Wasser dispergierbar ist, Mhrmedien o_og. Zusammensetzung eignen sich insbesondere zur Anzucht, Vermehrung und Erhaltung folgender Gruppen von Kulturpflanzen und Mikroorganismen durch Sterilkultur:

Blatt- und Stielgemüse (z.B. Brassica oleracea, var. bot-

rytis, capitata, gemmifera u.a.)

Hülsenfrüchte (ζ_βΒ_β Phaseolus vulgaris, Glycine

soja)

Pruchtgemüse .(z.B. Lycopersicon esculentum,

Capsicum annuum) Wurzelgemüse (z.B. Daucus carota, Apium

, '_ ·."· · · . ·' graveolens) ' ' -.··· Zwiebelgemüse (z_oB„ Allium c.epa)

Arzneipflanzen (z,B_e Digitalis purpurea,

Datura innoxia) Faserpflanzen (z.B. Linum usitatissimurn,

Cannabis sativa', Gossypiiyn

herbaceum, G₁, hirsutum)

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Futterpflanzen

Genußmittelpflanzen

Gewürzpflanzen Getreide

Hackfrüchte Beerenobst

Kernobst Steinobst Südfrüchte Ölfrüchte Zierpflanzen Mikroorganismen (z.B. Medicago sativa, Brassica oleracea var, viridis, Trifolium pratense) (z.B. Coffea arabica, Camellia

sinensis, Humulus lupulus) (z.B. Petrosllinum hortense) (z.B. Triticum aestivum, Seeale cereale, Triticale, Avena sativa, Hordeum vulgäre) (z.B. Solanum tuberosum, Beta

vulgaris, Zea mays) (z.B. Ribes nigrum, Ribes uva crispa, Rubus idaeus, Fragaria

ananassa) (z.B. Malus domestica, Pyrus domestica) (z.B. Prunus doraestica, Prunus

avium, Prunus cerasifera) (z.B. Citrus aurantium, Citrus

limon) (z.B. Brassica napus var. napus

Elaeis guinensis) (z.B.. Chrysanthemen spec. Dianthus

Caryophyllus, Petunia hybrida) z.B. Enterobacteriaceen wie Escherichia coli, Aerobacter äerogenes,- Bacillaceen wie Bacillus cerus, Bacterien wie Sarcina lutea, Actinomycetaceen wie Actinomyc'-es bövis, Mycophyta wie die öomycetes Phytophthora infestans und Peronospora spec*, wie die Ascomycetes Penicillum notatum, Saccharomyces cerevisae und Aspcrgillus funiigatus.

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p; des Wesens dor Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Stoffkombination als Stabilisator eines Nährmediums zu finden. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, indem mikrokristalline Cellulose mit Agar-Agar bzw« einem anderen, geeigneten Hydrationsmittel kombiniert und als Stabilisator eingesetzt wird. Die zum Einsatz vorgesehene mikrokristalline Cellulose wird durch heterogene saure Hydrolyse eines cellulosischen Ausgangsmaterials mit einem x-Cellulosegehalt von mehr als 90 % gewonnen und anschließend einer kolloiden Naßvermahlung unter Zusatz von Wirk- und Nährstoffen unterzogen,

Ausführungsbeispiele

Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachstehend anhand von einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden:

Es wird unter Verwendung von entionisiertem Wasser eine Nährlösung, bestehend aus . "

Ammoniumnitrat . 1,650 g

Kaliumnitrat 1,900 "

Magnesiumsulfatheptahydrat 0,370 "

Kaliumdihydrogenphosphat . 0,170 "

Borsäure 0,0062 "

Magnesiumsulfatmonohydrat ' ' 0,0169 "

Zinksulfatheptahydrat . 0,0086 "

Kaliumiodid · 0,00083 "

Natriummolybdatdihydrat . ' 0,00025 "

Kupfersulfatpentahydrat . 0,000025 "

Kobaltchloridhexahydrat ' 0,000025 " '

Eisen-II-sulfatheptahydrat 0,0273 "

Ethylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalzO, 0373 ' "

Kalziumchlorddihydrat 0,440 "

myo-Inosit . 0,100 "

Glycin 0,002 "

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O	,0005	g
O	,0005	It
O	,0001	Il
30		Il
1		1

Nicotinsäure

Pyridoxinhydrochlorid Thiaminhydrochlorid Saccharose

Wassor

(T. Murashige, F. Skoog, Physiol. Plant. 1£ 473-97 (1962) hergestellt, die als Grundlage für die Erzeugung des mikrokristallinen Cellulosegels dient. In diese Lösung wird unter Rühren mikrokristalline Cellulose, die aus Zellstoff mit einem oC-Zellulosegehalt von 93 % durch heterogene saure Hydrolyse bis zum LODP erhalten wurde, eingetragen und homogenisiert.

Durch kolloide HaßVermahlung wird ein ' thixotropes Gel erzeugt, das je nach.gewünschter Viskosität eine Peststoffkonzentration von 2 bis 12 % an mikrokristalliner Cellulose aufweist.

Noch in niedrigviskosem Zustand wird der Dispersion Agar-Agar zugesetzt, so daß dessen Konzentration 0,6 bis 0,05 %, bezogen auf die Gesamtnährmedienmenge, beträgt. Nach dem Erreichen der erforderlichen Viskosität wird die Dispersion getrocknet, *vorzugsweise sprühgetrocknet. Das daraus resultierende Pulver wird portioniert bzw. komprimiert und anschließend in herkömmlicher V/eise mikrobiologisch sterilisiert, so daß bei Einsatz von definierten Mengen in den einzelnen Kulturkolben stets gleiche Bedingungen büi Zusatz einer definierten sterilen Wassermenge beibehalten werden können« Die in den Kulturgefäßen befindlichen Lösungen werden in bekannter Weise erwärmt, um die .Ausbildung.der hochviskosen Kombination von Agar-Agar und mikrokristalliner Cellulose zu .gewährleisten. ·

Anschließend erfolgt das .Aufbringen der zu vermehrenden oder anzuziehenden Kulturpflanzen auf das Substrat.

Claims (2)

221538 WP C12N/221 598 Passung vom 3· 6β 1982

1« Stabilisator für ein Nährmedium für die Sterilkultur in hoehviskoser Form zur Anzucht, Vermehrung und Erhaltung von Kulturpflanzen und Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem Gemisch von 40 bis 120 Masseteilen mikrokristallinen Cellulosepulvers und 1 bis 12 Masseteilen Agar-Agar besteht«

2· Stabilisator nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrokristalline Cellulosepulver durch heterogene saure Hydrolyse eines cellulosischen Ausgangsraaterials mit einem c£~Cellulosegehalt von mehr als 90 % gewonnen und einer anschließenden kolloiden Haßvermahlung unter Zusatz von Y/irk- und Nährstoffen unterzogen wurde*