CZ372197A3

CZ372197A3 - Kunjugáty, způsob jejich přípravy a farmaceutické prostředky, které je obsahují

Info

Publication number: CZ372197A3
Application number: CZ973721A
Authority: CZ
Inventors: Prasad Koteswara Kapa; Gleb Kardash; Andrew Kucerovy; Philip Lake; Paul Gerard Mattner; Russell C. Petter; Mahavir Prashad; Sushill Sharma
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 1998-03-18
Also published as: TR199701426T1; AR004488A1; ZA964210B; NO975329D0; WO1996037233A1; US5691304A; CA2219778A1; HUP9801750A3; CZ288830B6; KR19990021926A; IL118407A; EP0830147A1; CO4700478A1; FI974004L; PL323186A1; JPH11505216A; RU2164149C2; FI974004A7; NO975329L; PE5398A1

Description

Konjugáty, způsob jejich přípravy a farmaceutické prostředky které je.obsahuj i.

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy ve vodě rozpustných konjugátů (nebo jejich solí) polymyxinu B (PMB) nebo jeho soli a dextranu, přičemž se polymyxin B nebo jeho soli nechají reagovat s dextranem ve vodném prostředí při pH od asi 9,3 do asi 10, přednostně od asi pH 9,5 do asi pH 9,7, při teplotě od asi 30° do asi 35°C, přednostně okolo 32°C. Výhodná varianta způsobu zahrnuje reakci síranu polymyxinu B s oxidovaným dextranem při teplotě asi 32°C, při které dojde k vytvoření kovalentní vazby mezi polymyxinem B a dextranem aminovou vazbou. Zlepšené konjugáty nebo jejich soli připravené způsobem podle vynálezu je možno snadno a reprodukovatelně připravit. Tyto konjugáty se vyznačují významně zlepšenými farmakologickými vlastnostmi, jako větší účinností a vetší proti-endotoxinovou aktivitou ve srovnání s. nekonjugovaným polymyxinem B.

Vynález se rovněž týká ve vodě rozpustných konjugátů nebo jejich solí, obsahujících polymyxin B nebo jeho sůl a dextran, kteréžto konjugáty nebo jejich soli mají protiendotoxinovou aktivitu větší než nekonjugovaný polymyxin B.

Dosavadní stav techniky

V lékařství je všeobecně uznávaná potřeba účinné terapie syndromu multiorgánového zánětlivého selhání (SIRS) a septického šoku. Vysoký počet pacientů, přesahující 100 000 kritických případů syndromu multiorgánového zánětlivého selhání a septického šoku ve vyvinutých zemích vyžaduje _ · ” — · · X- * · · ·»·. * · : * ··· ·

......... :

okamžitou terapii a téměř 1 milion pacientů, ohrožených vysokým rizikem sepse by mohlo mít z profylaxe užitek.

Na základě velkého počtu studií na lidech i na zvířatech je endotoxin považován za hlavní iniciátor/primární mediátor pathogenese syndromu multiorgánového zánětlivého selhání a dává vědecké zdůvodnění proti-endotoxinovému přístupu k sepsi. Endotoxiny nebo lipopolysacharidy jsou strukturní molekuly pocházející z buněčných stěn gram-negativních bakterií. Vneseny do krevního řečiště mohou být překážkou regulace tělesné teploty a způsobovat horečku. Jejich toxické účinky vedou k srdečním, plicním nebo ledvinovým selháním. Nemoci způsobené endotoxiny jsou hlavními příčinami úmrtí pacientů, umístěných na jednotkách intensivní péče.

PMB je jediné antibiotikum, které je schopno neutralizovat endotoxin tak, že se naváže na lipidovou část A endotoxinové. molekuly. PMB z Bacillus polymyxa (B.aerosporus) je vysoce nabitý amphiphilický cyklický peptidolipid. Je rovněž použitelný proti plísňovým infekcím, zvláště u pacientů se sníženou imunitou. Pro některé své vlastnosti však není PMB. ideálním antibiotikem. Za prvé je to krátký poločas v organismu, který vyžaduje, má-li být antibiotikum účinné, opakované podávání. Za druhé při průchodu ledvinami může způsobit jejich rozsáhlé poškození. Za třetí, vysoké dávky mají neurotoxické vlastnosti způsobující zástavu dechu.

Již dříve konjugovali výzkumníci PMB k immobilizovaným nebo fixovaným molekulám, viz na př. Issekutz, J. Immunol. Methods 61, (1983) 275-281, popisují immobilisace konjugací PMB na Sepharosu. Tyto konjugáty, ačkoliv jsou použitelné při purifikačních postupech, se nehodí k terapeutickému užití in vivo.

····

Způsob vedoucí k dosažení farmakologické aktivity, prodlouženi působení nebo sníženi orgánové toxicity zahrnuje konjugaci léčiv s vysokomolekulárními molekulami jako jsou dextran, polyethylenglykol nebo polyvinylpyrrolidin. Pokusy v tomto směru s konjugaci s polymery se však potkaly s omezeným úspěchem.. Na přiklad, konjugovaná forma prokainamidu (antiarytmické léčivo) byla méně aktivní a vykazovala kratší poločas působení než nativní prokainamid (Schacht a spol., Ann N.Y.,Acad.Sci. 416,(1985) 199-211). Podobně analog prostaglandinu B245 navázaný na nosič byl méně aktivní (o několik řádů) než nativní molekula (Bamford a spol., Bioch.Biophys.Acta 886, (1986) 109^-118) . Snížení biologické účinnosti bylo rovněž popsáno u konjugovaných forem kallikreinu, aprotininu, bradykininu (Odya a spolBiochem. Pharmacol.27, (1978)173-179), protinádorové léčivo daunorubicin (Hurwitz a spol., J.Appl.Biochem.2,(1980)25-35}, a mitomycin C (Takakura a spol., Cancer Res.44,(1984)25052510). Konjugované enzymy mají také sníženou biologickou aktivitu způsobenou sférickou zábranou a sníženou dostupností, substrátu (Blomhoff a spol., Biochem.Biophys.Acta 757,(1983)202-208; Marshall a spol.,

J.Biol.Chem.251,(4)(1976)1081-1087, R.L.Foster, Experimentia 31, (7)(1975)772-773, Wileman a spolJ.Pharm. Pharmacol. 35, (1983)762-765). V několika příkladech však dochází po konjugaci ke zlepšení oběhového poločasu (Wileman, supra; Kaneo, Chem.Pharm.Bull.37 (1)(1989)218-220).

Bylo by žádoucí vyvinout formu PMB, která by zůstala déle v krevním řečišti a/nebo neměla v terapeutických dávkách neuro- a nefrotoxické účinky. USP 5 177 059 a jeho ekvivalenty v jiných zemích, jako EP 428 486 popisují konjugáty polymyxinu B s polysacharidy jako s dextranem nebo hydroxyetyl škrobem, bílkovinami jako je albumin, a polymery, jako je polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol a ••0 . - ’· « .

.* ···· · 4· I · ·

-· ^: ». .. ’ polyvinylalkohol. Tento vynález popisuje specificky způsob chemické konjugace polymyxinu B s dextranem probíhající za teploty místnosti (t.j.asi 25°C nebo méně) a pH 8,5-9,0. Ve vynálezu popsané konjugáty jsou méně toxické než nekonjugovaný polymyxin a mají proti-endotoxinovou aktivitu, která není jasně definována, ale zdá se být menší nebo rovna vlastnostem nekonjugovaného polymyxinu B.

Způsob přípravy podle předloženém vynálezu zlepšuje způsoby popsané ve shora uvedených patentech a zajištuje přípravu konjugátu nebo jejich solí polymyxinu B nebo jeho solí, mající překvapivě zlepšené charakteristiky ve srovnání se známými PMB-dextranovými konjugáty, zvláště větší protiendotoxinovou aktivitu než ne konju_govan_ý_p.ol_ymyxin-B·,—lepší-———-----účinnost, lepší reprodukovatelnost a lepší farmakologické vlastnosti. Zvláště překvapující je, že nové PMB-dextranové konjugáty nebo jejich soli, podle tohoto vynálezu mají srovnatelně a reprodukovatelně větší proti-endotoxinovou aktivitu než nekonjugovaný PMB. Důvody pro tyto neočekávané nové charakteristiky nejsou na molekulární úrovni jasně zřejmé, je však pravděpodobné, že za reakčních podmínek, které jsou v předkládaném·vynálezu použity, změna pH mění distribuci protonů basických postranních řetězců. Při vyšším pH jedna nebo více aminoskupin se nejspíše stane lépe přístupnou navázání reduktivní aminací. Poněvadž každá z aminových skupin má charakteristickou hodnotu pKa, vyšší pH uvolňuje vždy stejný amin. Jestliže tento amin je obzvláště vhodný pro navázání (z pohledu účinku konjugátu) vznikne lepší forma konjugátu, protože výběrový způsob navázání se podílí na celkové struktuře. Struktura propůjčuje konjugátům srovnatelně dobře reprodukovatelnou hladinu aktivity, která je vyšší než hladina aktivity nativního PMB, t.zn. 125% nebo více aktivity než nativní PMB.

ve zlepšené přípravě ve vodě

Γ · _ · * • ⁰ · ; .· ·· * · · ··*· * · · • ·♦·· ♦ ··· · ·

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu spočívá rozpustných konjugátů nebo jejich soli polymyxinu B a dextranu, použitelných pro léčení plísňových a bakteriálních infekcí a zabraňujících vzniku onemocnění způsobených bakteriálními endotoxiny. Zejména se vynález týká přípravy ve vodě rozpustných konjugátů polymyxinu B a dextranu, nebo jejich solí, reakci polymyxinu B nebo jeho solí ,s dextranem ve vodném prostředí při pH od asi 9,3 do asi 10 a teplotě od asi 30° do asi 35°C. PMB je peptidové antibiotikum a osvědčený farmaceutický prostředek s mírnou antibiotickou aktivitou. Je klinicky používán místně nebo parenterálně více než 40 let. Vznik bakteriální resistence k PMB je velmi řídký. PMB váže endotoxin silou asi 10’⁶ M a je schopen zrušit, biologické působení endotoxinů všech klinicky důležitých gram-negativních bakterií velkého počtu modelů in vitro a in vivo. In vitro je používán jako standard k neutralizaci endotoxinů. Navíc, in vivo, chrání PMB proti pathologii bakteriálních sepsí na mnoha modelech při acidose, hypotensi a bakteriálních sepsích a zabraňuje úmrtím vlivem gramnegativní sepse u psů, králíků, krys a myší. Účinně také . brání vzniku sepsí u lidí, jako jsou popálení pacienti.

PMB užitý pro přípravu konjugátů v předkládaném vynálezu je komerčně dostupný. PMB může být připraven fermentací Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula. PMB se skládá ze směsi několika příbuzných dekapeptidů. PMB nebo jeho· farmaceuticky· přijatelné soli jsou ve vynálezu použity (jako síran polymyxinu B a podobné).

K přípravě látek uvedených v tomto vynálezu může být použit kterýkoliv farmaceuticky vhodný dextran. K dosažení kovalentní vazby peptidů je výhodné dextran chemicky modifikovat na př. oxidovat oxidačním činidlem na př.

• · « * ·· · · jodistanem sodným. Průměrná molekulová hmotnost dextranu je výhodná od asi 25 000 do asi 500 000, přednostněji od asi 50 000 do asi 200 000, ještě přednostněji od asi 63 000 do asi 76 000. Molekulová hmotnost může být stanovena na př. gelovou permeačni vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Nejvhodnější dextran je připravován fermentací Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-512). Obsahuje glukozové jednotky, které spojeny a(1-6)-vazbami v dlouhé lineární řetězce s. přibližně 5% větvením. 85% větvených řetězců obsahuje 1 až 2 glukozové jednotky, zbývajících 15% průměrně 33 jednotek.

Obecný způsob přípravy konjugátu PMB a dextranu ve vodném prostředí je popsán v USP 5 177 059 a je použit v předloženém vynálezu.—Přednos t ně_je_v_předlož eným v-y-ná-lez-u-pou-ž-i-t—---částečně oxidovaný dextran, připravený působením oxidačního činidla, jako je jodistan sodný (NaJOJ . Při tomto postupu vznikají oxidativním štěpením vicinálních diolů glukozových monomerů aldehydy. Reakcí částečně oxidovaných dextranů s PMB, nebo jeho soli, vznikají Schiffovy baze. Příprava konjugátů v tomto vynálezu vyžaduje pečlivou kontrolu pH po dobu reakce PMB a dextranu, zvláště během vzniku Schiffovy báze, od asi 9,3 do asi 10, přednostně od asi 9,5 do asi 10, ještě přednostněji od asi 9,5 do asi 9,7. Hodnotu pH je nejlépe udržovat ' borátovým pufrem, především obsahuje-li tetraboritan sodný. Teplota vodného prostředí po dobu reakce PMB a dextranu musí být udržována od asi 30° do asi 35°C, lépe asi 32°C. Následně vnesený borohydrid sodný (NaBH₄) redukuje Schiffovy baze a zbývající aldehydy a vytváří stabilní kovalentní vazby, přednostně mezi jednou nebo více aminovými skupinami, mezi PMB a dextraném. Konjugáty jsou přednostně Čištěny ultrafiltraci na př. použitím membrán zadržujících látky s molekulovou hmbtností větší než 10 000, kdy se odstraní zbývající PMB, anorganické meziprodukty (na • · · • ••t př. boráty) a eventuelně nízkomolekulární degradační produkty. Před čistěním je lépe nastavit pH vodného media na hodnotu asi 5 až 7.

Přednostní způsob přípravy v tomto vynálezu se vyznačuje tím, že zahrnuje;

a) přípravu částečně oxidovaného dextranu reakcí dextranu jodistanem sodným;

b) reakci polymyxínu B nebo jeho solí s připraveným částečně oxidovaným dextranem ve vodném prostředí při pH od asi 9,3 do asi 10 a teplotě od asi 30° do asi 35°C;

c) přidání borohydridu sodného do výsledného vodného prostředí; a

d) čištění vzniklého _konj_ug_átu polymyxin B^dextxan_.______·__. . ,____. ..

Vynález se týká ve vodě rozpustných konjugátů nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí polymyxínu B nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí a dextranu, konjugáty mající proti-endotoxinovou aktivitu větší než je proti-endotoxinová aktivita polymyxínu B, pro použití při prevenci a léčeni syndromu multiorgánového zánětlivého selhání nebo septického· Šoku. Zahrnuje také takové konjugáty nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole, připravené shora uvedeným způsobem a konjugáty a jejich farmaceuticky přijatelné sole získané během prováděni uvedeného postupu, farmaceutické 'léčivé přípravky, obsahující ve vodě rozpustné konjugáty (nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole) polymyxínu B nebo i jeho farmaceuticky přijatelnou solí a dextran jak shora i

uvedeno; společně s nejméně jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo přísadou a použití těchto konjugátů nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí pro přípravu léčiv použitelných k prevenci nebo léčení syndromu multiorgánového zánětlivého selhání a septického šoku.

Při způsobu přípravy podle tohoto vynálezu, stejně jako v konjugátech podle tohoto vynalezu připravených, je molekulový ··· * • · ♦ ♦ · • ♦ · □ I ^ww • ·*·· · 8 ; · ***** * * .....* poměr PMB nebo jeho soli k dextranu od asi 1:15 do asi 200:1, lépe od asi 1:2 do asi 1:5, nejlépe asi 1,5:5.

Sůl polymyxinu B je přednostně farmaceuticky přijatelná sůl PMB. Konjugát se považuje za ve vodě rozpustný, jestliže jeho rozpustnost je asi 25mg/ml nebo větší při 20°C; lépe 50mg/ml; nejlépe 65mg/ml nebo větší při 20°C.

Konjugáty PMB-dextran a jejich soli připravené podle vynálezu mohou být použity stejným způsobem jako PMB samotný, jmenovitě mohou být použity bud’ samostatně na př.jako antibiotikum při bakteriálních nebo plísňových infekcích nebo v kombinaci s jinými bakteriálními a /nebo protizánětlivými prostředky. Mohou být podávány v jakékoli formě, která je vhodná pro_p_odáváni nativního,PMB na př_._intramu.s.kulárně_______ intravenozně, intratekálně, subkonjuktiválně nebo místně. Složení pro intramuskulární injekční formu obsahuje typicky účinné množství PMB-dextranového konjugátu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli ve sterilní vodě, fyziologickém roztoku nebo přibližně 1% prokainu.HCl. Složení pro intravenozní injekční formu obsahuje typicky účinné množství konjugátu ve sterilní vodě. Složení pro intravenozní použití, obsahuje typicky účinné množství konjugátu v 5% dextroze nebo vodě. Složeni pro intratekální použití obsahuje typicky účinné množství konjugátu ve fyziologickém roztoku. Pro použití v očním lékařství je účinné množství konjugátu smícháno s vodou nebo fyziologickým roztokem a podle výběru s glycerinem nebo síranem měďnatým na oční kapky, nebo může být přidáno do masti nebo suspense. Krémy pro lokální použití, zvláště na spálená místa, obsahují typicky účinné množství konjugátu PMB-dextran nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli přidané do základu inaktivních ingrediencí jako parafinový olej, propylenglykol, polyoxypropylen, a emulsifikujicí vosk.

Čištěné konjugáty PMB-dextranu nebo jeho farmaceuticky použitelných solí podle tohoto vynálezu jsou v zásadě ··· * • · • ···· · qí · · • · . · · ···· * ··· ··.

nejedovaté. Množství konjugátu podle tohoto vynálezu, které má být použito lze stanovit podle množství PMB, které by bylo použito pro uvažovaného pacienta, s ohledem na stav pacienta, jeho věk, hmotnost a aktivitu příslušného konjugátu. Vzhledem ke zvýšené účinnosti konjugátů, menší toxicitě a prodloužené době působení je možné snížení dávky na polovinu nebo méně v porovnání s nativním PMB.

Molekulární hmotnosti konjugátů podle vynálezu mohou být stanoveny na př. vysokotlakou gelovou permeační chromatografií (SEC-HPLC, TSK-GEL G4 000 Pwxl, eluce 40mM fosfátovým pufrem PH 4,4 a detekovány laserovým rozptylem při malých úhlech) a srovnáním s referenčním vzorkem dextranu majícím průměrnou molekulovou hmotnost 79 800. Konjugáty podle tohoto vynálezu mají mít přednostně průměrnou molekulovou hmotnost od asi 55 000 do asi 80 000, přednostněji od asi 80 000 nejlépe od asi 63 000 do asi 76 000.

Zlepšené konjugáty podle tohoto- vynálezu jsou lépe reprodukovatelné, než konjugáty připravované dříve a mají větší proti-endotoxinovou. aktivitu než nekonjugovaný polymyxin B. Konjugáty podle tohoto vynálezu mají zlepšenou proti-endotoxinovou aktivitu, zejména poměr IC₅o nekonjugováného polymyxinu B k IC₅₀' konjugátů je větší než 1,0; přednostně větší než asi.1,25 nebo 1, 3;. přednostněji větší než asi 1,4. Použití IC₅₀ zde znamená koncentraci polymyxinu B, měřenou stanovením metodou s použitím karbocyaninovým barvivém, které ruší 50% posun absorbance karbocyaninovcého barviva při 450 nm za přítomnosti 0,05mg endotoxinu z E.coli. Aktivita (v %) je definována:

IC₅₀ nekonjugovaného polymyxinu B x 100

ICso konjugátu.:polymyxin B/dextrah • ·«

.· ··;· · 1(5 ···· ί

Stanovení karbocyaninovým barvivém je biochemické stanovení používané in vitro ke stanovování protiendotoxinových vlastností polymyxinu B a konjugátů připravených podle tohoto vynálezu. Toto stanovení je modifikaci dříve publikovaných sdělení (Ogawa a Kanoh, Microbiol.Immunol.28, (1973) 1313-1323; Zey a Jackson,

Applied.Microbiol.2_6, (1973) 129-133) a bylo optimalizováno pro použití mikrotitračních destiček. Při tomto stanoveni konjugát nebo nekonjugovaný PMB (positivní kontrola) konkuruje karbocyaninovému barvivu (malá kladně nabitá molekula, která mění spektrofotometrickou absorbanci při vazbě na endotoxin) ve vazbě s endotoxinem.

Příprava roztoků pro stanovení pomoci karbocyaninpyého. _._____ barviva;

1) Připraví se roztoky 0,15 M octanu sodného a 0,15 M kyselina octové. Smísením obou se získá 0,03 M octanový pufr (4.0,2 ml 0,15 M octanu sodného a 159,8 ml 0,15 M kyseliny octové).

2) 8,0 mg karbocyaninového barviva se rozpustí ve 12,5 ml ethylalkoholu. Tento roztok se zředí 37,5 ml octanového pufru. Výsledný roztok je 25% etanolický roztok s obsahem barviva 16C^g/ml, který musí být uchováván v ledové lázni ve tmě a smíchán nejméně 30 minut.

3) sériové ředění PMB a každého konjugátu se připravovuje ve 40mM fosfátovém pufru (pH=7,4). Každé ředění je 6x větší než konečná stanovovaná koncentrace.

4) po sonikaci, E.coli 0111:B₄ je endotoxin zředěn na

0.5mg/ml fyziologickým roztokem, z dříve připraveného, zamraženého zásobního roztoku o koncentraci l.Omg /ml fyziologického roztoku.

Stanovení na destičkách se provádí následujícím způsobem tak, že do prohlubni se nanáší vzorek nebo pufr jako první;

é

a) blank: 100 μΐ fyziologického roztoku a 50 μΐ 40 mM fosfátového pufru(pH=7,4), 3x paralelně;

b) positivní kontrola: 100 μΐ endotoxinu a 50 μΐ 40nM fosfátového pufru (pH=7,4, 3x paralelně;

c) PMB vzorky: 100 μΐ endotoxinu a 50 μΐ vzorků PMB, 3x paralelně;

d) negativní kontroly: 100 μΐ fyziologického roztoku a 50 μΐ vzorků konjugátů, 3x paralelně;

e) stanovení: 100 μΐ endotoxinu a 50 μΐ vzorků konjugátů,

3x paralelně.

Destičkami je několik minut otáčeno. 150 μΐ barvivá sé přidá do každé prohlubně, destičky jsou zabalí do folie a ponechají na ledu ve tmě 60 minut. Obsah prohlubní se promíchá multikanálovou pipetou a ihned se stanovení absorbce při 450 nm na zařízeni vyhodnocujícím mikrotitrační destičky·. Výpočet IC₅₀ se provede Reed-Muenchovou metodou.

Vynález je ilustrován následujícími příklady bez omezení'.. Všechny teploty jsou uvedeny ve stupních Celsia.

Příklady provedení vynálezu.

Přiklad 1

A) Oxidace dextranu litrová, 4-hrdlá baňka s kulatým dnem se naplní 2,3 litry vody pro injekční použití a 150 g dextranu. Směs se míchá do rozpuštění při 21°-24° přibližně 140 otáčkami/min. Přidá se roztok 3,9 g jodistanu sodného rozpuštěného v 60 ml vody pro injekční použití (mírně exotermní, přibližně 1°) . Nálevka, kterou se přidávalo se spláchne 30 ml vody pro injekční použití. Výsledná směs se ponechá 1 hodinu při 21°

24°. Pomoci vakua se roztok přefiltruje přes 0,22 μπι acetylcelulosovou filtrační membránu Corning, zahřeje na 30°-32°a udržuje při této teplotě.

B) Příprava síranu polymyxinu B/borátový pufr

Tento postup se začíná 45 minut před dokončením oxidace dextranu, filtrace a zahřátí viz A)nahoře. 12 litrová 4hrdlá baňka s kulatým dnem se naplní 3,00 1 borátového pufru pH 9,7, teplota pufru se upraví na 32°. Dále se přidá 45 g síranu polymyxinu B a vzniklá suspense se míchá při 32° 45 minut. Změří se pH směsi (na začátku 9,4) a upraví se na 9,7 při 32° přídavkem 30 ml 5 N NaOH.

—--P-ří-p-rava~-boráhOvého~pu±rur“^do^—vypňú'enú~'5^_AL'iXrové~4^hrdTé baňky s kulatým dnem se vnese 114,3 g tetraboritanu sodného dekahydrátu a 2,906 litrů (2,9 kg) vody pro injekční použití. Roztok se zahřeje na 32°C a pH se upraví na 9,7 (původně 9,3) přídavkem 37 ml 5 N NaOH. Roztok se pomoci vakua sfiltruje přes sterilní acetylcelulosový membránový filtr 0,22gm Corning o průměru 90 mm a skladuje.

C) Reakce sulfátu polymyxinu B s oxidovaným dextranem

Předehřátý (30°-32°) roztok oxidovaného dextranu (podle část A) se přidá co nej rychleji do míchané směsi roztoku polymyxinu v borátovém pufru o teplotě 32° (z Části B). Po přidání se změří pH (původní- 9,5) a upraví na 9,7 přídavkem 18 ml 5 N NaOH. Směs se míchá při 32° 1 hodinu. Do heterogenní směsi se přidá roztok 3,6 g borohydridu sodného v 50 ml vody pro injekční účely. Směs se míchá 2 hodiny při 32°. Ke směsi se přidá roztok 3,6 g borohydridu sodného v 50 ml vody. Přeruší se zahřívání a reakční směs se nechá za stálého míchání ochladit na teplotu místnosti během 14 hodin. pH reakční směsi se změří (10,0) a nastaví na 5,7 přídavkem

II · ·

* »00 0 • e ·· ··· • * 0 · · 0 t 0 >»« «00000 • 0 · * 0000·· 00 0

1,27 litru 1 N HC1. Výsledná směs se míchá po okyseleni 10 minut, pomocí vakua se sfiltruje sterilním 0,22μπι acetylcelulosovým membránovým filtrem Corning; získá se 6,8 litru roztoku konjugátu polymyxin B - dextran, který se použije pro čistění.

D)Čistění ultrafiltraci

Roztok konjugátu polymyxin B-dextran (z části C) se čistí s použitím předem upravené ultrafiltrační jednotky CH2PRS firmy Amicon s membránovou patronou S1Y10, Vyčištěný produkt se vyjme z ultrafiltrační jednotky a skladuje zmrazený na - 25°.

__ Podle analyzy má získanýikpn.j.uq.á.t_,nás.l.e.duj.íc.í__..___— charakteristiky:'

ICjo= 16,8 μς/ml aktivita = 124,7'% obsah dextranu = 65,37 mg/ml celkový obsah polymyxinu B =2,47 mg/ml obsah volného polymyxinu B =0,65 % poměr PMB:dextran =37,71 mg PMB/g dextranu Ukázalo se, že aktivita produktu získaného při reakční teplotě 32° a pH 9,5 je asi 125 % aktivity nekonjugovaného PMB.

Příklad 2

Příprava uvedená v příkladu 1 je opakována a získaný konjugát polymyxin B-dextran má následující charakteristiky:

IC50 = 16,4 μρ/πιΐ aktivita = 125,8 % obsah dextranu = 65,30 mg/ml celkový obsah polymyxinu B =2,49 mg/ml ·· β «* «··« • * · «· ·♦ · · · ··· · · · · · ··*·*« · · · *·♦ ♦ • · · · · * ···· « ··· · ·· ·· * obsah volného poiymyxinu = 0,67 % poměr PMB:dextran = 38,06 mg PMB/g dextranu

Konjugát získaný při reakční teplotě 32°a pH 9,5 vykazuje

126 % aktivity nekonjugovaného PMB.

Příklad 3

Konjugáty polymyxin B/dextran byly připraveny postupem uvedeným v příkladu 1 (výjimky jsou označeny) za účelem stanovení vlivu teploty na reakci mezi PMB a dextranem při pH

9,7. Bylo stanoveno užitečné zatížení (mg PMB/g dextranu), průměrná IC₅₀ (^ig/ml), a aktivita (%) . Výsledky jsou uvedeny -v—t-abu-l-ce—1-:------—-----------—-----------------~

Tabulka 1: Vliv teploty při pH 9,7 (10 mg PMB; 0,65 g NaI0₄; 50 g dextranu)

Vzorek č.	Teplota	Užitečné zatížení mg PMB/g dextranu	Průměrné IC₅o (gg/ml )	Aktivita (%)
3a	35°	15,87	25,18	99,7
3b	35°	19, 81	26,07	91/1
3c	35°	19,58	27,67	85,0
3d	10°	49,53	143,83	23, 6
3e	10°	54,95	187,87	9,5
3f	10°	56, 03	195, 7	10, 8

Z příkladu 3 je zřejmé, že snížením reakční teploty na

10°, při pH 9,7, se získá produkt s nižší aktivitou.

Příklad 4:

·«	•	9 9	4 4 4 ·
• 4	•	• ·	4 4	• 4
•	• ·	•	•	4 4
<1	• · · · ·	•	4 4	44 4 4
	•	•	4	4 4
• · · *	•	• ·	44 4	4 4

Konjugáty polymyxin B/dextran byly připraveny postupem uvedeným v příkladu 1 (výjimky jsou označeny) za účelem stanoveni vlivu pH na reakci mezi PMB a dextranem. Bylo stanoveno užitečné zatížení (mg PMB/g dextranu), průměrná hodnota IC_S0 (gg/nil) a aktivita (%) a výsledky jsou uvedeny v tabulce 2:

Tabulka 2: Vliv pH při teplotě 32°

Příklad č.	pH reakce	Užitečné zatížení (mg PMB/g dextranu)	PrůměrICso (gg/ml)	Aktivita (%)
4a	4,0^a)	2,36	ND	ND
4b	5,0^a)	14,34	ND	ND
Λ r*	Ί Γ\	i c: o	•KTTí	—-----\T-n-’--
-------—-	τ , Ub7	U / Z u	INU	IN U
4d	7,0^b)	16,09	164,4	11, 0
4e	8,0^b)	32,03	107,7	17, 8
4f	8,0^bl	29,51	139, 4	13,8
4g	8,5^C’	69, 94	74,5	24,0
4h	9,0^c)	50,99	22,6	95, 3
4i	9,0^c)	50,16	22,5	88.6
4j .	9,3^C1	43,33	19,4	94,0
4k	9,3^C1	39, 96	19, 0	95,8
41	9,5^C)	38,22	17,5	100,5
4m	9,5^C)	39, 9	17,8	98,1
4n	9,7^c)	36, 74	15, 8	133,2
4o	9, 7^c)	34,99	14,9	148, 9
4p	10,0^C\|	31, 89	18,7	97,3

a) octanový pufr; b)fosfátový pufr; cjborátový pufr;

ND: nestanoveno (vzorky jsou příliš zředěny, nelze stanovit)

Hodnoty v tabulce 2. ukazují, že snížení reakční teploty na 32° při pH mezi 9,5 a 9,7 umožňuje připravit konjugáty «* aaa· jejichž aktivita je lepší než aktivita nenavázaného PMB (příklady 41, 4n a 4o), zatím co další zvýšení pH na 10,0 není výhodné (příklad 4p).

Přiklad 5:

Byly připraveny konjugáty Polymyxin/dextran jako v příkladě 1 (výjimky jsou uvedeny) a byla měřena jejich protiendotoxinová aktivita. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3:

Tabulka 3: Vliv množství PMB (1,3 g NaI0₄: pH 9,7; 32°)

Příklad č.	Podmínky	Užitečné zatížení mg PMB/g dextranu	Průměr IC₅o (μς/ιηΐ)	Aktivita X%)
5a	15 g PMB	36,74	15, 8	133, 2
5b	15 g PMB	34,99	14,9	148,9
5c	15 g PMB	33, 81	17,6	109,0
5d	20 g PMB	46,06	19,7	121,5
5e	20 g PMB	44, 63	19, 5	115,5

Výsledky uvedené v tabulce 3 dále potvrzuji, že optimální, reakční podmínky jsou teplota asi 32° a pH od asi 9,5 do asi

9,7.

Shrnuto, výsledky uvedené v příkladech 1 až 5 ukazují, že při použití reakční teploty od asi 30° do asi 35° přednostně 32°, a pH od asi 9,3 do asi 10, přednostně asi 9,5 do asi

9,7, je možno připravit zlepšené konjugáty podle předloženého vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Ve vodě rozpustný konjugát nebo jeho sůl, vyznačuj Ιοί se tím, že se skládá z polymyxinu B nebo jeho soli dextranu a má proti-endotoxinovou aktivitu větší než je protiendotoxinová aktivita nekonjugováného polymyxinu B, tedy poměr IC50 nekonjugovaného polymyxinu B k IC₅₀ konjugátu je větší než

1,0.
2. Konjugát nebo jeho sůl podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že molekulový poměr polymyxinu B nebo jeho soli k dextranu je od asi 1 : 15 do asi 200 : 1.

On^Konjugať^-nebo j^ěho sůl’ podrě”hároku ’ 1, vyzná č u j ící se t í m, že obsahuje dextran o průměrné molekulové hmotnosti od asi 25 000 do asi 500 000.
4. Konjugát nebo jeho sůl podle nároku 1, vyznačuj icí se t i m, že obsahuje dextran o průměrné molekulové hmotnosti od asi 63 000 do asi 76 000.
5. Konjugát nebo jeho sůl podle nároku 1, vyznačuj íci se t i m, že má průměrnou molekulovou hmotnost od asi 63 000 do asi 76 000.
6. Způsob přípravy ve vodě rozpustných konjugátů nebo jejich solí polymyxinu B nebo jeho soli a dextranu, vyznačuj i cl se t i m, že polymyxin B nebo jeho sůl se nechá reagovat s dextranem ve vodném prostředí při pH od asi 9,3 do asi 10 a při teplotě od asi 30° do asi 35°C.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že jako soli polymyxinu B se použije síran polymyxinu B.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t i m, že průměrná molekulová hmotnost dextranu je od asi 63 000 do asi

76 000.
9. Způsob podle podle nároku 6, pro přípravu ve vodě rozpustného konjugátu (nebo jeho soli) polymyxinu B nebo jeho soli a dextranu vyznačující se tím, že se a) připraví částečně oxidovaný dextran reakcí dextranu s jodistanem sodným;

b) polymyxin B nebo jeho soli se nechají reagovat s částečně oxidovaným dextranem ve vodném prostředí při pH od asi 9,3 do asi 10 a při teplotě od asi 30° do asi 35°C, načež se

c) přidá borohydrid sodný do vzniklého vodného prostředí a

d) získaný konjugát se vyčistí.
10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje ve vodě rozpustný konjugát, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, polymyxinu B nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a dextranu, přičemž tento konjugát má proti-endotoxinovou aktivitu definovanou v nároku 1, spolu s nejméně jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.