CZ370099A3

CZ370099A3 - Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chrysaminu G pro diagnostiku Alzheimerovy nemoci a in vivo zobrazení a prevenci deposit amyloidu

Info

Publication number: CZ370099A3
Application number: CZ19993700A
Authority: CZ
Inventors: William E. Klunk; Jay W. Pettegrew; Chester A. Mathis Jr.
Original assignee: University Of Pittsburgh
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2000-06-14

Abstract

Sloučeniny vázající se na amyloid obecného vzorce I, které jsou ne-azoderiváty chrysaminuG, farmaceutické prostředky obsahující takového sloučeniny a 2působy využívající tyto sloučeniny pro identifikaci mozku postiženého Alzeimerovou nemocí in vivo a pro diagnostikujiných patologických stavů, charakterizovaných amyloidosou,jakoje Downův syndrom. Takéjsou popsány farmaceutické prostředky obsahující neazoderiváty chrysaminu G a způsoby použití takových sloučenin pro prevenci degenerace buněk a toxicity indukované amyloidem při onemocněních spojených s amyloidosou. Takéjsou popsány způsoby využívající neazoderivátů chrysaminu Gpro barvení nebo detekci deposit amyloidu v bioptických nebo nekroptických vzorcích tkáně. Takéjsou popsány způsoby využívající ne-azoderivátů chrysaminu Gpro kvantifikaci deposit amyloidu v homogenátech bioptických nebo nekroptických vzorků tkáně.

Description

Oblast vynálezu

Předkládaný vynález se týká identifikace sloučenin, které jsou vhodné pro zobrazení amyloidu u žijících pacientů. Přesněji se předkládaný vynález týká způsobů pro zobrazení deposit amyloidu v mozku in vivo pro _diagnos-ii_ALzhe.i-me-r-o-v-y-.--nemoci provedenou za života pacientů. Předkládaný vynález se také týká terapeutického použití takových sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Alzheimerova nemoc (AD) je neurodegenerativní onemocnění charakterizované ztrátou paměti a jinými kognitivními deficity. McKhann et al., Neurology 34: 939 (1984). Je nejčastější příčinou demence ve Spojených Státech Amerických. AD může postihnout již jedince ve věku 40-50 let. V současnosti není - vzhledem k tomu, že přítomnost onemocnění je špatně diagnostikovatelná bez nebezpečné biopsie mozku doba nástupu onemocnění známá. Prevalence AD se zvyšuje s věkem a ve věku 85-90 let je postiženo asi 40-50% populace. Evans et al., JAMA 262: 2551 (1989); Katzman, Neurology 43:13 (1993).

Podle definice je AD definitivně diagnostikována při vyšetření mozkové tkáně, obvykle při pitvě. Khachaturian, Arch. Neurology 34: 939 (1984). Neuropatologicky je toto onemocnění charakterizováno přítomností neuritických plaků (NP) , neurofibrilárních sítí (NFT) a ztrátou neuronů, spolu s mnoha dalšími nálezy. Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985). Řezy mozkovou tkání obětí Alzheimerovy nemoci vykazují přítomnost amyloidu ve formě proteinových extracelulárních jader neuritických plaků, které jsou charakteristickým rysem AD.

(·

Amyloidová jádra neuritických plaků jsou složena z proteinu nazývaného β-amyloid (Αβ), který je uspořádán , především do struktury β-složeného listu. Moři et al.,

Journal of Biological Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al., PNAS 83: 503 (1986). Neuritické plaky jsou časným a neměným aspektem onemocnění. Mann et al., J. Neurol. Sci. 89:

169.;___Mann.,_Mech-.—A.g-e-1-ng—Dev-—3-1-:-2-1-3—(-1-90-5-)-;-~Ter-ry^—e't^—aT?l^_i

J. Neuropathol. Exp. Neurol. 46: 262 (1987).

K počáteční deposici Αβ pravděpodobně dochází dlouho před tím, než se objeví klinické příznaky. V současnosti doporučované minimální mikroskopické kriterium pro diagnosu AD je založeno na počtu neuritických plaků nalezených v mozku. Khachaturian, Arch. Neurol., výše (1985). Nanenštěstí je hodnocení počtu neuritických plaků proveditelné až po smrti.

Neuritické plaky obsahující amyloid jsou převažujícím rysem vybraných oblastí mozku při AD, stejně jako při Downově syndromu a u jedinců homozygotních pro apolipoproteinovou E4 alelu, u kterých je značná pravděpodobnost vzniku AD. Corder et al., Science 261: 921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27: 643-657 (1927); Wisniewsky et al. v Zimmerman, H.M.

(ed.): Progress in neuropathology (Grune and Stratton, N.Y. 1973), str. 1-26. Mozkový amyloid lze snadno prokázat barvením mozkových řezů thioflavinem S nebo Kongo červení. Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Barvení kongo červení je charakterizováno dichroickým charakterem, který má žluto-zelenou polarizační barvu. Dichroická vazba je důsledkem struktury β-složeného listu amyloidových proteinů. Glenner, G., N. Eng. J. Med. 302: 1283 ·· ·'·

(1980). Detailní přehled biochemie a histochemie amyloidu je uveden v Glenner, N. Eng. J. Med. 302: 1333 (1980).

V současnosti je diagnostika AD provedena většinou pomocí hodnocení klinických kriterií, biopsií mozku a post-mortem studia tkání. Snahy výzkumníků ve vývoji metod pro diagnostiku Alzheimeroviy nemoci in vivo zahrnují (1) genetické testování, (2) imunotesty a (3) zobrazovací techniky.

Důkaz, že abnormality v metabolismu Αβ jsou nezbytné a dostatečné pro vznik AD, je založen na objevu bodových mutací v Αβ prekursorovém proteinu v několika vzácných rodinách s autosomálně dominantní formou AD. Hardy, Nátuře Genetics 1: 233 (1992); Hardy et al., Science 256: 184 (1992). Tyto mutace se vyskytují poblíž N- a C-terminálních štěpících míst nutných pro tvorbu Αβ z prekursorového proteinu. St. GeorgeHyslop et al., Science 235: 885 (1987); Kang et al., Nátuře 325: 733 (1987); Potter WO 92/17152. Genetická analýza velkého počtu AD rodin nicméně prokázala, že AD je geneticky heterogenní. St. George-Hyslop et al., Nátuře 347: 194 (1990) . Vazba markérů na chromosom 21 je prokázána pouze u několika rodin s AD s časným nástupem a není prokázána u žádných rodin s AD s pozdním nástupem onemocnění. Nověji byl identifikován gen na chromosomu 14, jehož produkt předpokládané obsahuje mnoho transmembránóvých domén a napodobuje integrální membránový protein. Sherrington et al., Nátuře 375: 754-760 (1995). Tento gen může být odpovědný až za 70% autosomálně dominantní AD s časným nástupem. Předběžná data naznačují, že tato mutace na chromosomu 14 způsobuje zvýšení produkce Αβ. Scheuner et al., Soc. Neurosci. Abstr. 21: 1500 (1995). Mutace velmi podobného genu byla identifikována na chromosomu 1 ve Volga German rodinách s AD s časným nástupem. Levy-Lahad et al., Science 269: 973-977 (1995).

•	4	49 e·
4	4	• · · ·
4 9	4	• · 99 9
9 44 4	9	« ·

Skríning genotypu apolipoproteinu E byl navržen jako cíl pro diagnostiku AD. Scott, Nátuře 366: 502 (1993); Roses,

Ann. Neurol. 38: 6-14 (1995). Nicméně, tato technika má určité nedostatky, protože alela apolipoproteinu E je pouze rizikovým faktorem AD, nikoliv markérem onemocněni. Neni přítomna u mnoha pacientů s AD a je přítomna u mnoha starých jedinců bez demence.' Bird, Ann. Neurol. 38: 2-4 (1995) .

Imunologické testy byly vyvinuty pro detekci přítomnosti neurochemických markérů u pacientů s AD a pro detekci amyloidového proteinu asociovaného s AD v mozkomíšním moku. Warner, Anal. Chem. 59: 1203A (1987); WO č. 92/17152, Potter; Glenner et al., U.S. Patent č. 4666829. Bylo prokázáno, že tyto metody nedetekují AD u všech pacientů, zejména ne v časných stadiích onemocnění, a tyto metody jsou reativně invasivní a vyžadují punkci mozkomíšního moku. Také byly provedeny pokusy o vývoj monoklonálních protilátek jako sond pro zobrazení Αβ. Majocha et al., J. Nud. Med. 33: 2184 (1992); Majocha et al., WO 89/06242 a Majocha et al., U.S. Patent č. .5231000. Hlavní nevýhodou těchto protilátkových sond je obtížný přechod těchto velkých molekul hematoencefalickou barierou. Použití protilátek pro in vivo diagnostiku AD vyžaduje značné abnormality hematoencefalické bariery umožňující průchod do mozku.· Neexistují přesvědčivé důkazy o tom, že u AD existují takové abnormality hematoencefalické bariery. Kalaria, Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews 4: 226 (1992).

Αβ protilátky jsou také nevýhodné pro použití v diagnostice AD, protože se obvykle váží na deposita Αβ neobsahující Αβ struktury β-listu (nefibrilární) mimo neuritických plaků. Yamaguchi et al., Acta Neuropathol. 77: 314 (1989). Tato deposita mohou být jiným typem lézí, které nejsou nezbytně nutně zapojeny v procesu demence při AD. Tato

9

	• ·	• · 9
* 5 ·	9 9 9	99 9
4 ·	9 9	9
···· ···	• 9 9 9 ···	< ·

Ji.’ v*.

skutečnost byla podpořena objevy deposit nefibrilárního amyloidu u kognitivně normálních kontrol. & starých psů. Moran et al., Medicína Clinica 98: 19 (1992); Shimada et al., Journal of Veterinary Medical Science 54: 137 (1992);

Ishihara et al., Brain Res. 548: 196 (1991); Giaccone et al., Neurosci. Lett. 114: 178 (1990). I tehdy, pokud jsou deposita nefibrilárního amyloidu předchůdci neuritických plaků, může být klíčovou patologickou událostí při AD proces, který mění jasně benigní deposita nefibrilárního amyloidu na neuritické plaky s okolní degenerací. Proto je potřebná sonda,_kt.erá_g-e_ specifická pro deposita fibrilárního Αβ a NFT jako více specifický markér pro patofyziologii AD, než jsou protilátky, které se vážou také na deposita nefibrilárního amyloidu.

Nedávno byl radioaktivně značený Αβ peptid použit pro značení difusních, kompaktních a neuritických plaků v řezech z mozku od pacientů s AD. Nicméně, tyto peptidy mají všechny nevýhody protilátek. Konkrétně, peptidy za normálních okolností neprocházejí hematoencefalickou barierou v množstvích nezbytných pro zobrazení.

Kongo červeň může být použita pro diagnostiku amyloidu in vivo v parenchymových tkáních jiných než mozková tkáň. Nicméně, Kongo červeň není pravděpodobně vhodná pro in vivo diagnostiku deposit Αβ v mozku, protože pouze 0,03% podané dávky jodem značené Kongo červeni se dostane do mozkového parenchymu.'Tubis et al., J. Amer. Pharm. Assn. 49: 422 (1960). Radioaktivním jodem značené bisdiazobenzidinové sloučeniny příbuzné Kongo červeni, jako je Benzo Orange R a Direct Blue 4, byly navrženy jako použitelné sloučeniny pro in vitro a in vivo detekci přítomnosti a lokalizaci deposit amyloidu v orgánu pacienta. Quay et al., U.S. patenty č. 5039511 a 4933156. Nicméně, stejně jako Kongo červeň, všechny tyto sloučeniny navržené Quayem obsahují silně acidické skupiny kyseliny sulfonové, které významně omezují vstup »·-· · těchto sloučenin do mozku a tak značně ztěžují dosažení detekovatelného množství nebo množství dostatečného pro zobrazení v mozkovém parenchymu.

Nemožnost hodnocení deposit amyloidu při AD před smrtí značně omezuje studium této devastující nemoci. Způsob pro kvanifikaci deposit amyloidu před smrtí je potřebný jak jako diagnostický prostředek při diagnostice mírných nebo klinicky nejasných případů, tak jako prostředek pro sledování účinnosti terap.i-e_z.am.ěř-ené—na_pr-ev-eacd-epo-sic—Αβ^—P-ro-to—j-e— nanejvýše důležité získání bezpečné a specifické metody pro diagnostiku AD za života pomocí zobrazení amyloidu v mozkovém parenchymu in vivo. I přes různé pokusy, které byly provedeny v diagnostice AD in vivo, neexistují v současnosti sondy pro mozkový amyloid použitelné za života jedince. Žádná metoda nevyužila sondu s vysokou afinitou pro amyloid, která by měla nízkou toxicitu, která by překonávala hematoencefalickou barieru a která by se účinněji vázala na AD oblasti mozku než na oblasti normálního mozku, a tak by identifikovala AD -deposita amyloidu v mozku před smrtí pacienta. Žádná in vivo metoda pro diagnostiku AD nesplňovala tato kriteria.

Velmi nová data naznačují, že sloučeniny vážící se na amyloid mají terapeutický potenciál u AD au diabetes mellitus typu II. Jak bylo uvedeno výše, existují dvě sirové kategorie plaků v mozku pacientů s AD, difusní a neuritické (klasické) . Zdá se, že difusní plaky neindukují morfologické· reakce, jako jsou reaktivní astrocyty, dystrofické neurity, mikroglie, ztráta synapsí a plná aktivace komplementu, která je zjišťována v neuritických plácích. Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309 (1989); Masliah et al., loc. cit. 137: 1293 (1990); Lue and Rogers, Dementia 3: 308 (1992). Tyto morfologické reakce všechnynaznačuji, že v oblastech sousedících s deposity fibrilárního Αβ neuritických plaků probíhají neurotoxické procesy a degenerace buněk. Αβ• · indukovaná neurotoxicita a degenerace buněk byla popsána na mnoha typech buněk in vitro. Yankner et al., Science 250: 279 (1990); Roher et al., BBRC 174: 572 (1991); Frautschy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 88: 83362 (1991); Shearman et al., loc. cit. 91: 1470 (1994). Také bylo popsáno, že agregace Αβ peptidu je nutná pro neurotoxicitu in vitro. Yankner, Neurobiol. Aging. 13: 615 (1992). Odlišnosti ve stavu agregace Αβ v difusních a neuritických plácích mohou vysvětlit chybění neurotoxické reakce v okolí difusních __________jtLaJců____L.o.r_e.n.z.o„.and-JY-ankner-,_P-roc-.—Na-ti—Acad-__Sc-i-.—9-1-:—1-2-24-3— (1994) . Nedávno tři laboratoře uvedly výsledky, které naznačují, že Kongo červeň inhibuje Αβ-indukovanou neurotoxicitu a degeneraci buněk in vitro. Burgevin et al., NeuroReport 5: 2429 (1994); Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 12243 (1994); Pollack et al., Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Zdá se, že mechanismus zahrnuje jak inhibici tvorby fibril, tak prevenci neurotoxického působení vytvořených fibril. Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad.

Sci. 91: 12243 (1994). Zdá se, že Kongo červeň také chrání buňky pankreatických ostrůvků před toxicitou amylinu. Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 12243 (1994). Amylin je fibrilární peptid podobný Αβ, který se akumuluje v pankreasu při diabetes mellitus 2. typu.

WO 96/34853 (Klunk a spol.) popisuje konkrétní azo-, vinylové a alkinylové sloučeniny, vážící se na amyloid. Ukázalo se, že deriváty chrysaminu G podle WO 96/34853 jsou použitelné pro diagnostiku Alzheimerovy choroby v důsledku schopnosti specificky vázat deposity amyloidu.

V oboru je známo, že některá azo-barviva mohou být karcinogenní. Morgan et al., Enviromental Health

Perspectives, 102(supp.) 2: 63-78 (1994). Zdá se, že tato potenciální karcinogenita je založena na skutečnosti, že azobarviva jsou ve značné míře metabolizována na volné původní aminy bakteriemi ve střevu. Cerniglia et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 107: 1224-1229 (1982). V případě benzidinových barviv (a mnoha jiných substituovaných benzidinů) je karcinogenem právě volný amin. Tyto skutečnost mají malý vliv pro studie zobrazování amyloidu, ve kterých ♦·· jsou extremně malá množství radioaktivně značeného barviva s vysokou specifickou aktivitou injikována přímo do krevního řečiště. V tomto případě bude podané množství zanedbatelné a barvivo bude obcházet střevní bakterie.

V případě terapeutického použití mají tyto skutečnosti zásadní význam. Uvolňování známého karcinogenu z terapeutické sloučeniny je nepřijatelné. Druhý problém související s metabolismem diazo-barviv je to, že značné množství podaného léku je metabolizováno střevními bakteriemi před absorpcí.______

Tato snížená biologická dostupnost je nevýhodou i tehdy, pokud jsou uvolňované metabolity neškodné.

Proto existuje potřeba sloučenin s vazbou na amyloid, které jsou podobné Kongo červeni, ale které vstupují do mozku (Kongo červeň nevstupuje). Takové sloučeniny mohou být použity pro prevenci degenerace buněk spojené s tvorbou fibril a proto pro léčbu patologických stavů při onemocněních spojených s amyloidem, jako je AD nebo Downův syndrom, a pro léčbu toxických vlivů na ostrůvky slinivky břišní při diabetes mellitus 2. typu.

Dále existuje potřeba sloučenin s vazbou na amyloid, které jsou netoxické a biologicky dostupné a proto mohou být použity jako terapeutická činidla.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy bezpečná, specifická metoda pro diagnostiku AD za života pacienta pomocí in vivo zobrazení amyloidu v mozkovém parenchymu.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro identifikaci deposit amyloidu v mozku za života pacienta za použití sondy s vysokou afinitou pro amyloid, která má nízkou toxicitu, může procházet hematoencefalickou barierou a rozlišuje AD mozek od normálního mozku. Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob léčby AD, který brání ukládání nebo toxicitě Αβ. Jiným předmětem peředkládaného vynálezu je způsob pro barvení a detekci deposit amyloidu v biopsiích nebo tkáňových řezech zhotovených při pitvě. Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro kvantifikaci deposit amyloidu v homogenátech biopsií nebo tkáňových řezů zhotovených při pitvě.

Pro splnění těchto a jiných předmětů proto vynález v jednom aspektu obsahuj-e_sl.o.uč.enlmi-,—která—se—v-á-ž-e—na—a-m-y-1-o-i-d-,—ra-a-g-í-eívzorec I, nebo její netoxickou sůl rozpustnou ve vodě:

kde je jeden ze skupiny zahrnující OC, CR'=CR',

CR' 2-CR'₂, C=C-C=C, CR'= CR'- CR' = CR', oc- CR' = CR' nebo CR'₂- CR'₂- CR'₂- CR'₂ (kde každý R' je nezávisle H nebo nižší alkyl);

X je C(R)₂ (kde každý R'' je nezávisle H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nOR' , kde n = 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, 0-CH₂CH₂F, CH₂-CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-CH₂F, CN, (C=0) -R' , N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂ O(CO)R' , 0R^ř , SR', COOR' , R_ph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂CR' ₂-R_Ph (kde R_ph představuje nesubstituovanou nebo substituovanou fenylovou skupinu, ve které jsou substituenty vybrány z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro R'', tri-alkylcínu, tetrazolu nebo oxadiazolu vzorce:

R’ \

nebo

N' kde R' je H nebo nižší alkyl)________________ nebo X je CR'=CR', N=N, C=O, O, NR' (kde R' je H nebo nižší alkyl) , S nebo SO₂;

každý Ri a R₂ je je nezávisle H,· F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nOR', kde n = 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-CH₂F, CN, (C=O)-R', N(R^ř )₂, NO₂, (C=O)N(R')₂ O(CO)R' , . OR' , SR', COOR', trialkylcín, R_ph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂- CR'₂-R_Ph (kde R_ph představuje nesubstituovanou nebo substituovanou fenylovou skupinu, ve které jsou substituenty vybrány z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro R_x a R₂, tetrazolu nebo oxadiazolu vzorce:

(kde R' je H nebo nižší alkyl), nebo triazenu vzorce:

,N

R_o (kde R₈ a R₉ jsou nižší alkyl), nebo nebo

,N

I··· ·«· každý Q je nezávisle vybrán z jedné z následujících struktur: IA, IB, IC, ID, IE, IF a IG, kde:

IA má následující strukturu:

(IA)

kde každý z R₃, R₄, R₅, R₆ nebo R-? je nezávisle definován stejně jako R·, (uvedený výše);__

IB má následující strukturu:

nebo

ho definován stejně jako Ri (uvedený výše);

IC má následující strukturu:

(IC)

kde každý z R-_₇, Rie, Ri9< R20 nebo R₂i je nezávisle definován stejně jako R-_: (uvedený výše) ;

ID má následující strukturu:

(ID)

»· «· kde každý z R₂₂, R23 nebo R₂₄ je nezávisle definován stejně jako Ri (uvedený výše) a \ _/

představuje heterocyklický kruh jednoho z následujících šesti vzorců:

-V c=c c=c c=c

0=^ ^=°

Π \ / \_/ /^c—^c\ /^{c c}\ o=< ^o=\ /° v°

w ⁰⁼\_) ' o

IE má následující strukturu:

(IE)

kde každý z R₂₅, R₂₆ nebo R₂₇ je nezávisle definován stejně jako Ri (uvedený výše) a \ __ /

představuje heterocyklický kruh jednoho z následujících šesti vzorců:

φ φ ♦ φ · ► · φ φ φ · φ φ ♦ ·

ΙΦ ΦΦ ΦΦ

ΗΟ' \₌/

0==/ \=0 0=<^ Ο

V⁰ η

W °=( 7° trs

V/

IF má následující strukturu:

kde přesně jeden z R₂₈, R₂₉, R₃₀, R31 nebo R₃₂ je vazba definovaná pro vzorec I a každý další z R₂₈, R₂₉, R₃₀,. R31 nebo R₃₂ je nezávisle definován stejně jako Ri (uvedený výše) ;

IG má následující strukturu:

• ·	a	9	·· ··	4 4
• ·	• ·	• ·	• « «4	•	•
i	•	4	· · ·	•	•
•	• ·	•	·' · · · ·	• ·	.·
4	•	•	• 4		•
• ·· ·	·· ·			• ·

kde přesně jeden z R₃₃, R₃₄, R₃₅, R₃₆, R₃₇, R₃₈ nebo R₃₉ je vazba definovaná pro vzorec I a každý další z R₃₃, R₃₄₍ R₃₅,

R36< R37, R38 nebo R₃₉ je nezávisle definován stejně jako Ri (uvedený výše).

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je sloučenina, která se váže na amyloid, mající vzorec I, jak byl definován výše, nebo její netoxická sůl rozpustná ve vodě, ve které je alespoň jeden ze substituentů R1-R7 a R₁₀-R₃₉ vybrán ze skupiny skládající se z ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, ¹⁹F, ¹²⁵I, CH2-CH2-¹⁸F, O-CH2-CH₂-¹⁸F, CH2-CH2-¹⁸F, O-CH2-CH₂-CH₂-¹⁸F a substituentů obsahujících uhlík, jak jsou uvedeny pro vzorec I, kde alespoň jeden uhlík je ¹¹C nebo ¹³C.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je sloučenina, která se váže na amyloid, mající vzorec I, jak byl definován výše, nebo její netoxická sůl rozpustná ve vodě, která se váže na Αβ s disociační konstantou (K_D) mezi 0, 0001 a 10, 0 μΜ při měření vazby na syntetický Αβ peptid nebo vazby na mozkovou tkáň při Alzheimerově chorobě.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob syntézy sloučeniny, která se váže na amyloid, mající vzorec I, jak byl definován výše, nebo její netoxické soli rozpustné ve vodě, ve které je alespoň jeden ze substituentů. R1-R7 a R10-R39 vybrán ze skupiny skládající se z ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F nebo ¹⁹F, kde uvedený způsob obsahuje stupeň reakce sloučeniny, která se váže na amyloid, mající vzorec I, jak byl definován výše, nebo její netoxické soli rozpustné ve vodě, ve které je alespoň jeden ze substituentů R1-R7 a Ri₀-R3₉trialkylcín, s halogenačním činidlem obsahujícím ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F nebo ¹⁹F.

Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek pro in vivo zobrazení deposit

	9	9	99 99 99
				•
•	9	9	• 9 9 9	•
»	• 9	9	9 ·' · · · 9 9	•
•	9	9	9 9	0
• ·· »	9 9 9

amyloidu, který obsahuje (a) sloučeninu, která se váže na amyloid, mající vzorec I, jak byl definován výše, nebo její netoxickou sůl rozpustnou ve vodě, ve které je alespoň jeden ze substituentů Ri-R? a R10-R39 vybrán ze skupiny skládající se z ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F, ¹⁹F, a substituentů obsahujících uhlík, jak jsou uvedeny pro vzorec I, kde alespoň jeden uhlík je ^1:LC nebo ¹³C, a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.

Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro in vivo detekci deposit amyloidu u jedince, který obsahuje kroky: (a) podání detekovatelného množství farmaceutického prostředku, a (b) detekci vazby sloučeniny na deposita amyloidu u uvedeného jedince. Předmětem předkládaného vynálezu je také způsob pro in vivo detekci deposit amyloidu u jedince, kde jsou deposita amyloidu umístěna v mozku subjektu. Tento způsob podle předkládaného, vynálezu může být použit u jedinců, u kterých existuje podezření na onemocnění spojené s amyloidosou nebo syndrom vybraný ze skupiny zahrnující Alzheimerovu nemoc, Downův syndrom a u homozygotů pro alelu apolipoproteinu E4.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu jsou farmaceutické prostředky a způsoby pro prevenci degenerace buněk a toxicity spojené s tvorbou fibril u stavů spojených s amyloidosou, jako je AD a dibetes mellitus 2. typu. Takové farmaceutické prostředky obsahují alkylové, alkenylové a alkynylové deriváty Chrysaminu G a farmaceuticky přijatelný nosič.

Takové sloučeniny by měly být netoxické.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je použití sond jako barviv pro vizualizaci a detekci deposit amyloidu v bioptických nebo pitevních vzorcích.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je použití radioaktivně značených sond pro kvantifikaci deposit amyloidu v bioptických nebo pitevních vzorcích.

000 • 0

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro odlišeni oblasti mozku postižených Alzheimerovou chorobou od normálních oblastí mozku.

Další předměty, vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu. Je třeba si uvědomit, že podrobný popis a konkrétní příklady ukazující výhodná provedení předkládaného vynálezu, jsou uvedeny pouze pro ilustraci, protože odborníkům v oboru budou po prostudování podrobného popisu zřejmé různé změny a modifikace spadající do rozsahu předkládaného vynálezu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. IA ilustruje chemickou' strukturu chrysaminu G a několika analogů chrysaminu G, které byly syntetizovány a testovány, včetně 3-jod - derivátu (3-ICG), 3-jod-dimethoxyderivátu (3-ICG(Ome)₂) , dimethylesterového derivátu (CG(COOMe)₂) , fenolového derivátu, kyseliny salicylové (SA), anilinového derivátu (1/2CG), Kongo červeně, 3,3'-dijodderivátu (3,3'-I₂CG), 3,3'-dibrom-derivátu (3,3'-Br₂CG),

3,3'-dichlor-derivátu (3, 3'-Cl₂CG) , 3-brom- derivátu (3-BrCG) a derivátu kyseliny 5-fluorsalicylové ((5-FSA)CG). Čísla na obrázku ukazují Κι (v μΜ) každé sloučeniny pro inhibici vazby [¹⁴C]Chrysaminu G na syntetický peptid, Αβ(10-43).

Obr. IB ilustruje chemickou strukturu chrysaminu G a několika analogů chrysaminu G, které byly syntetizovány a testovány, včetně derivátu kyseliny 3,3'-dikarboxylové (3,3'(COOH)₂CG), derivátu chrysaminu G s kyselinou 2,2'disulfonovou (2,2'- (S0₃) ₂CG) , derivátu kyseliny 3-brom,3isopropylsalicylové (3-Br-(3-iPrSA)CG) , derivátu kyseliny 3isopropylsalicylové ((3-iPrSA)CG), 2,4-difenolového derivátu (2,4-difenol), derivátu kyseliny γ-resorcylové ((6-0HSA)CG), • · · · · ♦ · · • · · · · ·····

3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidinového derivátu (3, 3'5,5'(CH₃)₄CG), 3,3'-dimethylového derivátu (3,3'- (CH₃)₂CG), 2,2'dimethylového derivátu (2,2' -(CH₃) ₂CG),benzisoxazolového derivátu (CG benzisoxazol) a 3-ferboxy-alkt nového derivátu (3(COOH)-C3C). Čísla na obrázku ukazují Ki (v μΜ) každé sloučeniny pro inhibici vazby [¹⁴C]Chrysaminu G na syntetický peptid, Αβ (10-43).

Obr. 2A-2K ilustrují chemické struktury alkenylových derivátů chrysaminu G .a alkenyl-trialkylcínových derivátů analogů chrysaminu G, zejména heterocyklických analogů. Všimněte si, že tyto struktury představují pouze polovinu molekuly, která je symetrická podle vazby znázorněné vlnovkou nahoře vpravo s tou výjimkou, že trialkylcínová skupina může být pouze na jedné straně bifenylové skupiny. Trialkylcínové deriváty jsou stabilní meziprodukty a bezprostřední prekursory pro přípravu halogenovaných radioaktivních derivátů s vysokou specifickou aktivitou. Heterocyklické analogy představují alternativní prostředky umístění slabě acidiakých skupin ve stejné strukturální pozici jako středně acidické skupiny karboxylové kyseliny v chrysaminu G. Tyto trialkylcínové prekursorové sloučeniny jsou uvedeny ve své protonované formě, protože odborníkům v oboru bude jasné, že jejich deprotonované formy a tautomery jsou také zahrnuty v těchto výkresech.

2A) alkenylový derivát chrysaminu G.

2B) alkenyl-trialkylcínový·derivát chrysaminu G.

2C) alkenyl-trialkylcínový derivát 3-hydroxy-l,2benzisoxazolového analogu.

2D) alkenyl-trialkylcínový derivát ftalimidového nebo isoindol-1,3(2H)-dionového analogu.

2E) alkenyl-trialkylcínový derivát ftalhydrazidového nebo

2,3-benzodiazin-l,4(2H,3H)-dionového analogu.

2F) alkenyl-trialkylcínový derivát 2,3-benzoxazin-l,4(3H)dionového analogu.

2G) alkenyl-trialkylcínový derivát (2H)1,3-benzoxazin2, 4 (3H)-dionového analogu.

2H) alkenyl-trialkylcínový derivát (3H)2-benzazin-l,3(2H)dionového analogu.

21) alkenyl-trialkylcínový derivát 1,8-naftalimidového analogu.

2J) alkenyl-trialkylcínový derivát tetrazolového analogu.

2K) alkenyl-trialkylcínový derivát oxadiazolového analogu.

Obr . 3 : Křivky vytěsnění [¹⁴C]chrysaminu G z vazby na Αβ (10-43) pomocí několika strukturálních analogů chrysaminu G. Použité zkratky jsou stejné jako na obr. 1. Obr. 3A) chrysamin G (prázdné trojúhelníčky); (5-FSA)CG (plné kosočtverce); 3,3'-(COOH)₂CG (plné čtverečky); 2,2'-(SO₃) ₂CH (plná kolečka). Obr. 3B) chrysamin G (prázdné trojúhelníčky); Kongo červeň (prázdná kolečka); anilinový derivát (prázdné obrácené trojúhelníčky); fenolový derivát (prázdné čtverečky); kyselina salicylová (X). Křivky, které ukazují vyšší vazbu při vyšších koncentrací, odrážejí tvorbu micel. Bedaux, F. et al., Pharm. Weekblad 98: 189 (1963).

Obr. 4A je Scatchardův graf vazby chrysaminu G na Αβ(1043). Křivka představuje nelineární úpravu metodou nejmenších čtverců pro model se dvěma nezávislými místy vazby. Přímky představují jednotlivé složky.

Obr. 4B je Scatchardova analýza vazby [¹⁴C]CG na typické vzorky kontrolního (kosočtverce) a AD mozku (čtverečky). Přerušovaná linie má stejný sklon jako AD linie a je uvedena pro srovnání s kontrolní křivkou. Tento vzorek AD mozku má zvětšení 48 NP/x200, K_D 0,35 μΜ a B_max 790 fmol/gg proteinu. Kontrola má K_D 0,48 μΜ a B_max 614 fmol^g proteinu.

Obr. 5 je graf znázorňující linearitu vazebného testu ve vztahu ke koncentraci peptidu. V typickém testu bylo použito přibližně 0,9 pg Αβ (10-43).

Obr. 6A je graf ukazující závislost asociace chrysaminu G a Αβ (10-43) na čase.

Obr. 6B je grafické znázornění určení asociační rychlostní konstanty (ki) .

Obr. 6C je graf závislosti disociace chrysaminu G z Αβ(1043) na čase.

Obr. 7 je grafické znázornění molekulárního modelu interakcí mezi chrysaminem G a Αβ..

Obr. 8A je graf ilustrující korelaci mezi množstvím .navázaného [¹⁴C]chrysaminu G a počtem neuritických plaků (NP) ve vzorcích mozku s AD.

Obr. 8B je graf ilustrující korelaci mezi množstvím navázaného [¹⁴C]chrysaminu G a počtem neurofibrilárních sítí (NFT) ve vzorcích mozku s AD. Na obr. 8A i 8B představuje osa-x průměrný počet NP nebo NFT na pole při zvětšení 200x na řezech barvených dle Bielschowskyho' získaných buď z horní/střední frontální (n=10) nebo u horní temporální kůry mozkové (n=10). Plné symboly a tlusté čáry představují mozky bez amyloidové angiopatie, prázdné symboly a přerušované linie ukazují mozky s amyloidovou angiopatií. Osa-y představuje celkovou, absolutní vazbu [¹⁴C]chrysaminu G (fmol/pg proteinu) v homogenátech vzorků mozku sousedních ke vzorkům použitým pro barvení. Bylo použito přibližně 75 μg proteinu a 150 nm [¹⁴C]chrysaminu G.

«· ·· ·

Obr. 9A, 9B a 9C. Na obr. 9A je uvedena vazba chrysaminu G na různé oblasti mozku v AD mozku mající více než 20 Nps/x200 zesílení, které se nazývají AD mozky s vysokým obsahem plaků. Na obr. 9B je uvedena vazba chrysaminu G na různé oblasti mozku v AD) mozku mající méně než 20 Nps/x200 zesílení, které se nazývají AD mozky s nízkým obsahem plaků. Uvedená data představují poměr vazby [¹⁴C]chrysaminu G v označených oblastech mozku ku vazbě [¹⁴C]chrysaminu G v mozečku (CB) stejného mozku. Horizontální sloupce představují průměr a chybové sloupce představují standardní odchylku pro kontrolu (kolečka) a AD mozek (kosočtverce na obr. 9A a 9B). Mozkové oblasti zahrnují frontální pól (FP), hlavu caudata (CAU), horní/střední frontální (SMF) , horní temporální (ST), dolní parietální (IP) a okcipitální (OC) kůru mozkovou. Hvězdička označuje signifikantní rozdíl vzhledem ke kontrole (* p < 0,05; ** p < 0,001) . Dva vzorky mozku od pacienta s Downovým syndromem jsou ukázány na obr. 9C. Kosočtverečky na obr. 9C představují mozek od 23-letého pacienta s Downovým syndromem ještě bez příznaků AD. Trojúhelníčky na obr. 9C představují 51-letého pacienta s Downovým syndromem, u kterého došlo k rozvoji AD, jak je tómu u většiny pacientů s Downovým syndromem okolo věku 40 let.

Obr. 10 je graf ilustrující ttkáňové koncentrace chrysaminu G u myší, kterým byla podána injekce [¹⁴C]chrysaminu G do laterální ocasní vény a které byly utraceny v uvedenou dobu. Prázdné symboly a tenké čáry představují absolutní radioaktivitu v jednotkách cpm/g tkáně (levá osa). Plné symboly a tlusté čáry představují poměr radioaktivity v mozku ku radioaktivitě v ledvinách (horní z

graf) nebo krvi (střední graf). Poměry jsou uvedeny na pravé ose.

Obr. 11: Horní část: Řez z dolního temporálního laloku AD mozku barvený 1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-1·· ·· • · € ·

• 9 9 9 · • ··< ··» yl)-benzenem technikou, kterou popsal Stokes and Trickey, J. Clin. Pathol. 26: 241-242 (1973). Je vidět velké množství neuritických plaků, neurofibrilární síť a četná neuropilní vlákna. Cerebrovaskulární amyloid je také intensivně zbarven (není uvedeno). Mikrofotografie byla získána pomocí fluorescenční mikroskopie. Dolní část: Řez mozkem transgenní myši (Tg(HuAPP695.SWE)2576; Hsiao et al., Science, 274: 99102 (1996)) barvený podobně 1,4-bis(2-(3-karboxy-4hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-benzenem, na kterém jsou vidět intensivně zbarvené plaky.

Obr. 12 je sloupcový graf ukazující vliv zvyšující se koncentrace Αβ (25-35) za přítomnosti a za absence chrysaminu G na buněčnou redukční aktivitu buněk krysího feochromocytomu (PC-12), kde tato aktivita je měřena redukcí 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-difenyltetrazoliumbromidu, MTT. Produkt redukce MTT absorbuje světlo vlnové délky 560 nm a tato absorbance je uvedena na svislé ose. Vliv Αβ(25-35) samotného je také uveden ve šrafovaných sloupcích a ukazuje snížení v MTT redukci závislé na dávce. Signifikantní rozdíly od kontrol (bez. Αβ (25-35) , bez chrysaminu G) jsou uvedeny ve šrafovaných sloupcích. Protektivní vliv 20 μΜ chrysaminu G je ukázán v prázdných sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi MTT redukcí ,za přítomnosti a za absence chrysaminu G jsou uvedeny v prázdných sloupcích.

Obr. 13 je sloupcový graf ukazující protektivní vliv zvyšující se koncentrace chrysaminu G na Αβ (25-35)indukovanou buněčnou redukční aktivitu buněk krysího feochromocytomu (PC-12), kde tato aktivita je měřena redukcí 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl(-2,5-difenyltetrazoliumbromidu, MTT. Produkt redukce MTT absorbuje světlo vlnové délky 560 nm a tato absorbance je uvedena na svislé ose. Vliv chrysaminu G za absence Αβ (25-35) je uveden ve šrafovaných sloupcích.

·· *

Nebyly pozorovány signifikantní rozdíly mezi kontrolou (bez Αβ (25-35), bez chrysaminu G) a jakýmikoliv koncentracemi chrysaminu G za absence Αβ(25-35). Redukce MTT za přítomnosti 1 μΜ Αβ (25-35) a zvyšujících se koncentrací chrysaminu G je uvedena jako prázdné sloupce. Signifikantní rozdíly mezi MTT redukcí za přítomnosti a za absence Αβ(25-35) při každé koncentraci chrysaminu G jsou uvedeny ve šrafovaných sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi MTT redukcí mezi Αβ(2535) kontrolou (bez chrysaminu G) a Αβ (25-35) plus zvyšující se koncentrace chrysaminu G jsou uvedeny černě v prázdných sloupcích.

Obr. 14 je srovnání vlivů chrysaminu G a inaktivních fenolových derivátů na toxicitu indukovanou Αβ (25-35). 1 μΜ Αβ(25-35) byl přítomen ve všech pokusech s výjimkou kontroly. Chrysamin G měl protektivní účinek při koncentracích 0,1 a 1 μΜ, zatímco fenolové deriváty neměly žádný protektivní účinek a snad i zvyšovaly toxicitu Αβ.

Předkládaný vynález využívá schopnosti alkylových, alkenylových a alkínylových derivátů chrysaminu G a jejich radioaktivně značených derivátů překonávat hematoencefalickou barieru in vivo a vázat se na Αβ přítomný v plácích, na Αβ přítomný v cerebrovaskulárním amyloidu a na amyloid skládající se z proteinů přítomných v NFT. Chrysamin G je derivát Kongo červeně, od které se liší hlavně tím, že skupiny kyseliny sulfonové přítomné v Kongo červeni jsou nahrazeny v chrysaminu G skupinami kyseliny karboxylové (obr. 1). Tato strukturální změna umožňuje chrysaminu G lepší vstup do mozku než má Kongo červeň a velké makromolekuly jako jsou protilátky. Tubis et al., J. Am. Pharmaceut. Assn. 49: 422 (1960). Také je chrysamin G více specifický markér pro AD

¢.

-'H

J?.

patofyziologii než jsou protilátky, protože protilátky se váží také na nefibrilární Αβ deposita nejasného patofyziologického významu.

Alkylové, alkenylové a alkrnylové deriváty chrysaminu G podle předkládaného vynálezu mají každou z následujících charakteristik: (1) specificky se vážou na syntetický Αβ in vitro; (2) vážou se na fibrilární deposita struktury β-listu v mozkových řezech; (3) mají schopnost překonávat nepoškozenou hematoencefalickou barieru in vivo.

Způsob podle předkládaného vynálezu určuje přítomnost a umístění deposit amyloidu v orgánu nebo oblasti těla, výhodně v mozku, pacienta. Způsob podle předkládaného vynálezu obsahuje podání detekovatelného množství farmaceutického prostředku obsahujícího sloučeninu vzorce I, jak byla definována výše, která se nazývá detekovatelná sloučenina, nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl rozpustnou ve vodě, pacientovi. Detekovatelné množství znamená, že podané množství detekovatelné sloučeniny je dostatečné pro umožnění detekce vazby, sloučeniny na amyloid. Účinné zobrazovací množství znamená, že podané množství detekovatelné sloučeniny je dostatečné pro umožnění zobrazení vazby sloučeniny na amyloid.

Vynález využívá sond pro amyloid, které byly spolu s neinvasivními neuro-zobrazovacími technikami jako je magnetická resonanční spektroskopie (MRS) nebo magnetická resonance (MRI) nebo zobrazování pomocí gamma záření, jako je například positronová emisní tomografie (PET) nebo počítačová tomografie pomocí emise jednoho fotonu (SPÉCT), použity pro kvantifikaci deposit amyloidu in vivo. Termín in vivo zobrazení označuje jakoukoliv techniku, která umožňuje detekci značené sloučeniny vzorce I, jak byla definována • · ί

• · · « · · • · · ··· ··· výše, podle předkládaného vynálezu. Při gamma zobrazení je záření emitované z vyšetřovaného orgánu nebo oblasti měřeno a vyjádřeno buď jako celková vazba nebo jako poměr, ve kterém je celková vazba v jedné tkáni normalizována na (například dělena) celkovou vazbou v jiné tkáni stejného subjektu během stejného postupu in vivo zobrazení. Celková vazba in vivo je definována jako celkový signál detekovaný ve tkáni při in vivo zobrazení bez potřeby korekce pomocí druhé injekce stejného množství značené sloučeniny s velkým nadbytkem neznačené, ale jinak chemicky stejné, sloučeniny. Subjektem je savec, výhodně člověk a nejlépe člověk, u ktere) j podezření na demenci.

Při in vivo zobrazení je typ dostupného detekčního přístroje hlavním faktorem ovlivňujícím výběr značícího činidla. Například radioaktivní·izotopy a ¹⁹F jsou zejména vhodné pro in vivo zobrazení v metodách podle předkládaného vynálezu. Typ použitého přístroje určí výběr radionuklidu nebo stabilního izotopu. Například, vybraný radionuklid musí mít takový typ rozpadu, který je detekovatelný daným typem přístroje. Dále je třeba brát v úvahu poločas rozpadu radionuklidu. Poločas rozpadu by měl být dostatečně dlouhý pro detekci v době maximálního vychytávání v cílové oblasti, ale měl by být natolik krátký, aby nezpůsoboval dlouhodové škodlivé ozáření pacienta. Radioaktivně značené sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být detekovány za použití gamma kamery, která detekuje emitované gamma záření vybrané vlnové délky. Mezi techniky gamma zobrazení patří například SPÉCT a PET. Pro detekci pomocí SPÉCT nebude výhodně vybrané radioaktivní činidlo emitovat částice, ale bude emitovat velké množství fotonů v rozsahu 140-200 keV. Pro detekci pomocí PET bude radioaktivním činidlem radionuklid emitující pozitrony, jako je například ¹⁹F, které budou anihilovat za vzniku dvou 511 keV gamma paprsků, které budou detekovány PET kamerou.

• ·

V předkládaném vynálezu jsou připraveny sloučeniny/sondy, které se vážou na amyloid, které jsou použitelné pro in vivo zobrazení a kvantifikaci deposit amyloidu. Tyto sloučeniny jsou použity společně s neinvasivnimi neuro-zobrazovacími technikami jako je magnetická resonanční spektroskopie (MRS) nebo magnetická resonance (MRI), positronová emisní tomografie (PET) nebo počítačová tomografie pomocí emise jednoho fotonu (SPÉCT). V předkládaném vynálezu mohou být pro MRS/MRI alkylové, alkenylové a alkrnylové deriváty chrysaminu G značeny ¹⁹F nebo ¹³C značeny za použití obecných technik organické chemie, které jsou v oboru známé. Viz například March, J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISM AND STRUCTURE, 3. vydání, 1985, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz. Alkylové, alkenylové a alkrnylové deriváty chrysaminu G mohou být také pro PET techniky radioaktivně značeny ¹⁸F, “c, ⁷⁵Br nebo ⁷⁶Br za použití technik dobře známých v oboru, které jsou popsány ve Fowler, J. and Wolf,

A. v POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H., vyd.) 391-450 (Raven Press, NA, 1986), jejíž obsah je zde uveden jako odkaz. Alkylové, alkenylové a alkynylové deriváty chrysaminu G mohou být .pro SPÉCT techniky radioaktivně značeny ¹²³I za použití jakékoliv z technik dobře známých v oboru. Viz například Kulkami, Int. J. Rad. App.1. and Inst. (Part B) 18: 647 (1991), jehož obsah je zde uveden jako odkaz. Dále, alkylové, alkenylové a alkínylové deriváty chrysaminu G mohou být také značeny jakýmkoliv vhodnýcr; radioizotopem jodu, jako je například ¹³¹I, ¹²⁵I nebo ¹²³I za použití jod ace diazotizovaného amino-derivátu přímo diazoniumjodidem, viz Greenbaum, F. Am. J. Pharm. 108: 17: (1936), nebo konversí nestabilního diazotizovaného aminu na stabilní triazen, nebo konversí neradioaktivního halogenovaného prekursoru na stabilní trialkylcínový derivát, který může být potom přeměněn na jodovou sloučeninu pomocí několika technik, které jsou dobře známé v oboru. Viz Satyamurthy and Barrio, J. Org. Chem. 48: 4394 (1983), Goodman et al., J. Org. Chem. 49: 2322 • ·

it (1984), a Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994, 905; Chumpradit et al., J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al., J. Med, Chem. 37: 4245 (1994). Například stabilní triazenový nebo trialkylcínový derivát alkylových, alkenylových nebo alki/nylových derivátů chrysaminu G reaguje s halogenačním činidlem obsahujícím ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F nebo ¹⁹F. Proto jsou stabilní triazenové nebo trialkylcínové deriváty chrysaminu G a jeho analogů novými prekursory použitelnými pro syntézu mnoha radioaktivně značených sloučenin podle předkládaného vynálezu. Proto jsou tyto triazenové nebo trialkylcínové deriváty jedním provedením předkládaného vynálezu.

Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chrysaminu G mohou být také radioaktivně značeny známý kovovými radioaktivními značícími činidly, jako je Technecium-99m (^99mTc) . Modifikace substituentů pro vložení ligandů, které se vážou na takové ionty kovů, může být odborníkem v oboru radioaktivního značení provedena bez zbytečných pokusů. Alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chrysaminu G značené kovem mohou být potom použity pro detekci deposit amyloidu.

Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou využívat izotopy detekovatelné nukleární magnetickou resonanční spektroskopií pro účely in vivo zobrazení a spektroskopie. Mezi prvky zejména vhodné pro použití v magnetické resonanční spektroskopii patří ¹⁹F a ¹³C.

Vhodné radioizotopy pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu zahrnují beta-zářiče, gamma-zářiče, pozitronové-zářiče a rentgenové zářiče. Mezi tyto radioizotopy patří ¹³¹I, ¹²³I, ¹⁸F, ⁷¹C, ⁷⁵Br a ⁷⁶Br. Vhodné stabilní izotopy pro použití v magnetické resonanci (MRI) nebo spektroskopii (MRS) podle předkládaného vynálezu

zahrnují ¹⁹F a ¹³C. Mezi radioizotopy vhodné pro in vitro kvantifikaci amyloidu v homogenátech bioptické nebo nekroptické tkáně patří ¹²⁵I, ¹⁴C a ³H. Výhodnými radioaktivními zobrazovacími činidly jsou ¹⁸F pro in vivo zobrazení pomocí PET, ¹²³I pro zobrazení pomocí SPÉCT, ¹⁹F pro MRS/MRI a ³H nebo ¹⁴C pro studie in vitro. Nicméně, jakákoliv běžná technika pro vizualizaci diagnostických sond může být použita ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

Způsob by měl být použit pro diagnostiku AD v mírném nebo klinicky nejasném stadiu. Tato technika by také měla umožnit longitudinální studie deposit amyloidu u lidské populace s vysokým rizikem vzniku deposit amyloidu, jako jsou jedinci s Downovým syndromem, familiární AD a homozygoti pro alelu apolipoproteinu E4. Corder et al., Science 261·: 921 (1993). Způsob umožňující sledovat depostita amyloidu v čase může určit, zda se tato deposita vyskytují dlouho před demencí, nebo zda tato deposita nesouvisí s demencí. Tento způsob může být použit pro sledování účinnosti terapie zaměřené na prevenci deposit amyloidu.

Obecně se bude dávka detekovatelně značeného alkylového, alkenylového nebo alkf-nylového derivátu chrysaminu G velmi lišit podle různých okolností jako je věk, stav, pohlaví a rozsah onemocnění u pacienta, podle kontraindikací, pokud jsou nějaké, podle současné terapie a jiných proměnných, a bude upravena ošetřujícím lékařem. Dávka může být v rozsahu od 0,001 mg/kg do 1000 mg/kg, výhodně je 0,1 mg/kg až 100 mg/kg.

Podání sloučeniny může být lokální nebo systémové a může být provedeno intravenosně, intraarteriálně, intrathekálně (prostřednictvím mozkomíšního moku) a podobnými způsoby. Podání může být také intradermální nebo intrakavitární, podle vyšetřované oblasti těla. Po uplynutí dostatečně dlouhé doby pro navázání sloučeniny na amyloid, například po 30 minutách

9

9 až 48 hodinách, je vyšetřovaná oblast vyšetřena běžnou zobrazovací technikou, jako je MRS/MRI, SPÉCT, plošná scintigrafie, PET a nebo novými vyšetřovacími technikami. Přesný protokol se bude lišit podle faktorů specifických pro pacienta, jak byly uvedeny výše, a podle vyšetřované oblasti, způsobu podání a použitého typu značícího činidla; určení konkrétních postupů bude pro odborníka rutinní záležitostí. Pro zobrazování mozku je výhodně měřeno množství (celková nebo specifická vazba) navázaného radioaktivně značeného chrysaminu G nebo derivátu nebo analogu chrysaminu G a je srovnáváno (jako poměr) s množství značeného chrysaminu G nebo derivátu chrysaminu G navázaného na mozeček pacienta. Poměr se potom porovnává se stejným poměrem pro normální mozek stejného věku.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu jsou výhodně podány ve formě injekčích přípravků. Obvyklý prostředek pro tento účel obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Prostředek může například obsahovat přibližně 10 mg lidského sérového albuminu a přibližně 0,5 až 500 μg značeného alkylového, alkenylového nebo alkfnylového derivátu chrysaminu G na ml fosfátového pufru obsahujícího NaCl. Mezi další farmaceuticky přijatelné nosiče patří vodné roztoky, netoxické přísady, včetně solí, konzervačních činidel, pufrů a podobně, jak je uvedeno například v REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. vydání, Easton: Mack Publishing Co., str. 1405-1412 a 1461-1487 (1975) a THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14. vydání, Washington: American Pharmaceutical Association (1975), jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.

Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej a injikovatelné organické estery jako je ethyloleat. Mezi vodné nosiče patří voda, alkoholové/vodné roztoky, salinické roztoky, parenterálni vehíkula jako je chlorid sodný, Ringerova dextrosa atd. Mezi o·· ··· • · · · · intravenosní vehikula patří tekutiny a nutriční roztoky. Mezi konzervační činidla patří antimikrobiální činidla, antioxidační činidla, chelační činidla a inertní plyny. pH a přesná koncentrace různých složek farmaceutického prostředku jsou upraveny podle obecných znalostí. Viz Goodman and Gilman' s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vydání).

Zejména výhodnými farmaceutickými prostředky podle předkládaného vynálezu jsou ty prostředky, které jsou kromě schopnosti specifické vazby na amyloid in vivo a schopnosti překonávat hematoencefalickou barieru také netoxické při vhodných dávkách a které mají dostatečné trvání účinku..

Molekulární modelování

Molekulární modelování bylo provedeno na počítačovém grafickém systému Evans and Sutherland PS-330, za použití počítačového modelovacího programu MacroModel (verse 2.5 dostupná od C.Stříl, Columbia University) pro generování Αβ peptidových řetězců v konformaci anti-paralelních β-listů. Kirschner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 503 (1986). Amyloidové peptidy byly použity bez dalších úprav struktury. Αβ peptidy byly uspořádány tak, že jednotlivé řetězce byly od sebe 4,76 A, což je vzdálenost charakteristická pro fibrily β-listu. Kirschner, výše. Chrysamin G byl energeticky minimalizován a byl umístěn vzhledem k modelu fibril tak, aby byl maximalizován kontakt s lysinem 16 Αβ(10-43) a hydrofobním regionem fenylalaninu 19 a 20.

Charakterizace specifické vazby na Αβ syntetický peptid: afinita, kinetika a maximum vazby

Charakteristiky vazby chrysaminu G a derivátů chrysaminu G jsou nejprve analyzovány za použití syntetického peptidu • · označeného Αβ (10-43). Peptid 10-43 byl vybrán proto, že bylo prokázáno, že tento peptid je modelovým systémem obsahujícím všechny charakteristické strukturální rysy Αβ peptidů.

Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991).

Aminokyselinový fragment 10-43 Αβ byl syntetizován za použití

9-fluorenylmethylchloroformiatu (FMOC) v Peptide Synthesis «· Facility of the University of Pittsburgh. Peptid byl charakterizován hmotností spektrometrií a hlavní složka měla »* M_r 3600 g/mol (výpočet 3598) . Peptid byl dále přečištěn technikou dle Hibich et al., která se, ve stručnosti, skládá ze sekvenční'vylučovací chromatografie na Biogel P10 koloně (2 x 180 cm, 200-400 mesh, Biorad, Richmond, CA) v 70% kyselině mravenčí, po které následuje druhá eluce v Biogel P4 koloně (2 x 180 cm, 200-400 mesh) v ÍM kyselině octové. Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991). Peptid se lyofilizoval a uskladnil se při -80 °C do použití v testech vazby.

Aminokyselinová sekvence pro Αβ (10-43) je následující:

10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
Tyr	Glu	Val	His	His	Gin	Lys	Leu	Val	Phe	Phe	Ala

22	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33
Glu	Asp	Val	Gly	Ser	Asn	Lys	Gly	Ala	Ile	Ile	Gly

34	35	36	37	38	39	40	41	42	43
Leu	Met	Val	Gly	Gly	Val	Val	Ile	Ala	Thr

Testy vazby na syntetický Αβ(10-43)

Testy vazby byly provedeny ve zkumavkách z borosilikatového skla velikosti 12 x 75 mm. Různé koncentrace neradioaktivních derivátů chrysaminu G byly přidány v 10% ethanolu/vodě. Ethanol byl nezbytný pro prevenci tvorby

micel, která se vyskytuje u těchto derivátů diazo-barviv, protože micely jsou zachycovány filtrem i za absence peptidu. Do výše uvedeného roztoku se přidalo 25 μΐ 0,36 mg/ml suspenze Αβ (10-43) v H₂O a dále se přidal 10% ethanol do objemu 950 μΐ. Po inkubaci po dobu 10 minut při teplotě okolí se přidalo 50 μΐ [¹⁴C]chrysaminu G ve 40% ethanolu, což vedlo k dosažení konečné koncentrace [¹⁴C]chrysaminu G 100-125 nM, podle použitého přípravku [¹⁴C]chrysaminu G. Vazebná směs se inkubovala po dobu 30 minut při teplotě okolí. Navázaná a volná radioaktivita se separovaly vakuovou filtrací přes Whatman GF/B filtry za použití Brandel M-24R Cell Harvester (Gaithersburg, MD), po které následovaly dva 3 ml výplachy 10% ethanolem při teplotě okolí. Filtry byly uvedeny do rovnováhy přes noc ve 4 ml Cytoscint®-ES scint i lačním, činidle (ICN Biomedicals, lne., Irvine, CA) v 7,0 ml plastových scintilačních zkumavkách před odečtem. V tomto a ve všech ostatních testech vazby byly inkubace provedeny nejméně trojmo a výsledky jsou uvedeny jako průměr ± standardní odchylka.

Kinetické studie

Kinetické studie vazby [¹⁴C]chrysaminu G ba Αβ (10-43) byly provedeny ve zkumavkách z borosilikatového skla velikosti 13 x 100 mm za použití filtračního testu popsaného výše. Pro kinetiku asociace bylo 25 μΐ 0, 36 mg/ml Αβ (10-43) umístěno v 475 μΐ 10% ethanolu a do roztoku se přidalo 4,5 ml [¹⁴C]chrysaminu G v čase 0. Směs se rychle promíchala a vazebná reakce se ukončila vakuovou filtrací přes Whatman GF/B filtry za použití Brandel M-24R Cell Harvester (Gaithersburg, MD), po které následovaly dva 3 ml výplachy 10% ethanolem při teplotě okolí v čase 5, 10, 20, 30, 45, 60, 75, 135, 240 a 300 sekund; navázaná radioaktivita se určila způsobem uvedeným výše.

Pro kinetiku disociace bylo 25 μΐ 0,36 mg/ml Αβ(10-43) umístěno v 475 μΐ 10% ethanolu a do roztoku se přidalo 25 μΐ 2,5 μΜ [¹⁴C]chrysaminu G ve 4 0% ethanolu. Tato směs se rychle promíchala a inkubovala se po dobu 30 minut při teplotě okolí. Směs se ředila 4,5 ml 10 μΜ neradioaktivního chrysaminu G v 10% ethanolu v čase 0, rychle se promíchala a disociace se ukončila filtrací popsanou výše v čase 0,5, 1,5, 3, 5 a 15 minut a navázaná radioaktivita se určila způsobem uvedeným výše.

Charakterizace specifické vazby na mozek postižený Alzheimerovou chorobou

Vazba chrysaminu G na homogenáty AD mozku a normálního mozku

Mozkové nekropsie byly získány od Neuropathology Core of the Alzheimer's Disease Research Center of the University of Pittsburgh. Kontroly byly definovány jako vzorky nesplňující neuropatologická kriteria pro AD (dostatečný počet NP nebo NFT) podle standardů uvedených v publikované NIA conference report. Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097 (1985). Byly studovány vzorky od osmi kontrol (věk 58-75 let), jedenácti AD (věk 61-84 let) a dvou Downových syndromů (věk 23 a 51 let). Bylo studováno šest AD mozků s vysokým počtem plaků (> 20 NPS/x200 zvětšení) a pět AD mozků s nízkým počtem plaků (< 20 NPS/x200 zvětšení). Dvě kontroly byly klinicky dementní, ale neměly NP ani NFT a byly diagnostikovány jako demence bez zvláštní histologie. Knopman, Dementia 4: 132 (1993). Jiná kontrola měla demenci a olivopontocerebellární atrofii. Ostatní kontroly neměly klinické ani histologické známky neurologického onemocnění. Nekroptické vzorky byly ihned zmrazený na -70 °C a byly uskladněny při této teplotě do homogenizace. Počet NP a NFT byl odečítán v řezech

z pěti separovaných, ale sousedních polí (při zvětšení 200) mezi kortikálnímí vrstvami 2 a 4 v kůře v přechodu mezi horními a středními frontálními gyry a horním temporálním isokortexem všech studovaných mozků. Bylo provedeno kvalitativní hodnocení přítomnosti amyloidové angiopatie v horní/střední frontální kůře. Pro identifikaci NP a NFT byla použita Bielchowskeho metoda impregnace stříbrem a barvení p Kongo červení bylo použito pro identifikaci mozkové amyloidové angiopatie. Podrobnosti tohoto postupu byly publikovány dříve. Moosy et al., Arch. Neurol. 45: 251 (1988). Vzorky použité pro vazbu CG na horní/střední “ frontální kůru nebo horní temporální kůru byly na makroskopické řezu sousední ke vzorkům použitým pro stanovení NP nebo NFT.

Přibližně 100 mg tkáně ze spojení horní a střední frontální kůry, horní temporální kůry, frontálního pólu, hlavy caudata, dolní parietální kůry, okcipitální kůry nebo mozečku bylo homogenizováno na Polytron® tkáňovém homogenizačním přístroji (PT 10/35, Brinkman Instruments lne., Westbury, NY) po dobu 30 sekund při nastavení 6 v 10% ethanolu při koncentraci 10-20 mg mozku/ml. Z každého mozku nebyly dostupné všechny oblasti. Alikvoty 25-150 μΐ tkáně (přibližně 25-300 gg proteinu podle techniky popsané Lowry et ¢, al., J. Biol. Chem. 193: 265 (1951)) byly inkubovány ve zkumavkách z borosilikatového skla velikosti 12 x 75 mm při k teplotě okolí s 10-750 nM [¹⁴C]CG (26,8 Ci/mol) v konečném objemu 1,0 ml 10% ethanolu po dobu 30 minut při teplotě okolí. Standardní studie využívaly přibližně 150 gg proteinu a 75 nM [¹⁴C]CG pro studie cerebellárního poměru a přibližně 75 gg proteinu a 150 ňM [¹⁴C]CG pro korelační studie s NP, NFT a amyloidovou angiopatií. Ethanol byl nezbytný pro prevenci tvorby micel, která se vyskytuje u těchto derivátů diazobarviv, protože micely jsou zachycovány filtrem i za absence peptidu. Navázaná a volná radioaktivita se separovaly vakuovou filtrací přes Whatman GF/B filtry za použití Brandel M-24R Cell Harvester (Gaithersburg, MD), po které následovaly dva 3 ml výplachy 10% ethanolem při teplotě okolí. Filtry byly uvedeny do rovnováhy přes noc ve 4 ml Cytoscint®-ES scintilačním činidle (ICN Biomedicals, lne., Irvine, CA) v 7,0 ml plastových scintilačních zkumavkách před odečtem. Saturovatelná (specifická) vazba byla definována jako celková vazba minus residuální (nesaturovatelná) vazba za přítomnosti 20 μΜ neznačeného CG. Ve všech testech vazby byly inkubace provedeny nejméně trojmo a výsledky jsou uvedeny jako průměr ± standardní odchylka, pokud není uvedeno jinak. Výsledky byly uvedeny buď v absolutních číslech ve fmol [¹⁴]CG navázaného na μρ proteinu v dané oblasti mozku, nebo jako poměr fmol/gg proteinu v této oblasti mozku ku fmol/gg proteinu v mozečku stejného mozku.

Dělení mezi oktanol/vodu

Přibližně 75 μΜ roztoky chrysaminu G nebo jeho analogů byly připraveny v 5,0 ml 1-oktanolu. Přidalo se 5 ml fosfátem pufrovaného salinického roztoku (0,15 M NaCl, 5 mM fosforečnan draselný, pH 7,4) a vrstvy se smísily rychlým promícháním. Směs se potom centrifugovala při 1000 g pro usnadnění vytvoření dvou čirých fází. Vrstvy byly separovány za použití separační. nálevky a 600 μΐ každé vrstvy bylo ředěno 400 μΐ ethanolu a potom byla měřena absorbance při 389 nm pro chrysamin G nebo Am_ax pro každý analog. Koncentrace byly stanoveny po korekci pro rozdíly molární absoptivity ve dvou rozpouštědlech a dělící koeficient byl vyjádřen jako koncentrace v oktanolové vrstvě děleno koncentrace ve vodné vrstvě. Pokusy byly provedeny trojmo.

Zobrazení vazby chrysaminu G na depozita amyloidu v mozku postiženém Alzheimerovou chorobou $ »

Pro vizuální demonstraci vazby CG derivátu na tkáň byly 8 mikronové parafinové řezy AD mozku s těžkými depozity cerebrovaskulárního amyloidu barveny 1,4-bis(2-(3-karboxy-4hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-benzenem za použití modifikované techniky popsané Stokes and Trickey, J. Clin. Pathol. 26: 241-242 (1973) se substitucí 1 mM 1,4-bis(2-(3-karboxy-4hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-benzenu za Kongo červeň, ale postup byl jinak stejný. Nabarvené řezy byly vyšetřovány za použití fluorescenční mikroskopie.

Stanovení schopnosti sloučeniny překonávat hematoencefalíckou barieru

Studie na myších: Samicím Swiss-Webster myší bylo injekčně podáno do laterální ocasní vény přibližně 0,03 gCi/g [¹⁴C]chrysaminu G v 0,9% roztoku NaCl. Myším byl zlomen vaz v časech 15 minut, 35 minut, 1 hodina, 4 hodiny a 24 hodin po injekci. Rychle se odebrala krev z karotid, mozek, játra a ledviny a rychle se tyto orgány zvážily a homogenizovaly se v destilované/deionizované H₂O za použití skleněného homogenizátoru. Byla odvážena alikvóta do 18,0 ml plastové scintilační zkumavky (Beckman Poly-Q-Vial) a po přidání 10,0 ml scintilační směsi (Cytoscint®-ES (ICN)) a uvedení do rovnováhy přes noc bylo provedeno měření. Obsah [¹⁴C]chrysaminu G ve tkáni byl vyjádřen v cpm/mg tkáně.

Pokusy, ve kterých byla radioaktivita extrahována z tkáně, byly provedeny stejným způsobem s tou výjimkou, že bylo injekčně podáno 0,05 gCi/g [¹⁴C]chrysaminu G a myši byly utraceny po 60 minutách. Potom byl odebrán mozek a játra a byla provedena extrakce postupem podle Folche. Folch et al., J. Biol. Chem. 226: 447 (1957). V obou tkáních bylo více než 95% extrahované radioaktivity obsaženo v organické vrstvě. Organická vrstva byla odpařena do sucha, byla resuspendována

1· · · *

v minimálním množství 10% methanolu/90% ACN a byla injekcí vnesena do kolony z oxidu křemičitého (Prep Nova Pak HR Silica, 7,8 x 300 mm, Waters, Milford, MA) a byla eluována isokraticky stejným rozpouštědlem. Za těchto podmínek je 99% radioaktivity eluováno s rozpouštědlem, zatímco většina lipidů je zadržována déle, takže frakce eluovaná v rozpouštědle je vhodná pro injekci do C4 kolony s reversní fází, která je popsána výše. Celá frakce v rozpouštědlu se odebere, suší se a resuspenduje se v 10% ACN/90% fosforečnanu sodném (5 mM, pH 6) a injekčně se vnese spolu s autentickým neradioaktivním chrysaminem G do C4 kolony. Frakce eluované v jedné minutě se odeberou a měří se po přidání 10 ml Cytoscint®-ES.

V ještě jiném provedení se vynález týká farmaceutického prostředku a způsobu pro prevenci degenerace buněk a toxicity spojené s tvorbou.fibril, ke které dochází , u některých onemocnění spojených s amyloidosou, jako je Alzheimerova nemoc, Downův syndrom, a diabetes mellitus 2. typu, hereditární mozková hemorhagická amyloidosa (Dutch), amyloid A (reaktivní), sekundární amyloidosa, familiární středomořská horečka, familiární amyloidová nefropaťie s urtikarií a hluchotou (MudčLe-wells syndrom) , amyloid lambda L-řetězců nebo amyloid kappa L řetězců (idiopatický, spojený s myelomem nebo makroglobulinemií),Abeta 2M (chronická hemodialljfsa),

ATTR (familiární amyloidová polyneuropatie (Portugalsko, Japonsko, Švédsko), familiární amyloidová kardiomyopatie (Dánsko), izolovaný kardiální amyloid, systémová senilní amyloidosa, AIAPP nebo amylin-insulinom, atriální natríuretický faktor (isolovaný atriální amyloid), prokalcitonin (medulární karcinom štítné žlázy), gelsolin (familiární amyloidosa (Finsko)), cystatin C (hereditární mozková hemorhagie s amyloidosou (Polární oblasti)), AApo-A-I (familiární amyloidová polyneuropatie - IOWA), AApo-A-II (akcelerované stárnutí u myší), amyloid asociovaný s fibrinogenem a Asor nebo Pr P-27 (skrapie, Creutzfeld37

Jacobova nemoc, Gertsmann-Straussler-Scheinker syndrom, hovězí spongiformní encefalitida) nebo ke které dochází u jedinců, kteří jsou homozygotní pro apolipoproteinovou E4 alelu. Tento způsob obsahuje podání farmaceutického prostředku obsahujícího chrysamin G, nebo jeden z výše uvedených derivátů chrysaminu G, subjektu, u kterého je podezření, že má takové onemocnění spojené s amyloidosou, nebo že má značné riziko vzniku takového onemocnění.

Protože některé diazo-sloučeniny mohou být karcinogenní, zahrnují terapeutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu pouze netoxické, nekarcinogenní sloučeniny. Předkládaný vynález tedy řeší problémy spojené s potenciální karcinogenitou tak, že využívá pouze alkylové, alkenylové nebo alkrnylové sloučeniny, které neobsahují skupiny, které by mohly být metabolizovány na karcinogenní benzidinové sloučeniny.

Jakékoliv potenciální problémy spojené s nižší biologickou dostupností jsou také vyřešeny použitím alkylových, alkenylových a alk»nylových derivátů azo-sloučenin. Tyto sloučeniny nejsou substrátem pro redukci bakteriálními nebo savčími azo-reduktasami.

Kromě toho jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu určené pro terapeutické použití výhodnější než existující sloučeniny, protože obsahují l,4-bis(2-(3-karboxy-4hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-benzenovou vazbu, která není substrátem pro bakteriální azo-reduktasy ve střevu.

In vitro studie ukázaly, že Αβ neurotoxicita vyžaduje tvorbu fibril a že je inhibována Kongo červení. Přesněji, bylo prokázáno, že Kongo červeň vážící se na amyloidové fibrily inhibuje neurotoxicitu fibrilárního Αβ tím, že inhibuje tvorbu fibril nebo vazbu již vytvořených fibril. Lorenzo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 12243-12247 '·« * » φ» ·· ·« • · ·· ·· 9 9 9 9 9 9 • 9 β esěee • Φ · · · Φ 99· 999

9 · · · ·

9999 999 999 9999 ·9 9 99 (1994). Bylo také prokázáno, že Kongo červeň inhibuje toxicitu amylinu spojeného s diabetem, což je jiným typ amyloidových fibril, na buňky ostrůvků pankreatu. Lorenzo et al., výše. Viz též Burgevin et al., NeuroReport 5: 5459 (1994); Polladc et al., J. Neurosci. Letters 184: 113-116 (1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Tato data naznačují, že sloučeniny vážící se na amyloid, jako jsou alkylové, alkenylové a alkinylové deriváty chrysaminu G, které se podobají Kongo červeni, ale na rozdíl od ní dobře vstupují do mozku, by měly být efektivní v prevenci buněčné degenerace a toxicity spojené s tvorbou fibril u onemocnění spojených s tvorbou amyloidu.

V příkladu 8 a na obrázcích 12 a 13 je ukázáno, že chrysamin G má účinky velmi podobné účinkům popsaným pro Kongo červeň v tom, že má protektivní vilv u krysího feochromocytomu, který je závislý na dávce. Proto je tento in vitro test prostředkem pro selekci sloučenin použitelných ve farmaceutických.prostředcích pro prevenci buněčné degenerace a toxicity spojené s tvorbou fibril.

Sloučeniny jako je chrysamin G a jeho výše popsané deriváty jsou testovány podle předkládaného vynálezu na in vivo účinnost v prevenci tvorby amyloidových fibril nebo s ní spojené degenerece buněk, jak je měřena tvorbou dystrofických neuritů, ztrátou synapsí, tvorbou neurofibrilární sítě a gliosou na zvířecích modelech, jako je senilní zvířecí model pro mozkovou amyloidosu, Wisniewsky et al·., J. Neuropathology and Exp. Neurol. 32: 566 (1973), myší model familiární středomořské horečky (Neurochem., Inc., Kingston, Ontario, Canada) a transgenní myší model neuropatologie Alzheimerova typu (Games et al., Nátuře 373: 532-527 (1995); Hsiao et al., Science 274: 99-102 (1996). V modelu familiární středomořské horečky se u zvířat vyvíjí systémová amyloidosa. V in vivo testu podle předkládaného vynálezu jsou srovnávány sériové nekropsie od zvířat léčených a neléčených sloučeninou

podle předkládaného vynálezu a je hodnocena inhibice tvorby amyloidu. Ve zvířecích modelech pro tvorbu mozkového amyloidu je kromě sériového sledování tvorby amylodiu také v sériových nekropsiích od zvířat léčených a neléčených sloučeninou podle předkládaného vynálezu hodnocena přítomnost neurodegenerace spojené s amyloidem, jak je měřena tvorbou dystrofických neuritů, ztrátou synapsí, tvorbou neurofibrilární sítě a * gliosou.

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek· obsahující chrysamin G nebo jeho deriváty podán subjektu, u kterého se předpokládá tvorba amyloidu nebo amyloidových fibril, degenerace buněk a toxicita. Ve výhodných provedeních je takovým subjektem člověk, u kterého je riziko vzniku mozkového amyloidu, včetně nedementní populace vysokého věku a pacientů majících onemocnění spojené s tvorbou amyloidu. a diabetes mellitus 2. typu. Termín prevence zahrnuje zmírnění degenerace buněk a toxicity spojené s tvorbou fibril. Zmírněním je míněna prevence závažnějších forem degenerace buněk a toxicity u pacientů, u kterých se již projevily příznaky toxicity, jako je například demence.

Farmaceutický prostředek pro prevenci degenerace buněk a toxicity spojené s tvorbou fibril při onemocněních spojených s amyloidosou obsahuje chrysamin G nebo jeho derivát popsaný & výše a farmaceuticky přijatelný nosič. V jednom provedení takový farmaceutický prostředek obsahuje sérový.albumin, » chrysamin G nebo derivát chrysaminu G a fosfátový pufr obsahující NaCl. Mezi další farmaceuticky přijatelné nosiče patří vodné roztoky, netoxické přísady, včetně solí, konzervačních činidel, pufrů a podobně, jak jsou popsány, například, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. vydání, Easton: Mack Publishing Co., str. 1405-1412 a 1461-1487 (1975) a THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14. vydání, Washington: American Pharmaceutical Association (1975), a UNITED STATES • · ·

PHARMACOPEIA XVIII. 18. vydání, Washington: American

Pharmaceutical Association (1995), jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.

Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej a injikovatelné organické estery jako je ethyloleat. Mezi vodné nosiče patří voda, alkoholové/vodné roztoky, salinické roztoky, parenterální vehikula jako je chlorid sodný, Ringerova dextrosa atd. Mezi intravenosní vehikula patří tekutiny a nutriční roztoky. Mezi konzervační činidla patří antimikrobiální činidla, antioxidační činidla, chelační činidla a inertní plyny. pH a přesná koncentrace různých složek farmaceutického prostředku jsou upraveny podle obecných znalostí. Viz Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vydání).

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu může být takový farmaceutický prostředek podán orálně, ve formě kapalné nebo pevné, nebo může být podán' injekčně intravenosně nebo intramuskulárně, ve formě suspenze nebo roztoku. Termínem farmaceuticky účinné množství je míněno takové množství, které brání degeneraci buněk a toxicitě spojené s tvorbou fibril. Takové množství se bude lišit podle věku,.hmotnosti a stavu pacienta a bude upraveno odborníkem v oboru podle známých protokolů. V jednom provedení je dávka od 0,1 do 100 mg/kg a den, nebo je tato dávka rozdělena do menších dávek, které jsou podány dvakrát až čtyřikrát za den. Takový režim podávání může pokračovat denně po dobu života pacienta. Alternativně může být farmaceutický prostředek podáván intramuskulárně v dávkách 0,1 až 100 mg/kg každých 1-6 týdnů.

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro detekci amyloidových deposit v bioptických nebo nekroptických vzorcích tkáně. Způsob obsahuje inkubaci tkáně fixované formalinem s roztokem sloučeniny vzorce I, jak je popsána výše. Výhodně je roztokem 25-100% ethanol (ve kterém je zbylá část voda) nasycený sloučeninou vzorce I. Po inkubaci sloučenina barví nebo značí deposita amyloidu ve tkáni a barvená nebo značená deposita mohou být detekována nebo visualizována jakoukoliv standardní technikou. Mezi takové detekční prostředky patří mikroskopické techniky jako je mikroskopie světelná, fluorescenční mikroskopie, laserovákonfokální mikroskopie a polarizační mikroskopie.

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro kvantifikaci množství amyloidu v bioptickém neboo nekroptickém vzorku tkáně. Tento způsob obsahuje inkubaci značeného alkylového, alkenylového nebo alk/nylového derivátu chrysaminu G, výhodně sloučeniny vzorce I, nebo její netoxické soli rozpustné ve vodě, s homogenátem bioptického nebo nekroptického vzorku. Tkáň je získána a homogenizována za-použití známých technik. Výhodně je sloučenina značena radioaktivním značícím činidle, ačkoliv jiné značící sloučeniny, jako jsou enzymy, chemiluminíscenční činidla a imunofluorescenční sloučeniny jsou také v oboru známé. Výdodným radioaktivním značícím činidlem je ¹²⁵T, ¹⁴C nebo ³H, výhodným značícím substituentem vzorce I je alespoň jeden z Ri-R₇, Ri₀-R₂7. Tkáň obsahující deposita amyloidu se bude vázat na alkylové, alkenylívé nebo alkrnylové deriváty chrysaminu G. Navázaná tkáň se potom oddělí od nenavázané tkáně pomocí technik v oboru známých, jako je například filtrace; Navázaná tkáň může být potom kvantifikována jakoukoliv technikou známou v oboru. Viz příklad 3. Jednotky radioaktivně značeného derivátu chrysaminu G navázaného na tkáň jsou potom přeměněny na gg amyloidu na 100 mg tkáně pomocí srovnání se standardní křivkou určenou inkubací známých množství amyloidu s radioaktivně značeným derivátem chrysaminu G.

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro odlišení mozku postiženého Alzheimerovou nemocí od normálního mozku, kde uvedený způsob obsahuje získání

9· • · β

·«·· ·« • · '· *··« ··

G Q «*·· ·· ·· • · · · β 9 9 9

999 999

9 |· 99 tkáně ze (i) mozečku a (ii) jiné oblasti stejného mozku od normálních jedinců a od jedinců s podezřením na Alzheimerovu nemoc. Viz příklad 3. Jsou vyrobeny homogenaty takových tkání a ty jsou potom inkubovány s alkylovým, alkenylovým nebo alkrnylovým derivátem chrysaminu G. Pro každý typ tkáně (například mozeček, non-mozeček, normální, abnormální) je potom vypočítáno množství tkáně, které se váže na alkylový, alkenylový nebo alkrnylový derivát chrysaminu G a je vypočítán poměr pro vazbu na tkáň jinou než mozečkovou ku tkáni mozečkové pro normální tkáň a pro tkáň od pacientů s podezřením na Alzheimerovu nemoc. Tyto poměry jsou potom srovnávány. Pokud je poměr z mozku pacienta s podezřením na Alzheimerovu nemoc o 90% vyšší než poměr pro normální mozek, tak je stanovena diagnosa Alzheimerovi| nemoci.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Syntéza chrysaminu G a jeho derivátů

Syntéza chrysaminu G

Syntéza chrysaminu G (t.j. 4,4'-bis(3-karboxy-4hydroxyfenylazo)bifenylu) vyžaduje následující reakční stupně. Tyto reakční stupně jsou dále označovány jako obecný postup syntézy chrysaminu G”. Benzidin.2HC1 (28,9 mg, 0,11 mmol, Sigma Chemical Company, ST. Louis, MO) se přidá do 1,5 ml 1:1 DMSO:destilovaná/deionizovaná H₂O v 50 cc zkumavce s okrouhlým dnem. Každý z reakčních stupňů se provede při· 0 °C, pokud není uvedeno jinak. Přidá se 29 μΐ koncentrované HC1, což vede po promísení ke vzniku čirého roztoku. Do roztoku benzidinu se po kapkách přidá roztok 15,5 mg (0,22 mmol) NaNO₂ ve 300 μΐ 1:1 DMSO/H₂O, což vede ke vzniku směsi s pH přibližně 2-3. Tato reakční směs se mísí po dobu 45 minut a potom se do této tetra-azotizované směsi po kapkách během 10 minut přidá 24,8 mg (0,18 mmol) methylsalicylatu (Aldrich) rozpuštěného ve 2,0 ml 100% DMSO obsahujícího 250

• · · 9 · 9 9 9 9 9

99 99 9 9 9« 9 9 ·· · 9 9

mg/ml Na₂CO₃ v suspenzi, za udržování pH přibližně 10,5. Výsledná směs se mísí po dobu 1 hodiny při 0 °C a potom přes noc při teplotě okolí.

Po této době se pH upraví na přibližně 7 a směs se extrahuje třemi 50 ml díly chloroformu. Kombinované chloroformové extrakty se promyji třemi 50 ml díly H₂0 a potom se vysuší za zisku dimethylesteru chrysaminu G (t.j. . 4,4’-bis(3-methoxykarboyl-4-hydroxyfenylazo)bifenylu), který se dále přečistí rekrystalizací z chloroformu/hexanu. Ester se potom hydrolyzuje rozpuštěním v přibližně 100 ml 1:1 směsi ethanolu/H₂0 obsahující čtyři ekvivalenty NaOH a zahřívá se při teplotě zpětného toku po dobu 3 hodin. Po odpaření ethanolu se provede lyofilizace H₂O za zisku tetra-sodné soli chrysaminu G. Chrysamin G ve formě volné kyseliny se připraví rozpuštěním tetra-sodné sole v H₂O, jedním promytím chloroformem pro odstranění nehydrolyzovaného dimethylesteru, snížením pH na přibližně 2 a extrakcí se třemi 50 ml díly ethylacetátu. Kombinované ethylacetatové extrakty se promyji třemi 50 ml objemy H₂O a vysuší se.

Za těchto podmínek není přítomen žádný methylsalicylat, kyselina salicylová ani benzidin a je přítomno pouze stopové množství mono-substituovaného produktu, 4-hydroxy-4’-(3karboxy-4-hydroxyfenylazo)bifenylu, podle HPLC s reverzní fází využívající C4 kolony (Vydac 214-TP510) za použití systému rozpouštědel pufr obsahující fosforečnan sodný (5 mM, pH 6):acetonitril (ACN) 90:10, isokraticky po dobu 10 minut a potom zvýšení na 50% ACN na dalších 20 minut při průtoku 3,5 ml/min. Výtoková frakce z kolony je monitorována při 290 a 365 nm za použití detektoru s duální vlnovou délkou, diodovým uspořádáním (Perkin Elmer 235C). Za těchto podmínek eluuje chrysamin G v 17,6 minutě.

Struktura chrysaminu G a jeho derivátů byla potvrzena pr» protonovou NMR v DMSO-de s TMS jako vnitřním standardem.

I

Píkové hodnoty pro tetra-sodnou sůl chrysaminu G byly následující; SA označuje protony v určitých pozicích kruhu na skupině kyseliny salicylové a BZ označuje protony na benzidinové skupině: SA-3, dublet J = 8,73 Hz při 6,75 ppm; SA-4, dublet dubletů J = 8,73 a 2,72 Hz při 7,82 ppm; BZ-2/6, dublet J = 8,44 Hz při 7,91 ppm; BZ-3/5, dublet J = 8,44 Hz při 7,95 ppm; a SA-6, dublet J = 2,72 Hz při 8,28 ppm. UV/viditelné spektrum ve 40% ethanolu mělo λπ,_3Χ při 389 nm. Molární absorptivita chrysaminu G byla stanovena výpočtem koncentrace chrysaminu G ve srovnání s píkovými plochami s vnitřním standardem při NMR a potom inhed provedením UV/viditelného spektra alikvoty NMR vzorku ředěného ve 40% ethanolu. Molární absorptivita ve 40% ethanolu při 389 nm byla 5, 5 x 10⁴ AU/ (cm.M) .

[¹⁴C]chrysamin G byl syntetizován modifikací výše uvedeného postupu. Tetra-azotitace benzidinu byla provedena způsobem popsaným výše s tou výjimkou, že byla provedena ve 100% H2O. Do 50 μθί krystalické kyseliny salicylové-karboxy-¹⁴C (Sigma) v 0,5 ml konické skleněné zkumavce bylo přidáno 25 μί 2,5 M Na2CO₃ v H₂O. Do konické zkumavky bylo přidáno 60 μΐ tetraazotizované benzidinové směsi, provedlo se míšení a směs se uchovávala při 0 °C po dobu 1 hodiny. Pro zabránění tvorby mono-substituovaného benzidinového vedlejšího produktu se do reakční směsi přidalo 12,5 μΐ 250 mM neradioaktivní kyseliny salicylové (Sigma) v 2,5 M Na₂CO₃ a reakční směs se po dobu jedné hodiny ponechala při 0 °C. Zkumavka se potom inkubovala přes noc při teplotě okolí. Celá směs se rozpustila v minimálním množství 35% ACN a injikovala se do C4 kolony, jak byla popsána· výše. Pík odpovídající standardu chrysaminu G byl odebrán a lyofilizován. Specifická aktivita 26,8 Ci/mol vyla vypočítána stanovením absorbance při 389 nm a potom stanovením radioaktivity v alikvotě stejného vzorku. [¹⁴C]chrysamin G byl uskladněn ve 4 0% ethanolu. Když byl

přečištěný [¹⁴C]chrysamin G znovu injikován do C4 kolony a byl eluován isokraticky s 21% ACN při 3,5 ml/min, tak bylo >98% radiaktivity eluováno současně s autentickým chrysaminem G v 10,4 minutě. Mnoho derivátů chrysaminu G bylo syntetizováno za použití tohoto postupu obecné syntézy chrysaminu G; výjimky jsou uvedeny dále. Struktury derivátů byly potvrzeny NMR. Obr. 1 ukazuje chemickou strukturu chrysaminu G a několika jeho derivátů.

Podobným postupem byl syntetizován [³H]chrysamin G. 3,3'[³H]benzidin byl komerčně připraven American Radiolabelled Chemicals, lne., (St. Louis), reakcí směsi 0,7 mg 3,3'dijodbenzidinu, 1 mg paladiového/živočišné uhlí katalyzátoru, 200 μΐ N,N-diisopropylethylBminu a 500 μΐ THF s 8,26 Ci tritiového plynu bez nosiče při teplotě okolí během 3 hodin. Přesný výtěžek a specifická aktivita nejsou uvedeny. 3,3'[³H]benzidin eluoval současně se skutečným benzidinem a neobsahoval mono-jodové nečistoty. Protože komerčně získaný materiál obsahoval určitý residuální.Ν,N diisopropylethylamin, který interferoval s diazotizací,, byl

3, 3'-[³H]benzidin přečištěn elucí z Vydac C4 kolony s lineárním gradientem 100% voda (pH = 6,0) až 100% 0,01 N Hel (pH = 2,2) v 10 minutě (4,0 ml/min). Při tomto postupu eluoval 3,3' ~[³H]benzidin v přibližně 9,5 minutách bez N,Ndiisopropylethylaminu a v rozpouštědle, které mohlo být bez modifikace použito v diazotizační reakci. Diazotizace v objemu několika stovek μΐ se 100-násobným nadbytkem nitridu sodného, po které následovala reakce se 100-násobným nadbytkem kyseliny salicylové v NaCCh vedla k zisku tritiovaného derivátu chrysaminu G (4,4'-bis(3-karboxy-4hydroxyfenylazo)-3, 3 '-(³H]bifenylu) , který byl přečištěn pomocí HPLC způsobem uvedeným výše, za zisku specifické aktivity 35 Ci/mmol.

e » · · 9 · • · · · · ·

Syntéza alkenylových (CH=CH) derivátů chrysaminu G

4,4'-bifenyldikarboxylová kyselina (Aldrich) se přemění redukcí s LiAlH₄ na 4,4'-bis(hydroxymethyl)bifenyl, který je potom přeměněn na 4-4'-bis(jodmethyl)bifenyl reakcí s Nal a BF₃-etheratem v ACN. Jodo-sloučenina se zahřívá při 90 °C po dobu 1 hodiny s nadbytkem triethylfosfitu za vzniku tetraethyl-4,4'-bifenyldimethylfosfonatu. Při podobné reakci

1,4-naftalendikarboxylové kyseliny (Aldrich) nebo 9,10anthracen-dikarboxylové kyseliny (Aldrich) vznikne příslušný tetraethyl-fosfonat. Po rekrystalizaci z hexanu se fosfonat rozpustí v DMF a reaguje s desetinásobným nadbytkem methoxidu sodného a potom se 2 ekvivalenty kyseliny 5-formylsalicylové v DMF. Po míšení při teplotě okolí po dobu 24 hodin se reakční směs vnese do vody. Okyselení vody na pH 5,0 za 'použití HCI způsobí vysrážení fluorescentního produktu , .4,4'-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-bifenylu, který může být potom selektivně extrahován do ethylacetátu z jakéhokoliv mono-substituovaného vedlejšího produktu. Při podobné reakci tetraethyl-p-xylylendifosfonatu (TCI America) s kyselinou 5-formylsalicylovou nebo jejím derivátem se získá 4,4'-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-benzen. 1,4bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-naftalen nebo 9,10-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-anthracen se získá podobně reakcí vhodného fosfonatu s kyselinou 5formylsalicylovou. Jiné deriváty se získají při použití jiných kongenerů kyseliny formylsalicylové, kyselin formylbenzoových nebo hydroxy- nebo methoxybenžaldehydů.

Pokud jsou požadovány jiné než výše uvedené substituenty skeletu, tak je vhodná dikarboxylová kyselina (jako je například kyselina 2-bromtereftalová (Aldrich)) redukována na diol, přeměněna na jodid a potom na tetraethyldifosfonat, za použití způsobu uvedeného výše. Pokud jsou požadovány vedlejší skupiny jiné než kyselina salicylová, tak je vhodný fenol (který obvykle také obsahuje acidickou skupinu) nejprve • _____Φ Λ ______>»» ΦΦΦ ·»·

/^ován v orto nebo para pozici (podle přítomnosti jiných substituentů) fenolu a potm je formylován na jodu za použití běžných postupů.

Syntéza butadienylových (CH=CH-CH=CH) derivátů chrysaminu G

Tetraethylester kyseliny p-xylylendifosfonové (TCI America, Portland, OR) je rozpuštěn v suchém DMSO a reaguje s

10-násobným nadbytkem t-butoxidu draselného (Aldrich) a potom se dvěma ekvivalenty 3-methoxykarbonyl-4methoxycinnamaldehydu (který je připraven z methylesteru kyseliny 5-jod-2-methoxybenzoové a akroleinu za použití standardních postupů) v suchém DMSO. Po míšení při teplotě okolí po dobu 24 hodin se reakční směs vnese do vody. Okyselení vody na pH 5,0 za použití Hel způsobí vysrážení fluorescen.tního produktu, l,4-bis(4-(3-karboxy-4methoxyfenyl)-1,3-butandien-l-yl)-benzenu, který může být potom selektivně extrahován do ethylacetátu z jakéhokoliv mono-substituovaného vedlejšího produktu. Po odštěpení methoxy- skupiny za použití nadbytku thioethoxidu sodného v refluxujícím DMF se získá derivát kyseliny salicylové.

Podobná reakce jiných kombinací fosfonatových substituentů skeletu s vhodnými cinnamaldehydovými deriváty, jak jsou popsány výše, vede k zisku požadovaných materiálů.

Syntéza alkylem substituovaných alkenylových (CR'=CR') derivátů chrysaminu G

4,4'-bifenyldikarboxylová kyselina (Aldrich) nebo 1, 4-benzendíkarboxylová kyselina (Aldrich) se nejprve přemění redukcí s LiAlH₄ na bis(hydroxymethyl) sloučeninu, která je potom přeměněna na dikarboxaldehyd reakcí s BaMnO₄ v ethylacetátu. Tento dialdehyd reaguje s R'MgX (kde R’ je nižší alkyl a X je Br nebo I) v Grignardově reakci za vzniku HOCR’H-Ph-Ph-CR’H-OH nebo HOCR’H-Ph-CR'H-OH. Alkylem substituovaná bis(hydroxymethy) sloučenina se potom přemění

	•		99 9'9	99	•
•		•	9 ·	9 9	•
«	9 9	•	• · 99	9 9 9	•
9	9	t	9	•	•
99 9 9	·'··			··

na alkyl-substituovanou bis(jodmethyl) sloučeninu reakcí s Nal a BF₃-etheratem v ACN. Jodo-sloučenina se zahřívá při 90 °C po dobu 1 hodiny s nadbytkem triethylfosfitu za vzniku alkylem-substituovaného tetraethyl-dimethylfosfonatu. Při podobné reakci 1,4-naftalendikarboxylové kyseliny (Aldrich) nebo 9,10-anthracen-dikarboxylové kyseliny (Aldrich) vznikne příslušný alkylem substituovaný tetraethyl-dimethylfosfonat.

Potom mohou být syntetizovány alkylem substituované alkenylové sloučeniny třech skupin, konkrétně AR-CR'=CR'-Q, AR-CR’=CH-Q a nebo AR-CH=CR'-Q (kde R’ je nižší alkyl a Q je definován pro vzorec I). Sloučenina AR-CR*=CR*-Q může být připravena reakcí alkylem-substituovaného tetraethyldimethylfosfonatu s vhodným arylketonem jako je kyselina 5-acetylsalicylová (Crescent Chemicals Co., Inc., Hjauppage NY). Sloučenina AR-CR’=CH-Q může být připravena reakcí alkylem-substituovaného tetraethyldimethylfosfonatu s vhodným aldehydem jako je kyselina 5-formylsalicylová (Aldrich). Sloučenina AR-CH=CR'-Q může být připravena reakcí alkylem-substituovaného tetraethyldimethylfosfonatu s vhodným arylketonem jako je kyselina 5-acetylsalicylová (Crescent Chemicals Co., Inc., Hjauppage NY). Reakční podmínky jsou stejné jako podmínky použité pro přípravu alkenylových (CH=CH) derivátů popsané výše.

Syntéza alkínylových (CsC) derivátů chrysaminu G

Kyselina 5-jodsalicylová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se přemění na methylester reakcí s methanolem, trimethylortoformiatem a kyselinou sírovou. Takto získaný methylester kyseliny 5-jodsalicylové reaguje s (trimethylsilyl)acetylenem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti palladia. Trimethylsilylová skupina se odstraní a dva ekvivalenty vzniklého methylesteru kyseliny 5-acetylensalicylové reagují s 4,4’-dibrombifenylem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti • · palladia, jak bylo uvedeno výše. Výsledný alkynylový analog chrysaminu G, 4,4'-bis(2-(3-methoxykarbonyl-4hydroxyfenyl)acetylen-l-yl)-bifenyl se připraví hydrolýzou esteru, jak je popsána výše.

Alternativní syntéza alk»-nylových (CsC) a vinylových (CH=CH) derivátů chrysaminu G

Kyselina 5-bromsalicylová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se přemění na methylester/methylether reakcí s methyljodidem za přítomnosti K₂CO_3z jak je popsáno výše.

Takto získaný methylester kyseliny 2-methoxy-5-brombenzoové reaguje s (trimethylsilyl)acetylenem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti palladia.

Trimethylsilylová skupina se odstraní a dva ekvivalenty vzniklého methylesteru kyseliny 2-methoxy-5-acetylenbenzoové reagují s 4,4'-dibrombifenylem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti palladia, jak bylo uvedeno výše. Výsledný alkrnylový analog chrysaminu G, 4,4’-bis(2-(3karboxy-4-methoxyfenyl)acetylen-l-yl)-bifenyl se připraví hydrolýzou esteru, jak je popsána výše. Tento alkrnylový. analog se redukuje běžnými metodami za zisku vinylového analogu chrysaminu G.

Jiná alternativní syntéza alkenylových derivátů využívá buď Suzukiho, nebo Steelov:y reakce, které využívají borových nebo cínových derivátů methylesteru kyseliny 2-methoxy-5acetylenbenzoové (nebo jiných hydroxy-kyselinových derivátů, ják jsou popsány výše) pro navázání 1,4-dijodbenzenu, 4,4’dijodbifenylu nebo jiných di-jodových nebo dibromových substituentů skeletu. V některých případech je výhodné připravit borové nebo cínové deriváty 1,4-diacetylenylbenzenu (nebo 4,4’-diacetylenylbifenylu) a navázat tyto deriváty na kyselinu 5-jodsalicylovou (nebo na jiné jod-hydroxy kyseliny).

• · ¹ ·«·· »·· i·····

Syntéza di alkí'nyl ových {C=C-C=C) derivátů chrysaminu G

Kyselina 5-jodsalicylová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se přemění na methylester reakcí s methanolem, trimethylortoformiatem a kyselinou sírovou. Takto získaný methylester kyseliny 5-jodsalicylové reaguje s (trimethylsilyl)acetylenem (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) za přítomnosti palladia. Trimethylsilylová skupina se odstraní a dva ekvivalenty vzniklého methylesteru kyseliny 5-acetylensalicylové reagují s 4,4'-bis(2bromacetylen-l-ylbenzenem (syntetizovaným z trimethylsilylacetylenu a 1,4-dijodbenzenu) za přítomnosti palladia, jak bylo uvedeno výše. Výsledný dialkrnylový analog chrysaminu G, 4,4’-bis (4-(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenyl)1, 3-butadif-n-l-yl)-bgfT2(?h se připraví hydrolýzou esteru, jak je popsána výše.

Syntéza alken-alkrnylových (C=C-C=C) derivátů chrysaminu G

Podobně jako při syntéze alkenylových a alkr nylových derivátů popsané výše jsou Suzuki ho nebo Steeloviý reakce použity pro navázání kov-alkenylových derivátů benzenu, bifenylu nebo jiných skeletových skupin na methylester kyseliny 2-methoxy-5-(2-jodacetylen-l-yl)-benzoové (nebo na jiný vhodný derivát hydroxy-kyseliny) nebo - alternativně může být 5-kov-alkenylový derivát methylesteru kyseliny 2methoxybenzoové navázán na 1,4-bis(2-jodacetylen-l-yl)-benzen (nebo 4,4’-bis(2-jodacetylen-l-yl)-bifenyl).

Syntéza alkylových (CH₂-CH₂) nebo dialkylových (CH₂-CH₂CH₂-CH₂) derivátů chrysaminu G

Alkenylové, alkí nylové, dialkenylové, dialk» nylové ti&bo alken-alk» nylové deriváty popsané výše jsou hydrogenovány standardními technikami za použití vodíku a platinového nebo palladiového katalyzátoru.

0..0 · 0'0 ♦ · · · · · · · ♦ · 0 0 0+00 e · 0 0 0 0 0000«·

0 0 0 0 0

0000 «0· 000 0000 0« 0:0

Syntéza di-fluor-alkenylových derivátů chrysaminu G

5-fluor derivát, 1,4-bis(2-(2-hydroxy-3-karboxy-5fluorfenyl)ethen-l-yl)-benzen, je syntetizován substitucí kyseliny 3-formyl-5-fluorsalicylové za kyselinu 5-formylsalicylovou. [ⁱ⁸F]aryl fluoridové deriváty chrysaminu G mohou být připraveny substitucí ¹⁸F-značených prekursorů jako je [¹⁸F]LiBF4, v Schiemanióvě reakci, prostřednictvím triazenového rozkladu s Cs [¹⁸F], nebo pomocí nukleofilní substituce ¹⁸F-zaX, kde X = tosyl, triflat, N02, ⁺N(CH₃)₃ nebo halogen - Viz Fowler, J. and Wolf, A., v POSITRON EMISSICN TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J. and Schelbert, H.~, vyd.) 391-450 (Raven Press, NY, 1986) a Kilbourn, M., Fluorine-18 labeling of radipharmaceuticals (Nati. Acad. Press, Washington, D.C.) (1990).

Syntéza aromatických fluoralkyl- nebo fluoralkoxyderivátů

Aromatické fluoralkylové deriváty jsou syntetizovány za použití metody, kterou popsal Bishop et al., J. Med. Chem. 34: 1612 (1991), ve které Claisenovo přeskupení vhodných 0allyl etherů tvoří aromatický allylový derivát, který může být dále funkcionalizován za zisku fIuorethylových nebo fluorpropylových derivátů. Alternativně může být aromatický jodid snadno přeměněn na aromatický alk/n skládající se ze dvou až pěti atomů uhlíku, za použití vazebné metody 'využívající palladia, kterou popsal Sonogashira et al., Tetrahedron Letters, 4467-4470 (1975). Po následné derivatizaci alkrnu se získá fluoralkylový derivát. Fluoralkoxy-deriváty mohou být připraveny metodou, kterou popsal Chumpradit et al., J. Med. Chem. 36: 21 (1993), ve které alkylace vhodného fenolu s vhodným 1-brom-(nebo jod • » · '····· • · * · ♦· ···«··

C9 · · · « · · ·*·· ··· ·«· ···· «· «.· nebo sulfonyloxy) - omega-fluoralkanu vede k zisku odpovídáj ícího fluoralkoxy-derivátu.

Radiofluorace aromatických alkylsulfonyloxy- a alkoxysulfonyloxy- derivátů

Radiof luorace vedoucí k zisku aromatických [¹⁸F]f luoralkyla [¹⁸F]f luoralkoxy- derivátů je provedena postupem, který popsal Mathis et al., Nucl. Med. Biol. 19:.571 (1992), ve kterém jsou aromatické alkyl- nebo alkoxysulfonyloxy(například alkoxytosylat) deriváty substituovány [¹⁸F]f luoridem za zisku aromatických [¹⁸F]fluoralkyl- nebo [¹⁸F]f luoralkoxy- sloučenin.

Rádiojodace a radiobromace pomocí trialkylcínu

Syntéza trialkylcínových derivátů

Obecná struktura trialkylcínových derivátů chrysaminu G je uvedena na obr. 2B. Obecně bude trialkylcínová skupina substituována ve 3-pozici na jedné straně bifenylové skupiny, ale jiné pozice, včetně kyseliny salicylové nebo heterocyklické skupiny, jsou také potenciálním cílem substituce. Tyto trialkylcínové deriváty jsou stabilní bezprostřední prekursory pro přípravu rádiojodovaných a radiobromovaných sloučenin, které mají být použity u lidí.

Přesněji se tyto trialkylcínové deriváty používají pro přípravu halogenovaných radioaktivních sloučenin, které jsou použitelné pro zobrazení amyloidu in vivo.

Obecné postupy pro syntézu trialkylcínových derivátů

Ttrialkylcínové deriváty jsou připraveny z vhodných arylhalogenidů, [ (C₆H₅) ₃P]3Pd (0) , a hexaalkyldicínu, za použití postupu, který publikovali Kosugi, M. et al., Chem. Lett.

« · • · ·9· «·· • »!· · · · ·

1981, 829; Heck, R. Pure and Appl. Chem. 1978, 691;

Echavarren, A., and Stille, J., J. Am. Chem. Soc. 1987, 5478; Mitchell, T., J. Organometallic Chem. 1986, 1; a Stille, J., R. Pure and Appl. Chem. 1985, 1771. Tyto deriváty mohou být také získány za použití n-BuLi a trialkylcín chloridu v postupu popsaném v Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994, 905.

Syntéza 3-trialkylcínových derivátů 4,4'-bis(3methoxykarbony1-4-hydroxyfenylazo)-bifenylu

3-brom- nebo 3-jod-4,4'-bis(3-methoxykarbonyl-4hydroxyfenylazo)-bifenyl nebo jeho dimethylether jsou připraveny syntézou 3-brom- nebo 3-jodbenzidinu (viz výše), tetraazotizací a vazbou na methylsalicylat, jak je uvedeno -pro syntézu chrysaminu G, a methylací fenolu jako je popsána výše, pokud je požadována methoxy-sloučenina. 1 mmol fenolického esteru nebo methoxy-esteru, [ (C₆H₅) ₃P]₃Pd (0) (0,1 až 0,2 mmol), hexabutyldicín nebo hexamethyldicín (1,25 mmol) a dioxan (25 ml) se pod atmosférou argonu zahřívají při 70 °C po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladí a rozpouštědlo se odpaří. Trialkylcínhalogenid se odstraní vodným KF. Organický materiál se extrahuje ethylacetátem, suší se přes síran hořečnatý, filtruje se a rozpouštědlo se odpaří za redukovaného tlaku. Zbytek se přečistí na silikagelu za zisku 3-trialkylcín-4,4'-bis(3-methoxykarbonyl-4-hydroxyfenylazo)bifenylu.

Rádiojodace nebo radiobromace trialkylcínových derivátů

Tributyl- nebo trimethylcínové deriváty jsou rádiojodovány pomocí Na[¹²⁵I] nebo Na[¹²³I] nebo radiobromovány pomocí Na[⁷⁵Br] nebo Na[⁷⁶Br] za použití publikovaných postupů, jako například Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm.

1994, 905; Chumpradit et al., J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al., J. Med. Chem. 37: 4245 (1994). Obecně, 0,5 mg trialkylcínové sloučeniny, 0,2 ml bezvodého acetonitrilu, 10 μΐ 2M H₃PO₄, 2-100 μΐ roztoku Na[¹²⁵I] nebo Na[¹²³I] (nebo Na[⁷⁵Br] nebo Na[⁷⁶Br]) s vysokou specifickou aktivitou (>2000 Ci/mmol) v NaOH při pH 9-12 a dichloramin-T (DCT) (20 μΐ 2,5 mg/ml DCT v acetonitrilu) se umístí v 1 ml Reacti-Vial. Zkumavka se uzavře a směs se mísí při teplotě okolí ve tmě. Reakce se *

sleduje HPLC a po 30 minutách se utlumí 50 μΐ 2M Na₂s₂O₃. _a. Výsledný materiál se přečistí za použití standardních chromatografických technik. Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994, 905. Podobně se analogickým postupem připraví ¹⁸F deriváty s nízkou specifickou aktivitou.

Obecné postupy pro přípravu neradioaktivních I, Br, Cl, F -a -SH derivátů.

Obecně, 3- nebo 4-amino deriváty kyseliny 5řormylsalicylové, nebo odpovídající deriváty heterocyklických •analogů kyseliny salicylové uvedené na obr. 2, se přemění na odpovídající diazo-sloučeniny reakcí s nitritem sodným a Hel nebo H₂SO₄. Jodové deriváty jsou připraveny přímo přípravou diazoniumjodidu, který je potom přeměněn na aryljodid, nebo.

* přes triazenové deriváty. Viz například Greenbaum, F. Am. J.

Pharm. 108: 17 (1936); Satyamurthy and Barrio, J. Org. Chem. 48 : 4394 (1983), Goodman et al., J. Org. Chem. 49: 2322 (1984) . Arylbromidy a chloridy jsou připraveny z diazo’ sloučenin reakcí s CuCl nebo CuBr podle Sandmeyerovy reakce nebo prostřednictvím triazenu, stejně jako jodové deriváty. Arylfluoridy jsou reakcí diazoniových sloučenin s NaBF₄, HBF₄nebo NH₄BF₄ v Schiemannově reakci, nebo prostřednictvím triazenové dekompozice, stejně jako jodové deriváty. Arylthioly jsou připraveny z diazoniových sloučenin reakcí s nukleofilními činidly obsahujícími síru, jako je HS~, EtO• ·' • · · · · • ·’ • ·

CSS~ a S₂ ²~. Alternativně mohou být arylthioly připraveny nahrazením arylhalogenidů nukleofilními činidly obsahujícími síru. Tyto reakce jsou popsány v March, J., ADVANCED ORGANIC

CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS AND STRUCTURE (3. vydání,

1985).

Obecné postupy pro přípravu radioaktivních C, F a Tc derivátů

Kromě výše uvedených postupů je podle postupů uvedených v literatuře provedeno radioaktivní značení vysokou specifickou aktivitou ^99mTc pro SPÉCT nebo jinými radionuklidy emitujícími pozitrony, jako je ¹¹C, ¹⁸F, ⁷⁵Br a ⁷⁶Br. Některé možné postupy jsou, popsány dále, ale existují jiné dobře známé postupy, které jsou popsány v Fowler, J. and Wolf, A. v POSITRON .EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M.,

Mazziota, J., and Schelbert, H., vyd.) 391-450 (Raven Press, NA, 1986), Coenen, H. et al., Radiochimica Acta 34: 47 (1983) a Kulkami, Int. J. Rad. Appl. and Inst. (Part B) 18: 647 (1991) jejichž obsah je zde uveden jako odkaz.

^99mTc deriváty jsou připraveny tvorbou komplexů s arylthioly. Radioaktivní značení ⁿC může být snadno provedeno pomocí N-methylace, O-methylace, jak jsou popsány výše, za substituce [¹¹C]methyljodidu, [¹¹C]alkylace nebo [¹¹C]karboxylace vhodného alkylového, alkenylového .nebo alkrnylového analogu chrysaminu G. [¹⁸F]aryl fluoridové deriváty chrysaminu G mohou být připraveny substitucí ¹⁸Fznačených prekursorů jako je [¹⁸F]LiBF4, v Schiemar^ově reakci popsané výše, prostřednictvím triazenového rozkladu s Cs [¹⁸F], nebo pomocí nukleofilní substituce ¹⁸F-za-X, kde X = tosyl, triflat, NO2, ⁺N(CH3)₃ nebo halogen. Radiobrom. . ace za použití ⁷⁵Br nebo ⁷⁶Br může být provedena pomocí elektrofilní (Br+) nebo nukleofilní (Br-) substituční techniky analogicky k radiojod aci, viz Coenen, H., výše.

• ·· · • » · e . ·· ·· ·· · e e · · · 4 « ♦ « 9 9 9 9 9

Syntéza 3-hyrdroxy-l, 2-benzisoxazolových derivátů a příbuzných derivátů (viz obr. 2C)

Methyl ester kyseliny 2,6-dihydroxybenzoové (γresorcylové) (TCI America, Portland, OR) se přemění na hydroxamovou kyselinu za použití hydroxylaminhydrochloridu postupem, který popsal Boshagen (Chem. Ber. 100: 954-960, 1967). Kyselina hydroxamová se přemění na odpovídající 3hydroxy-1,2-benzisoxazol za použití SOCI2 a potom triethylaminu, též postupem, který popsal Boshagen (Chem.

Ber. 100: 954-960, 1967). Tato sloučenina se potom přemění na formylový derivát a naváže se na vhodný tetraethyldifosfonat (který může být v některých případech brómovaný) postupem, který je popsán výše pro syntézu alkenylových derivátů. Bromové deriváty mohou být potom přeměněny na trialkylcínové a jodové deriváty postupem popsaným výše.

Alternativně je kyselina 5-formylsalicylová navázána na vhodný tetraethyldifosfonat obvyklým způsobem a výsledný 4, 4’-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)-benzen je přeměněn nejprve na dimethylester a potom na hydroxamovou kyselinu a nakonec na benzisoxazol postupem, který popsal Boshagen, jak je uveden výše. Třetí typ 3-hydroxy-l,2benzisoxazolu je syntetizován z několika izomerických dihydroxybenzendikarboxylových kyselin včetně kyseliny 4,6dihydroxy-1,3-benzendikarboxylové, kyseliny 3,6dihydroxyftalové a kyseliny 2,5-dihydroxytereftalové (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). Po formyl^ci a navázání na vhodný tetraethyldifosfonat za použití standardních technik, po čemž následuje konverse na dimethylestery, jsou dihydroxy/diestery přeměněny na dihydroxy/dihydroxamové kyseliny reakcí s hydroxylaminem za použití postupu, který popsal Bdshagen, jak je uveden výše. Konverse na dvojitý benzisoxazol je provedena reakcí s SOC1₂ a triethylaminem, • · Φφ Φ φ Φ φ Φ · · Φ φ φ φ φ · φ φ φ

Φ β Φ Φ Φ' Φ φφφφφφ φ φ φ φ φ φ φφφφ «φφ «φφ φφφφ φ» φφ opět za použití postupu, který popsal Boshagen, jak je uveden výše.

Syntéza ftalimidového nebo isoindol-1,3(2H)-dionového derivátu (viz obr. 2D)

3-hydroxyftalimid připravený z anhydridu kyseliny 3hydroxyftalové (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) je přeměněn na formylový derivát a naváže se na vhodný tetraethyldifosfonat (který může být v některých případech brómovaný) postupem, který je popsán výše pro syntézu alkenylových derivátů. Bromové deriváty mohou být potom přeměněny na trialkylcínové a jodové deriváty postupem popsaným výše.

Syntéza ftalhydrazidového nebo 2,3-benzodiazin-l,4(2H,3H)dionového derivátu (viz obr. 2E)

3-hydroxyftalhydrazid připravený z reakce anhydridu kyseliny 3-hydroxyftalové (Aldrich Chemical Company,

Milwaukee, WI) s hydrazinem je přeměněn na formylový derivát a naváže se na vhodný tetraethyldifosfonat (který může být v některých případech brómovaný) postupem, který je popsán výše pro syntézu alkenylových derivátů. Bromové deriváty mohou být potom přeměněny na trialkylcínové a jodové deriváty postupem r ' , 1 popsaným výše.

Syntéza 2,3-benzoxazin-l,4-(3H)-dionového derivátu (viz obr. 2F)

Anhydrid kyseliny 3-hydroxyftalové (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) je přeměněn na 2,3-benzoxazin za použití hydroxylaminu. Benzoxazinový derivát je potom přeměněn na formylový derivát a naváže se na vhodný tetraethyldifosfonat (který může být v některých případech brómovaný) postupem, který je popsán výše pro syntézu ·· 44 • · 4 4 4 4 . 4 . 4 · 4 4 • 4 ······

4 · ···· · alkenylových derivátů. Bromové deriváty mohou být potom přeměněny na trialkylcínové a jodové deriváty postupem popsaným výše.

Syntéza (2H)1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dionového derivátu (viz obr. 2G)

Tato sloučenina je syntetizována postupem podle Effenberger et al., Chem. Ber. 105: 1926-19.42; 1972. Stručně, 4-hydroxybenzaldehyd (Aldrich) se naváže na vhodný tetraethydifosfonat stejným postupem, jako byl postup použitý pro deriváty kyseliny formylsalicylové. Tento addukt je potom přeměněn na karbamat reakcí s ethoxykarbonylisokyanatanem (O=C=N-CO-O-Et) za přítomnosti triethylaminu. Tento substituovaný karbamat (nebo fenylester kyseliny Nethoxykarbonyl-karbamové) je přeměněn na benzoxazindion zahříváním v difenyletheru. Benzoxazindion je potom přeměněn na trialkylcínové a jodové deriváty postupem popsaným výše.

Syntéza (3H)2-benzazin-l,3(3H)-dionového derivátu (viz obr. 2H)

Kyselina 3-hydroxyfenyloctová (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se formyluje, přemění se na amid a potom se naváže na vhodný tetraethydifosfonat stejným postupem, jako byl postup použitý pro deriváty kyseliny formylsalicylové. Tento addukt je potom přeměněn na ethylester kyseliny N-(3hydroxyfenylacetoxy)-karbamové reakcí s ethylchlorformiatem. Tento substituovaný karbamat je přeměněn na benzoxazindion zahříváním v difenyletheru. Benzoxazindion je potom přeměněn na trialkylcínové a jodové deriváty postupem popsaným výše.

Syntéza 1,8-naftalimidového derivátu (viz obr. 21)

4-amino-l,8-naftalimid je přeměněn na formylový derivát a naváže se na vhodný tetraethyldifosfonat (který může být v ·· · * ·

některých případech hromovaný) postupem, který je popsán výše pro syntézu alkenylových derivátů. Bromové deriváty mohou být potom přeměněny na trialkylcínové a jodové deriváty postupem popsaným výše.

Syntéza tetrazolových a oxadiazolových derivátů (viz obr. 2J a 2K)

2-kyanfenol (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) se přemění na tetrazol reakcí s azidem sodným nebo hlinitým postupem, který popsal Holland and Pereira, J. Med. Chem. 10: 149 (1967) a Holland U.S. patent č. 3448107. Stručně, 2kyanfenolový nebo alkenylkyanfenolový derivát chrysaminu G (připravený navázáním 4-formyl-2-kyanfenolu na vhodný tetraethyldifosfonat) (1 mmol) v 40 ml DMF reaguje s azidem sodným (10 mmol) a triethylaminhydrochloridem (10 mmol) po atmosférou argonu. Směs se mísí při 120 °C po dobu 2 hodin a potom se směs ochladí a zpracuje se způsobem analogickým se způsobem popsaným výše pro chrysamin G.

Oxadiazoly jsou syntetizovány reakcí tetrazolů připravených výše s anhydridem kyseliny (jako je anhydrid kyseliny octové). Alternativní způsob popisuje Bamford et al., J. Med. Chem. 38: 3502 (1995). V tomto postupu reagují hydrazidalkenylové deriváty chrysaminu G nebo kyseliny salicylové (získané reakcí příslušných esterů s hydrazinem) s methylisothiokyanatanem za přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu.

Syntéza derivátů chrysaminu G pro použití pro kontroly

Anilinový derivát je syntetizován substitucí dvou ekvivalentů anilinu (Fisher Chemical Company, Fair Lawn, NJ) za každý ekvivalent benzidinu. Derivát kyseliny 2,2'disulfonové je syntetizován substitucí kyseliny benzidin2,2’-disulfonové (Pfaltz and Bauer, lne., Waterbury, CT) za

9 ·	•		• 4 ··
'·	4		4 4 4 4
4	• 4	4	4 '4 44 4
4	4	4	4 '·
• 4 · ·	4 4 4

benzidin. Fenolový derivát je syntetizován substitucí jednoho ekvivalentu fenolu za každý ekvivalent kyseliny salicylové. Kongo červeň (Aldrich čistoty) je získána komerčně.

Příklad 2: Chrysamin G a deriváty chrysaminu G se specificky váží na Αβ

-Vá^-da^na'’·^^ 3 ---------Chrysamin G se dobře váže na syntetický Αβ (10-43) peptid in vitro. Obr. 4A ukazuje Scatchardovu analýzu vazby chrysaminu G na Αβ(10-43). Složka s vyšší afinitou má K_D0,257 μΜ a B_max 3,18 nmol chrysaminu G/mg Αβ (10-43) . Složka s nižší afinitou je těmito daty hůře definována, ale zdá se, že má K_D 4,01 μΜ a B_max 18,7 nmol chrysaminu G/mg Αβ (10-43).

Složka s nízkou afinitou představuje vazbu chrysaminu G při vysokých koncentracích na odlišné místo s nízkou afinitou, nikoliv vazbu na nečistoty přípravku. Množství chrysaminu G injikované in vivo je tak nízké, že neexistuje vazba na složku s nízkou afinitou. Při velmi nízkých koncentracích je poměr vysokoafinitní ku nízkoafinitní vazbě velmi vysoký.

Vazba chrysaminu G je lineární při použitých koncentracích peptidu, jak ukazuje obr. 5.

Kinetik® vazby

Studie kinetiky ukázaly velmi rychlou asociaci (obr. 6A), v podstatě dokončenou po 1 minutě, při [chrysamin G] = 112 μΜ s ti/2 8,9 ± 1,8 sec. a o něco méně rychlou disociaci (obr.

6C) , ti/2 = 55 ± 9,4 sec. (disociační rychlostní konstanta (Κι) = 1,26 x 10’² sec’¹). Obr. 6B ukazuje transformaci dat asociační kinetiky podle metody, kterou popsali Bennett and Yamamura. Bennett, J.P. and Yamamura, H.I. v NEUROTRANSMITTER

99	Φ	9	99 99
9 • •	9 • · • '···	9 • •	• · 9 9 9 '· -99 9 9 9

RECEPTOR BINDING (N.Y.: Raven Press 1985), str. 61-89. Lineární část asociační křivky na obr. 6A je transformována do přímky na obr. 6B, kde je graficky znázorněn ln[B_eq/(_eq-B_t) ] v závislosti na čase, kde B_eq je množství chrysaminu G vázané v rovnovážném stavu (4 min.) a B_t je množství navázané v čase t. Sklon této přímky je roven K_observed a Ki = (k_observed - K-J /[chrysamin G], kde K-i je disociační rychlostní konstanta určená z dat uvedených na obr. 6C. Křivka na obr. 6C je určena rovnicí:

A_t = Aoe”^{k_1 fc} kde At je množství chrysaminu G, který zůstává navázaný v čase t, Άο je množství navázaného chrysaminu G v čase 0, t je čas v minutách a k_i je disociační rychlostní konstanta. Z této analýzy byla vypočítána hodnota asociační rychlostní konstanty (ki) 3,75 x 10⁴ M“¹ s*¹ a potom K_D = k-i/ki = 0,34 μΜ, což je v dobrém souladu se Scatchardovou analýzou.

Deriváty chrysaminu G mohou inhibovat vazbu chrysaminu G na Αβ

Hodnoty K_b pro inhibicí vazby [¹⁴C] chrysaminu G na Αβ(1θ43) pomocí analogů chrysaminu G jsou uvedeny pod chemickými vzorci na obr. 1 a několik křivek inhibice je uvedeno na obr. 3. Ki je definována jako IC50/ (1 + [L]/KP, kde [L] je koncentrace [¹⁴C] chrysaminu G v testu (0,100 až 0,125 μΜ) a Kp je 0,26 μΜ, což je K_p chrysaminu G určená Scatchardovou analýzou výše. Chrysamin G sám dává Ki 0,37 ± 0,04 μΜ, což je hodnota, která velmi dobře odpovídá Scatchardově analýze a analýzám kinetiky. Kongo červeň má Ki 2,82 ± 0,84 μΜ. Difluorový derivát chrysaminu G, (5-FSA)CG, (obr. 1), má třetinovou účinnost ve srovnání s chrysaminem G samotným (Ki = 1,16 ± 0,19 μΜ) . Aktivita difluorového derivátu chrysaminu G κ

·· ·	♦ »9	9«
.9	9	9	«	• 9 9
•	• 9	9	•	9 99 9
•	•	•	9	9
• 9« 9	9 9 9			9 ·

naznačuje, že ¹⁸F difluorové deriváty chrysaminu G jsou použitelné pro PET zobrazení a že ¹⁹F difluorové deriváty chrysaminu G jsou použitelné pro MRS/MRI zobrazení.

3-ICG je o něco účinější než chrysamin G. Aktivita 3-ICG derivátu naznačuje, že ¹²³I difluorový derivát chrysaminu G je použitelný pro SPÉCT zobrazení. Methylace fenolu 3-ICG l* snižuje afinitu o faktor 10 pro 3-ICG (OMe) ₂. Methylace karboxylatové skupiny způsobuje ještě větší (asi 200-násobné) snížení afinity pro CG(C00Me)₂. Úplné odstranění kyseliny, jaké je například u fenolového derivátu, zcela zruší vazebnou afinitu.

Tyto výsledky naznačují, že kyselinová skupina analogu chrysaminu G má hlavní úlohu ve vazbě na Αβ a dále naznačují, že fenolová skupina má usnadňující úlohu. Účinky fenolu mohou být zprostředkovány vodíkovou vazbou na kyselinu, která může stabilizovat strukturální orientaci kyselinové skupiny. Přítomnost fenolu v orto pozici může také měnit distribuci náboje kyseliny jak prostřednictvím vodíkové vazby, tak prostřednictvím změn v distribuci náboje aromatického systému jako celku. Alternativně se může fenol přímo účastnit vazby na amyloid prostřednictvím dvouvýběžkové vazby jak fenolu, tak kyseliny na amyloidové vazebné místo. Přidáním druhého fenolu v orto pozici vzhledem ke karboxylatu v derivátu kyseliny resorcylové, (6-OHSA)CG, vzniká sloučenina s nejvyšší afinitou v této sérii, s K± 0,094 ± 0,02 μΜ.

s Zdá se, že zvyšující se lipofilnost bifenylového skeletu o něco zvyšuje afinitu. Di-halogenové deriváty, 3,3’-I₂CG, 3,3'-Cl₂CG, a 3,3’-Br₂CG, mají všechny velmi podobné hodnoty K_iz které jsou přibližně poloviční vzhledem ke chrysaminu G.

Deformace úhlu vzepětí mezi fenylovými kruhy bifenylové skupiny způsobená substitucí v 2-pozici značně snižuje afinitu. Toto je demonstrováno inaktivitou derivátu • ·

*· • · • ····

chrysaminu G s kyselinou 2,2'-disulfonovou, 2,2’-(S0₃) ₂CG. Protože 3,3'-dikarboxylový derivát, 3,3’-(COOH) ₂CG, má pouze

7-krát nižší aktivitu než chrysamin G, tak je nepravděpodobné, že další acidické skupiny jsou jedinou příčinou ztráty aktivity kyseliny 2,2'disulfonové. 2,2'derivát je jedinečný tím, že objemné sulfonatové skupiny ve 2-pozici vytlačují bifenylovou skupinu z planarity. Molekulární modelovací studie ukázaly, že úhel vzepětí mezi dvěma bifenyl benzenovými kruhy v derivátu kyseliny 2,2'disulfonové je 83°. Tento úhel je přibližně 35-40° v chrysaminu G a ve všech ostatních aktivních derivátech.

V pokusu o využití významu dvouvýběžkového charakteru funkčních skupin chrysaminu G byla studována vazba anilinového derivátu, který představuje jednu polovinu molekuly chrysaminu G (obr. 1). Přibližně stanovení energie vazby může být vypočítáno z rovnice:

ÁG = -RT ln K_eq kde ÁG je energie vazebné reakce, R je molární plynová konstanta (8,31441 J/(mol«°K) ) , T je teplota ve °K a K_eq je rovnovážná konstanta pro reakci:

(sonda) + (peptid) = (sonda*peptid) a K_eq = 1/K_D « l/Κι. Při použití hodnoty 0,26 μΜ pro K_Dchrysaminu G je energie vazby přibližně 38 KJ/mol. Pokud se anilinový derivát váže s přibližně jednou polovinou této energie, pak je předpokládaná vazebná energie přibližně 19 KJ/mol. Při Ki 73 μΜ pro anilinový derivát je energie vazby 23 KJ/mol, což přijatelně odpovídá předpokládané hodnotě. Význam hydrofobního regionu chrysaminu G a anilinového derivátu je demonstrován úplným chyběním vazebné aktivity kyseliny salicylové samotné.

·· · · ·· ·· ♦ · «· ·· · · ···· • · · · · · · · • · · · · · *·· ··· • · · · · * ···· »·· ··· ·«·· ·· ··

Afinita chrysaminu G pro Αβ se zdá být několikrát vyšší než afinita kongo červeni pro tento peptid. Vazba je reversibilní s disociační konstantou přibližně 250-400 nM, při měření Scatchardovou analýzou, kinetickými metodami nebo inhibicí vazby. Vzhledem k nekrystalickému, špatně rozpustnému charakteru amyloidových fibril nebyla struktura komplexů kongo červeni nebo chrysaminu G s amyloidem nikdy přesně definována přesnými strukturálními technikami jako je rentgenová krystalografie nebo mnohorozměrová NMR. Byly navraženy modely interakcí kongo červeni s amyloidem. Cooper, Lab. Invest., 31: 232 (1974); Romhanyi, Virchows Arch., 354: 209 (1971) . Tato práce naznačuje, že kongo červeň se neváže na jedinou molekulu amyloidového peptidu, ale že se váže na několik molekul Αβ orientovaných do struktury vlákna beta•listu. Klunk et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 1273 (1989).

Obr. 7 ukazuje schéma tohoto modelu, vytvořené pomocí MacroModel 2.5, ve kterém chrysamin G pokrývá 5 peptidových řetězců v uspořádání antiparalelního beta-listu. Peptidy jsou použité bez dalších strukturálních úprav. Peptidy jsou uspořádány tak, že alternující řetězce jsou od sebe vzdáleny 4,76 A, což je charakteristické pro fibrily beta-listu. Alternující peptidové řetězce jsou nakresleny černě a bíle. Chrysamin G (černý) má minimalizovanou energii a je tak uložen ve vztahu k modelu fibrily, aby byl maximalizován kontakt s lysinem 16 (světle šedé ovály na horním obrázku) a hydrofobním regionem fenylalaninů 19/20 (dolní část). Dva pohledy na stejný model jsou z úhlů přibližně 90° od sebe. Bílé šipky ukazují směr pohledu druhého obrázku.

Vzdálenost 19,1 A mezi skupinami karboxylové kyseliny chrysaminu G dobře odpovídá vzdálenosti 19,0 A mezi 5 řetězci (4 x 4,76 A mezi sousedními řetězci, Kirschner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 503 (1986)). Pokud nativní struktura Αβ obsahuje vlásenkové smyčky, jak naznačili Hilbich et al., (Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218: 149 (1991)), pak by měly řetězce 1 a 2, 3a 4, 5a6 atd. tvořit poloviny stejné molekuly, ale model by jinak měl být stejný. Také je důležité si povšimnout nutnosti pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků v tomto modelu, jako je lysin-16 v Αβ. Předchozí práce ukázaly, že vazba kongo červeně dobře koreluje s počtem aminokyselin s pozitivním nábojem ve vzorku amyloidových fibril. Klunk et al., J. Histochem. Cytochem.

37: 1273 (1989). Dvojvýběžkový charakter modelu uvedeného na obr. 7 a význam hydrofobních interakcí je podpořen snížením afinity jednovýběžkového anilinového analogu chrysaminu G a inaktivitou kyseliny salicylové, stejně jako zvýšenou účinností lipofilnějších sloučenin majících dva halogeny na benzidinové skupině (viz obr. 1). Význam téměř planární bifenylové skupiny je podporován inaktivitou derivátu kyseliny 2,2’-disulfonové,

Příklad 3: Chrysamin G rozlišuje mozek postižený

Alzheimerovou nemocí od normálního mozku

Charakterizace vazby chrysaminu G na AD mozek

Byla provedena Scatchardova analýza vazby chrysaminu G a derivátů chrysaminu G na vzorky AD mozku s cílem poznat zvýšenou vazbu chrysaminu G na AD mozek. (Obr. 4B, tabulka 1) . Za použitých podmínek vykazovaly kontrolní AD mozky jednu vazebnou složku. K_D v AD mozku byla o 16% nižší než v kontrolním mozku, ale rozdíl nebyl statisticky významný (p = 0,29) . B_max byla v AD mozku o 36% vyšší než B_max v kontrolním mozku, ale rozdíl opět nedosáhl statistické významnosti (p = 0,09). Proto se zdá, že zvýšená vazba v AD mozku je způsobena hlavně přítomností většího množství stejné vazebné složky, jaká existuje v kontrolním mozku, a nikoliv přítomností jiné složky.

Φ

Tabulka 1: Srovnání parametrů vazby v AD a kontrolních mozcích

	K_D (μΜ)	B_max (pmol/^g proteinu)
kontrola (n = 6)	0,47 ± 0,049	0, 576 ± 0,092
AD (n = 5)	0,39 ± 0,048	0,784 ± 0,061

Vazba CG na AD mozek signifikantně koreluje s počtem NP v asociačních kůrách mozkových. Obr. 8A ukazuje korelaci vazby [¹⁴C]CG s počtem NP v horní/střední frontální a horní temporální kůře AD mozku. Korelace s NP byla statisticky významná, ať byly použity kontroly ,(r = 0,69; p = 0,001) nebo ať byly posuzovány AD mozky samotné (r = 0,59; p = 0,007). Obr. 8B ukazuje podobné korelace pro počet NFT. Stejně jako pro NP byly korelace s NFT byla statisticky významné, ať byly použity kontroly (r = 0,60; p = 0,001) nebo ať byly posuzovány AD mozky samotné (r = 0,50; p = 0,026). Korelace s NFT není překvapivá, protože CG je derivát kongo červeně, která barví NFT. Počet NP signifikantně koreloval s počtem NFT (r = 0,82; p = 0,0001).

Pro mozky použité v této studii byla dostupná pouze kvalitativní data týkající se přítomnosti nebo absence amyloidové angiopatie, takže nemohla být provedena podobná korelace mezi vazbou CG a množstvím cerebrovaskulárního

i.....

amyloidu. Nezdá se, že by přítomnost amyloidové angiopatie byla současnou proměnnou v korelaci mezi vazbou CG a počtem NP. Obr. 8A ukazuje zlepšenou korelaci CG vazby s počtem NP v mozcích bez amyloidové angiopatie (r = 0,79; p = 0,01) ve srovnání s mozkyfe deposity cerebrovaskulárního amyloidu (r = 0,49; p = 0,15). Podobné zlepšení nebylo zjištěno pro korelaci s počtem NFT.

• ·

K_D pro vazbu [¹⁴C] chrysaminu G na AD mozek je podobná jako K_D pro vazbu [¹⁴C] chrysaminu G na syntetický Αβ in vitro, což naznačuje, že vazba v mozkových homogenátech může také představovat interakci s Αβ. Korelace vazby chrysaminu G s NFT může naznačovat, že chrysamin G se také v mozkových homogenátech váže na tyto struktury. Alternativně, protože počet NFT těsně koreluje s počtem NP, může být korelace vazby [¹⁴C] chrysaminu G na NFT pouze epifenoménem Vazby chrysaminu G na NP.

’ Použitelné zde uvedené deriváty nebo analogy chrysaminu G mají vazebné afinity, které jsou nejméně v rozmezí 0,01 až · 10,0 μΜ K_D, při měření pomocí vazby buď na syntetický Αβ peptid, nebo na mozkovou tkáň při Alzheimerově nemoci;

¹ sloučeniny s vyšší afinitou, které mají vazebné afinity v rozmezí od 0,0001 do 0,01 μΜ, jsou také použitelné ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem nemusí být vazba chrysaminu G specifická pro Αβ. Místo toho může vazba chrysaminu G odrážet celkový obsah amyloidu v mozku, který se skládá z agregovaných deposit Αβ v neuritických plácích a cerebrovaskulárního amyloidu. Deposita fosforylovaného tau * proteinu v NFT mohou také přispívat k vazbě chrysaminu G.

Goedert, M. et al., PNAS 85: 4051 (1988). NFT jsou také ^ÍSl složeny z antiparalelních fibril struktury beta-listu, které mají kvarterní strukturu podobnou vláknům Αβ. Kirschner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 503 (1986).

Celková a relativní vazba chrysaminu G odlišuje AD mozek od normálního mozku

Vazebné testy in vitro, jako jsou například testy zde popsané, jsou v oboru používány jako modely pro skríning sloučenin pro in vivo vazbu a pro předpovězení úspěšnosti v následných studiích in vivo zobrazení. Viz Young, A: et al., Receptor Assays: In Vitro and In Vivo. v POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY (Phelps, M., Mazziota, J., a Schelbert, H., vyd.) str. 73-111 (1986). Značený chrysamin G a deriváty chrysaminu G podle předkládaného vynálezu mohou být použity ve vazebných testech in vitro, které jsou popsány výše a dále, pro kvantifikaci deposit amyloidu v bioptických nebo nekroptických vzorcích.

Saturovatelná (specifická) vazba [^I4C] chrysaminu G byly pozorována jak pro homogenáty AD mozku, tak pro homogenáty kontrolního mozku a tvoořila 60-80% celkové vazby v AD mozku. Nesaturovatelná vazba byla velmi podobná v AD mozku a kontrolním mozku. Jak saturovatelná, tak celková vazba byla vyšší v AD mozku než v kontrolním mozku. I přes nižší sensitivitu získanou při použití celkové vazby je tento parametr více prediktivní v úspěchu v in vivo studiích, které jsou konečným cílem předkládaného vynálezu. Také pro rozšíření na in vivo studie je výhodné, aby byla vazba chrysaminu G na kortikální oblasti normalizována vzhledem k k oblastem mozku, ve kterých je vazba vazba chrysaminu G velmi podobná v AD i kontrolním mozku. Toto umožňuje vypuštění nutnosti počítat absolutní množství vazby, které je in vivo obtížně proveditelné. Vyšetřovali jsme vazbu v mozečku jako potenciální kontrolní oblasti, protože klasické NP se v této oblasti vyskytují mimořádně vzácně (Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309 (1989)).

Průměrné množství vazby [¹⁴C] chrysaminu G na kontrolní mozeček je téměř stejné množství vazby na AD mozeček (tabulka 2), což podporuje použití mozečku jako vnitřní kontroly.

Proto mozečkový poměr (CBR) přesně odráží absolutní množství navázaného [¹⁴C] chrysaminu G a má tu výhodu, že poskytuje vnitřní kontrolu pro každý mozek. Vazba je vyšší v AD mozku, • · · • · · · · · ať je vyjádřena v absolutních číslech ve ίιηοΐ/μς proteinu (tabulka 2), nebo jako poměr k vazbě na mozeček stejného mozku (tabulka 3). CBR je sensitivnější měření a vykazuje mezi mozky menší variabilitu. Použití celkové vazby a CBR značně usnadňuje použití těchto ex vivo výsledků v in vivo studiích. Proto jsou výsledky uvedené dále uvedeny v těchto hodnotách, kdykoliv je to možné.

Tabulka 2: Srovnání celkové vazby v AD a kontrolním mozku *

Oblast mozku	kontrola (CBR)	AD (CBR)	P
Frontální pól	0,87 ± 0,04 (n=6)	1,87 ± 0,25 (n=10)	p < 0,004
Horní/střední frontální	0,73 + 0,02 (n=8)	1,84 ± 0,18 (n=ll)	p < 0,001
Horní temporální	0,86 ± 0,08 (n=8)	1,63 ± 0,17 (n=ll)	p < 0,002
Hlava kaudata	0,95 ± 0,04 (n=4)	1,76 ± 0,31 (n=7)	p < 0,04
Dolní parietální	0,90 ± 0,08 (n=8)	1,93 ± 0,20 (n=ll)	p < 0,001
Okcipitální	0,77 ± 0,13 (n=8)	1,44 ± 0,20 (n=ll)	p < 0,02

* Kombinace AD mozků s nízkým a vysokým obsahem plaků

Tabulka 3: Srovnání celkové vazby v AD a kontrolním mozku jako poměr k vazbě na mozeček*

Oblast mozku	kontrola (fmol/Hg proteinu)	AD (fmol/gg proteinu)	P
Mozeček	75 ± 13 (n=8)	73 ± 9 (n=ll)	p = 0,91
Frontální pól	58 ± 8 (n=6)	124 ± 16 (n=10)	p < 0,006
Horní/střední frontální	54 ± 10 (n=8)	130 ± 21 (n=ll)	p < 0,005
Horní temporální	66 ± 17 (n=8)	121 ± 14 (n=ll)	p < 0,002
Hlava kaudata	73 ± 11 (n=4)	123 ± 22 (n=7)	p < 0,14
Dolní parietální	76 ± 13 (n=8)	137 ± 19 (n=ll)	p < 0,03
Okcipitální	64 ± 16 (n=8j	95 ± 12 (n=ll)	p < 0,15

* CBR pro každý mozek se získá dělením absolutní hodnoty vazby [¹⁴C] chrysaminu G v tomto vzorku absolutní hodnotou vazby [¹⁴C] chrysaminu G na vzorek mozečku stejného mozku. Hodnoty v tabulce jsou průměrné CBR z každé oblasti mozku (± SEM). Je uvedena kombinace AD mozků s nízkým a vysokým obsahem plaků.

Obr. 9A a 9B ukazují vazbu [¹⁴C] chrysaminu G na šest oblastí mozku normalizovanou na vazbu na mozeček stejného mozku. Vazba chrysaminu G na oblasti AD mozku mající více než 20 NP při zvětšení 200x, t.j. na AD mozek s vysokým obsahem plaků, je uvedena na obr. 9A. Vazba chrysaminu G na oblasti AD mozku mající méně než 20 NP při zvětšení 200x, t.j. na AD mozek s nízkým obsahem plaků, je uvedena na obr. 9B. Ve všech oblastech mozku je vazba na AD mozek statisticky významně vyšší než vazba na kontrolní mozek (viz tabulka 3).

V horní/střední kůře mozkové neexistuje přesah mezi kontrolou a jakýmkoliv AD vzorkem. Ve všech mozkových oblastech kromě

Φ okcipitální kůry mozkové neexistuje přesah mezi kontrolou a AD vzorkem majícím více než 20 NP při zvětšení 200x. V mozkových oblastech s nejmenší deposicí klasických NP, jako je okcipitální kůra mozková (a mozeček), byl pozorován největší přesah hodnot pro AD a kontrolu.

Obr. 9C ukazuje data od pacientů s Downovým syndromem. U všech pacientů s Downovým syndromem vznikají ve čtvrté dekádě věku deposita Αβ a umnoha z nich dochází k rozvoji AD. Wisniewsky et al., Neurology 35: 957 (1985); Schapiro et al., Neurobiol. Aging 13: 723 (1992). U obou těchto pacientů byla vazba [¹⁴C] chrysaminu G vyšší než u kontrol. Protože mladší pacient (věku 23 let) měl deposita amyloidu, ale nebyl klinicky dementní, tak obr. 9C naznačuje, že chrysamin G může detekovat odlišnosti od kontrol u nedementních pacientů, u kterých se později rozvine AD, dlouho před tím, než jsou klinicky jasné příznaky demence.

Sloučeniny a způsoby podle předkládaného vynálezu poskytují dvě použitelná měření pro rozlišení AD mozku od normálního mozku: (1) celkovou vazbu chrysaminu G (tabulka 2), nebo (2) poměr vazby chrysaminu G v dané oblasti mozku ku vazbě chrysaminu G na mozeček stejného mozku (tabulka 3).

Tato měření mají dvě hlavní výhody pro in vivo kvantifikaci AD neuritických plaků. Za prvé, tím, že je poskytnut prostředek pro měření celkové vazby na Αβ, spíše než pro měření specifické vazby na Αβ, může být způsobem podle předkládaného vynálezu provedena kvantifikace deposit Αβ bez nutnosti vystavení subjektu druhé injekci radioaktivního materiálu pro měření nespecifické vazby. Vzhledem k tomu jsou data vyjádřena pouze jako celková vazba. Ve všech provedených pokusech byla data specifické vazby pro AD a kontrolní mozek ještě více odlišná.

• 4 4 4 4 4 4 4 « · · 4 4444·· • · 4 · « • ··· ··· ···· 44 «4

Za druhé, rozdíly ve vychytávání derivátů chrysaminu G v mozku budou ovlivňovat absolutní koncentraci chrysaminu G v mozku. Budou proto nutné určité mechanismy pro započítání takových variací mezi jedinci. Každý pacient může být svou vlastní kontrolou, pokud se nalezne oblast mozku, která má málo deposit Αβ (t.j. pokusná čistá oblast). Protože se klasické NO mimořádně vzácně nalézají v mozečku (Joachim et al., Am. J. Pathol. 135: 309 (1989)), byla vazba chrysaminu G na mozeček použita jako kontrola pro každý studovaný mozek.

Výsledky byly vyjádřeny jako poměr vazby chrysaminu G v dané oblasti mozku ku vazbě chrysaminu G na mozeček stejného mozku (obr. 9 a tabulka 3).

Pro in vivo kvantifikaci amyloidu při AD je třeba brát v úvahu vliv mozkové atrofie. Proto musí být při použití chrysaminu G a derivátů chrysaminu G jako sond pro in vivo kvantifikaci amyloidu mozková atrofie korigována podle měření objemu provedeného MRI. Měření objemu pomocí MRI provedené ve způsobech podle předkládaného vynálezu jsou analogické k běžným vyšetřením. Viz Pearlson, G. and Marsh, L., MAGNETIC RESONANCE IMAGING IN PSYCHIATRY v Annual Review of Psychiatry (svazek 12), Oldham, J. et al., vyd., str. 347-381 (1993).

Proto bude způsob pro určení celkové radioaktivity na objem mozku využívat následující rovnice: ' celkový SPÉCT nebo PET signál z oblasti mozku A objem mozku určený MRI (s vyloučením CSF) v blasti mozku A

Při označení tohoto měření jako signál/objem pro mozkovou oblast A nebo S/V_A může být mozečkový poměr vyjádřen jako:

S/V_a

Poměr _A = -----S/Vc_B kde S/V_cb je signál/objem v mozečku stejného jedince během stejného zobrazovacího vyšetření. Tento poměr z jakékoliv mozkové oblasti jiné než mozečku od poacienta, u kterého je podezření na AD nebo jiný patologický stav charakterizovaný deposity amyloidu, může být srovnáván s normálními hodnotami analogického poměru pro stejné oblasti mozku ve skupině normálních kontrolních subjektů odpovídajícího věku. Poměr vazby na oblasti s největším množstvím deposit neuritických plaků k vazbě na mozeček může být použit jako parametr pro odlišení pacientů s Alzheimerovou nemocí od kontrolních pacientů.

Příklad 4: Koeficienty dělení mezi oktanol-vodu pro chrysamin G, deriváty chrysaminu G a kongo červeň

Koeficient dělení mezi oktanol-vodu měří relativní lipofilnost sloučeniny. U součenin s vyšší lipofilností je pravděpodobné, že budou lépe překonávat hematoencefalickou barieru. Viz Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vydání). Koeficient dělení mezi oktanolvodu je pro chrysamin G 60,22 ±3,97 a pro kongo červeň je 0,665 ± 0,037 (p < 0,001). Toto ukazuje, že chrysamin G je přibližně 90-krát lipofilnější než kongo červeň a proto je teoreticky pravděpodobnější, že bude překonávat hematoencefalickou barieru. Koeficient dělení mezi oktanolvodu je pro 3-jod- a 3,3'-dijod- deriváty chrysaminu G (obr. 1) 72,53 ±0,74 a 112,9 ±7,3, v příslušném pořadí. Tyto koeficienty dělení mezi oktanol-vodu ukazují, že tyto deriváty, které jsou neradioaktivními analogy některých radioaktivně značených derivátů chrysaminu G použitých pro in vivo studie, jsou až 170-krát lipofilnější než kongo červeň a až dvakrát lipofilnější než chrysamin G. Tyto koeficienty naznačují, že tyto deriváty budou vstupovat do mozku lépe než kongo červeň I chrysamin G.

Příklad 5: Schopnost chrysaminu G a derivátů chrysaminu G překonávat hematoencefalickou barieru a metabolismus chrysaminu G

Použití sond pro amyloid pro diagnostiku AD in vivo vyžaduje, aby byly tyto sondy schopny překonávat hematoencefalickou barieru a aby se dostaly do kontaktu s deposity amyloidu.

Schopnost chrysaminu G překonávat hematoencefalickou barieru byla studována na Swiss-Webster myších. Po i.v. injekci'byl poměr mozek/krev měřený v 15 minutě vyšší než 10:1 a.ve 35 minutě dosáhl 20:1 (obr. 10). Radiaktivita v mozku zůstávala během tohoto období relativně konstantní, ale snižovala se v krvi a zvyšovala se v játrech. Poměr mozek/ledviny byl nejvyšší v 15 minutě (během vyšetřované doby) a dosáhl hodnoty 0,5. Při extrakci mozku a jater v 60 minutě po i.v. injekci [¹⁴C]chrysaminu G bylo >95% zpětně získané radioaktivity eluováno současně s chrysaminem G při HPLC s reversní fází, což ukazuje, že nedošlo během tohoto období k žádnému významnému metabolismu chrysaminu G.

Chrysamin G se dostává do mozku normálních myší a poměr mozek/krev je vysoký. Radioaktivita v mozku zůstává relativně konstantní během prvních 30 minut, zatímco v krvi se snižuje a v játrech se zvyšuje. Tyto data naznačují, že vysoký poměr mozek/krev je spíše důsledkem účinného odstraňování chrysaminu G z krve játry, než další akumulací v mozku. Bylo zjištěno, že v 60 minutě je v podstatě veškerá radioaktivita zjištěná v mozku a játrech nezměněný chrysamin G. Kongo červeň nepřekonává hematoencefalickou barieru dobře. Tubis et al., J. Amer. Pharm. Assn. 49: 422 (1960). Většina kongo červeně je vychytávána v játrech a slezině a poměr mozek/ledviny zjištěný u morčat je přibližně 0,07. Tubis et al., výše. Chrysamin G je také vychytáván v játrech, ale více přechází do mozku.

» ·

Testy na zvířatech in vivo jsou dalším základem pro určení dávky, účinnosti přechodu přes hematoencefalickou barieru a vazebné schopnosti. Pro tento účel je zejména výhodný model transgenní myši, který popsal Games et al., Nátuře 373: 532527 (1995) nebo Hsiao et al., Science 274: 99-102 (1996) a senilní zvířecí model pro mozkovou amyloidosu; t.j. zvířata jako jsou transgenní myši nebo psi nebo opice vysokého věku, o kterých je známo, že u nich dochází ke vzniku různého počtu mozkových neuritických plaků Alzheimerova typu, viz Wisniewsky et al., J. Neuropatol. and Exp. Neurol. 32: 566 (1973); Selkoe et al., Science 235: 873 (1987, jsou testována na vazbu a účinnost detekce. Tento in vivo test vyžaduje kontrolní bioptické nebo nekroptické sledování pro potvrzeníá a kvantifikaci přítomnosti amyloidových deposit.

Jiné vhodné zvířecí modely pro použití v testování způsobů a sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou vytvořeny transgenní technikou. Například, Quon et al., Nátuře 352: 239-241 (1991) použiti inhibiční doménu promotoru krysí neuron-specifické enolasy pro přípravu transgenních myší. Viz též Wirak et al., Science 253: 323-325 (1991). Ještě jiné modely byly připraveny intrakraniálním podáním β/Α4 peptidu přímo zvířatům (Tate et al., Bull. Clin. Neurosci. 56: 131139 (1991) .

Je třeba si uvědomit, že žádný z in vivo zvířecích modelů nemůže být považován za mimořádně dobrý model pro AD neuropatologii. Místo toho tyto modely více odpovídají ukládání amyloidu během normálního stárnutí. Toto platí zejména pro modely savců vysokého věku. Všechny tyto modely vykazují převahu difusních plaků, jak byla popsána výše pro model starých psů. Zatímco v těchto modelech existuje nějaký cerebrovaskulární amyloid, je v nich pouze malé množství neuritických plaků, s výjimkou modelu transgeních myší (Games et al., a Hsiao et al.). Jiné modely transgenních myší často

BSSGttobsahují pouze difusní plaky. Proto, ačkoliv mohou být tyto modely užitečné pro studium distribuce sond v mozku, je zde pouze malá pravděpodobnost, že budou vykazovat stejné kvantitativní odlišnosti, jaké jsou předpokládány pro AD mozky na základě in vitro studií vazby chrysaminu G na AD mozky, které byly uvedeny výše.

Hodnocení schopnosti alkylových, alkenylových nebo alkrnylových derivátů chrysaminu G překonávat hematoencefalickou barieru u člověka

Vhodně radioaktivně značený derivát chrysaminu G se specifickou aktivitou přibližně 500 Ci/mol nebo vyšší je injikován intravenosně v dávce přibližně 10 mCi normálním jedincům a jedincům se suspektní AD a je provedeno sledování pomocí SPÉCT nebo PET zobrazení pro analyzování detekovatelnosti derivátu v mozku ve srovnání s jinými orgány a pro definování časového průběhu detekovatelnosti v mozku. Dávka, která může být spolehlivě detekována, je označena jako zobrazovací účinná dávka.

Hodnocení alkylových, alkenylových a alkrnylových derivátů chrysaminu G v rozlišení AD a kontrol odpovídající věku u člověka

Zobrazovací účinná dávka vhodně radioaktivně značeného derivátu chrysaminu G je injekčně podána jedinci, u kterého se předpokládají deposita amyloidu v mozku způsobená patologickým stavem jako je AD. Po době 15 minut až 24 hodin je detekován radioaktivní signál z mozku pomocí PET nebo SPÉCT. Radioaktivita je simultá^ě detekována ve všech oblastech mozku pokrytých detektorem. Tato plocha bude nastavena tak, aby pokrývala většinu mozečku, horní temporální kůry mozkové, střední/horní frontální kůry mozkové, a vmezeřených oblastí mozku. Před studií je provedeno MŘI vyšetření, takže může být ve vybraných

oblastech provedena korekce pro mozkovou atrofii, způsobem uvedeným v příkladu 3. Vypočítají se proměnné S/V_A, S/V_CB a Poměr_A (viz příklad 3) a srovnají se s analogickými normativními poměry získanými dříve od normálních kontrolních jedinců odpovídajícího věku.

Příklad 6: Histologická lokalizace vazby alkenylového derivátu chrysaminu G na amyloid

Horní část obr. 11 ukazuje lidský AD mozek barvený 1,4bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)benzenem. Metoda barvení byla metoda podle Stokes and Trickey, J. Clin.

Pathol. 36: 241-242 (1973), se substitucí 1,4-bis(2-(3karboxy-4-hydroxyfenyl)ethen-l-yl)benzenu za kongo červeň. Toto barvení je mnohem intenzivnější než barvení chrysaminem G, kongo červení nebo thioflavinem S. Snadno může být identifikováno množství amyloidových plaků a neurofilních vláken, stejně jako neurofibrilární síť. Spodní fotografie na obr. 11 ukazují řez mozkem transgenní myši (Tg(HuAPP695.SWE) 2576; Hsiao et al., Science, 274: 99-102 (1996)) barvený

1,4-bis(2-(3-karboxy-4-hydroxyfenyl).ethen-l-yl)-benzenem. Denzní amyloidové plaky jsou intenzivně nabarveny. Cerebrovaskulární amyloid se také intensivně barví jak v myším, tak v lidském mozku (data nejsou uvedena).

Příklad 7: Hodnocení toxicity alkylových, alkenylových a alkf nylových derivátů chrysaminu G

Při dávkách 10 a 100 mg/kg neradioaktivního chrysaminu G podaných intraperitoneálně nebyly u myší během 72 hodin pozorovány žádné změny chování ani toxicita. Dávky [¹⁴C]chrysaminu G byly v řádech 1 mg/kg.

Zdá se, že chrysamin G má malou akutní toxicitu, podle pokusů provedených pro stanovení LD₅₀. I při maximálním objemu, který může být myším injikován bez škodlivých účinků • · · ·· ··* • · · * ·«·*···· • · · · · samotného objemu (přibližně 0,025 ml/g), nasyceného roztoku chrysaminu G injikovaném myším (100 mg/kg) nybyly během 72 hodin (nejdelší testované období) pozorovány změny chování. Dáv ky nutné pro detekci radioaktivně značených derivátů pomocí SPÉCT nebo PET budou o řád nižší než tyto dávky.

Kongo červeň může být bezpečně injikována člověku v dávkách mnohem vyšších, než jsou dávky použité pro radioaktivně značené deriváty chrysaminu G. LD₅₀ pro kongo červeň byla pro myši stanovena na 190 mg/kg (Tubis et al., J. Amer. Pharm. Assoc. 49: 422 (1960)), což je podobné jako LD₅₀>100 mg/kg, která byla stanovena pro chrysamin G. Proto mají tyto dvě chemicky podobné sloučeniny podobně nízkou toxicitu u myší.

Jiné alkylové, alkenylové nebo alkinylové deriváty chrysaminu G mohou být podobně testovány na toxicitu u myší a jiných savců pomocí injekce různých koncentrací a sledování různých známek toxicity u zvířat, za použití dobře známých technik. Viz Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. vydání).

Příklad 8: Hodnocení schopnosti chrysaminu G chránit před toxicitou způsobenou Αβ (25-35)

Chránění PC-12 buněk před toxicitou indukovanou Αβ (25-35)

Buňky krysího feochromocytomu (PC-12) byly kultivovány v RPMI 1640 mediu s 10% fetálním hovězím sérem. Přibližně 5000 exponenciálně rostoucích buněk bylo umístěno v 96-jamkových plotnách v objemu 100 μΐ media a provedla se inkubace při 37 °C přes noc. Αβ(25-35), který byl předem agregován při 37 °C po dobu 7 dnů, byl pre-inkubován s chrysaminem G (CG) nebo příbuznou sloučeninou ve vodném roztoku před přidáním 20 μΐ pro dosažení uvedených konečných koncentrací (0,01 - 10 μΜ

Αβ (25-35) a 0, 03 - 20 μΜ CG) . Buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin před přidáním 13,3 μΐ 5 mg/ml MTT (3, (4,5dimethylthiazol-2-yl)2,5-difenyltetrazoliumbromi) ve sterilním fosfátem pufrovaném salinickém roztoku. Po 4,5 hodinách při 37 °C se přidalo 100 μΐ extrakčního pufru (20% hmot./obj. SDS v 50% DMF/vodě, pH upraveno na 4,7 pomocí 2,5% 80% kyseliny octové a 2,5% IN Hel) a plotny se inkubovaly přes noc. Hansen et al., J. Immunol. Methods 119: 203 (1989). Vývoj barvy byl měřen při 560 nm. Maximální životaschopnost byla definována jako absorbance kontrolních jamek, do kterých bylo přidáno pouze 20 μΐ destilované, deionizované H₂0. Maximální toxicita byla definována jamkami, ve kterých byly buňky lyžovány přidáním 0,1% (konečná konentrace) Triton-X100.

Inkubace PC12 buněk s Αβ (25-35) vedla ke snížení schopnosti těchto buněk redukovat MTT, které bylo závislé na koncentraci (obr. 12). Obr. 12 ukazuje vliv zvyšujících se koncentrací Αβ (25-35) za přítomnosti nebo nepřítomnosti chrysaminu G na buněčnou redukční aktivitu PC12 buněk, jak je měřena redukcí MTT. Absorpce produktu redukce MTT při 560 nm je uvedena v grafu na svislé ose. Vliv Αβ (25-35) samotného je ukázán ve plných sloupcích a ukazuje snížení redukce MTT závislé na dávce. Statisticky významné rozdíly od kontrol (bez Αβ, bez chrysaminu G) jsou ukázány čísly v plných sloupcích. Protektivní vliv 20 μΜ chrysaminu G je ukázán v prázdných sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi MTT redukcí za přítomnosti a za absence chrysaminu G jsou uvedeny čísly v prázdných sloupcích.

Obr. 13 ukazuj# . protektivní vliv zvyšující se koncentrace chrysaminu G na Αβ (25-35)-indukovanou buněčnou redukční aktivitu PC-12 buněk. Vliv chrysaminu G za absence

Αβ (25-35) je uveden ve šrafovaných sloupcích. Nebyly

pozorovány signifikantní rozdíly mezi kontrolou (bez Αβ(2535), bez chrysaminu G) a jakýmikoliv koncentracemi chrysaminu G za absence Αβ(25-35). Redukce MTT za přítomnosti 1 μΜ Αβ (25-35) a zvyšujících se koncentrací chrysaminu G je uvedena v prázdných sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi MTT redukcí za přítomnosti a za absence Αβ (25-35) při každé koncentraci chrysaminu G jsou uvedeny čísly ve šrafovaných sloupcích. Signifikantní rozdíly mezi MTT redukcí mezi Αβ(2535) kontrolou (bez chrysaminu G) a Αβ (25-35) plus zvyšující se koncentrace chrysaminu G jsou uvedeny čísly v prázdných sloupcích.

Jak bylo popsáno dříve, kongo červeň chrání před toxicitou indukovanou Αβ při koncentracích vyšších než 2 μΜ, s dosažením kompletní ochrany při 20 μΜ. Burgevin et al., NeuroReport 5: 2429 (1994); Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 12243 (1994); Pollack et al., Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack et al., Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Chrysamin G má protektivní účinek, který je závislý jak na koncentraci Αβ (25-35) (obr. 12), tak na koncentraci chrysaminu G (obr. 13). Protektivní účinek chrysaminu G je zřetelný při 0,2 μΜ, což je koncentrace velmi blízká Ki chrysaminu G pro vazbu na syntetický Αβ, 0,37 μΜ (obr. 1) . Chrysamin G se zdá být účinejší než kongo červeň a vykazuje účinnost v rozmezí od 0,1 do 1,0 μΜ. Toto odpovídá ^hodnotám Ki pro.vazbu na syntetický Αβ, které jsou 0,37 μΜ pro chrysamin G a 2,8 μΜ pro kongo červeň (obr. 1).

V jiném pokusu (obr. 14) byl hodnocen vliv chrysaminu G a fenolového derivátu (viz obr. 1), který se neváže na Αβ, na buňky inkubované s 1 μΜ Αβ (25-35). Chrysamin G vykazoval protektivní účinky při 0,1 a 1 μΜ, ale fenolový derivát ·· · • 0 «0 • · · nevykazoval žádné protektivní účinky a snad zvyšoval toxicitu

Αβ.

Tyto výsledky naznačují, že lipofilní derivát kongo červeni, chrysamin G, brání cytotoxicitě indukované Αβ v buněčné kultuře v koncentracích velmi podobných koncentracím, při kterých se váže na Αβ. Tato ochrana vykazuje strukturální specificitu, protože fenolový derivát, který se neváže na syntetický Αβ, také nebrání cytotoxicitě indukované Αβ. Protože chrysamin G proniká dobře do mozku, jsou tyto výsledky důkazem, že chrysamin G a deriváty chrysaminu G vážící se na Αβ mají terapeutický,potenciál při léčbě AD.Mechanismus ochranného účinku chrysaminu G je dosud neznámý. Existují dvě obecné možnosti. Za prvé může chrysamin G interferovat s agregací Αβ. Za druhé může chrysamin G interferovat s účinky (přímými nebo nepřímými) Αβ na cílové buňky. Kongo červeň neinhibuje agregaci TIB, stejně jako nebrání toxickým účinkům agregovaného Αβ. Lorenzo and Yankner, Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 12243 (1994)'.

Interference s agregací je ve výše uvedeném pokusu nepravděpodobná, protože Αβ byl pre-agregován před inkubací s chrysaminem G. Proto může být inhibice agregace prokázána jako víznamný terapeutický účinek chrysaminu G, ale není pravděpodobné, že by vysvětlovala ochranné, účinky chrysaminu G před pre-agregovaným Αβ. Model vazby chrysaminu G na Αβ popsaný na obr. 7 ukazuje, jak může chrysamin G potáhnout povrch Αβ. Toto může změnit rozpoznávání fibrilární deposit receptory buněčného povrchu a jinými makromolekulami, jako jsou proteiny komplementu, a interferovat s toxickými vlivy Αβ, které mohou být zprostředkovány těmito makromolekulami.

Je pravděpodobné, že chrysamin G a kongo červeň mají mnohotné účinky, jak před, tak po agregaci Αβ. Toto je výhodné z terapeutického hlediska, protože je pravděpodobné, že ·· • · ·*·« ··· * ·· ·· ·· ·· · · « ·· · • · · · · · • · · ··· ··· • · · · • ♦ · ···· ·« ·· pacienti budou v období, kdy se u nich budou vytvářet Αβ agregáty, stejně tak jakou budou mít deposita amyloidu.

Claims

Patentové nároky ( fJi

1. Sloučenina, která se váže na amyloid, mající vzorec I, nebo její netoxické sůl rozpustná ve vodě:

^R2 ^R1^R1 ^R2 ^R2 x^X\ ^R2

Q—zQz—q q—zQz—θ—Q— zQz— Q

R2 RíRjl R2

Q—zQz-<>-zOz—Q

0—ZQZzQz—Q nebo ^R2 ^R2

TT

K₂ K₂ kd^eZ^~^Z je jeden ze skupiny zahrnující C=C, CR'=CR', CR'₂-CR'₂, C=C-C=C, CR'= CR'- CR' = CR', C=c- CR' = CR' nebo CR'₂- CR'₂~ CR'₂- CR'₂ (kde každý R' je nezávisle H nebo nižší alkyl);

X je C(R)₂ (kde každý R'' je nezávisle H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nGR', kde n = 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂CH₂F, ch₂-ch₂-ch₂f, 0-CH₂-CH₂-CH₂F, CN, (C=O)-R', N(R')₂, no₂, (C=0)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR' , R_ph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂CR'₂-R_Ph (kde Rph představuje nesubstituovanou nebo substituovanou fenylovou skupinu, ve které jsou substituenty vybrány z jakýchkoliv nefenylových substituentů definovaných pro R'', tri-alkylcínu, tetrazolu nebo oxadiazolu vzorce:

'3

9 9 ·

9.9 «»

R’ kde R' je H nebo nižší alkyl) nebo X je CR'=CR', N=N, C=O, O, NR' (kde R' je H nebo nižší alkyl) , S nebo SO₂;

·>

každý Ri a R₂ je je nezávisle H, F, Cl, Br, I, nižší alkyl, (CH₂)_nOR' , kde n = 1, 2 nebo 3, CF₃, CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂F, CH₂CH₂-CH₂F, O-CH₂-CH₂-CH₂F, CN, (C=O) -R' , N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR', trialkylcín, R_ph, CR'=CR'-R_Ph, CR'₂- CR' ₂-Rph (kde R_ph představuje nesubstituovanou nebo substituovanou fenylovou skupinu, ve které jsou substituenty vybrány z jakýchkoliv ne.f enylových substituentů definovaných pro R_x a R₂, tetrazolu nebo oxadiazolu vzorce: