CZ330297A3 - Terapie arteriovenózními a venozními štěpy: způsoby a přípravky - Google Patents
Terapie arteriovenózními a venozními štěpy: způsoby a přípravky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ330297A3 CZ330297A3 CZ973302A CZ330297A CZ330297A3 CZ 330297 A3 CZ330297 A3 CZ 330297A3 CZ 973302 A CZ973302 A CZ 973302A CZ 330297 A CZ330297 A CZ 330297A CZ 330297 A3 CZ330297 A3 CZ 330297A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- oligonucleotides
- antisense
- tissue
- procollagen
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 302
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 152
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims abstract description 100
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 59
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 108010087776 Proto-Oncogene Proteins c-myb Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000009096 Proto-Oncogene Proteins c-myb Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 160
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 160
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 124
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 116
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 claims description 114
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 112
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 claims description 100
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 94
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 74
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 40
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 claims description 36
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 35
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 33
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 30
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 28
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 28
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 claims description 27
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 claims description 27
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims description 26
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 24
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 claims description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 19
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 claims description 18
- 230000003890 fistula Effects 0.000 claims description 18
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- -1 L-myc Proteins 0.000 claims description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 13
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 230000037390 scarring Effects 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 8
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 8
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 8
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 8
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 6
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 claims description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims description 3
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 claims description 2
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims 2
- 235000010676 Ocimum basilicum Nutrition 0.000 claims 2
- 240000007926 Ocimum gratissimum Species 0.000 claims 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 claims 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 claims 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 8
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 36
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 230000009471 action Effects 0.000 description 23
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 23
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 21
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 20
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 20
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 19
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 19
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 19
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 19
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 19
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 19
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 18
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 18
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 14
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 13
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 12
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 10
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 10
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 10
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 7
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 7
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 7
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 7
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 6
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 6
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010087705 Proto-Oncogene Proteins c-myc Proteins 0.000 description 5
- 102000009092 Proto-Oncogene Proteins c-myc Human genes 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 5
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 5
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 5
- 206010003226 Arteriovenous fistula Diseases 0.000 description 4
- 108091028690 C-myc mRNA Proteins 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 101500027983 Rattus norvegicus Octadecaneuropeptide Proteins 0.000 description 4
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- WZSUOQDIYKMPMT-UHFFFAOYSA-N argon krypton Chemical compound [Ar].[Kr] WZSUOQDIYKMPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 4
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 238000013310 pig model Methods 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-FXLFCPKBSA-N (2S)-(214C)azolidine-2-carboxylic acid Chemical compound N1[14C@@H](CCC1)C(=O)O ONIBWKKTOPOVIA-FXLFCPKBSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 3
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 3
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 230000008321 arterial blood flow Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108700021031 cdc Genes Proteins 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000037333 procollagen synthesis Effects 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 3
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 2
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004079 Prolyl Hydroxylases Human genes 0.000 description 2
- 108010043005 Prolyl Hydroxylases Proteins 0.000 description 2
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091061750 Signal recognition particle RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 2
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229930185229 antidesmin Natural products 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-N dihydroxy-selanyl-selanylidene-lambda5-phosphane Chemical class OP(O)([SeH])=[Se] PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 2
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 108700021654 myb Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- WTFUTSCZYYCBAY-SXBRIOAWSA-N 6-[(E)-C-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-N-hydroxycarbonimidoyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C/C(=N/O)/C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 WTFUTSCZYYCBAY-SXBRIOAWSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150012716 CDK1 gene Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010048631 Coronary artery dissection Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 101000702579 Crotalus durissus terrificus Snaclec crotocetin Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 101000614355 Dictyostelium discoideum Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 101100059559 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) nimX gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006570 Euonymus japonicus Species 0.000 description 1
- 208000035874 Excoriation Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 240000001973 Ficus microcarpa Species 0.000 description 1
- 229920000544 Gore-Tex Polymers 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100030477 Plectin Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108010018070 Proto-Oncogene Proteins c-ets Proteins 0.000 description 1
- 102000004053 Proto-Oncogene Proteins c-ets Human genes 0.000 description 1
- 108010001859 Proto-Oncogene Proteins c-rel Proteins 0.000 description 1
- 102000000850 Proto-Oncogene Proteins c-rel Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282890 Sus Species 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000006906 Vascular Ring Diseases 0.000 description 1
- 206010048671 Venous stenosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 101100273808 Xenopus laevis cdk1-b gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000002945 adventitial reticular cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009246 art therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 150000008107 benzenesulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGSPXMVUFBBBMO-UHFFFAOYSA-N beta-aminopropionitrile Chemical compound NCCC#N AGSPXMVUFBBBMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000269 carotid artery external Anatomy 0.000 description 1
- 210000004004 carotid artery internal Anatomy 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000003098 cholesteric effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004141 dimensional analysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- XTGGILXPEMRCFM-UHFFFAOYSA-N morpholin-4-yl carbamate Chemical compound NC(=O)ON1CCOCC1 XTGGILXPEMRCFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000024717 negative regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001691 poly(ether urethane) Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102220301843 rs1554745695 Human genes 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K selenophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=[Se] JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N selenophosphoric acid Chemical class OP(O)([SeH])=O JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002832 shoulder Anatomy 0.000 description 1
- 238000013424 sirius red staining Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000015590 smooth muscle cell migration Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002943 spectrophotometric absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003444 succinic acids Chemical class 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid group Chemical class S(N)(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 208000014001 urinary system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001604 vasa vasorum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 230000004865 vascular response Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Terapie arteriovenózními a venózními štěpy: způsoby a přípravky
Křížové odkazy na příbuzné přihlášky, Tato přihláška je pokračováním PCT Přihlášky US94/11853 pro Spojené státy ze 17. října 1994, zde zahrnuté v odkazu, která je pokračováním přihlášky 08/138,637 z 15. října 1993, zde zahrnuté v odkazu.
Oblast techniky
Vynález se obecně týká oligonukleotidů a jejich použití jako terapeutických činidel, zejména použití oligonukleotidových antisensních a antigenových látek k inhibici syntézy proteinů extracelulámí matrice, zejména fibroblastů a buněk hladkého svalstva.
RQsa.vadjtii.siav techniky
Arteriovenózní shunty a pištěle poskytují místa hemodialyzačního přístupu v oběhovém systému hemodialyzováných pacientů. Naneštěstí arteriovenózní shunty a pištěle po čase selhávají, což vede k vážným lékařským komplikacím pro více než 300 000 hemodialyzovaných pacientů ve světě (Newman, G.E., in Vascular Disease: Surgicaí and Interventíonal Therapy, E. . Strandness, Ed. (1994)). Podle studií 12 až 45 % arteriovenózních shuntu a pištěli během prvního roku selhává (Newman, G.E., (1994), zde citovaný). Hlavním důvodem pro selhání přístupového místa je progresivní venózní stenosa (Sedberg et al., Circulation 80, 1726-1736 (1989)). Disfunkční hemodialyzační přístupová místa nebo místa po selhání vyžadují lékařskou terapii, buď chirurgické nahrazení arteriovenózního shuntu, nebo transkatetrovou intervenci (tzn. balónkovou angioplastiku nebo stent) ke zvětšení cévy vycházející ze shuntu nebo pištěle (Newman, G.E., (1994), zde citovaný). Chroničtí hemodialyzovaní pacienti s komplikací arteriovenózního shuntu a pištěle tráví pro udržení průchodnosti přístupových míst přibližně 30 dní v roce v nemocnici.
Hemodialyzační přístupová místa jsou známa jako “Achilova pata” hemodialyzovaných pacientů, i když je konstrukce arteriovenózního shuntu nebo pištěle pro hemodialýzu nezbytná.
Arteriovenózní shunty a pištěle jsou obyčejně konstruovány jako Brescia-Ciminovy arteriovenózní pištěle nebo polytetrafluorethylenové (PHE, Gor-Tex™) štěpy. Ve většině případů je žíla chirurgicky spojena s arterii, buď přímo, nebo nepřímo prostřednictvím PTTE štěpu, v oblasti předloktí, v oblasti ramene, nebo v oblasti stehenní.
I • a · · « ♦ « ♦ a · • * »
* · *
Arteriovenózní píštěie jsou pouze jedním příkladem arteriovenózních štěpů, které během doby progresivně selhávají. Jiné typy štěpů (např. venózních štěpů), které vedou k nutnosti lékařského zákroku, jsou aortokoronámí bypassové Štěpy, karotické štěpy, iliofemorální Štěpy a fermoropopliteální štěpy. V těchto štěpech je segment žíly umístěn v arteriálním systému. Jedním z převažujících lékařských stavů týkajících se arteriovenózních Štěpů všech typů nebo venózních štěpů umístěných v arteriálním systému, je pokles vnitrního průměru cévy s časem. To se obvykle vyskytuje v existující žíle, nebo v štěpu tvořícím část těla žíly (zde nazývané “žílová doména” štěpu). Předpokládá se, že vystavení žíly vysokému arteriálnímu tlaku mění morfologii žíly; v průměru klesá zejména vnitřní průměr žílové domény štěpu. Štěp také trpí trombózou a dalšími poruchami, jako např. infekcí.
Dříve než se předložil tento vynález, mely terapie arteriovenózních a venózních štěpů omezenou účinnost a většinou vyžadovaly invazivní terapie. Snaha se zaměřila na mechanické zvětšování vnitrního průměru Štěpu v průřezu se zesílenými stěnami cév, jako v místech selhání hemodialyzacního přístupu. Jiné způsoby se jednoduše spoléhají na chirurgickou revizi místa selhání štěpu, jako pri nahrazení arteriovenózního shuntu. Tyto typy terapie podle dosavadního stavu techniky vyžadují značný lékařský dozor, často vyžadují hospitalizaci a v případě některých přístupových hemodialyzačních míst mohou vést k neschopnosti nalézt vhodné přístupové místo pro hemodialýzu, jak se zde uvádí.
Několik studií zaměřených na morfologii žil v selhávajících štěpech, jako arteriovenózní štěpy a venózní Štěpy (např. aortokoronámí bypassy) poskytlo informace o pathomechanismu těchto poruch. Tenkostěnňé žíly odpovídají brzy na vystavení arteriálnímu krevnímu průtoku a tlaku. Žíla začíná vyvíjet neointimu. Odpověď na vysoký arteriální tlak a průtok neodvratně vede ke značnému zúžení lumene, což způsobuje sníženou průchodnost žíly. Buňky hladkého svalstva cév se primárně nacházejí v medii a neointimě. Fibroblasty se nacházejí v adventicii a perivaskulámí tkáni. Fibroblasty přispívají ke granulaci perivaskulámí tkáně během opravy poranění žíly. Jako odpověď na zranění, jak buňky hladkého svalstva, tak fibroblasty zvyšují syntézu proteinů matrice ve stěně cévy a perivaskulámí tkáni. Následně se žíla zužuje a stává se ztuhlejší kvůli zesílení stěny cévy při vzniku jizvy v perivaskulámí tkáni, což vede k nevratnému selhání štěpů, jako v případě arteriovenózních trubic nebo venózních štěpů.
Nepřiměřená syntéza proteinů extracelulámi matrice a/nebo syntéza aberantnich forem těchto proteinů je spojena se širokým spektrem škodlivých stavů, včetně vzácných dědičných chorob stejně jako obecně získaných poruch, jako ztráta průchodnosti artenovenózních a i
4» * · venózmchŠtěpů (Sedberg etal, Circulation 80, 1726-1736 (1989)), fibrotická kožní choroba,
- · pulmonámí-fibrosa, psteoarthritida, vaskulární rěstenosa, a podobně (Wěisš^ Jáyšon/Editors,“ - ·> Collagen in Health and Disea.se. Churchill Livingstone, Edinburgh, 1982; Gardner, Editor, · Pathological Basis of the Connective Tissue Diseases,Lea & Febiger, Philadelphia, 1992). ’
Extracelulární matrice se skládá primárně z kolagenů, proteoglykanů, elastinu a fíbronektinu. J±^±^W£ho^z těchto stavů je spojeno s velice komplexními biologickými odpověďmi na fyzikální, chemická á/nebó biologická poranění. Takové odpovědi zahrnují přoliféračiámigraci-···»*»· =¾ tůzných typů buněk a syntézu růstových faktorů, které přispívají k odpovědi nebojí modifikují. Vaskulární poruchyJako na priklad atheroskleróza aryaskulární restenosa, jsou spojenvis lokální proliferací a migrací buněk, stejně jako produkcí několika tříd strukturálních proteinů a mnoha i růstových faktorů, včetně růstového faktoru odvozeného od destiček (PDGF), základního fibroblastového růstového faktoru, faktoru ά tumorové nekrosy, interleukinu-1, prostaglandinů a různých protoonkogenů (Ross, Nátuře, 362,801-809 (Í993)/Morishita et al, Proč. Nati. Acad: Sci., 90, 8474-8478 (1993)). Přesná role těchto faktorů v různých chorobných procesech není ·.
~ ;.......
Ohromný ekonomický dopad poruch spojených s nepřiměřenoůsyňtězďu ' proteinů extracelulární matrice, zejména vaskulárních poruch, posloužil jako silný hybný moment pro vývoj
chorob, stejně jako v jiných, kde stav choroby je spojen se zřejmou nepřiměřenou expresí endogenního genu, poskytuje mnoho výhod použití tak zvaných antisensních sloučenin (Milligan et al., J. Med Chem., 36, 1923-1937 (1993); Uhlmánn, Peyman, ChemicaÍReviews, 90, 543-584 (1990); Goodchild, Bioconjugate Chemistry, !, 165-187 (1990); Crooke, Ann. Rev. Pharmacol
Toxicol.,, 32, 329-376 (1992); Stein et al. Science, 261,1004-1012 (1993) a tak podobně).
Zvláštní výhoda antisensního přístupu je ta, žé není nutno provádět vyhledávácí kroky pro identifikaci kandidátských sloučenin schopných se navázat na terapeutický cíl. Pokud je známo, že nepřiměřená exprese genu způsobuje chorobu, na kterou je hledán lek, pak struktury l
kandidátských antisensních léčiv jsou automaticky určeny podle nukleotiďové sekvence nepřiměřeně exprimovaného genu. Je zapotřebí pouze vytvořit oligonukleotid nebo jeho analog schopný vytvořit stabilní duplex nebo triplex s genem, nebo asociovaným cílovým polynukleptidem, založený na Watson-Crickově, respektive Hoogsteenově párování. Je vidět, že vynález není limitován na zvláštní mechanismus působení. Specificky navázaná antisensní sloučenina buď způsobuje že cíle jsou náchylnější enzymové degradaci, nebo blokuje translaci * · · » ř v • v nebo procesování, nebo jinak blokuje či inhibuje funkci cílového polynukleotidu.
Bylo by velmi výhodné, kdyby byly identifikovány jednotlivé geny, které se vztahují k syntéze strukturálních proteinů jako kolagenu, které přispívají k chorobným stavům. Taková ¥ identifikace by okamžité vedla k nadějné antisensní terapii mnoha poruch spojených s nepřiměřenou syntézou proteinů.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje způsob terapie poruch spojených s nepřiměřenou syntézou extracelulámí matrice, zejména kolagenu. Způsob zahrnuje administraci jedinci, potřebnému takové terapie, efektivního množství jednoho nebo více antisensních oligonukleotidu specifických pro jaderné protoonkogeny. Jak je definováno níže, “antisensní oligonukleotid specifický pro jaderný protoonkogen” je oligonukleotid o sekvenci (i) schopné tvont stabilní duplex s doménou mRNA transkriptu jaderného protoonkogenu nebo genu buněčného cyklu, nebo (ii) schopné tvořit stabilní triplex s doménou mRNA transkriptu jaderného protoonkogenu nebo genu buněčného cyklu. S výhodou antisensní oligonukleotidy podle vynálezu tvoří stabilní duplexy s doménami mRNA transkriptu jaderného protoonkogenu. Ještě výhodněji jsou antisensní oligonukleotidy podle vynálezu specifické pro mRNA transkripty omyc nebo c-myb protoonkogenů. Nejvýhodněji jsou antisensní oligonukleotidy podle vynálezu specifické pro mRNA transkripty c-myc protoonkogenu.
·. , A
S výhodou jsou c-myc antisensní oligonukleotidy administrovány lokálně na místo, kde dochází k nepřiměřené syntéze proteinů extracelulámí matrice.
Vynález zahrnuje způsob prevence selhání místa hemodialyzacniho přístupu a vaskulámích štěpů stykem místa hemodialyzacniho přístupu nebo vaskulámího Štěpu s oligonukleotidem komplementárním k jaderné protoonkogenové mRNA, buď ex vivo, nebo iň vivo v lidské bytosti. Vynález navíc zahrnuje prostředky obsahující místa hemodialyzacniho přístupu, vaskulámí štěpy nebo vyřízlé, s lidskou tkání kompatibilní, žíly a oligonukleotidy podle vynálezu ve složkách nebo tkáních takových struktur.
Vynález dále zahrnuje způsob redukce vzniku jizev v lidské tkáni administrací terapeuticky efektivního množství k protoonkogenu antisensního oligonukleotidu do tkáně.
Vynález také zahrnuje způsob inhibice vzniku, fibrózní spojovací tkáně administrací terapeuticky efektivního množství k protoonkogenu antisensního oligonukleotidu.
Ί
- » * * * * ' * * * í )' · • · * » « a r * * / r v
ί t
vt* i
v <-*:
‘ř, X .f.
i +' : ί ·ιΐ· ·
i.y ' Stručný popis obrázků.
L. Obr. J ukazuje příklad artenovenózního štěpu před a po arterializaci a ztrátu průchodnosti ' v žílové doméně štěpu.· - ; .· ' ' ř ' ř > » 1 Obr. 2a ukazuje fotografii průřezu normální prasečí, žíly barvené Veřhoffovým barvivém v · ’.·. u '' ‘·. ’ ' *> 2 . . (zvětšeno 1 Οχ). ·4 ’·\ . . \. > . Jv ; ‘.
.^Obr. 2b ukazuje průřez arterializováné, prasečí žíly barvené Veřhoffovým .barvivém (zvětšeno 5x): ;
Obr. 3 a ukazuje fotografii průřezu normální prasečí žíly barvené Sirriovou Červení » ε ·. Λ· 4 · . ' r . řj. · . '*·.»· (zvětšeno 5x).“·^^^ ť ΐ Obr. 3b ukazuje fotografii průřezu arterializpvané prasečí žíly barvené Šímovou červení , v ’· \ ‘ s': u- ' ···' ' · -Λ·./. < a (zvetseno 5x): ' ·*··'-···. . ..._ ’*' ' ; ř 1 ΐ:.'· , , ' ' * / /; ' . ’ ' . > ’..j! 1 .1 ’>'··» ./- »· * ’
Á Obr.. 4a ukazuje fotografii průřezu normální prasečí žíly barvené protilátkami proti α-aktinu (zvětšeno 10x). ; a · . .1- ‘ '* . , - ,.· .; ·. ' * '·. · , j- ‘ . v }
Obr. 4b ukazuje .fotografii průřézu arterializoýáné prasečí žíly barvené protilátkami proti . ^.c-aktinu(zvětšeno5x). ___- ; ~
Obr. 4c ukazuje fotografii průřezu normální prasečí žíly barvené protůáficámr proti desminu (zvětšeno lOx).
Obr, 5á ukazuje fotografii průřezu arterializované prasečí žíly barvené protilátkami proti jadernému antigenů proliferující buňky (PCNA) (zvětšeno 25x). .. / - , v. ’-i· 'it__ ' ‘•'i. ,,
Obr. 5b ukazuje fotografii průřezu artériálizované prasečí žíly barvené Veřhoffovým » ’ 1 ' ,“5 barvivém (zvětšeno 25x). ; *Obr. 5c ukazuje fotografii průřezu arterializované prasečí žíly barvené Sirriovoů červení ··/·>£ ; ' .. ·· ’· . - .· _ . ’ (zvětšeno 25x).
Obr. 6á ukazuje fotografii průřezu lidské žíly z aortokoronámího štěpů barvené ·, ' ' . . .' , ’·
Veřhoffovým barvivém (zvětšeno 5x). ‘<
Obr. 6b ukazuje fotografii průřezu lidské žfly z aortokoronámího štěpu barvené Sirriovoů červení (zvětšeno 5x).
·· .'Κ .· -τ·*
| 7 | J |
| - - - , | “ý· |
| .. - - | |
| 4.. | |
f
Obr. 6c ukazuje fotografii průřezu lidské žily z aortokoronámího štěpu barvené protilátkami proti α-aktinu (zvětšeno 5x).
Obr. 6d ukazuje fotografii průřezu lidské žíly z aortokoronámího štěpu barvené protilátkami proti PČNA (zvětšeno 50x).
Obr. 7a ůkazuje fotografii průřezu orgánové kultury prasečí žíly podrobené působení » · * *
PDGF (od destiček odvozeného růstového faktoru) a barvené protilátkami proti PCNA (jadernému antigenu proliferující buňky) a dobarvené hematoxilynem a eosinem (zvětšeno 50x).
Obr. 7b ukazuje fotografii průřezu orgánové kultury prasecí žíly bez působení PDGF barvené protilátkami proti PCNA a dobarvené hematoxilynem a eosinem (zvětšeno 25x).
Obr. 7c ukazuje fotografii průřezu arterializované prasečí žíly vystavené působení PDGF a oligonukleotidu (sekvence ID No: 1) a barvené protilátkami proti PCNA a dobarvené barvivý hematoxilynem a eosinem (zvětšeno 50x).
Obr. 8a ukazuje fotografii průřezu orgánové kultury lidské žíly dvě sekundy vystavené působení fiuoresceinem koncově značeného oligonukleotidu (sekvence ID No:l) (zvětšeno 25x).
Obr. 8b ukazuje fotografii průřezu orgánové kultury lidské žíly 30 minut vystavené působeni fiuoresceinem koncově značeného oligonukleotidu (sekvence ID No: 1) (zvětšeno 25x).
Obr. 8c ukazuje fotografii průřezu orgánové kultury lidské žíly jednu hodinu inkubované s fiuoresceinem koncově značeným oligonukleotidem (sekvence ID No:l) (zvětšeno 25x).
Obr. 8d ukazuje fotografii průřezu orgánové kultury lidské žíly dvě hodiny inkubované s fiuoresceinem koncově značeným oligonukleotidem (sekvence ID No:l) (zvětšeno 25x).
Obr. 9a ukazuje fotografii průřezu prasecí žíly dvě hodiny perivaskulámě injektované fiuoresceinem koncově značeným oligonukleotidem (sekvence JD No:l) (zvětšeno 50x).
Obr. 9b ukazuje fotografii průřezu prasečí žíly 30 minut podkožně injektované fiuoresceinem koncově značeným oligonukleotidem (sekvence ID No: 1) (zvětšeno 50x).
Obr. 9c ukazuje fotografii průřezu prasečí žíly podkožně administrované fiuoresceinem koncově značeným oligonukleotidem (sekvence ID No: 1) dvě hodiny po injekci (zvětšeno 50x).
Obr. 10 ukazuje fotografii průřezu typické kontroly (to jest po injekci sensního oligomeru) prasečí koronární arterie jeden měsíc po poranění.
Obr. 11 ukazuje fotografii průřezu typické prasečí koronární arterie vystavené antisensnímu působení.
Obr. 12 ilustruje maximální neointimální oblast jako funkci stupně poranění.
Obr. 13 ukazuje efekt antisensních oligonukleotidu cílených na oblast iniciace translace c-ζηχ mRNA na extracelulámí hladiny prokolagenu I, prokolagenu III a fibronektinu v postkonfluentních lidských buňkách hladkého svalstva. Prokolagen I a prokolagen III byly v upraveném médiu určeny Westem-blotem, zatímco fibronektin byl měřen imunoprecipitací.
Obr. 14 ukazuje sekvenčně specifický efekt omyc antisensních oligonukleotidu na kolagen typu I. Lidské buňky hladkého svalstva se inkubovaly 24 hodin s různými kontrolními f
• -Ť
... · »' »
,. v * '4 ' ' ” : i
- —*·4.·'·
V /< 1 ' '
V . ' , .* a > ’ řťrwtr. —
z., rv , ' “ 1 . ** j“ · * *· *. .·» — ’ . : ?. .« ' . . · . ?*··· 7' ’; ' ’ ’ ; * * k * '· _ . ‘ f _ 4 ·.·▼·..
. 5.· '4 . f. . t . ' *' oligonukleotidy (16 μΚί) včetně senshich, 4bp.chýbně spároyáných a scramblovaných sekvenci rMí^Va-antisensních oligonukleotidů (16 μΜ) .cílených ňá^růžné oblássti'-c-myc mRNA Hladiny kolagenu typu I se v médiu měřily po upraveném štěpení pepsinem š použitím Westém-blotu.
' ' ·' .”' -7 řw( - . r- .'
Horní obrázek : Bloty ukazují a řetězce kolagenu. Linie 1: žádné oligonukleotidy; linie 2: sensňi . oligonukleotidy/linie3: 4bp chybně spárované ODN (oligonukleotid); linie 4: scramblované ’ Jj^^otigoim^otidý; linie 5: antisensní cílení na oblast iniciace translace c-myc mRNA (poloha 559-573, ASI); linie 6. antisensní cílení na exonT (poloha 40(M19^Š2);jlihie'7:^tišéňsni: i ‘ cílení na exon 3 (poloha. 1264-1283/ ÁS3). Dolní obrázek: Histogramy zobrazující procenta —Y_’ ,. (//-. . . .2' '2... ...
: změny kontroiních -hodnot (bez oligonukleotidů) získané z densitometrických měřeni 3 (separátních pokusů. (průměr ± SEM). Mis: 4bp chybně spárované oligonukleotidy; Ser:
- + ‘ ' ' ' .2 J, ' * 4 . J ζ” ‘ H ·*· ’ **>' “· ' á scramblované oligonukleotidy. j ; / ť » * . .*♦·».· ' . · j t * ' 4 ‘ ' .
Obr. ,15 ukazuje inhibici c-myc proteinu antisensními oligonukleotidyJ (ASI).
<' ' --£' ť*- :'ý - - - 1 i. * .i 'Í', ,r \ ' ‘í'Í
Postkonfluentní buňky hladkého svalstva ;se‘inkubovaly 24; hodin s- nebo‘ bez antisensních '/ oligonukleotidů. P62 c-myc se určil imunoprecipitací jaderných extraktů značených [--S]=methióniflgojeúkmn naautoradiogřamu-SDS-pGlyakiyiamidového.gelu :.
Obr. 16 ukazuje metabolický stav buněk hladkého svalstva následně po oligonukleotidech. Buňky se inkubovaly 4 hodiny s nebo bez. oligonukleotidů (16 μΜ) a značily [35S]-melhioninem 16 hodin. RadióznaČené proteiny se měřily po prěcipitaci TCA. Antisensní oligonukleotidy / ·*.“, ií i ; 1 4 , nevykázaly žádný“ efekt na inkóiporaci methioninu do proteinů/což ukazuje normální : metabobekou aktivitu buněk hladkého svalstva. Údaje ukazuji dpm/105 buněk (průměr ± SEM ze dvou oddělených pokusů), S: sensní; MIS: chybně spárovaný; SCR: scramblované, ASI: antisensní oligonukleotidy cílené ná oblast iniciace translace c-myc mRNA.
Obr. 17 ukazuje obnovu kolagenu typu I po odstranění c-myc antisensních oligonukleotidů (AS 1). Buňky hladkého svalstva se inkubovaly 24 hodin s nebo bez antisensních oligonukleotidů (16 μΜ). Po 3 promytích se přidalo médium bez oligonukleotidů a po 24 hodinách se oddělilo. Kolagen typu I se určil Westem-blotem po štěpení pepsinem. Po odstranění c-myc antisenšních oligonukleotidů se pozoruje úplná obnova kolagenu typu I. ·
Obr. 18 ukazuje efekt c-myc antisensních oligonukleotidů na hladinu ρΓοα,(Ι) a pro a2(I) mRNA Veškerá RNA se isolovala z buněk hladkého svalstva inkubovaných 24 hodin s nebo bez oligonukleotidů (16 μΜ) a analyzovala Northem-blotem (lttyg/linie). Antisensní oligonukleotidy (ASI) neměly žádný vliv ria hladinu proa/I) a pro c^(I) mRNA. Pokusy konané 6 hodin po antisensním působení poskytly podobné výsledky. 7S RNA nevykázala žádnou změnu.
» ·
Obr. 19 ukazuje extracelulámí a intracelulární proteiny značené prolinem [14CJ. Lidské buňky hladkého svalstva se inkubovaly 16 hodin s nebo bez oligonukleotidů, potom se značily [14C] prolinem další 4 hodiny v médiu bez séra. Proteiny značené prolinem [14C] se analyzovaly na polyakryíamidových SDS gelech. Pozorovala se inhibice radioznačených proteinů v upraveném médiu, která byla provázena zvýšenou hladinou intracelulámího prokolagenu ctj(I) a 0^(1) po c-myc antisensním působení.
Obr. 20 ukazuje obsah hydroxyprolinu v lidských buňkách hladkého svalstva po antisensním působení a v buňkách kontrolních.
Obr. 21 ukazuje efekt c-myc antisensního působení na hladinu extracelulámího kolagenu typu I ve fibroblastech lidské kůže.
Obr. 22 ukazuje hladinu intracelulámího a extracelulámího prokolagenu ve spojení s fibróblasty lidské kůže po c-myc antisensním působení a s fibroblasty kontrolními.
Obr. 23 ukazuje termální stabilitu intracelulámího prokolagenu ve fibroblastech lidské kůže. Pepsinem čištěný prokolagen z buněk po nebo bez působení oligonukleotidů se 2 minuty inkuboval s trypsinem a chymotrypsinem za určené teploty a dělil se elektroforézou na polyakrylamidovém SDS gelu. Bez ohledu na působení oligonukleotidů se pozorovaly podobné teploty tání (to jest okolo 41 °C), což nasvědčuje konformaci normálního triple-helixu a řetězců prokolagenu po působení c-myc antisensních oligonukleotidů.
Obr. 24 ukazuje hladinu prokolagenu ctj(I) mRNA ve fibroblastech lidské kůže po působení c-myc antisensních oligonukleotidů a ve fibroblastech kontrolních.
Obr. 25 ukazuje obnovu kolagenu typu I ve fibroblastech lidské kůže po c-myc antisensním působení a ve fibroblastech kontrolních 24 hodin po působení oligonukleotidů a vystavení čerstvému médiu bez oligonukleotidů.
Obr. 26 ukazuje průřez prasecí koronární arterií a perivaskulámích tkání. Distribuce c~myc antisensních oligonukleotidů (sekvence ID No:l) se stanovila ve stěně cévy a v přilehlých perivaskulámích tkáních (zvětšeno 20x).
Obr. 27a-f ukazuje vzory distribuce c-myc antisensních ODN (sekvence ID No:l) v koronárních arteriích 30 minut po transkatetrové administraci. Obr. a, b: Fázový kontrast a fotomikrografie fluorescenční mikroskopie stejné sekce ukazují transmurální lokalizaci fluoresceinem značených oligonukleotidů. Antisensní oligonukleotidy jsou přítomny v médii, adventicu a v perivaskulámích tkáních. Obr. c, d: Fázový kontrast a fotomikrografie fluorescenční mikroskopie ukazují subintimální, netransmurální distribuci oligonukleotidů. Oligonukleotidy jsou , ; , detekovatelné pouze v médii. Obr. e, f: Fázový kontrast a fotomikrografie fluorescenční : ; mikroskopie ukazují středostenovou, netransniurální přítomnost oligonukleotidu (zvětšeno 62,5x) ^ '
Obr.: 28a a 28b ukazuje setrvání c-myc antisensních oligonukleotidů v arteriální stěně 3 dny r ' pó transkatetrové administraci. Obr. á, b: Fázový kontrast, respektive fotomikrografie fluorescenční mikroskopie stejného řezu (zvětšeno 62,5x). ’ .
- Obr. 29 ukazuje histogram zobrazující cévní a perivaskulámí radioaktivitu po intramurální administraci J5S-značených fosforothioátoýých c-myc antisenšhíčh' oligonukleotidů? Podobný celkový obsah ODN je pozorován po 30 minutách (prázdný sloupec; n = 6) a po 3 dnech (plný
.......... ... . r ,'! I.’*' í —sloupec; n =-4)/^jějičHjáplikácckvůli?césto\^ní z penvaskulárního prostoru-do stěnycévy^ Výsledky jsou uváděny jako průměr ± SEM.
Obr. 30a-d ukazuje zachování vaškulámích struktur po transkatetrové administraci omyc antisensních oligonukleotidů. Obr. a: Fluorescenčně značené oligonukleotidy jsou jasně.zřetelné v koronární vzdušnicové.stěně 30 minut po injekci. Obr. b: Přilehlé sekce ukazují zachovanou vnitřní elastickou vrstvu a nonnální orientaci elastických tkání bez narušení (Verhoffbvo barvivo).
z ' ř . í Obr. c: Vjmístě rétence ODN byl pozorován mírný pokles cytoplazmového zbarvení a jaderná pyknóža (hematoxylinové. a eosinové barvivo). Obr. d: Řez phíeMý řezu ukázanéfiiů ňá óbř/?Í9 zobrazuje rozlišení výše uvedených změn 3.dny po podání oligonukleotidů (hematoxylinové a eosinové barvivo, zvětšeno 50x). . v..
Obr. 31 ukazuje intracelulární lokalizaci fluoresceinem značených c-myc antisensních oligonukleotidů stanovených konfokální mikroskopií vaskulámích buněk hladkého svalstva in vitro.
Obr. 32 ukazuje intracelulární lokalizaci fluoresceinem značených c-myc antisensních oligonukleotidů 30 minut po iritramurálním podáni oligonukleotidů in vivo, jaderná lokalizace je viditelná v mediálních buňkách hladkého svalstva. Obr. 33 ukazuje intracelulární lokalizaci fluoresceinem značených c-myc antisensních oligonukleotidů 30 minut po intramurálním podání oligonukleotidů invivo, jademálokahzace je viditelná v adventiciálních buňkách.
Definice. Termín “kolagen” se zde používá pro třídu molekul syntetizovaných z prokolagenu. Kolagen se syntetizuje z prokolagenu extracelulámě, štěpením N- a C-konců vně buňky. Protilátky proti triple-helikální oblasti kolagenu rozpoznávají také triple-helíkální oblast prokolagenu. Protilátky zde používané jsou buď specifické pro kolagen I á prokolagen I, nebo kolagen III a prokolagen III. Kolagen se také může syntetizovat in vitro z prokolagenu • . · . ' · · • . . .....
• · · . , Γ ' ‘ · pepsinovým štěpením.
Termín “štěp” se zde používá pro označení vaskulámího štěpu, jako arteriovenózního nebo venózního štěpu.
Termín “nukleosid” se zde používá pro přirozené nukleosidy, včetně 2'-deoxy a 2'-hydroxyIovaných forem (např. jako popisuje Komberg, Baker, DNA Replication, 2nd Ed., Freeman, Sán Francisco, 1992). “Analogy” nukleosidů zahrnují syntetické nukleosidy s modifikovanými bázemi a/nebo modifikovanými cukernými zbytky (obecně popisuje Sheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980). Takové analogy zahrnují syntetické ·
nukleosidy navržené k zesílení vazebných vlastností, např. stability duplexu nebo triplexu, špecifitý a tak podobně.
Termín “oligonukleotid” se zde používá pro lineární oligomery přirozených a modifikovaných monomerů nebo vazeb, včetně deoxyribonukleosidů, ribonukleosidů, jejich α-anomemích forem, polyamidových nukleových kyselin a tak podobně, schopných specifického vázání se k cílovému polynukleotidu prostřednictvím regulérních monomer-monomer interakcí, jako Watson-Crickovo párování bází, Hoogsteenovo nebo reversní Hoogsteenovo párování a tak podobně. Monomery jsou obvykle spojeny fosfodiesterovými vazbami nebo jejich analogy za
J vzniku oligonukleotidů o velikosti od několika monomemích jednotek, např. 3-4, do stovek monomemích jednotek. Kdykoliv je oligonukleotid zapsán jako sekvence písmen, jako “ATGCCTG”, znamená to razení nukleotidů od 5 - do 3-konce zleva doprava a “A” značí deoxyadenosin, “C” značí deoxycytidin, “G” značí deoxyguanosin a “T” značí thymidin, pokud není uvedeno jinak. Analogy fosfodiesterové vazby zahrnují fosforothioáty, fosforodithioáty,
V fosforoselenoáty, fosforodiselenoáty, fosforanilothioáty, fosforanilidáty, fosforamidáty, 3'-5' fosforamidáty a tak podobně, jak je plně popsáno níže.
“Stabilita” ve spojení se vznikem duplexu nebo triplexu obecně znamená jak pevně se antisensní oligonukleotid váže na svou cílovou sekvenci; přesně to značí volnou energii vzniku duplexu nebo triplexu za fyziologických podmínek. Teplota tání za standardních podmínek, popsaných níže, je vhodným měřítkem Stability duplexu a/nebo triplexu. S výhodou jsou podle vynálezu vybírány antisensní oligónukleótidy, které mají teploty tání nejméně 50 °C za standardních podmínek uvedených níže; ph fyziologických podmínkách a preferovaných koncentracích je vznik duplexu nebo triplexu podstatně zvýhodněn oproti disociaci antisensního oligonukleotidu a jeho cíle. Rozumí se, že stabilní duplex nebo triplex může při určitém provedení obsahovat chybné spárování bází mezi dvojicemi a/nebo, v případě triplexu, trojicemi bází. Jako * ·
1
Λ\1
- * v případě .sekvence JĎ^Norl·, což je lidská sekvence s jedním chybným spárováním bází v posledním nukleotidu, vzhledem ke srovnatelné prasečí sekvenci. Š výhodou tvoří antisensní oligonukleotidy podle vynálezu s cílovými polynukleotidy bezchybně spárované duplexy a/nebo triplexy. 1 , .
Termín “syntéza”, zde používány v biologickém kontextu, značí proces vzniku biolo+.i £ gických molekul, zejména molekul extracelulámí matrice a proteinů extracelulámí matrice..
Termín “syntéza” zahrnuje procesy jak uvnitř, tak vně buňky, které vedbuíce vzniku biólogickych molekul, ha příklad, ale bez omezení na, transkripci mRNA, translaci mRNA, post-translační
modifikaci proteinů,-^glykosylaciÁpěptidázovéýštěpenÍTtextracelulární peptidázové štěpení,___..
intracelulámí peptidázové štěpení, transport proteinů, sekreci proteinů a fosforylaci proteinů. S V výhodou vynález inhibuje translaci proteinů molekul extracelulámí matrice, post-translační procesování proteinů, sekreci proteinů a intracelulámí peptidázové štěpení. ' Detailní popis vynálezu. Vynález se týká použití určitých antisensních látek pro inhibici nepřiměřené syntézy proteinů extracelulámí matrice v tkáni, zejména kolagenu, přesně kolagenu typu I aJH Nepřiměřena aZriebo nadměrná syntéza proteinů extracelulámí matrice může vyústit do pathologických stavů, které představují na příklad vznik nežádoucí fibróžní pojivové tkáně. Pathologické stavy, obecně se vyskytující u lidí, zahrnují sklerotické potuchy, vaskulámi restenosu, atherosklérózu, atherogenezi, keloidní chorobu, cirrhózu jater, revmatické poruchy kloubů,. ztrátu průchodnosti arteriovenžních a venózních štěpů, postchirurgické zjizvení, rekostruktivní chirurgii a tak podobně. Různé typy tkání mohou být místem nepřiměřené syntézy, včetně vaskulámích buněk hladkého svalstva, endótelových buněk, kožních a orgánových fibroblastů, na příklad při keloidní chorobě nebo při vzniku postraumatických nebo postchinirgických jizev, synoviálních buněk a jiných kloubních složek. Jedno provedení vynálezu je zejména užitečné při prevenci selhání nebo ztráty průchodnosti arteriovenžních a venózních štěpů. Jiné provedení vynálezu je zejména užitečné při terapii restenosy, akutního vaskulámího zranění, typicky následujícího u lidí po angioplastice. Restenosa je spojena s migrací buněk hladkého svalstva do vaskulámi intimy, proliferací a syntézou složek extracelulámí matrice (např.
Holmes et al., PTCA, Chapter 12, Vliestra et al., Editors, Davis Company, Philadelphia, 1987).
Administrací terapeuticky efektivního množství antisensní látky do tkáně obsahující cílový polynukleotid je inhibována nepřiměřená (to jest nadbytečná) syntéza extracelulámího proteinu.
Cílové polynukleotidy mohou být jednovláknové nebo dvouvláknové DNA nebo RNA; nicméně jsou preferovány jednovláknové DNA nebo RNA cíle. Genomové nukleotidové sekvence a » » mRNA transkripty jaderných onkogenů podle vynálezu jsou podle stavu techniky známy a zahrnují c-myc, c-myb, c-fos, N-myc, C-myc, p53, c-rel, oski, c-ets-1, oets-2 a tak podobně (např. Glover, Editor, Oncogenes, IRL Press, Oxford, 1989). C-myc a c-myb sekvence jsou popsány v následujících odkazech: c-myc protoonkogenové sekvence jsou popsány v Marcu et al., Ann. Rev. Biochem., 61, 809-860 (1992); Watt et al., Nátuře, 303, 725-728 (1983); Battey et al., Cell, 34, 779-787 (1983); Epštein et al., N17S publication PB93-100576; c-myb protoonkogenje popsán v Gewirtz et al., U.S. patent 5,098,890; Majello etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 9636-9640 (1986). Navíc může být cílen jaderný antigen proliferující buňky, cyclin (D, a H ), cdc2 kináza, cdk kináza a E2F (zde nazývány jako “geny buněčného cyklu”). S výhodou jsou jadernými protoonkogeny cílenými antisensními oligonukleotidy podle vynálezu c-myc a/nebo c-myb.
Rozumí se, že cíl, na který jsou namířeny c-myc antisensní oligonukleotidy podle vynálezu, zahrnuje allelické formy protoonkogenů. Výběr jednotlivých sekvencí antisensních oligonukleotidu při znalostí sekvence cílového polynukleotidu se řídí podle literatury (např. Ulmann et al., citovaný výše; Crooke, citovaný výše; Zamecnik, Stephenson, Proč. Nati. Acad. Sci., 75,280-284 (1974)). S výhodou jsou c-myc antisensní látky vybírány tak, že G-C obsah je nejméně 60 %. Výhodně jsou sekvence oligonukleotidu vybírány z 12 až 15 kontingentních bází sekvence ID No:I, 5-7, nebo 8-11. Preferované mRNA cíle zahrnují místo 5'-čepičky, místo vázání tRNA primem, místo iniciačního kodonu, místo splétání mRna donoru, místo splétání mRna akceptoru a tak podobně (např. Goodchild et al., U.S. patent 4,806,463).
Při výběru antisensních oligonukleotidu pro cílení ATG iniciačního místa lidského c-myc ve druhém exonu, antisensní oligonukleotidy s následnými sekvencemi mohou být administrovány s použitím oligonukleotidůs délkou 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29,30,31,32,33,34 nebo 35 bází a vybírány z oblasti 25 bází na obou stranách ATG místa (lidská sekvence viz Gazin et al., E.M.B.O. Joumal, 3, 2, 383-387 (1984), sekvence je zde zahrnuta v odkazu):
5'cccgc tccagcagcc tcccgcgacg ATG cccctcaacg ttagcttcac caaca 3'
S výhodou budou antisensní oligonukleotidy zahrnovat ATG místo. Oblasti 25 bází na obou stranách sekvence ID No: 6 a 7 se také mohou použít pro výběr oligonukleotidu o velikosti uváděné v tomto Odstavci.
Antisensní oligonukleotidy podle vynálezu mohou zahrnovat jakoukoliv polymerní látku schopnou specifického vázání na cílový polynukleotid prostřednictvím regulérních interakci fit monomer-nukleosid, jako Watson-Crickovo párování bází, Hoogsteenovo nebo reversní .Hoogsteenovo párování bází a tak-podobně.„Antisensní oligonukleotidy podle vynálezu mohou také obsahovat zavěšené skupiny nebo části, bud’jako součást, nebo odděleně od základní *' *- 'r * ‘ * opakující se jednotky polymeru, vedoucí ke zvýšení specifity, resistence vůči nukleázám, dopravy nebo jiných vlastností spojených s účinností, např. cholesteróvé zbytky, interkalátory duplexů jako * ' ' í. . * ‘ ·4 ' 1 · . Λ · ‘'1 akndin, poiy-L-lysin, ‘‘kepoyání konče” jednou nebo více vůči nukleázám resistentními vazbami jako fosforothioát a tak podobně. Sekvence určitých representativních oligonukieotidů ·····-—·♦;· _ použitelných podle vynálezu jsou uvedeny v Seznamu sekvencí zde obsaženém.
' ’ ' ' ' /-b ~ '—-k · .,··?ύ.··· ... . „ __.... ' , μ. ..
‘ ; ' Antisensní oligonukleotidy podle vynálezu zahmují jejich farmaceuticky přijatelné soli,— —~ , _ ;+ τ ΐ ... -.-·· '7 včetně alkalických zemin, např. sodíku nebo hořčíku, amonné soli nebo NX/, kde X je Cj-C4’ alkyl. Další farmaceuticky přijatelné soli zahrnují organické karboxylové kyseliny jako kyselinu octovou, .mléčnou, vinnou, jablečnou, 2-hydroxyethansulfonovou, laktobionovou a jantarovou;
“ ‘ ; ’’ · * * .... _ organické sulfonové kyseliny jako methansulfonovou, ethansulfonovou a benzensulfonovoú; a ’.
anorganické kyseliny jako chlorovodíkovou, sírovou, fosforečnou a sulfamovou. Farmaceuticky ř~-··· - pnjatelné sob látký s:hydro)gdowu^^Q^jahrnújíjniomtakové látky v kombinaci s vhodným katíontem jako Na+, NH/ a tak podobně.
A‘i/.
S výhodou je resistence vůči nukleázám antišensním látkám udělena zavedením intemúkleosidové vazby resistentní vůči nukleázám. Podle stavu techniky je známo mnoho takových vazeb, např. fosforothióáty (Zon, Geiser, Anti-Cancer Drug Design, 6, 539-568 (1991); Stec et al., U.S. patent 5,151,510; Hirschbein, Ú.Š. patent 5,166,387; Běrgot, .U.S. patent -
5,183,885); fosforodithioáty (Marshall et al., Science, 259,1564-1570 (1993); Caruthers, Nielsen, * Intemational appbcation PCT/UŠ89/02293); fosforámidáty, např.-OP(=O)(NR’IR2)-O-, kde R1 a R2 je buď vodík, nebo C]-C3 alkyl (Jager et al., Biochemistry, 27, 7237-7246 (1988); Froehler · et al., Intemational application PČI7US90/03138); 3 -5' fosforamidáty (popsána v PCT přihlášce Gryaznov et al. PCT/US95/03585, látky a způsoby jsou zde zahrnuty do odkazu); peptidové ~ k·’ ř nukleové kyseliny (Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design, 8, 53-63 (1993), Intemational appbcation PCT/EP92/01220); methylfosfonáty (Millér et al., U.S. patent 4,507,433; Ts'o et al.,
U.S. patent 4,469,863; Miller et al., U.S. patent 4,757,055); a P-chirální vazby různých typů, zvláště fosforothioáty (Stec et al., European patent application 92301950.9; Lesnikowski,
Bioorganic Chemistry, 21, 127-155 (1993)). Další vazby resistentní vůči nukleázám zahrnují fosforoselenoát, fosforodiselenoát, fosforanilothioát, fosforanilidát, alkylfosfotriester jako methyla ethylfosfotríester, karbonát jako karboxýmethylester, karbamát, morfolino-karbamát,
• t
-thioformacetál, silyl jako dialkyl (Cj-C6)- nebo difenylsilyl, sulfamátester a tak podobně. Takové vazby a způsoby jejich zavedení do oligonukleotidů jsou popsány v mnoha odkazech (např. přehledně uvedeny v Peyman a Ulmann, citovaný výše; Milligan et al., citovaný výše; Matteucci et al., International application PCT/US91/06855). S výhodou se v látkách podle vynálezu používají fosforové analogy fosfodiesterové vazby, jako fosforothioáty, fosforodithioáty, fosforamidáty nebo methylfosfonáty. Ještě výhodněji se jako vazba resistentní vůči nukleázám používá fosforothioátová vazba. Rozumí se, že navíc k preferovaným vazebným skupinám, látky podle vynálezu mohou obsahovat další modifikace, např. báze s borem (Spielvogel et al., 5,130,302); cholesterové zbytky (Shea et al., Nucleic Acids Research, 18, 3777-3783 (1990); Letsiňger et al., Proč. Nati, Acad. Scí, 86, 6553-6556 (1989)); 5-propenylovou modifikaci pyrimidinů (Froehler et al., Tetrahedron Letí., 33, 5307-5310 (1992)) a tak podobně.
S výhodou se antisensní látky podle vynálezu syntetizují konvenčními postupy na komerčně dostupných automatizovaných DNA syntezátorech, např. Applied Biosystems (Foster City, CA) model 380B, 392 nebo 394 DNA/RNA syntetizátor. S výhodou se používá fosforamiditová chemie (např. Beaucage, Iyer, Tetrahedron, 48,2223-2311 (1992); Molko et al., U.S. patent 4,980,460; Koster et al., U.S. patent 4,725,677; Caruthers et al, U.S. patenty 4,415,732, 4,458,066 a 4,973,679 a tak podobně).
V provedení, kde je žádoucí vznik triplexu, je zúžen výběr cílových sekvencí. Obecně asociace třetího vlákna prostřednictvím Hoogsteenova párování bází je stabilnější podél homopyrimidin-homopurinových úseků v dvoj vláknovém cíly. Obvykle se triplety tvoří u T-A*T nebo C-G*C motivů značí Watson-Crickovo párování bází a “*” značí Hoogsteenovo párování bázi); nicméně jsou možné i jiné motivy. Hoogsteenovo párování bází na příklad umožňuje paralelní a antiparalelní orientaci mezi třetím vláknem (Hoogsteenovým vláknem) a na purin bohatým vláknem duplexu, na který se třetí vlákno váže, v závislosti na stavách a na složení vláken. Literatura poskytuje rozsáhlé vedení při výběru vhodných sekvencí, orientace, podmínek, typu nukleosidu (např. zda použít ribonukleosidy nebo deoxyribonukleosidy), modifikací báze (např. methylovaný cytosin a tak podobně) pro maximalizaci nebo jinou regulaci stability triplexu v závislosti na jednotlivém provedení (např. Roberts et al., Proč. Nati. Acad Scí, 88, 9397-9401 (1991); Roberts et al., Science, 258, 1463-1466 (1992); Distefano et al., Proč, Nati. Acad. Scí, 90,1179-1183 (1993); Mergny et al, Biochemistry, 30,9791-9798 (1991); Cheng et al, J. Am. Chem. Soc., 114, 4465-4474 (1992); Beal, Dervan, Nucleic Acids Research, 20, 2773-2776
I (1992); Beal, Dervan, J. Am. Chem. Soc., 114, 4976-4982 (1992); Giovannangeli et al. Proč.__ ·» r ' / * » · F * <·· « < * * r » * · * ‘ * * * » · ί ·.
T r-pP^— -^aíl:Acad. Sci.,-S9, 8631-8635 (1992); Moser, Deiy^, Sejeme, 238,;645-65£(j987); McShan’ et al.,7. BiokChem., 267,-5712-5721 (1992); Yoon et al, froc. Natí Acad. Sci., 89, 3840-3844 (1992); Blume et al., Nucleic Acids Research, 20,1777-1784 (1992) a tak podobně.
Délka oligonukleótidových zbytků je dostatečná pro zajištěni specifického vázání pouze k žádanému cílovému polynukleotidu, ne na nahodilých místech, jak je uvedeno, v mnoha
- / * . .4. , ’ .. t.· ,η .
odkazech.(např. Rosenberg et al.,'Intemational application PCT/US92/05305; Szostak et al.„ Melh. Enzymol, 68,419-429 (1979)). Shora je délka omezena několika faktory’ včetně nevýhody T t , J ' . í t - · v a nákladnosti syntézy a čištění oligomerů delších než 30-40 núkleosidů, větší tolerance delších oligonukleotidú vůči chybnému párování bází než u kratších-oligónůklěotidůTzda jsou přítomny — modifikace ke zlepšení vázání a specifity, zdaje žádaná tvorba duplexu nebo triplexu a tak podobně; Obvykle ántisensní látky podle vynálezu mají délku v rozmezí 12 áž 60 nukleotidů. Výhodněji mají ántisensní látky podle vynálezu délku v rozmezí 15 až 40 nukleotidů'a
P-Z · vl z i, ♦ jt** ; ’ ' ” -4· » Λ ' riejvýhodňěji mají délku v rozmezí 18 až 30 nukleotidů. % >
S výhodou se tepelná stabilita antisensních oligonukleotidú podle vynálezu určuje jako --’1(ηνΐ£&:(8ηί-η^-Ι(^ν1α^ί5οα3εβΜ£^44Χ^ό^\ρ£^ί5ράαα 50_% vláken určuje teplotu táni Tm, .
která zpětně poskytuje výhodné měřítko stability. Měření.Tm se typicky provádějí ve * * • ♦« ♦ · · • · * • *Λ w · ί-'.’ fyziologickém roztoku pň neutrálním pH s koncentrací cílového a antisensního oligonukleotidú mezi i,0-2,0 μΜ. Typické podmínky jsou následující 150 mM Naďa 10 mM MgClj v lOmM sodnofosfátovém půfni (pH 7,0) nebo v lOmM Tris-HCl pufru (pH 7,0), nebo podobné podmínky. Údaje pro křivky tání se shromažďují při zahříváni vzorku komplexu ántisensní • U , >· V·1 oligonukleotid/cilový polynukleotid od pokojové teploty do 85-90 °C. Se vzrůstající teplotou vzorku se odečítá absorbance při 260 nm v intervalech 1 °C, např. s použitím Cary (Austrálie) modelu 1E nebo Hewlett-Packard (Palo Alto, ČA) modelu HP 8459 UV/VIS spektrofotometru a modelu HP 89100A regulátoru teploty, nebo podobných zařízení. Takové techniky poskytují vhodné podmínky pro měření a srovnáni vazebných sil antisensních oligonukleotidú různých délek a různého složení.
Jiným aspektem tohoto vynálezu je farmaceutický přípravek použitelný pro inhibicí syntézy proteinů extracelulární matrice, zahrnující farmaceuticky přijatelný excipient a ántisensní oligonukleotid specifický pro jaderný protoonkogen, který je přítomný v množství postačujícím • ‘ v pro inhibicí syntézy proteinů extracelulární matrice, když je administrován potřebnému subjektu. Ántisensní oligonukleotidy podle vynálezu se používají jako jedna nebo více složek takového farmaceutického přípravku. Složky farmaceutického přípravku podle vynálezu závisí na několika • · · t r *··· * · « '··♦»<
♦ * ' « * _ ♦ · * • « faktorech, včetně povahy choroby nebo léčeného stavu, lokalizace chorobných lézí, způsobu podávaní léčiva a/nebo zamýšlené administrace, která může zahrnovat in vivo administraci prostřednictvím katetru do cílové leze nebo orgánu, místní aplikaci, intranasální administraci, administraci implantovanými nebo transdermálními pomocnými uvolňovacími systémy, a tak podobně.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu zahrnují farmaceutický nosič, který může obsahovat množství složek umožňujících různé funkce, včetně regulace koncentrace léčiva, regulace rozpustnosti, chemické stabilizace, regulace viskozity, zlepšení absorpce, regulace pH, atak podobně. Na příklad ve vodou rozpustných přípravcích farmaceutický přípravek s výhodou obsahuje pufr jako fosfátový pufr, nebo sůl jiné organické kyseliny, výhodně s pH mezi 7-8. Pro přípravky obsahující špatně rozpustné antisensní látky se pro zlepšení rozpustnosti mohou použít mikroemulze, na příklad neiontový surfaktant jako Tween 80 v množství 0,04-0,05 % (w/v). Jiné složky obsahují antioxidantyjako kyselinu askorbovou, hydrofilní polymery jako monosacharidy, disachandy a další karbohydráty včetně celulózy nebo jejích derivátů, dextrinů, chelatujících činidel jako EDTA a podobných složek známých farmaceutickým odborníkům (Remingtons Pharmaceutical Science, poslední vydání, Mack Publishing Company, Eastón, PA).
Pomocné uvolňovací systémy vhodné pro použití s farmaceutickými přípravky podle vynálezu zahrnují semipermeabilní polymemí matrice ve formě filmu, mikrokapsulí nebo podobně, včetně polylaktidů, kopolymerů Lrglutamové kyseliny a gama-ethyl-L-glutaniátu, poly(2-hydroxyethylmethakrylátu) a podobných materiálů (např. Rosenberg et al., Intemational application PCT UŠ92/05305). Pomocné uvolňovací systémy také obsahují lipozomálne zachycené antisensní látky, jak se popisuje např. v Liposome Technology, Vol. II (Incorporation of Drugs, Proteins and Genetic Materiál, CRC Press).
Efektivní množství c-myc antisensního oligonukleotidu pro jednotlivé aplikace závisí na několika faktorech, včetně chemické povahy antisensního oligonukleotidu, léčené poruchy, způsobu administrace a tak podobně. S výhodou efektivní množství poskytne koncentraci c-myc antisensního oligonukleotidu mezi 1-100 μΜ na cílový polynukleotid, výhodněji efektivní množství poskytne koncentraci antisensního oligonukleotidu mezi 1-10 μΜ na cílový polynukleotid.
Při vaskulámích poruchách jako restenosejsou antisensní oligonukleotidy specifické pro jaderné protoonkogeny s výhodou administrovány lokálně k traumatizované arterii prostřednictvím katetru. S výhodou jsou antisensní oligonukleotidy dopravované k lézím restenosy * ·
- ------,- ^myc a/nebo c-myb specifické, výhodněji se používá kombinace antisensních oligonukleotidů
- ; - specifických jak pro c-/nyc,tak pro c-mybk redukci -syntézy/proteinů extracelůlární matrice spojené s restenosou. Typicky se rcstsnosa objevuje po procedurách jako po podkožní transluminální koronární angioplastice (PTCA), která způsobuje lokální porušení nebo poranění · · tJ·' arteriální stěny. Jako odpověď na takové poranění často vzniká okluzivní léze kvůli následujícím „
..... π; . -j . . :
··»«»·vjevům: zápal arterie v místě poraněni, thromboza, nahrómadění buněk hladkého svalstva migrací
a proliferací a syntéza extracelůlární matrice buňkami hladkého svalstva a
Při poruchách vaskulámího štěpu jsou oligonukleotidy s výhodou dopravovány do
pojivově tkáně obklopující Štěp k prevenci selhání Štěpu.4)becně.ksělhánFštěpu dócházrkdyž ztráta průchodnosti dosáhne 50 % a více. Ukazuje se, že dodávání oligonukleotidu technikami zde popsanými může být cíleno na arteriovenózní štěpy jako, ale bez omezení na, protetické ·Λ. t í píštěie (včetně PTFE, Goretxu nebo Impry, poly-(ether-urethanu), dakronu, lidské pupeční šňůry, geneticky manipulované žíly a hovězí á prasečí cévy s potlačenou imunitou), arteriovenózní
artero-safenózních Štěpů) a venózní štěpy jako, ale bez omezení na, žílové štěpy používající safenózní žílové alloštěpy s potlačenou imunitou, pupeční žílové alíoštěpy s potlačenou imunitou, geneticky modifikované žíly, xenoštěpy s potlačenou imunitou a žílové autoštěpy a jakékoli další žíly kompatibilní s lidmi, to jest transplantační tkáně a materiály schopné transplantace do lidské tkáně. ’
Pro perivaskulámí administraci oligonukleotidů při prevenci selhání vaskulámího Štěpu, zejména selhání artériovenózního štěpu, jsou oligonukleotidy podle vynálezu-obecně injektovány do perivaskulámí tkáně obklopující místo zamýšlené aplikace. V případech indikace kontinuální infuze oligonukleotidu, jako u pacientů s podstatnou a rychlou ztrátou průchodnosti artériovenózního štěpu, se používají jiné typy dopravovacích systémů jako podkožní infuzni pumpy, gelové a biodegradabiiní matrice nanesené na štěp a s výhodou smíchané s lidským serumaibuminem v poměru oligonukleotidu k proteinu 1:10 až 1:100, gely (jako pluronické Hydrori nebo ethylen-vinylacetátové gely), gely (jak popisuje Edelmen et al., Circulatíon Research 76, 176Ί82 (1995); Edeiman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 87, 3773-3777 (1990); metody jsou zahrnuty do odkazu), obývací katetrové systémy (jako Broviacovy katetry nebo kompletně obývací katetrové reservoárové systémy jako popisuje Poletti et al., J. Neurosurg, 55, 581-584, metody jsou zahrnuty do odkazu), impregnované PTFE hadice, další impregnované
F · · * τ
* biokompatibilní materiály nebo jiné prostředky a systémy dopravování léčiva zde popsané. Ukazuje se, že se v blízkosti místa může vytvořit reservoár pro uvolňování oligonukleotidu, aby se zvýšila doba trvání administrace oligonukleotidu. Reservoár se může jednoduše vytvořit injekcí oligonukleotidu do perivaskulámí tkáně během a po chirurgickém zákroku, ale před uzavřením rány, nebo podkožní injekcí po nahmatání arteriovenózního Štěpu, jako v případě arteriovenózní píštěle, nebo řízením injekce způsoby podle stavu techniky známými, např. sonogramy. Injekce se při rozsáhlejší terapii může opakovat, např. v místech hemodialyzačního přístupu. Není nutné nebo žádoucí odstranit adventicii z cévy, neboť perivaskulámí tkáň může sloužit jako depot nebo reservoár oligonukleotidu, který má relativně nízkou rychlost difúze. Oligonukleotid v reservoáru je také mnohem pomaleji unášen oběhovým systémem než při administraci intraluminálním katetrem. Při podkožní nebo perivaskulámí administraci je administrovaná dávka v rozmezí 0,1 až 100 mg na cévu, výhodně 0,25 až 50 mg a výhodněji 0.5 až 10 mg na jednu administraci.
Vedle administrace oligonukleotidu perivaskulámí tkání pro prevenci selhání štěpu, se jako reservoár používají další anatomické struktury, jako endotelová vrstva, media a adventicia, zejména když oligonukleotid není aplikován z lumene cévy. Přirozeně se vyskytující reservoárová místa, včetně perivaskulámí tkáně, jsou užitečná zejména při terapii arteriovenózních štěpů, zvláště arteriovenózních shuntů, kde mediová nebo elastická vrstva je, přes chirurgický zásah, neporušená a nerozřezaná. Zejména je výhodné použití míst blízko žílové domény v f arteriovenózního Štěpu, zvláště žílové domény arteriovenózního shuntu nebo píštěle. Žílová doména arteriovenózní píštěle vytváří žílovou část píštěle, jak ukazuje šipka na Obr. 1. Ukazuje se, že nepřirozeně se vyskytující reservoáry také mohou selhávajícímu štěpu dodávat oligonukleotid, jak ukazuje šedá oblast na Obr. 1, příklady jsou zde diskutovány. Při použití nepřirozeně se vyskytujících reservoáru je výhodou buď jejich bíodegradabilita, nebo možnost opětovného naplnění. Opětovně naplnitelné reservoáry jsou s výhodou dvou typů 1) opětovně naplnitelný reservoár upevněný po směru žílové domény arteriovenózního štěpu a v nebo podél PTFE hadice nebo jiného biokompatibilniho materiálu použitého pro arteriovenózní štěp, 2) reservoár upevněný v perivaskulámí tkáni obklopující arteriovenózní štěp, výhodně v 5 cm od ve 2 cm, opětovně naplnitelný jehlou při podkožní injekci. Takové nepřirozeně se vyskytující perivaskulámí reservoáry se implantují během chirurgického zákroku při vytváření arteriovenózního štěpu. Opětovně naplnitelné perivaskulámí reservoáry se vytvářejí z materiálů používaných v hrudních implantátech a jsou s výhodou používány ve spojeni se semipermeabilní membránou, která umožňuje difúzi oligonukleotidu do
»» *
t fi • < “ * * perivaskulámí tkáně. _______ _______...... __ * t- — - Pň ex v/vo-aplikaci oligonukleotidů;pro prevenci selhání vaskúlámích štěpů tvořených . žílami, zejména při procedurách bypassu, jsou žily kontaktovány ex vivo s oligonukleotidem komplementárním k jadernému protoonkogenu mRNA. Obecně jsou žíly inkubovány alespoň 10 minut při teplotě 20 až 37 °C ve sterilním fyziologicky přijatelném pufru. Kratší doby jsou .-·*. ^ přípustné při obzvlášť vysokých koncentracidi. Delší inkubacní doby mezi 30 až 90 minutami jsou
také vhodné a kompatibilní s dobou zpoždění mezi vyjmutím žíly a transplantací v takových ; procedurách. Nižší inkubacní teploty, jako 4 °C jsou také použitelné, zejména když žíla musí být — · · . J· ........ ,γ '. ’·**· >
transportována ze vzdáleného donomího nústa,-ve spojenítsíbbecněfyyššínii koncentracemi—— oligonukleotidu. Obecně se koncentrace pohybuji od 5 do 500 μΜ v závislosti na délce inkubace, I
v.rdzmezí 22 až 37°C. Výhodně se koncentrace oligonukleotidu pohybuje v rozmezí 10 až 100 μΜ a výhodněji 25 až 100. ,μΜ. Ukazuje se, že je použitelných mnoho typů fyziologicky přijatelnýchpufrů,· jako 0,9% solný (NaCl) nebo fosfátový fyziologický pufr a další pufiy a šoli
- - zde popsané.-Ukazuje^.^ppdlé.ýjgn^eafje^pouateJných mnoho fypů žil, včetně žil nelidských,
žil z geneticky manipulovaných savců, zejména vepřů, a mnoho lidských žil pro vytvoření
Při intravaskulární aplikaci (např. pro prevenci restenosy po angioplastice), jsou antisensní oligonukleotidy s výhodou administrovány do blízkosti leze prostřednictvím katetru zevnitř ,b lumene, nebo skrz adventiciu (to jest nejvnější vrstvu stěny cévy) s materiály napomáhajícími pomalému uvolňování antisensní látky (např pluronický gelóvý systém jak popisuje Simons et al., Nalure, 359, 67-70 (1992), nebo porézní balónek nebo iontoforetický balónek jak popisuje
U , * *
Fernandez-Ortiz et al., Circulation, 89, 1518-1522 (1994); metody jsou zde zahrnuty v odkaze).
Další techniky pomalého uvolňování pro lokální podávání zahrnují stenty obalené antisensní látkou, např. s použitím ovinutí nebo gelu (Wilenský et al., Trends in Cardiovascular Med., 3, 163-170 (1993)). Dávka dopravovaná k cílové lézi je v rozmezí I pg až 10 mg pro každou nebo obě antisensní látky použité ve farmaceutickém přípravku. S výhodou je dávka v rozmezí 1 pg až 1 mg; ještě výhodněji je dávka v rozmezí 1 pg až 10 pg? S výhodou je doba dopravování v rozmezí 30 sekund až 60 minut; ještě výhodněji je v rozmezí 30 sekund až 1-2 minuty (např. Zalewski et al., str. 79-87, Coronary Angioplasfy, Goldberg, Editor, Davis, Philadelphie, 1988).
Při katetrové administraci je administrovaná dávka v rozmezí 0,1 až 10 mg na arterii,
* · výhodně 0,25 až 4 mg na arterii a ještě výhodněji 0,5 až 3 mg na arterii. Administrovaná dávka je množství léčiva aplikované do tkáně, kde jako “dávka dopravená k cílové lézi” je v množství léčiva v tkáni po dodání do tkáně.
Techniky koronární angioplastiky jsou odborníkům podle stavu techniky dobře známy a detailně jsou popsány v zevrubných pojednáních (Clark, Coronary Angioplasty, Liss, New York, 1987; Vliestra et al., citovaný výše a tak podobně).
Při nadbytečné formaci jizev v kůži, např. poschiiurgických jizev, keloidní chorobě, a tak podobně, je pro inhibici syntézy proteinů extracelulámí matrice, zejména syntézy kolagenu, kožními fibroblasty, preferovaná povrchová aplikace nebo aplikace do kůže.
Při povrchové aplikaci je administrovaná dávka (množství léčiva aplikované do tkáně) obecně v rozmezí 0,01 pg až 10 mg léčiva na cm2, výhodně 0,2 pg až 7 mg léčiva na cm2 a ještě výhodněji 0,5 mg až 4 mg léčiva na cm2. Administrovaná dávka pro použití s postchirurgickým obvazem je výhodně 0,2 až 4 mg léčiva na cm2. Administrovaná dávka pro použití s povrchovými krémy při kožních abrazích, kožních lézích, akné a postchirurgické terapii je výhodně 0,5 až 3 mg léčiva na cm2.
Při urologických poruchách vedoucích k urethrálnimu, ureterálnímu zjizvení nebo zúžení nebo k zjizvení nebo zúžení měchýře, je preferovaná lokální administrace prostřednictvím katetru nebo implantáty obalenými antisensním oligonukleotidem.
Při nadbytečném zjizvení vnitřních orgánů obsahujících buňky hladkého svalstva a fibroblasty, jako gastrointestinální orgány, žlučovody, plíce a játra, je administrace antisensních látek systemická nebo lokální. Lokální administrace zahrnuje přímou injekci antisensních oligonukleotidů do cílového orgánu, dopravování implantovanými gely nebo polymery nebo pomalé uvolňování z obalených stentů nebo jiných prosthetických materiálů.
Pro každou z výše popsaných poruch jsou kritéria pro výběr pacientů pro terapii a prostředky dosažení terapeutických cílů podle stavu techniky specifických poruch dobře známa. Na příklad při vaskulámí restenose faktory spojené s náchylností k stávám zahrnují mužské pohlaví, rozšíření při stenose bypassového štěpu, základní linii Canadian Heart třídy 3 nebo 4 a infarkty myokardu (Holmes et al., Chapter 12 in Vliestra et al., editors, PTCA, Davis Company, Philadeiphia, 1987). Účinnost terapie se stanovuje stejným způsobem jako při jiné PTCA technice. Obvykle se výsledky určují visuálně, ale jsou k dispozici další techniky. Stanovení selhání místa hemodialyzačního přístupu zahrnuje barevný Dopplerův ultrazvuk, kontrastní angiografii a ultrazvuk (např., Dousset et al., Radiology, 181, 89 (1991); Nonnast-Daniel et al., Lancet, 339 • · *.*
JÍ • »·· * ·*' ť\ . * • t*4 • · · # '· ♦ ♦ * *· f . · .· r _ · b· '# .♦ * **·+· í4*· *
Λ r.· (8786),-143 -(1992);-Davidson.et:M r^a^éy 7Hte77M/ió»qZ, 40, 91-95 (1991);jrnetody jsou zde’;. zahrnuty do odkazu) a fyzické nálezy (j akosilně zvýšený_bruit.· přes místo prístygu nebo puls - “vodního kladiva”). Stanovení vážnosti stenosy nebo restenosy (pro určení kandidáta přo PTCA·;
nebo rvýsledků PTCA) se provádí v rozmezí od visuálního pozorování lézí po komplexní počítacovoú analýzu rozměrů v úvahu přicházející arteríe, např. z tomagrafických údajů - průtoku. ďístálním.vaskulánum řečišti, densitometričké charakteristiky stenosy, regionální změny-pohybu · 7/Ί-·..... / stěny v zóně leže (např. Bove, Chapter 9 in Vliestra et al.1, citováno výše).
·. ^ . . z» •T‘
*.
K<* * s
F . i
..i ty .<J i · v i; *
Pnkladvprovedeni vynálezu ř ,. ..
* '* ' · f . .-'i· + ‘υ·' ' ’ . Přikladl , ·*·* - či* f .* )H
-i >* — te; ' >
• 4' +'V / i
V ?* · ’ ’ ' · . + *1 .» .' i 4 y,
- -Ů '
Remodelování arterializoyané prasečí žíly,. - in vivo model· pro ztrátu průchodnosti . , arteriovenózních Štěpů.
·· r-í., ., j,
- -Pro děmpnstrad úěinnosti:OhgojnjldeotiduTppdle_vj®ál^?upn redukci produkce proteinu extracelulární matrice v žílové doméně arteriovenózního štěpu, se nejprve.vyvinul in vivo prasečí model. Tento model umožňuje monitorování průchodnosti arteriovenózního štěpu včetně žílové \ 4.* f -.
domény štěpu.
< ‘ ; · ϊ\ i - 11 , *, >i . * V prasecím arterializovaném žílovém modelu jsou safenózní žíly vyříznuty a potom . - /·· -¾^.^ ΛΓ4;. ,..:.,...+¾ / y- . -i'». . Λ/:/·.· ’ anastomováriy, konec-kě-koňci, ke-karotickým arteriím. Po ukončení chirurgického zákroku se nechal průtok arteriální krve znovu nabýt normálních arteriálních tlaků (Violaris et al., Aňh.
Thorac. Surg., 53, .667-71 (1995); Angelini et al., J. Ihorac. Cardiovas. Surg., 99,433-9 (1990); metody jsou zde zahrnuty do odkazu). Vysoký arteriální tlak v konec-ke-konci safenózním žílovém štěpu , simuluje vystavení, žíly vysokému arteriálňímu tlaku v artenovenózním nebo venózním štěpu. Žílové domény yenózních štěpů (n = 7) se odstranily osm dni po konstrukci štěpu a podrobily histologické analýze, pokud není uvedeno jinak. Pro srovnání se použily normální koronární žíly nevystavené arteriálňímu tlaku.
I* .1.:
r:
V ' ‘ fF* *r í'
Λ>
-<, :<
. Λί
Normální netransplantované žíly a žíly nevystavené arteriálňímu tlaku neukázaly Žádnou zesílenou perivaskulární tkáň, perivaskulární prostor s malým množstvím pojivové tkáně a nespojitou adipózní tkáň, a tenkou a neporušenou mediu, jak ukazuje Obr. 2a (Verhoeffovo barvivo). Žílové domény štěpů vykazovaly nárůst perivaskulární tkáně, která obklopila mediu jako límec s velkým množstvím granulované tkáně. To bylo ukázáno Verhoeffovým barvením, jak
ukazuje Obr. 2b. Stejný řez také vykazuje intaktní a neporušenou mediu postrádající disekci. V některých sekcích se v 8 až 14 dnech po chirurgickém zákroku pozorovala neointima.
Normální netransplantované žily a žíly nevystavené arteriálnímu tlaku ukázaly malé množství nepojivové perivaskulámi tkáně a mediu barvenou Šímovou červení, jak ukazuje Obr. 3 a. Naproti tomu žílové vykazovaly domény štěpů nárůst uložení kolagenu v perivaskulámi tkání již po osmi dnech. Velká množství hustého perivaskulámího kolagenu se barvila Sirriiovou červení, specifickým barvivém pro fibrilámí kolagen (včetně typu I a IH), jak ukazuje Obr. 3b. Media vykazovala menší zbarveni než perivaskulámi tkáň. V řezu s neointimou byl kolagen h ? - <
zřetelně přítomen.
Normální netransplantované žily a žily nevystavené arteriálnímu tlaku neukázaly žádný α-aktin v perivaskulámích vrstvách a vrstvách adventicie s použitím protilátek proti a-aktinu. Positivně na α-aktin se barvily pouze buňky hladkého svalstva v medii, jak ukazuje Obr. 4a. í.
Naproti tomu žílové vykazovaly domény štěpů vykazovaly náriist syntézy α-aktinu v medii a v adventicii. Velká množství α-aktinu v medii se barvila protilátkami specifickými proti a-aktinu, jak ukazuje Obr. 4b. Zbarvení medie indikuje přítomnost buněk hladkého svalstva syntetizujících α-aktin v medii. Také adventicia vykazovala zbarvení na α-aktin, což indikovalo myofibroblastovou syntézu α-aktinu. Také perivaskulámi tkán vykazovala zbarvení na a-aktin.
Žíly se také barvily na desmin, který je exprimován buňkami hladkého svalstva, s použitím anti-desminových protilátek. Normální netransplantovaná žíla a žíla nevystavená arteriálnímu tlaku ukázala zbarveni na desmin pouze v medii, jak ukazuje Obr. 4c. Podobně žílové domény venózních Štěpů vykázaly zbarvení na desmin v buňkách hladkého svalstva pouze v medii. Velká množství buněk hladkého svalstva v medii se barvila pozitivně protilátkami proti desminu, údaje nejsou uvedeny. Žádné zbarvení na desmin se nepozorovalo v perivaskulámi tkáni nebo adventicii, což indikovalo dvě populace buněk syntetizujících α-aktin: jedna populace lokalizovaná v medii (buňky hladkého svalstva, pozitivní na desmin, pozitivní na α-aktin) a jedna populace lokalizovaná v adventicii (fibroblasty a myofibriblasty; negativní na desmin; pozitivní na a-aktin).
Žílové domény Štěpů vykazovaly nárůst proliferace buněk v medii a perivaskulámi tkáni. Velká množství proliferujícich buněk v medii a perivaskulámi tkáni se barvila protilátkami specifickými na jaderný antigen proliferující buňky (PCNA), markér buněčné proliferace, jak ukazuje Obr. 5a. Pro srovnání se podobný řez barvil Verhoeffovým barvivém, Obr. 5b a Šímovou červení, Obr. 5c. V tomto řezu se pozoruje raný vznik neointimy, na Obr. 5b jako tenká tmavá i ' ,W ·
* r •J: ' '*·* '.«r
Λ 23 *
* i
·.*( ‘ ./
V ' *·
·.<
’λ- ··' ·.
Μ»fc « vrstva několik-buněk-od lumene „transplantované žňy. Normálně neointima v žíle není. Vyšší W zbarvení na kolagěn v périvaskuláriutkániwe.srovnMÍ.sjn^digaje zřetelnější.při větším zvětšení, jak ukazuje Obr 5c. Zbarvení.na PCŇA še kvantifikovalo: 30 % buněk v transplantovaných žilách * . - c ' . , - , ·,.' ť ;·*_.. .. .
1 se barvilo pozitivně na PCNA, zatímco méně než 1 % buněk y netransplahtovaných žilách še . ,’λ ý : ‘ Λ- ‘--A·· > ' .„· : barvilo pozitivně na PCNA. <; ,.<. . /·.·’ • i. ' -V ; J X ’ 1 · - - · . . ·*>·' . |/ ‘j.’ siHM^^Tytórvýsledky potvrzují.relativně raný nárůst produkce extracelulární matnce-fibroblasty, myofibroblasty a buňkami hladkého svalstva v pojivové tkáni a stěně cévy transplantovaných žilách odpovídající .vysokým arteriálnim tlakům.' Nárůst tloušťky tkáne a buněčné proliferace
Zť... ' ί . -..τ; . TX,; ď __' *' --.7 v __-___ v . H', . f .-f.
okolo žíly, včetně pojivovU tkáně v penvaskuiárnírn 'prostoru: (\Znik^jižev)/;mphóyjbránit(J/^~ žádanému rozšířeni žíly v odpověď na artenální krevní tlak. .»·, · • ' ’ <' ’ *·-.·’·< :í Ř,r ★. .''-i **· .,7 ·. ’ 'a.·; '
Inhibice produkce extracelulární matrice ve vaskulámích buňkách (např. v buňkách j hladkého svalstva a fibroblastech),’ např. syntézy kolagenu, je také specificl^ ukázána v Příkladech .
6, 9 a 13? . ?
Λ i· .h
K.
,-Á '5 .t·.
ílt. ‘ i
Priklad-2 L, £ ' **· ř: .1 · λ
• r *jí.
,s' ΐ*
ř.
.4 i:
.*,*· tf;
* .
Lidská arterializovaná žíla - model pro ztrátu průchodnosti arteriovénózních štěpů.
Pro demonstraci nárůstu produkce extracelulární matrice jako následku arterializace žil v lidech, se studovaly lidské žíly arterializované chirurgickými bypassy Výsledky z lidí jsou . - —- w ·. .i-·-·<<;·;,' .-Λ · · « . 'T , • · í. B · · f 1 - -.· * - » _ -» , . i»
- ř ·. , _· ; . ‘‘V - '·^.
překvapující, neboť zásadně nebyla detekována buněčná proliferace, nicméně v cévní stěně bylé přítomno Značné zbarvení na kolagen.
Lidské safenózní žíly, které posloužily jako aortokoronárinbypassový štěp, sé vyjmuly z ,*· těla pacienta dva roky po diagnóze okluze. Arteriáiní krevní tok vystavuje žílu; normálním arteriálriím tlakům: Žílové domény aortokoronáihích štěpů se podrobily, histologické analýze.
Lidské žílové domény aortokoronámích štěpů vykazovaly nárůst v périvaskulámí tkáni a neointomální tloušťku. To bylo prokázáno Verhoeffovým barvením, jak ukazuje Obr. 6a. Zesílená neointima nahradila médiu a je pozorovatelná ztráta průchodnosti žíly. Tato žíla je částečně okludovaná kvůli ztrátě vnitřního průměru žíly. Naproti tomu normální lidská safenózní netranspiantovaná žíla a žíla nevystavená arteriálnímu tlaku nevykázala žádnou zesílenou 1 ř ',τ périvaskulámí tkáň a tenkou, neporušenou a nedisektovanou mediu, údaje nejsou uvedeny.
Lidské žílové domény aortokoronámích štěpů také vykazovaly velké množství kolagenu v périvaskulámí tkáni a v medii. Velké množství kolagenu se barvilo pozitivně Sirriovou červení, t ' specifickým barvivém pro fibrilámí kolagen (včetně typu I a ΙΠ) v perivaskulámí tkáni a v medii, jak ukazuje Obr. 6b.
Lidské žílové domény Štěpů vykazovaly malá množství α-aktinu v neointimě a žádný α-aktin v perivaskulámí tkáni, s výjimkou pozitivního zbarvení ve vasa vasorum, protilátkami specifickými pro α-aktin, jak ukazuje Obr. 6c. Nedostatek zbarvení v medii a v perivaskulámí tkáni indikuje, že pouze málo buněk produkovalo α-aktin. Namísto pozitivního zbarvení na a-aktrn, se tyto řezy, jak ukazuje Obr. 6b, barvily výrazněji na kolagen, což indikuje, že zjizvená tkáň vyplnila jak perivaskulámí tkáň, tak stěnu cévy.
Lidské žílové domény aortokoronámích štěpů nekazovaly žádnou buněčnou proliferaci v medii a v perivaskulámí tkáni. Žádné buňky v medii a v perivaskulámí tkáni se nebarvily protilátkami specifickými pro jaderný antigen proliferujíci buňky (PCNA), markér buněčné proliferace, jak ukazuje Obr. 6d. I při zvětšení 25x bylo nalezeno několik pozitivně zbarvených buněk. Zbarvení na PCNA se kvantifikovalo a méně než 1 % buněk v transplantovaných lidských žilách se barvilo pozitivně na PCNA.
Příklad 3
Lidské a prasečí cévové orgánové kultury - model pro účinnost neluminálního dodávání oligonukleotidu a inhibicí cévní odpovědi na poranění.
Pro demonstraci účinnosti oligonukleotidu podle vynálezu při redukci produkce proteinů extracelulámí matrice a vaskulámího kompromisu po procedurách zavedení arteriovenózního shuntu nebo bypassu se nejprve vytvořil model orgánové kultury. Tento model umožňuje monitorování příjmu oligonukleotidu, stimulace vaskulámích buněk B-řetězcem od destiček odvozeného růstového faktoru (zde značeného “PDGF’) a inhibice PDGF stimulace vaskulámími buňkami oligonukleotidy podle vynálezu.
Pro prasečí cévovou orgánovou kulturu byly vyňaty vnitrní karotické arterie nebo arterie z prsních žláz (n = 3) a rozřezány na kroužky o tloušťce 5-15 mm. Kroužky se inkubovaly za podmínek orgánové kultury po různé časy, jak je uvedeno níže. Pro model lidské cévové kultury se vyňaly safenózní žíly z pacientů podstupujících bypassový chirurgický zásah. Po vyjmutí se nepoužité žílové segmenty rozřezaly na kroužky o tloušťce 5-15 mm.
Pro stanovení efektu c-myc oligonukleotidů na buněčnou proliferaci se prasečí vaskulámí ____kroužky čtyři dny inkubovaly při 37 °C v médiu bez séra (DMEM, Dulbecco s Modified Eagle s » *
I ♦···»·* *< A '' | r r · · · r ·'.·· ’**’**' • '' ....».· , , ·'»··· ť“ ' r l -Λ ř * '<
. ‘ ' .· ’ ' 25 ř ’ . * . . · . i + . '
.. Medium) s antibiotiky a 1 % Neutrddoma,· s ncbo.bez PDGF (100 ng na ml), pokud není uvedeno _ ~ a- /ínak? PDGF normálně stimuluje váskulámi buňky,-např.-buňky hladkého1 svalstva a fibrpblasty ’_____ ’ , k proliferaci a je známo, že jej uvolňují destičky po poranění tkáně pro léčení rány. PDGF indukovaná proliferace buněk se měřila PCNA zbarvením, jak je zde uvedeno. I po čtyřech dnech si kroužky zachovaly svou morfologii. . . ť
Prasečí cévy/ orgánové kultuře odpovídaly ná PDGF stimulaci. Prasečí cévy v orgánové .
*·· . ”···· -------.··' r-rT”-TT-,;·'ii.
kultuře vykázaly buňky pozitivně zbarvené na PCNA v adventičii a v medii, jak ukazuje Obr. 7a. Hnědé jaderné zbarvení presentuje PCNA zbarvené buňky* zatímco purpurově zbarvené buňky ” jsou zbarvené počitadlovými barvami hematoxyliném á cosinem ~P ercehtuální zastoupeni buněk - ΓΤ ’ pozitivně zbarvených na PCNA bylo 15± 5 % (n = 3). Kontrola, cévyinkubované pouze v.médiu ..
bez séra bez PDGF nevykázaly žádné signifikantní PCN A zbarvení. Buněk pozitivně zbarvených * \ *, J A na P.CNA bylo méně než 1 %, jak ukazuje Obr. 7b. i , >
Oligonukleotidy podle vynálezu inhibovaly PDGF indukovanou stimulaci prasečích cévových orgánových kultur. Přídavek oligonukleotidu (sekvence ID No:l, 16 pMj inhiboval ' ;-·- PDGF índukovanou buněčnou proliferaci, jakLukazujejObr, 7c. „Po 4. dnech inkqbáce; s _ / oligonukleotidy bylo PCNA zbarvení 2 ± 0,2 % buněk (n = 3; p < 0,00 i versus samotný PDGF).
Pro umožnění difúze oligonukleotidu do cévové stěny lidské žíly se lidské safenózní žíly · . . v, inkubovaíy s oligonukleotidem. Oligonukleotidy podle vynálezu rychle difundovaly do lidských žílových orgánových kultur. Přídavek fluoresceinem koncově značeného oligonukleotidu (sekvence ID No. 1, 100 μΜ) do média orgánové kultury vedl k rychlé, časově závislé difúzi značeného oligonukleotidu do lidských žil při irikubačních Časech 2 sekundy (pokojová teplota), 30 minut (37 °C), 1 hodina (37 °C) a 3 hodiny (37 °C), jak ukazuje Obr. 8a-8d. Značené oligonukleotidy difundovaly jak přes luminální povrch žil, tak přes perivaskulámí povrch žil. Oligonukleotidy se po čase lokalizovaly jak v buňkách, tak buněčném jádru. Kontrolní lidské žíly A *
inkubované bez oligonukleotidu vykázaly malou autofluorescenči, i při uzávěrkových expozičních časech 2-3x delších než uzávěrkové časy pro žíly inkubované s oligonukleotidy. . *
Tyto údaje jsou v souhlase s tím, že oligonukleotidy podle vynálezu inhibují PDGF indukovanou stimulaci vaskulámich buněk ve stěně cévy. Tyto údaje také demonstrují účinnost dodávání oligonukleotidu z perivaskulámí tkáně cév, místo použití luminálního dodávání oligonukleotidu. Zejména může být dodávání oligonukleotidu z perivaskulámí tkáně použito ex vivo pro dodávání oligonukleotidu vyňatým žilám nebo arteriím užitým při venóznich štěpech nebo jiných typech vaskulámich štěpů. Navíc se může perivaskulámí tkáň vystavit působeni oligonukleotidů podle vynálezu in vivo a umožnit tak přenos oligonukleotidů do stěny cévy, pro zabránění zesíleni stěny cévy a perivaskulámí tkáně.
Příklad 4
Dva prasečí modely demonstrují in vivo perivaskulámí dopravování oligonukleotidů.
Pro demonstraci účinnosti perivaškulámího dopravování oligonukleotidů podle vynálezu se testovaly dva in vivo prasečí modely. U prvního modelu se chirurgicky odkryla prasečí femorální žíla a oligonukleotid se vstnkl do okolní pojivové tkáně perivaskulámí tkáně. U druhého modelu se chirurgický zákrok neuskutečnil a oligonukleotid se vstnkl podkožně do pojivovové tkáně v okolí prasečích žil. Tyto modely umožnily monitorování příjmu oligonukleotidů po administraci buď 1) perivaskulámí injektáží před nebo po konstrukci arteriovenózního štěpu před uzavřením chirurgicky manipulovaného místa, nebo 2) podkožní injektáží do perivaskulámí tkáně v případě nutnosti opakované postchirurgické administrace. Koncově fhioresceinem značené oligonukleotidy (sekvence ID No: 1) se vstrikly v koncentraci 100 μΜ (10 mg) dů obou modelů s použitím 22 kalibrované jehly.
In vivo příjem oligonukleotidů byl rychlý po přímé perivaskulámí aplikaci oligonukleotidů do chirurgicky odkryté žíly. Fluorescence se pozorovala v jádru buněk lokalizovaných v cévě a perivaskulámí tkáni během 30 minut (údaje nejsou ukázány) a dvou hodin (Obr. 9a), což indikovalo, že oligonukleotidy difundovaly přes difuzní bariéry stěny cévy a perivaskulámí tkáně.
In vivo příjem oligonukleotidů byl také rychlý po podkožní injekci. Fluorescence se pozorovala v jádru buněk lokalizovaných v cévě a perivaskulámí tkáni během 30 minut (Obr. 9b) a tří hodin (Obr. 9c), což indikovalo, že oligonukleotidy difundovaly přes difuzní bariéry steny cévy a perivaskulámí tkáně.
Tyto výsledky ustavuji perivaskulámí dopravování jako způsob administrace oligonukleotidů podle vynálezu do štěpů, zejména perivaskulámí dopravování oligonukleotidů do arteriovenózních a venóznich štěpů. Obecně oligonukleotidy mohou být vstřikovány jak se zde ukazuje, nebo oligonukleotidy mohou být dopravovány prostřednictním jiných prostředků, které umožňují dopravování oligonukleotidů do perivaskulámí tkáně, jako implantabilnich reservoárů, časem uvolňujících gelů nebo matric a oligonukleotidem impregnovaných materiálů nebo zařízení jako PTFE hadice, jak je zde diskutováno. Tyto typy způsobů perivaškulámího dopravování se mohou použít pro dopravení oligonukleotidů podle vynálezu při prevenci zesílení perivaskulámí tkáně nebo stěny cévy v artenovenóznich štěpech, zejména žílových domén přístupových míst hemodiaiýzy používaných u hemodialyzovaných pacientů. Úspěch podkožní injekce také indikuje účinnost opakovaného dodávání oligonukleotidu do arteriovenózního Štěpu, fzejměria postupových míst hemodiaiýzy používaných u hemodialyzovaných pacientů. Vedle uvedeného úspěšného dopravování oligonukleotidu do penvaskulámích míst žil je luminální dopravování do arterií také ukázáno v příkladech 8, 18a 19.. j ··.
Příklad 5 — 4.
Klinický protokol přístupového místa hemodiaiýzy.
*· · -r ’ 4 .
Pacienti vyžadující přístupová místa pro hemodialýzu poprvé nebo nahrazení selhávajících míst budou podrobeni terapii oligonukleotidy podle vynálezu. Terapii budou podrobeny buď 4 '* •U. . li L pištěle, nebo Brescia-Cimirio pištěle.
_ J -1' . v
Pacienti budou dostávat oligonukleotidy o sekvenci BD.No: 1, 5 nebo 6. Oligonukleotidy budou obsahovat fosforothioátové nebo fosforamidátové vazby. Lyofilizoyané oligonukleotidy s fosforothioátovými vazbami jsou suspendovány v pufru jak sě zde popišújé.Oligóhúkléótidý s fosforothioátovými nebo fosforamidátovými vazbami se syntetizují podle procedur zde diskutovaných a uchovávají se za sterilních podmínek. Oligonukleotidy s různými sekvencemi se administrují odděleně a pacienti mají během terapie dostávat pouze jednu sekvenci.
Pacieritům je administrováno-1-10 mg oligonukleotidu,v čase chirurgického zákroku v místě hemodíalyzačního přístupu. Oligonukleotidy jsou vstřikovány do perivaskulámí tkáně v žílové oblasti arteriovenózníhp shuntu s použitím standardní kalibrované jehly. 22 nebo menší .’Po vstříknutí je chirurgický zákrok ukončen. Pacientům je opakovaně administrováno 1-10 mg oligonukleotidu s použitím podkožních injekcí v týdenních intervalech po 6 měsíců. Podkožní injekce u pacientů s obtížně nahmatatelnými žílami.jsou řízeny podle sonogramů. Jinak se injekce
X..
řídí nahmatáním oblasti arteriovenózního shuntu, zejména v žílové doméně shuntu.
U pacientů je během prvního roku monitorována fimkční průchodnost místa hemodíalyzačního přístupu. Sonogramy nebo angiogramy místa se provádějí v 1. týdnu a ve 3, 6 a 12 měsících. Rychlosti průtoku se určují s použitím Dopplerovy a ultrazvukové techniky, jak se zde diskutuje.
Oligonukleotid použitý pro administraci se vybírá a syntetizuje způsobem zde diskutovaným a podle stavu techniky známým. Sekvence a způsoby diskutované v tomto přikladu t ♦ t
Ís w
'-Η a dalších příkladech by neměly být chápány jako omezení rozsahu vynálezu, ale jako specifické provedení vynálezu. Další oligonukleotidy musí být pouze konsistentní se strukturou zde navrhnutou. Není nutné, aby oligonukleotidy působily určitým mechanismem účinku zde navrženého, pokud oligonukleotidy jsou příznivě testovány v iv vitro a in vivo modelech zde použitých.
Příklad 6
Inhibice syntézy kolagenu v lidských buňkách hladkého svalstva.
V tomto příkladu se explantované lidské buňky hladkého svalstva provádějící syntézu kolagenu podrobily terapii omyc nebo c-myb antisensním oligonukleotidem a porovnaly s kontrolami nepod robenými terapii a/nebo podrobenými “sensní” terapií.
Lidské buňky hladkého svalstva (SMCs) byly získány ze safenózních žil pacientů podstupujících běžný bypassový chirurgický zákrok. Buňky se izolovaly explantační metodou. Explantáíy se umístily do mističek tkáňové kultury obsahujících Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM) doplněné 20% zahřátím inaktivováným fetálním hovězím sérem (FBS), 100 IU/ml penicillinu, 100 pg/ml streptomyciňu a 2 mM/ml glutaminu (CM-20). Kultury se uchovávaly při 37 °C v humidifikovaném inkubátoru s 5% CO2. Buňky vykazovaly typické morfologické charakteristiky vaskulárních buněk hladkého svalstva, to jest tvar vřetene a vzor pahorek-a-údolí. Identifikace vaskulárních buněk hladkého svalstva byla dále potvrzena in silu barvením α-aktinem hladkého svalstva. Buňky rostly do konfluence a byly subkulturovány každých Ί dní. Pro experimenty se použily pouze lidské buňky hladkého svalstva z 3. nebo 4. pasáže.
Pokusy se prováděly se subkonfluentními a post-konfluentními lidskými buňkami hladkého svalstva. Buňky se umístily na plotny o 10 000/cm2 (subkonfluentní) nebo 25 000/cm2 (post-konfluentní) obohacené CM-20. Tri dny po umístění na plotny se přidal čerstvý CM-20 obsahující kyselinu askorbovou (50pg/ml). V různých experimentech se ke kulturám přidaly následující oligonukleotidy (16 μΜ):
antisensní (5-AACGTTGAGG GGCAT) (sekvence ID No: 1);
sensní oligomer (5'-ATGCCCCTCA ACGTT) (sekvence ID No:2);
bp chybně spárovaný oligomer (5'-AACGTGGATT GGCAG) (sekvence ID No:3); scrambled oligomer (5-GAACGGAGAC GGTTT) (sekvence ID No:4);
r » * r - < - F < ’ f ♦ r r . r * · « » * » » · · · » » r *
•«' nebo c-rnyb antisensní (5-TATGCTGTGC CGGGGTCTTC GGGC) (sekvence ID No:5). * 1 O 24 hodin později se kulturační médium oddělilo pro Western blótý a buňky se podrobily / analýze RNA. Při každém pokusu se prováděl test exkluze trýpanové modře. “' Á Kolagen se měřil následujícím způsobem: Pro měření kolagenu Western blotem se použily jak vzorky vystavené působení pepsinu (triplé-helikální doména kolagenu I), tak vzorky nevystavené působeni pepsinu. Vzorky přes noc inkubovaly při 4°C v pepsinu (1 mg/ml) a kyselině octové (0,5 mol). ÁlikvotyA^stéjňýčhAbjériiěch TOórku se koncentrovaly rychlostní vakuovou centrifugou a poté se vzorky rozpustily v SDS gelu s pufrem (50mM TRIS-HC1 pH 6,8, .JOOmM dithiothreitol,2%SDS,0,l%bromofenolovámodř a 10% glycerol) a povařilylOminut. Následovala centriíugace při 11 000 10 minut a vzorky se dělily elektroforeticky na 7,5% SDS-polyakrylamidovém gelu a přenesly na nitrocelulózový filtr. Po inkubaci v blokovacím roztoku se filtry obsahující vzorky inkubovaly s biotinem značenou primární protilátkou proti
- - ' ’ ·.·.»/· - - - . . . ... - . ; · . .. lidskému kolagenu I a ΙΠ (Southem Biotech. SC.) 1 hodinb při pokojové teplotě. /Filtry se promyly a potom inkubovaly se streptavidiném značenou křenovou peroxidázou. Po přídavku reakčniho substrátu se filtry vystavily rentgenovému filmu. Pokusy se opakovaly alespoň dvakrát při separátních příležitostech. ‘ ” “ - Lidské buňky hladkého svalstva použité ve všech pokusech prošly 3-4 pasážemi. Fenotyp těchto buněk se považuje za ireversibilne syntetický a spojený s různými stavy choroby. Ukázalo še, že abnormální akumulace kolagenu ve stěně cévy je způsobena hlavně těmito syntetickými buňkami. Jak subkonfluentní/tak postkonfluentní buňky hladkého svalstva produkovaly při ’Γ · . . . *·· ' •·Λ stimulaci sérem kolageny typu I a ΙΠ. *'.··
V subkonfluentních buňkách hladkého svalstva byla po terapii, c-wyc antisensním oligonukleotidem pozorována 80% redukce syntézy kolagenu typu I, ve srovnání s kontrolním vzorkem (bez přídavku oligonukleotidu) a s buňkami podrobenými působení c-myc sensního oligonukleotidu. V kónfluentních buňkách hladkého svalstva počty buněk počítané na Coulterově počítadle byly podobné u kontrolních buněk a buněk podrobených aňtisenšnímu i sensnímu působení. Při použití testu exkluze trypaňovou modří byla viabilita buněk 97 %, 96 % a 95 % u kontrolních buněk, buněk podrobených antisensnímu působení a buněk podrobených sensnímu působení. Kolagen typu I nebyl detekovatelný v buňkách podrobených c-myc antisensnímu působení. Buňky podrobené působení c-myc sensního oligomeru nevykazovaly při srovnání s kontrolním vzorkem žádný rozdíl v hladině kolagenu typu I proteinu. Kolagen triple-helikálního typu I se měřil po štěpení a výsledky ukázaly shodné trendy jako vzorky nepodrobené působení •j t ' pepsinu.
V subkonfluentních buňkách hladkého svalstva byla po terapii c-myc antisensním oligonukleotidem (16 μΜ) pozorována 80% redukce syntézy prokolagenu typu I, při srovnání s kontrolním vzorkem (bez přídavku oligonukleotidu) a se vzorkem podrobeným působení c-myc sensního oligonukleotidu. V postkonfluentních buňkách hladkého svalstva nebyl kolagen typu I detekovatelný v buňkách podrobených c-myc antisensnímu působení. Buňky podrobené působení c-myc sensních oligonukleotidu a otigonukleotidů 4bp chybně spárovaných nevykazovaly redukci *
v hladině kolagenu typu I proteinu při srovnání s kontrolním vzorkem (bez přídavku oligonukleotidu). Redukce kolagenu typu I jak v proliferujících tak v subkonfluentních buňkách hladkého svalstva napovídá, že inhibice syntézy kolagenu je nezávislá na inhibici buněčného růstu působením antisensních látek. Různé dávky (4, 8 a 16 μΜ) antisensního oligonukleotidu prokázaly redukci syntézy prokolagenu typu I závislou na dávkování. Podle testu exkluze
I trypanovou modří byla viabilita buněk po různém působení oligonukleotidu srovnatelná. Ve všech skupinách zůstalo životaschopných více než 90 % buněk.
V postkonfluentních buňkách hladkého svalstva byla syntéza kolagenu typu I zastavena c-myc antisensním oligonukleotidem při koncentraci 16 μΜ. V kontrolním vzorku (bez přídavku oligonukleotidu) a v buňkách podrobených působení oligonukleotidu se scramblovanou sekvencí byla hladina kolagenu typu I podobná.
Tyto výsledky jsou dále potvrzeny v příkladech 9, 13 a 17.
i
Příklad 7 ' 1 * * ’ r
Inhibice syntézy kolagenu v lidských buňkách kožních fibroblastů.
V tomto příkladu se explantované lidské buňky kožních fibroblastů (lidské FBCs) podrobily působení c-myc nebo c-myi antisensního oligonukleotidu a porovnaly s kontrolními vzorky nepodrobenými terapii a/nebo podrobenými “sensní” terapii.
, Lidské FBCs se získaly od pacientů podstupujících kožní transplantace a izolovaly se explantační metodou. Explantované FBCs se kultivovaly postupem popsaným pro lidské buňky hladkého svalstva a stejným způsobem se přidávaly antisensní a kontrolní oligonukleotidy. V pokusech se použily lidské FBCs ze 3. až 10. pasáže. Syntéza kolagenu.se měřila postupem popsaným v příkladu 6.
V konfluentních lidských FBCs redukovaly c-myc antisensní oligonukleotidy (8 a 16 μΜ) * 1 syntézu prokolagenu typu I v závislosti na dávkování. Buňky podrobené působení c-myc sensních oligonukleotidů, oligonukleotidů 4bp chybně spárovaných*! scramblovanýčh Oligonukleotidů
.....‘v·- ... .. ... ; . . __ / vykazovaly podobné hladiny kolagenu typu I proteinu ve srovnání s kontrolními buňkami (bez
-r *+· J A přídavku oligonukleotidů). ’:í '
V tť.
Tyto výsledky jsou také dále potvrzeny v příkladu 13. (
--f , , · , · *
J .·
Přiklad 8 t -. Redukce vzmku neointimy v prasečím modelu koronární denudace.
Účinnost c-myc antisensních látek při inhibici vzniků neointimy se testovala administrací *’ c-myc specifických antisensních (sekvence ID Nó:l) a placebo (sekvence ID No:21) fosforothioátových oligonukleotidů do místa koronární angioplaštiky ve standardním prasečím modelu s použitím konvenčních protokolů (např. Karas et al., J. Am. CoIÍ Card., 20, 467-474(1992); Schwartz et al., Circulatíon, 82,2190-2200 (1990)). Domestikovaná krosbrední prasata (Sus scrofd) se préd studií premedikovala orálně aspirinem (650 mg); Obecná anesteze spočívala v intramuskuiámí injekci ketaminu (12 mg/kg) a xylazinu“(8mg/kg).Další dávky ariestetikase· dávaly intrvenózně během pokusu. Po chirurgickém odkrytí pravé externí karotické arterie se praseti intravénózně administroval heparin (10 000 U) a nifedipin (10 mg) se dal bukálně. S' použitím 8 French SAL 1 zaváděcího katetru (Medtronic Interventional Vasculár, lne., Dan verš,
MA) se kanylovaly koronární ostie pod fluoroskopickým vedením. Po intrakoronámí injekci· * nitroglycerinu (100 pg) a před dodáním c-myc antisensního oligonukleotidů a placeba sé použil žvětšelý balónek angioplaštiky k poškození intimálních a mediálních vrstev arteriálních stěn nafouknutím při 6 až 10 atm, podle velikosti arterie, která se pohybovala od 2,0 do 3,5 mm a zadržením třikrát po 30 sekundách. Ihned po odstranění angioplastikového balónku se prováděla intramurální injekce (1 mg/ na cévu) do koronárních arterii s použitím separátního porézního balónku. Předem bylo určeno, že intramurální dopravování léčiva je bézpečríé, když tlak injekce nepřesáhne 4 atm, objem períuzátu byl 2 ml a poměr balonek-arterie 1,4 až 1. C-myc antisensní (13 replikátů) nebo placebo (12 replíkátů) oligomery se vstnkovaly pod tlakem 4 atm a ! dopravování bylo v průměru ukončeno během 27 sekund. Dávka oligomerů byla 1 mg na poškozenou koronární arterii. S dodáváním oligomerů nebyly spojeny Žádné adverzní efekty. Jeden měsíc po dopravení byla zvířata utracena a v místech poškození se morfometrií určila maximální neointimální oblast (NA max), neointimální tloušťka (NT max) a residuální lumen.
Výsledky (průměr ± SEM) jsou uvedeny v níže Tabulce I:
Tabulka I
| Oligomer | Replikáty | NA max (mm2) | NT max (mm) | RL |
| (%) | ||||
| Placebo | 12 | 0,80 ±0,17 | 0,48 ± 0,09 | 64 |
| ± 6 | ||||
| Antisensní | 13 .. | 0,24 ± 0,06 | 0,20 ± 0,04 | 81 |
| ±5 | ||||
| P | <0,01 | <0,01 | ||
| <0,05 |
Obr. 10 ukazuje fotografii průřezu exemplárního kontrolního vzorku (to jest po injekci sensního oligomeru) koronární arterie jeden měsíc po poškození. Pozoruje se signifikantní neointimální tloušťka (viz Šipky). Obr. 11 ukazuje fotografii průřezu exemplární koronární arterie podrobené antisensnímu působení.Pozoruje se značná redukce neointimy. Při analýze maximální neointimální oblasti jako funkce stupně poškození (Obr. 12) vykazují regresní linie presentující vztah mezi neointimou a poškozením (to jest vážnosti poškození) signifikantní rozdíly ve sklonech (p < 0,01). Jak ukazuje Obr. 12, antisensní oligomery Signifikantně redukovaly vznik neointimy, zejména při pokročilejším poškození.
·. λ
Příklad 9
Inhibice produkce extracelulámi matrice v lidských buňkách hladkého svalstva působením omyc antisensního oligonukleotidu.
Tento příklad dále ukazuje účinnost působení c-myc antisensního oligonukleotidu při inhibicí syntézy proteinu extracelulámi matrice lidskými buňkami hladkého svalstva, zejména prokolagenu I a ΠΙ. Tento přiklad také dále potvrzuje pozorování z příkladu 6. Antisensní terapie významně redukovala hladiny extracelulámího prokolagenu ve stimulovaných lidských buňkách hladkého svalstva (s působením 20% FBS).
¢.
A. Měření prokolagenu I a prokolagenu HI, Wěsteni-blotenv > Přo další potvrzení, že c~myc antisensní pligonuklebtidy‘inhibují-syntézu-proteinů-
extracelulárni matrice, se měřil prokolageriž lidských buněk hladkého šxůlstval a HI.Hj·
Jak intraceiulámí tak extfacelulámí prokólagen (typu *Pá ΠΙ) se měřil s pomoci Westem-blótó. Odpočívající lidské buňky hladkého svalstva se ponechaly v médiuDMEM ' ’ * · . ’ ·Χ ·► : . · s· ” · . - · .· ’ · · · , íDulbeccos Modified Eaele's Medium) s 5% FBS (fetální hovězí sérum). Lidské buňky hladkého
ť' L . ,’·,-»· svalstva se stimulovaly s něbo^bezohgopuidéptidů^vinědiu obsahujícím 20% FBS a-kyselinu^ áelrnřhminiiAn iin/mlt O íp 7námn -5p cťinínliiip «vntpvn nmlcnlaopnu v ltddcvr.li hlinkách
“ : - -> v, ·► r1
7-1 ’ 'i ·>'?
..3..
, /.‘i-· i,
.*·
L.KB Biotechnology, lne., Piscataway, NJ).
Pokud není uvedeno jinak, byly ve všech příkladech použity c-myc antisensní oligonukleotidy odpovídající sekvenci ID No: 1.
B. Inhibíce sekrece extracelulámího prokolagenu I a prokolagenu ΙΠ c-myc antisensními oligonukleotidy.
Hladiny prokolagenu se kvůli minimalizaci vlivu různých rychlostí růstu mezi experimentálními podskupinami určovaly v postkonfluentních buňkách hladkého svalstva s ustálenou hustotou. Po působení c-myc antisensních oligonukleotidů se v kondiciovaném médiu pozorovala značná redukce (90 %) extracelulámího prokolagenu I a extracelulámího prokolagenu ΙΠ, jak ukazuje Westem-blot (Obr. 13). Tento efekt byl koncentračně závislý v rozmezí 4 až 16 μΜ a docházelo k němu již po 3 hodinách po inkubaci buněk hladkého svalstva s c-myc antisensními oligonukleotidy (údaje nejsou ukázány).
Redukce extracelulámího prokolagenu I po přídavku antisensních oligonukleotidů nebyla ovlivněna přídavkem β-aminopropionitrilu a vyloučila se možnost antisensním působením vyvolaného zesíťování kolagenu (údaje nejsou ukázány).
C. C-myc antisensní fosforothioátové oligonukleotidy k exonům 1, 2 a 3 jsou efektivní inhibitory syntézy proteinů extracelulámí matrice.
Pro další potvrzení sekvenčně specifického působení c-myc antisensních fosforothioátových oligonukleotidů, se na buňky hladkého svalstva působilo několika kontrolními sekvencemi včetně sensních, 4bp chybně spárovaných a scramblovaných oligonukleotidů (pokud není uvedeno jinak, jsou zde použity fosforothioátové oligonukleotidy). Účinky kontrolních sekvencí na hladiny prokolagenu I v kondiciovaném médiu se porovnaly s účinky třech antisensních sekvencí směrovaných proti rozdílným oblastem c-myc mRNA. Jak ukazuje Obr. 14, konsistentní redukce extracelulámího prokolagenu I se pozorovala po působení různých antisensních oligonukleotidů, zatímco kontrolní sekvence takový účinek neměly.
Tabulka ΙΠ
| Sekvence ID No: | Oligonukleotidová sekvence (5-3) | Lokace lidského c-myc nukleotidu | Typ oligonukleotidu |
| 1 | AACGTTGAGG GGCAT | 559-573 | antisensní |
| 2 | ATGCCCCTCA ACGTT | 559-573 | sensní |
| 3 | AACGTGGATT GGCAG | 559-573 | 4bp chybně spárované |
| 4 | GAACGGAGAC GGTTT | scramblované | • |
| 5 | TATGCTGTGC CGGGGTCTTC | c-myb | antisensní |
| GGGC | |||
| 6 | GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT | 400-419 | antisensní |
| 7 | TCATGGAGCA CCAGGGGCTC | 1264-2383 | antisensní |
D. Imunoprecipitace extracelulámího fibronektinu a jaderného c-myc proteinu.
Pro určení účinků oligonukleotidových sekvencí na syntézu proteinu extracelulámího fibronektinu a c-myc proteinu se postkonfluentní buňky hladkého svalstva 4 hodiny inkubovaly s nebo bez oligonukleotidů v médiu bez methioninu. Poté se na 16 hodin přidal [3SS]methionin (25 pCl/mi, DuPont NEN, MA) a počet buněk se určil na Coulterově počítači. Extracelulární fibronektin v kondiciováném médiu a c-myc protein v jaderných buněčných extraktech se měřil imunoprecipitací po metabolickém značení.
Po přídavku proteinázových inhibitorů se oddělilo kondiciované médium a alikvoty
I obsahující shodné počty se 4 hodiny inkubovaly s protilátkami proti fibronektinu (Becton Dickonson, Bedford, MA) a poté ještě 2 hodiny s akrylamidovými kuličkami proteinu A Stafylokoku. Po centriíúgaci se granule třikrát promyly, povarily v SDS-PAGE vzorkovém pufru 5 minut a dělily elektroforeticky na 6% polyakrylamidovém SDS gelu. Značené vrstvy buněk se třikrát promyly vychlazeným PBS a lyžovaly v 0,1% NP-40, lOmM TRIS (pH 7,9), lOmM MgCI2, 15mM NaCl, 5mM EDTA, lmMPMSF, 1 pg/ml leupeptinu a 1 pg/ml pepstatinu.
Paralelně s testy s extracelulámím fibronektinem bylá buněčná jádra oddělena centrifugací procedurami neznámými podle stavu techniky. Změřila se koncentrace proteinu v jaderných extraktech a alikvoty obsahující 500 pg proteinu se 12 hodin inkubovaly s anti-c-myc protilátkou, pan-rayc (dar od G.I. Evana) a poté dalších 90 minut s akrylamidovými kuličkami proteinu A • t λ · r ·
I
i. * > · __ Stafylokoku. Po promytí se kuličky oddělily a povářily v SDS-PAGE vzorkovém pufhi a rozpustná frakce se dělila élektrofbreticky SDS-Page. Gel se vysušil á exponoval na Kodak-Omat - — ‘ film při -70 °C 5 až 7 dní, ; ‘ .
_ · L x- * . ' ,
E. Hladiny extracelulámího fíbronektinu se neměnily působením c-wj/c antisensních oligonukleotidů, zatímco hladiny c-myc proteinu klesaly?/ . Ňa rozdíl od signifikantní redukce extracelulámích prokolagenů, hladiny extracelulámího fíbronektinu v kondiciovaiiém mediu nebyly signifikantně ovlivněny (Obr.-13),‘ což ukazuje na •s : r. . > . Sj,. ť , · * selektivní účinky antisensních oligonukleotidů. Inkubace postkonfluehtních buněk hladkého !« · . ----.- : ' t —·'· >'?· *—
- Λ1 ^valstva s c-/7(yc antisensními oligonukleotidy vedla ke snížení proteinu v jaderných extraktech (Obr. 15). f
I.
’·4· ·.
r *
Příklad 10 , f;
• 1-4
C-myc antisensni oligonukleotidy nemění celkový metabolismus lidských buněk hladkého ' - · ‘ : ς„'·, svalstva/ - -.- ·,- - . . . ,..^.Pro další zaručení, že oligonukleotidy nepůsobí jiné změny ve fingování buněk hladkéhor svalstva, se prováděly testy integrity buněčné membrány, buněčného metabolismu a indukce genů angažujících se při syntéze kolagenu nebo degradace. · .
i ' · ' ,
Integrita buněčné membrány lidských buněk hladkého svalstva se testovala s pomocí ‘ . “ · ' **’·. ,. · . - trypanóvé modře. Podle “stanovení exkluzí trypaňové modře zůstalo po působení různých ', ' ‘ r * J>· ‘.
oligonukleotidů (16 μΜ) životaschopných více než 95 % buněk.
Pro stanovení celkové proteinové syntézy se alikvoty kondiciovaného média precipitovaly ve vychlazené 10% trichloroctové kyselině (TCA) 30 minut při 4 °C a granule se promylý dvakrát v 5% TCA. Granule se poté rozpustily v Solvable™ (DuPont NEN, MA) a inkorporovaná * * , « radioaktivita se měřila na scintilačním počítači (Pharmacia LKB Biotechnology lne. Piscataway,
NJ). Celková syntéza proteinu, jak se naměřila zde popsanou tnkorporací [35S]methioninu. byla ς v' srovnatelná u buněk hladkého svalstva inkubovaných s nebo bez antisensních (sekvence H) No:l) oligonukleotidů (Obr. 16). Pozornost zasluhuje, že buňky stimulované s 20% FBS vykazovaly zvýšenou syntézu proteinu ve srovnání s nestimulovanými buňkami pň působení pouze 0,5% FBS. Působení c-myc-antisensního oligonukleotidů neredukovalo syntézu proteinu ve srovnáni se sensnim, chybně spárovaným kontrolním vzorkem a kóntrolním vzorkem bez žádného oligonukleotidů.
•ϊ hodin po odstraněni c-mycantisensních oligonukleotidů se hladina prokolagenu I v kondiciovaném médiu vrátila na kontrolní hladinu (Obr. 17). Tyto výsledky indikují, že antisensní oligonukleotidy (sekvence ID No:l) vedou k selektivní, ale reversibilní redukci extracelulámích prokolagenu a zachovávají normální metabolickou aktivitu vaskulárních buněk hladkého svalstva.
Protože antisensní oligonukleotidy mohou indukovat expresi necitových genů, určovala se pro vyloučení nespecifických efektů kolagenolytická aktivita a hladiny interferonu γ po působeni c-myc antisensních oligonukleotidů.
Postkonfluentní buňky hladkého svalstva se inkubovaly v médiu bez séra s nebo bez oligonukleotidů. Po 24 hodinách se oddělily alikvoty média. Aktivity matricových metalloproteinů se určovaly po selektivní destrukci tkáňového inhibitoru metailoproteázy dithiothritolem a jodacetamidem. Latentni kolagenázy produkované lidskými buňkami hladkého svalstva se aktivovaly aminomethylrtuťnatým acetátem a poté se inkubovaly s kolagenem typu I nebo želatinou a produkty štěpení se stanovily pomocí SDS-PAGE (metodami dle D.D. Dean et al., J. Clin. Invesí, 84,678-685 (1989); P.E. Desrochersetal., J. Biol. Chem., 267, 5005-5012 (1992), zde začleněnými do odkazů). Metailoproteázy se charakterizovaly elektroforézou na SDS-substrátovém gelu (to jest zymografií) při nedenaturujících podmínkách s použitím buď β-kaseinu, nebo želatiny jako substrátu. Srovnatelná kolagenolytická aktivita proti kolagenu typu
I a želatině se prokázala v kondiciovaném médiu z buněk hladkého svalstva po působení kontrolních, sensních a antisensních (sekvence ID No:l) oligomenů, což nasvědčuje tomu, že c-myc antisensní oligonukleotidy nezvyšují endogenní kolagenolytickou aktivitu.
Pro určení zda byl indukován c-myc interferon γ, potentní inhibitor syntézy kolagenu typu I, se interferon γ testoval v kulturačním médiu a lidských buňkách hladkého svalstva. Interferon γ nebyl detekovatelný v kondiciovaném kulturačním médiu a buněčných lyzátech po inkubaci s c-myc antisensními oligonukleotidy (sekvence ID No. l) ELISA metodou.
Příklad 11
C-myc antisensní oligonukleotidy nevykazují žádný efekt na prokolagen a((I), 0^(1) a «,(111) mRNA v lidských buňkách hladkého svalstva.
Tento příklad ukazuje, že působeni c-myc antisensních oligonukleotidů nevede ke snížení mRNA prokolagenu v lidských buňkách hladkého svalstva.
Pro měřeni mRNA z prokolagenu se postkonfluentní buňky hladkého svalstva 24 hodin * - 38 inkubovaly s nebo bez oligonukleotidu, třikrát se promyly vychlazeným PBS a lyžovaly v 4M guanidiniumisothiokyanátu. Celková RNA se isolovala fenol-chloroformovou extrakcí, následovanou precipitací isopropanolem. Celková RNA se kvantitativně stanovila spektrofotometrickou absorbancí při 260nm. Vzorky se stejným množstvím RNA (10 pg) se denaturovaly a separovaly na 0,8% agarosových/formaldehydových gelech a blotovaly na nitrocelulózových membránách. RNA se zesíťovala na nitrocelulózové membrány s pomocí UV zesíťovače (Stratagene, CA). Bloty se hybridizovaly při 42 °C 24 hodin s cDNA probami lidského prokolagenu α/I) (ATCC) a lidského prokolageneu α,(Ι) (dar H. Kuivaniemi). Jako kontrolní vzorek se použily proby pro 7S ribosomální RNA. Proby se značily 32P-CTP nick-transiací na specifickou aktivitu vyšší než 10’ cpm/pg DNA Bloty se následně dvakrát promyly v 2x, lx, 0,5x a 0,lx SSC-0,1% SDS při 42 °C 15 minut. Každé promytí se dvakrát opakovalo. Bloty se exponovaly na Kodak-Omat film při -70 °C se zesíleným stínítkem od 6 hodin do 3 dnů.
Snížení omyc proteinu po antisensním působení vede k možnosti transkripční regulace exprese kolagenu. Hladiny prokolagenu <ij(I) a prokolageneu (¾ (I) mRNA se analyzovaly v buňkách hladkého svalstva po inkubaci s nebo bez oligonukleotidu s použitím analýzy Northem-blotem. Jak ukazuje Obr. 18, antisensní oligonukleotidy nepůsobily na hladiny prokolagenu α,(Ι) a prokolageneu p (I) mRNA. Rovněž se pozorovaly podobné hladiny prokolagenu aj(HI) v případě působení omyc antisensních oligonukleotidu a bez otigonukleotidů (údaje nejsou ukázány). 7S RNA zůstala nezměněna, při všech třech experimentálních podmínkách.
Příklad 12
Intracelulámí akumulace prokolagenu v lidských buňkách hladkého svalstva při působení c-myc antisensních oligonukleotidu.
Tento příklad ukazuje, že působení omyc antisensních oligonukleotidu zvyšuje prokolagen uvnitř lidských buněk hladkého svalstva. Tyto výsledky jsou v souladu s poklesem syntézy prokolagenu extracelulámí matrice v přítomnosti omyc antisensních oligonukleotidu.
A. Intracelulámí hladiny prokolagenu jsou zvýšeny omyc antisensním působením.
Pro studium mechanismů zapojených pň redukci extracelulámího prokolagenu působení m omyc antisensních oligonukleotidu, se sekretované a intracelulámí prokolageny určovaly po 4 hodinách značení [,4C]prolinem.
<'Γ f39
Pro měřeni intracelulámího prokolagenu po působení c-myc antisenšních oligonukleotidů, . se buňky 20 hodin inkubovaly s nebo bez oligonukleotidu v 20% FBS-DMEM. Na další 4 hodiny se k buňkám přidalo médium bez séra obsahující askorbovou kyselinu (50 pg/ml), [14C]prolin (2,5 pCI/ml, DuPont NÉN, MA) a oligonukleótidy. Kulturačnrmédium se oddělilo a přidaly se proteázové inhibitory. Alikvóty média sě centrifugovaly přes sloupec Microcon-30 kvůli ; odstranění neinkorporóvaného radioisotopu a koncentraci vzorků pro elektroforézu. Odpovídající ' vrstvy buněk se poté třikrát promyíy vychlazeným PBŠ, lyžovaly'v SDS-PAGE vzorkovém pufru a povařily 5 minut kvůli inaktivaci proteáz. Alikvoty koncentrovaného média, buněčné lyzáty (ze, 7^^^D^jnéhp2p.očtu^uněk) arprokolagen I .purifikováný z kožních buněk lidsl^/ch fibrpblástů (dar od __
W. Arnolda) se dělily elektroforetieky na 6% polyakiylamid-SDS gelech s 3% stackujícími oblastmi. Gely se fixovaly 30 minut, v 10% kyselině octové, 20% methanolu, vysušily a exponovaly na film při-70 °C 7 dní: · , <
r ? · ·♦ ··.”.* . * ... J
C-myc antisensní působení snížilo sekretovaný prokólagěn značený [I4C]prdlinem a bylo1 podobné Westem-blotú DNA. C-myc antisensní působení zvýšilo . významně intracelulámí koncentraci prokolagenu -Ι ve srovnání s buňkami nevystaveným antisensnímu působení a buňkami vystavenými působení scramblováných oligonukleotidů (Obr. 19). ~ ~
B. Zvýšení hladiny intracelulámího prokolagenu není způsobeno neschopností lidských buněk hladkého svalstva hydroxylovat prolin po působení c-myc antisensních oligonukleotidu.
Intracelulámí akumulace prokolagenu může odrážet inhibicí post-translačních modifikací požadovaných pro sestavení oc řetězců prokolagenu do triple-helikální konformace. Kvůli 1 · , · ·> * ’ »· s vyloučení této možnosti se měřil účinek c-myc antisensního působení na prolyl-4-hydrolázovou aktivitu a obsah hydroxyprolinu. - /-·.
Postkonfluentní buňky hladkého svalstva se 24 hodin inkubovaly s nebo bez oligonukleotidu v 20% FBS-DMEM, jak se popisuje výše. Vrstvy buněk se třikrát promyly vychlazeným PBS a lyžovaly v 0,2M NaCl, 20mM TRIS-HC1, pH 7,4, 0,1% Triton x-100, 0,1M giycin a 10 μΜ DTT (metody podle Kivirikko et al., Methods in Enzymology 82, 245-364 (1982) jsou zde zahrnuty do odkazu). Lyzáty se poté sonikovaly 30 sekund v ledu a měřila se koncentrace proteinu. Zbývající buněčné lyzáty se centrifugovaly při 13 000 rpm 20 minut při 4 °C.
V alikvotech supematantu se testovala přolyl-4-hydrolázová aktivita měřením vzniku radioaktivního 4-hydroxyprolinu s použitím [14C]prolinem značeného prokolagenu I jako substrátu (metody podle Kivirikko et al., Anaí Biochem. 19, 249-255 (1967) jsou zde zahrnuty .^ϊΛ:
•4 •J do odkazu). Alikvoty buněčného lyzátu se hydrolyzovaly a hydroxyprolin se stanovil specifickým 4 chemickým postupem.
ProIyl-4-hydrolázová aktivita, pivotálni enzym kontrolující vznik triple-helikální j konformace, byla v experimentálních podskupinách podobná. Byla 11,7 ± 0,1 (dpm/pg proteinu, průměr ± SD ze 2 oddělených pokusů) v kontrolních buňkách hladkého svalstva bez působení oligonukleotidů, 12,0 ± 2,3 v buňkách inkubovaných se scambled oligonukleotidy (16 μΜ) a 10,5 ± 2,0 po působení c-myc antisensních oligonukleotidů (16 μΜ).
Obsah hydroxyprolinu byl větší v buňkách s c-myc antisensními oligonukleotidy (sekvence v·
ID No: 1) než v buňkách bez oligonukleotidů nebo v buňkách se scambled oligonukleotidy (Obr.
20). Zvýšeni obsahu hydroxyprolinu odráží zvýšení hladin prokolagenu, který je substrátem pro prolyl-4-hydroxylázu.
Příklad 13
Inhibice produkce extracelůlární matrice v lidských kožních fibroblastových buňkách lidských fibroblastů s použitím c-myc antisensních oligonukleotidů.
Tento příklad demonstruje účinnost terapie omyc antisensními oligonukleotidy pn inhibici syntézy proteinů extracelůlární matrice, zejména prokolagenu I a ΙΠ, v lidských kožních fibroblastových buňkách. Antisensní terapie silně redukuje hladiny extracelulámího prokolagenu ve stimulovaných lidských kožních fibroblastových buňkách (po působení 20% FBS). Tento příklad také dále potvrzuje poznatky z příkladu 7.
A. Test na extracelůlární a intracelulámí kolagen I a IH s použitím Western blotů.
Pro další určení, zda c-myc antisensní oligonukleotidy inhibují syntézu extracelulámího a intracelulámiho prokolagenu I a III v lidských kožních fibroblastech, se určily hladiny prokolagenů, jak se popisuje u lidských buněk hladkého svalstva v příkladech 9 a 12. Lidské kožní fibroblastové buňky použité při experimentech s lidskými kožními fibroblasty byly konfluentní. Buňky se získaly a byly kultivovány jako v příkladu 7 metodami podle stavu techniky známými.
B. Rychlá inhibice sekrece extracelulámího kolagenu I a ΠΙ s použitím terapie c-myc antisensními oligonukleotidy.
Tyto experimenty ukazují, že c-myc antisensní oligonukleotidy inhibují sekreci extracelulámího kolagenu I a ΠΙ v lidských kožních fibroblastech způsobem závislým na dávkování a na antisensní sekvenci, a Že k inhibici dochází velice rychle.
4.1
7. ·?· r
Pro další určení dávkovači odpovědi a antisensní' specifity c-zwyc antisensních oligonukleotidu při inhibicí syntézy proteinů extracelulámí matrice se extracelulámí kolagen I , * měřil pomocí Western blotů buněčných proteinů lidských fibroblastů isolovaných z lidských
T· ’ Ϊ r ’ » fibroblastů po různých terapiích. Na lidské fibroblastové buňky se po 24 hodin působilo buď srambled oligonukleotidy (sekvence ID No: 4, 16 μΜ), chybně spárovanými oligonukleotidy ’ *’ . , . > (sekvence IĎ No: 3, 16 μΜ), antisensními oligonukleotidy (sekvence ID No: 1, 4, 8, 16 μΜ)/ ··« · =a. 7».^- = >7 X, · X .aits-.ióiran:
nebo se nepůsobilo žádnými oligonukleotidy, jak se zde diskutuje, a proteiny těchto buněk sé testovaly na kolagen I pomocí Western blotů ukázaných n a Obr. 21, linie 1, respektive 5. Dvojitý
.......... pás představuieretězcekolaRenu ai(I\atUíT), homí/respektive dolní pásy. Buňky po antisensnim----= lij působení vykazovaly proporční pokles množství kolagenu I se vzrůstajícími hladinami c-myc antisensních oligonukleotidů, zatímco kontrolní buňky (bez oligonukleotidu,' s chybně spárovanými a scramblované oligonukleotidy) vykazovaly vyšší množství kolagenu než při nejnižŠí použité koncentraci c-myc antisensních oligonukleotidů. Óíigonukleotid (sekvence ID No: 1, 16
Λ . Γ ·«.
μΜ) také inhiboval buněčnou proliferaci v čerstvě plátovaných fibroblastech; při srovnání s 20%
FBS asensními kontrolními vzorky byla buněčná proliferacepo 4 dnech inhibována 25, respektive .
%. Tyto výsledky společně s dalšími zde uváděnými výsledky, zejména absence up-regulace degradačních cest kolagenu a prokolagenu c-myc antisensním působením, ukazují, že produkce extracelulámí matrice, zejména sekrece prokolagenu I, je inhibována c-myc antisensním působením?
Časový průběh působení c-myc antisensních'oligonukleotidů na sekreci kolagenu I lidskými kožními fibroblastovými buňkami ukázal rychlou inhibicí sekrece de novo syntetizovaného kolagenu I. V čase 0 se lidské kožní fibroblastové buňky vystavily čerstvému médiu (“čerstvé médium” jak se zde používá, obsahuje 20% FBS a askorbovou kyselinu 50 pg/ml a další uvedené složky) buď se žádnými oligonukleotidy, se scramblovanými oligonukleotidy, nebo s antisensními oligonukleotidy po 24 hodin (koncentrace oligonukleotidů byla 16 μΜ; sekvence DD No: 1 a 3). Po 3, 6 a 24 hodinách se odebraly alikvoty každého buněčného média a testovaly se na přítomnost kolagenu I Western blotem, jak se zde diskutuje. Redukce hladiny kolagenu se pozorovala v buňkách vystavených aňtisensnímu působení při srovnání s kontrolními buňkami (bez oligonukleotidů a se scramblovanými oligonukleotidy) již po 3 hodinách. Po 24 hodinách buňky vystavené antisensnímu působení vykazovaly nejméně 5 až 10 krát nižší sekreci kolagenu I než kontrolní buňky. Hodnoty získané po 6 hodinách vykazují mezivýsledky.
Sekrece kolagenu III lidskými fibroblastovými buňkami byla také inhibována c-myc antisensními oligonukleotidy. Lidské fibroblastové buňky se vystavily po 24 hodin čerstvému médiu neobsahujícímu žádné oligonukleotidy, nebo obsahujícímu 16 μΜ scramblované oligonukleotidy, nebo 16 μΜ omyc antisensní oligonukleotidy, a po uplynutí 24 hodin se médium testovalo na přítomnost extracelulámího kolagenu III. V buňkách vystavených antisensnímu působení nebyl pozorován žádný extracelulámí kolagen ΙΠ, zatímco kontrolní buňky (bez oligonukleotidů a se scramblovanými oligonukleotidy) vykazovaly přítomnost extracelulámího kolagenu III (alespoň 10 až 100 krát vyšší hladinu kolagenu ΠΙ při srovnání s buňkami vystavenými antisensnímu působení).
Tyto výsledky společně s dalšími zde uváděnými výsledky ukazují, že produkce extracelulámí matrice, zejména sekrece prokolagenu I a ΠΙ, je inhibována omyc antisensním působením.
C. Akumulace intracelulámího prokolagenu I a simultánní pokles extracelulámího prokolagenu I působením c-zwyc antisensních oligonukleotidů.
Inhibíce sekrece prokolagenu I omyc antisensním působením na lidské fibroblastové buňky byla spojena s akumulad intracelulámího prokolagenu I. Lidské fibroblastové buňky se po 24 hodin vystavily čerstvému médiu neobsahujícímu žádné oligonukleotidy, nebo obsahujícímu 16 pM scramblované oligonukleotidy, nebo 16 pM omyc antisensní oligonukleotidy, a médium a odpovídající lidské fibroblastové buňky se poté testovaly na přítomnost extracelulámího prokolagenu I a intracelulámího prokolagenu I s použitím 14Cprolinem značených produktů syntézy proteinů, separovaných jak se zde popisuje. Na Obr. 22 hlavní pásy v liniích 1 až 3 ukazují řetězíce prokolagenu 0^(1, ΙΠ) a α2(Ι). V buňkách vystavených antisensnímu působení je množství sekreto váného prokolagenu I redukováno alespoň 10 až 20 krát ve srovnání s kontrolními buňkami (bez oligonukleotidů a se scramblovanými oligonukleotidy, linie 1, respektive 2). Horní pás v liniích 1 až 3 je 116 Kd (“horní pás”), což odpovídá prokolagenu α,(Ι, ΠΙ) ; dolní pás v liniích 1 až 3 (zleva doprava) je 100 Kd, což odpovídá prokolagenu a2(I). Na Obr. 22 linie 4 až 6 ukazují intracelulární prokolagen I alespoň 5 krát vyšší v buňkách vystavených antisensnímu působení (linie 6) než v kontrolních buňkách (linie 4 a 5). Na Obr. 22 linie 7 ukazuje markéry molekulové hmotnosti.
Tyto výsledky ukazuji, že omyc antisensní terapie snižuje množství prokolagenu sekreto váného lidskými fibroblastovými buňkami a zvyšuje množství prokolagenu v buňkách.
Přiklad 14
C-myc antisensní oligonukleotidy nemění termální stabilitu intracelulámího prokolagenu v lidských kožních fibroblastech.
Terciární struktura intracelulámího prokolagenu se‘ neměnila c-myc antisensním _ působením. Lidské fibroblastové buňky se po> 24 hodin vystavily čerstvému médiu neobsahujícímu ' žádné oligonukleotidy, nebo obsahujícímu 16 μΜ scramblované oligonukleotidy, nebo 16 μΜ c-myc antisensní oligonukleotidy . Teplota tání1 prokolagenu při všech experimentálních
- — a podmínkách se měřila způsobem zde popsaným a podle stavu techmky známým Obr 23 ukazuje, / že profily táni pro kontrol™ buňky (bez oligonukleotidů a se scramblovanými ohgonukleotidy) a buňky vystavené antisensnímu působení jsou podobné. Tyto výsledky ukazují, že prokolagen přítomný uvnitř buněk vystavených antisensnímu působení zachovává normální triple-hélikální
- J · - ... , Λ . .
konformaci stejnou jako v kontrolních buňkách.
Tyto výsledky ukazují, že c-myc antisensní terapie nevede k pozorovatelné změně ýe ___ struktuře přokóláfíénú; která by vedla k nárůstu intracelulární degradace nebo ke sníženi exportu proteinu z buňky.
Příklad 15 * L 1 + r -Jí t < * t-J ‘ \ / 11.....’ Λ
Terapie c-myc antisensnínii oligonukleotidy riemění hladinu prokolagenu Aj(I) mRNA v lidských kožních fibroblastech.
Tento příklad ukazuje, že terapie c-myc aritišénsnínii oligonukleotidy ňeinhibuje syntézu proteinů extracelulámi matrice* zejména prokolagenu I, redukcí hladiny mRNA prokolagenu v lidských kožních fibroblastových buňkách. Antisensní terapie neredukuje hladiny mRNA prokolagenu ve stimulovaných lidských kožních fibroblastových buňkách (po působení 20% FBS).
A. Měření mRNA prokolagenu a/I).
RNA se isolovala Northem analýzou způsobem zde uvedeným: Buňky se 3x promyly vychlazeným PBS pufrem a lýzovaly v 4M guanidinium isothiokyanátu. RNA se extrahovala fenol/chloroformem a kvantifikovala spetrofotometricky absorbanci při 260/280 nm. RNA vzorky (20 pg) se dělily elektroforeticky na 0,8% agaroso-formaldéhydových gelech. Po přenosu RNA na nitrocelulózové filtry se bloty fixovaly ultrafialovým ozářením. Bloty se prehybridizovaly 5x ve standardním fyziologickém citrátu, 2x Denhardtovým roztokem, 0,1% SDS a 0,2 mg/ml denaturovanou DNA (salmon sperm) alespoň 4 hodiny při 65 °C. Hybridizace se prováděla pres noc s použitím stejného pufiu obsahujícího cDNA radioznačené 32P dCTP nick-translací na specifickou aktivitu 108-109 cpm/pg. Bloty se promyly při 65 °C v 0,5% standardním fyziologickém citrátu a 0,1% SDS. Filtry se exponovaly na Kodak X-Omat film při - 70 °C s intenzifikací stínítka 1 až 5 dní. Autoradiografie výsledných Northem blotů se kvantifikovala skenovací densitometrií a integrací ploch píku. V těchto studiích se použily proby: 1,8 Kb pro-alfa 1(1) (HF-677) cDNA odpovídající COOH-terminálnímu propeptídu a karboxy-terminální doméně triple-helikální oblasti lidského pro-alfa 1(1) řetězce typu I prokolagenu (Chu et al., Nucleic Acids Res., 10, 5925-5934 (1982).
B. Hladiny mRNA prokolagenu α/I) nejsou sníženy omyc ántisensní terapií.
Hladina mRNA prokolagenu alfa I v lidských fibroblastových buňkách nebyla ovlivněna c-myc ántisensní terapií. Lidské fibroblastové buňky se po 24 hodin vystavily čerstvému médiu neobsahujícímu žádné oligonukleotidy, nebo obsahujícímu 16 μΜ scramblované oligonukleotidy, nebo 16 μΜ omyc ántisensní oligonukleotidy. mRNA se puntíkovala při všech experimentálních podmínkách a analyzovala se ná přítomnost mRNA prokolagenu alfa I způsobem zde popsaným a podle stavu techniky známým. Obr. 23 ukazuje že hladiny mRNA prokolagenu I v kontrolních buňkách (bez oligonukleotidú a se scramblovanými oligonukleotidy; linie 1, respektive 2) jsou podobné hladinám mRNA prokolagenu alfa I v buňkách vystavených antisensnímu působeni (linie 3).Tyto výsledky ukazují, že omyc ántisensní terapie lidských fibroblastových buněk nesnižuje regulaci mRNA transkripce genu prokolagenu alfa I.
Výsledky testování mRNA společně s dalšími zde uváděnými výsledky ukazují, že omyc ántisensní terapie snižuje sekreci prokolagenu I a III, což jsou proteiny vedoucí k syntéze kolagenu v extracelulární matrici.
Příklad 16
C-myc ántisensní oligonukleotidy nemění obnovu syntézy proteinů extracelulární matrice po přerušeni terapie c-myc antisensními oligonukleotidy v lidských kožních fibroblastech.
Schopnost lidských fibroblastových buněk syntetizovat kolagen I po odstranění terapie omyc antisensními oligonukleotidy nebyla narušena. Lidské fibroblastové buňky se po 24 hodin vystavily Čerstvému médiu neobsahujícímu žádné oligonukleotidy, nebo obsahujícímu 16 μΜ •t · φ » * · ' •« * · • · · · * · scrambled oligonukleotidy, nebo 16 μΜ c-myc antisensní oligonukleotidy. Lidské fibroblastové buňky při všech experimentálních podmínkách se poté vystavily čerstvému médiu bez přídavku jakéhokoliv oligonukleotidů a testovaly se na přítomnost kolagenu I způsobem zde popsaným. Obr. 25 ukazuje, že kontrolní buňky (bez oligonukleotidů a se scrambled oligonukleotidy) a buňky vystavené antisensnímu působení produkují podobné hladiny extracelulámiho kolagenu 124 hodin po ukončení terapie. Tyto výsledky ukazují, že po 24 hodinách došlo k úplnému obnovení produkce kolagenu lidských fibroblastových buňkách vystavených c-myc antisensní terapii.
C-myc antisensní terapie nevykazuje žádné cytotoxické efekty, které by vedly k _____ , ___ . .i .....
27- —- neschopnosti buňký^sé\fátiťksekreči7předterapeutickýchrhladini prokolagenu—
Příklad 17
Inhibice syntézy extracelulámí matrice v prasečích koronárních arteriích.
Tento příklad dále ukazuje in vivo účinnost lokalizované terapie c-myc antisensními jdigonukleotidý pri smžování progrese syntézy extracelulámí matrice po tkáňovém traumatu. Tento příklad také dále ukazuje in vivo účinnost lokalizované terapie c-myc antisensními oligonukleotidy při snižování progrese zjizvení vnitřních orgánů, stejně jako pn snižování progrese zjizveni tkáně spojeného se syntézou molekul extracelulámí matrice, jako kolagenu.
A. Inhibice produkce fibrilámích látek extracelulámí matrice terapií c-myc antisensními oligonukleotidy. λ
Pro určení vlivu c-myc antisensní terapie na progresi syntézy extracelulámí matrice po tkáňovém traumatu, še in Vivo. poranila prasečí srdce, vystavila působení oligonukleotidů jak se *
popisuje v příkladu 8 (pokud není uvedeno jinak) a usmrtila po 3, 7 a 28 dnech po podáni oligonukleotidů. Byly použity stejné c-myc antisensní a sensní oligonukleotidy (sekvence ID No: 1 a 2) a dávky (1 mg na arterii) jako v příkladu 8.
Průřezy traumatizovanými (poraněnými) koronariemi z prasat vystavených antisensní terapii vykazovaly rozdíly v mikroskopické extracelulámí architektuře ve srovnání s traumatizovanými koronariemi vystavenými sensní terapii. Traúmatizované koronarie z každé experimentální skupiny se testovaly jako slepé vzorky světelnou mikroskopií, se zvětšením 20 až
62x. Tkáň se barvila Verhoff-Van-Giesonovým barvivém, podle stavu techniky známým, ke zvýraznění buněk a extracelulámí matrice, a sirriovou červení, podle stavu techniky známou, ke zvýrazněni kolagenu. Cévy vystavené antisensní terapii, které vykazovaly menší oblast neointimy p t. .-- * · · f - r f í* r ' * · r- ,, » > . - · · · · než kontrolní cévy, také vykazovaly menší zbarvení červení než kontrolní cévy (vystavené sensní terapii).Cévy vystavené antisensní terapii vykazovaly nižší extracelulámí fibrilámí látky než cévy vystavené sensní terapii; a cévy vystavené antisensní terapii vykazovaly menší extracelulámí prostor mezi buňkami. Neointimální proliferace buněk hladkého svalstva byla stanovena s použitím imunozbarveni pro PCNA (jaderný antigen proliferujících buněk) po balónkové denudaci a transkatetrovým podáváním omyc sensních (S) nebo antisensních (AS) oligonukleotidů (1 mg) do prasečích koronárních arterií, víz Tabulka IV. Antisensní terapie koronárií inhibovala progresi proliferace buněk hladkého svalstva způsobenou tkáňovým traumatem ve srovnání se sensní terapii koronárií. PCNA zbarvení umožnilo stanoveni počtu proliferujících buněk v daném průřezu neointimou. Obecně se napočítalo 200 až 1000 buněk a určila se procenta proliferujících buněk hladkého svalstva a vyjádřila jako proliferační index. Proliferační index (PI), poměr neointima/media (I/M) a redukce v I/M poměru (ΔΙ/M) byly následující:
Tabulka IV
| Den | n | P*(%) | Poměr I/M | ΔΙ/Μ(%) | |
| s | 4 | 5±2 | 0,09 ± 0,03 | ||
| 3 | AS | 8 | 3±5 | 0,05 ± 0,02 | l 44 |
| S | 4 | 47 ± 13 | 0,28 ± 0,04 | ||
| 7 | AS | 8 | 11 ± 13** | 0,12 ±0,05** | l 57 |
| S | 6 | N/A | 1,19 ±0,51 | ||
| 28 | AS | 4 | N/A | 0,47 ± 0,30* | l 61 |
P* proliferující buňky/celkový počet buněk x 100, * p ( 0,05, ** p ( 0,01
Koronárie s redukovaným poměrem I/M měly zlepšený lumenální průměr. Tyto výsledky ukazují, že lokalizovaná omyc antisensní terapie inhibuje během doby růst buněk hladkého svalstva a vznik extracelulámí matrice.
Lokalizovaná omyc antisensní terapie inhibuje progresi vzniku jizev v traumatizované tkáni, jako vznik jizev v koronáriích po traumatu balónkové angioplastiky způsobený proliferací ♦ r r r ť ' ·* r ' f r ·· · buněk hladkého svalstva a vznik extracelůlární matrice.
Příklad 18
Rychlá lokalizace c-myc antisensních oligonukleotidů v prasečích koronárních arteriích.
Tento příklad ukazuje in vivo účinnost c-myc antisensních oligonukleotidů při penetraci vaskulámí a pojivovou tkání s použitím prostředků lokální dopravy. Ve spojení s dalšími výsledky zde diskutovanými tyto výsledky ukazují schopnost c-myc antisensní terapie lokalizovat se v buněčném jádru/během 30 minut a před počátkem c-myc indukce (ke které dochází během 3 až/ 4 hodin). Lokální distribuce c-myc antisensních oligonukleotidů po lokální administraci do stěny cévy koronární arterie potlačuje vznik jizev po balónkové angioplastíce.
A. Lokální dopravování c-myc antisensních oligonukleotidů značených buď karboxyfluoresceinem, nebo 3SS-fosforothioátem.
C-myc antisensní oligonukleotidy použité v tomto příkladu se připravily způsobem zde uvedeným. Fosforothioátové antisensní oligonukleotidy (sekvence ID No: 1) řízené proti oblasti iniciace translace lidského c-myc genu použité při distribučních studiích byly značeny karboxyfluoresceinem (480 nm excitace, 520 nm emise, Molecular Probes, lne.) popsaným způsobem (Inverson et al., Antisense Res. Dev. 2, 211-222 (1992)) a metodami zde zahrnutými v odkazu. Pro kvantitativní studie se oligonukleotidy značily 3ÍS na každé intemukleotidové vazbě se specifickou aktivitou 1,8 x 10g cpm/pmol.
Pro experimenty se použila domestikovaná imbrední prasata (Sus scrofa), příprava
4· probíhala způsobem zde popsaným. Koronární óstia byla kanylována s použitím 9 French SAL 1 zaváděcího katetiu (Cordis Corp., Miami, FL) pod fluoroskopickým vedením. Po intrakoronámí injekci nitroglycerinu (100 pg) se získala baselinová koronární angiografie. Vybrané domény koronárních arterií se poté podrobily denudaci (traumatizaci) zvětšelým balónkem inflantovaným 3 x (6 atm) po 30 sekund. Poté se zavedlo dopravovací zařízení Kaplan-Simpson Infusasleeve (LocalMed, Palo Alto, CA) přes standardní angiopiastikový balónek (“podpůrný” balónek) do . * I 1 vybrané oblasti. Toto zařízení se skládá z multilumenální infuzní oblasti (18 mm) obsahující multiplitní postranní otvory (40 pm), které jsou umístěny proti stěně cévy prostřednictvím inflantujícího podpůrného balónku. Zařízeni používalo při studiích infuzní roztoky s použitím rigidních nekolapsovatelných kanálků. Tento tvar minimalizoval ztrátu léčiva v krevním toku a povoloval separátní kontrolu infuze léčiva a umístěni zařízení na dopravováni léčiva v cévě. Po úplné expanzi interního balónkového katetru, se fluoroskopicky ověřila infuzní doména a administrovaly se c-myc antisensní oligonukleotidy. Intramurální injekce se prováděly pod externím tlakem 100 PSI. Celkový objem injektátu byl 5 až 6 ml, dopravený externí pumpou s 40 ml/min. Administrovaná dávka byla 1 mg na arterii. Po ukončení injekce se zařízení odstranila a natočily se finální angiogramy. K zajištění vhodných podmínek dopravování oligonukleotidů se použila sériová koronární angiografie k měření luminálního průměru vybraných koronárních arterii, luminálního průměru před dodáním oligonukleotidu (to jest po dedudaci poraněním) a po administraci oligonukleotidu. Navíc se in sítu měřily průměty denudací a podpůrných balónků. Jako Škálovací zařízení se pro všechna angiografická měření použil zaváděcí katetr. V určených časech byla zvířatům podána letální dávka pentobarbitalu sodného (100 mg/kg iv).
Jak ukazuje Tabulka V, průměrný luminální průměr cévy byl 2,5 ± 0,1 mm při baselině. Poranění koronární arterie se docílilo zvětšelým balónkem (také známým jako denudaČní) (průměrný poměr balonek/arterie 1,1). Všechny cévy zůstaly průchodné po roztažení balónkem s průměrným luminálním průměrem 2,6 ± 0,1 mm. C-myc antisensní oligonukleotidy se administrovaly expandovaným dopravóvacím zařízením při dosažení přímého kontaktu s endoluminálním povrchem cévy (průměrný poměr balonek/arterie 1,0).
Tabulka V
Angiografiské charakteristiky založené na kvantitativní koronární angiografii (n - 14).
| Počáteční luminální průměr (mm) | 2,5 ±0,1 |
| Poměr denudační balonek/arterie | 1,1 ±0,0 |
| Luminální průměr po denudaci (mm) | 2,6 ±0,1 |
| Poměr dopravovací balonek/arterie | 1,0 ±0,0 |
| Luminální průměr po dopravení (mm) | 2,6 ±0,1 |
B. Kvalitativní stanoveni dopravování oligonukleotidů.
Pro určení distribuce fluorescenčně značených oligonukleotidů po transkatetrovém dopravování byly koronární arterie vyříznuty s přilehlými tkáněmi. Po vypláchnutí lumene cévy
PBS se arterie fixovaly v 10% pufřovaném formalinu 6 hodin a vložily se do parafinu. Arterie se nařezaly ná sériové’4'pm silné’režy~(50mmna cévu včetně18_mnrinjektované~domény).
Prohlídka místa injekce a proximálních a distálních domén cévy poskytla informaci o podélné distribuci oligonukleotidů. Navíc neinjektovaná koronární arterie ze stejného zvířete sloužila jako další kontrola. Řezy se zbavily parafinu a konce se obalily SlowFade-Light antifadovým činidlem (Molecular Probes, lne., Eugene, OR). Každé krycí sklíčko obsahovalo cévu, periadventiciální tkáň a přilehlý myokard (Obr. 17), který umožnil určení hloubky penetrace oligonukleotidů. Fluorescentně značené antisensní oligonukleotidy se zviditelnily pod mikroskopem Nikon Ophtiphot vybaveným XF-22 filtrem pro epifluorescenci. Fotografie se snímaly na filmech Kodak Ektachrome PÍ 600.
Pro analýzu intracelulámí lokalizace fluorescenčně značených oligonukleotidů in vitro a in vivo se použil laserový skenovaci konfokálni mikroskop (model Zeiss Axiovert 100) vybavený MRC-600 krypton-argonovým laserem. Krypton-argonový laser emituje laserové linie při excitační vlnové délce 488 nm. Indukované fluorescenční světlo je skenováno pres objektiv 63x a konvertováno na video signál k zobrazení na obrazovce počítače. Obrazy se fotografovaly z obrazovky počítače na filmy Kodak Ektachrome 100. Pro studie in vivo k určení časového průběhu přijmu oligonukleotidů vaskulámími buňkami hladkého svalstva se buňky 2 dny pěstovaly na komůrkových krycích sklíčkách v médiu obsahujícím 10% fetální hovězí sérum a přidaly se fluorescenčně značené oligonukleotidy (8 pM) na 2 minuty, 30 minut a 2 hodiny. Poté se buňky promyly třikrát s PBS a fixovaly 50% acetonem a 50% methanolem. Pro studie in vivo se řezy koronárních arterií získané postupem výše popsaným analyzovaly konfokálni mikroskopií při optické tloušťce 0,4 až 0,5 pm.
C. Distribuce antisensních oligonukleotidů ve stěně cévy.
Pro určení distribuce oligonukleotidů ve stěně cévy sě měřila jejich lokalizace v koronárních arteriích 30 minut a 3 dny po intramurálni administraci (n = 4). Fluorescenčně značené oligonukleotidy se detekovaly pouze v oblasti injekce, ale ne v distálních segmentech nebo v neinjektovaných koronárních arteriích. Po 30 minutách se v injektovaných segmentech, které předtím prodělaly balónkovou denudaci, pozorovaly tři rozdílné fokální vzory distribuce oligonukleotidů. Hustá transmurální lokalizace zahrnující celou tloušťku médie byla spojena s více rozptýlenou adventiciální a perivaskulámí distribucí (Obr. 27a a 27b). V každém řezu oligonukleotidy zaujímaly pouze doménu arteriálního obvodu. Subintimální nontransmurální vzor byl obecný; byl buď roztroušený mezi transmurální lokalizací, nebo na okrajích injektovaných +
segmentů (Obr 27c a 27d). Stredostěnový nontransmurální vzor byl nejméně obvyklý a byl nalezen v_sousedství transmurální lokalizace (Obr. 27e a 27f). Adventicia cévy byla v řezech
« « *
5ΰ vykazujících nontransmurální distribuci prosta antisensních oligonukleotidů.
... . Také byla studována role předchozího vaskulámího poranění pri distribuci c-myc antisensních oligonukleotidů v arteriální stěně. Analýza konsekutivnich destiček ukázala transmurální distribuci nejobvyklejší v oblastech disekce s lokalizací oligonukleotidů dosahující k sousedícím řezům. Subintimální nontransmurální vzor byl obvykle spojen se zachovanou vaskulámí integritou. Po 3 dnech byly oligonukleotidy jasně zřetelné v transmurální lokalizaci (Obr. 28a a 28b). Subintimální nontransmurální distribuce byla méně zřetelná jako výsledek vymývání oligonukleotidů. Žádný důkaz lineární “jet-like” lokalizace nebyl pozorován po 30 *· minutách nebo 3 dnech. 1 ..Z Γ > TL. .
Tyto údaje společně ukazují na fokální vzor intramurální distribuce oligonukleotidů po transkatetrové administraci pod tlakem. Disekce koronární arterie způsobená předchozí balónkovou denudaci usnadnila vstup a transmurální distribuci oligonukleotidů. Nontransmurální vzor byl obvykle spojen s intaktní interní elastickou laminou. . · ,
D. Intramurální dopravování oligonukleotidů v koronárních arteriích.
_ Doba usazení oligonukleotidů se m’ J/Vwjněnla pro určeni, zda antisensni terapie vede k retenci oligonukleotidů. Pro kvantitativní adresování do tkáně byly do prasečích koronárních arterií s použitím transkatetru dopraveny 33S-značené c-myc antisensní oligonukleotidy. Jak ukazuje Obr. 29, po 30 minutách po místně specifické administraci se měřila radioaktivita v tkáni, která odráží obsah oligonukleotidů 2510 ± 1436 cpm (n = 6) ve stěně cévy a 2163 ± 966 cpm (n = 6). v perivaskulámí tkáni oproti tkáňovému pozadí 17 ± 4 cpm. O 3 dny později radioaktivita spojená s oligonukleotidem vzrostla na 3595 ± 1672 cpm (n = 4) ve stěně cévy, zatímco hladiny v periadventiciální tkáni poklesly na 432 ± 201 cpm (n. = 4). Výše uvedená hladina oligonukleotidů byla dosažena přes rychlé vyprázdněni plazmy (t1/2 15 ± 2 min). Množství detekovaných oligonukleotidů pri 30 minutách a 3. dnech odpovídalo 0,1 % celkově administrované dávky. Tyto výsledky indikují, že transkatetrové podávání pod tlakem vede k depozici antisensních oligonukleotidů v mediálních a adventiciálních tkáních a v perivaskulámích tkáních.
E. Vaskulámí integrita po intramurální administraci oligonukleotidů.
Protože transkatetrová injekce pod tlakem jakéhokoliv terapeutického činidla do steny arterie může indukovat vaskulámí .poničení, měřil se rozsah poničení. Nejdříve se s použitím
I kvalitativní koronární angiografie pozorovala neprůtoková limitující koronární disekce v 1 z 14 intramurálníčh injekcí v prasečích koronárních arteriích neodolávajících předchozímu poranění zvětšelým balónkem. Za druhé se ke stanovení Iuminálního průměru po intramurálním dopravení oligonukleotidú (n = 14) použila kvantitativní koronární angiografie. Nebyla pozorována žádná signifikantní změna v luminálním průměru po transkatetrové administraci oligonukleotidú (Tabulka V). Za třetí se s použitím světelné mikroskopie stanovily účinky transkatetrové injekce oligonukleotidú. Pro určení jemných změn ve složkách celulámí a extracelulární matrice ve stěně cévy se vyhodnocovaly řezy koronárních arterií s transmurální distribucí oligonukleotidú a žádnou viditelnou disekcí. Jak ukazuje Obr. 30a, transmurální distribuce oligonukleotidú (Obr. 30a) byla spojena s intaktní vnitřní elastickou laminou a elastickými tkáněmi ve stěně cévy (Obr. 30b). Slabý pokles v cytoplazmovém zbarvení a jaderná pyknosabyla příležitostně pozorována v místě retence oligonukleotidú po 30 min (Obr. 30c). Tyto změny nebyly pozorovány po 3 dnech po dopravení (Obr. 30d).
Příklad 19
Rychlá jaderná lokalizace c-myc antisensních oligonukleotidú in vitro v lidských buňkách hladkého svalstva a in vivo v prasečích buňkách hladkého svalstva.
Tento příklad dále ukazuje účinnost terapie c-myc antisensními oligonukleotidy in vivo ukázáním rychlé lokalizace omyc antisensních oligonukleotidú v jádru buněk hladkého svalstva jak in vitro (lidských), tak in vivo (prasečích). Tento rychlý časový průběh umožňuje inhibici aktivace omyc antisensního genu, dříve stanovenou v řádu hodin (3 až 4 hodiny).
A. Intracelulámí lokalizace karboxyfiuoresceinem značených c-myc antisensních oligonukleotidú.
Pro analýzu intracelulámí lokalizace fluorescenčně značených oligonukleotidú in vitro se použil laserový skenovací konfokální mikroskop (model Zeiss Axiovert 100) vybavený MRC-600 krypton-argonovým laserem (Bio-Rad). Krypton-argonový laser emituje laserové linie při excitační vlnové délce 488 nm. Indukované fluorescenční světlo je skenováno přes objektiv 63x a konvertováno na video signál pro zobrazení na obrazovce počítače. Obrazy se fotografovaly z obrazovky počítače na filmy Kodak Ektachrome 100. Pro studie in vivo k určení časového průběhu příjmu oligonukleotidú vaskulámími buňkami hladkého svalstva se buňky 2 dny pěstovaly na komůrkových krycích sklíčkách v médiu obsahujícím 10% fetální hovězí sérum a poté se na 2 minuty, 30 minut a 2 hodiny přidaly fluoresceinem značené oligonukleotidy (8 μΜ). Buňky se poté promyiy 3 krát s PBS a fixovaly 50% acetonem a 50% methanolem.
___ B. Celulámí příjem antisénsních oligonukleotidů, _ _ _ -. Intramurální. podávání antisensních oligonukleotidů je následováno rychlým celulámím ' příjmem oligonukleotidů, aby se umožnila inhibíce exprese cílového genu, v tomto případe c-myc.
Jak ukazuje Obr. 31, vaskulámí buňky hladkého svalstva vykazují in vitro preferenční jadernou ' lokalizaci fluorescence 30 minut po inkubaci s fluoresceinem značeným oligonukleotidy. Podobně \ 30 minut po in vivó transkatetrové administraci v prasetech .byla jaderná lokalizace oligonukleotidů pozorovaná v medii (Obr. 32) a ádventicii (Obr) 33), což ukazuje srovnatelně rychlý příjem antisensních oligonukleotidů in vivo, K intracelulárnímu příjmu antisensních
- olieonukleotidů vaskulániírrii buňkarni hladkého svalstva /n v//ro a zzrv/vo dochází během — .. ... . kritického, časového okna poskytnutého/pro modulaci c-myc protoonkogenu, důležitého inducibilniho genu regulujícího proliferaci buněk hladkého svalstva po poranění stěny cévy. .
·· ř 1
Průmyslová využitelnost • < . ‘ ; ' .
Vynález poskytuje způsob terapie poruch spojených s nepřiměřenou syntézou proteinů extracelulámí matrice s použitím oligonukleotidových antisensních a antigenových látek. Vynález poskytuje způsob prevence selhání místa hemódialyzačního přístupu a vaskulámích štěpů stykem místa hemódialyzačního přístupu nebo vaskulámíhó štěpu s oligonukleotidem komplementárním • ’ v » . k jaderné protoonkogenové mRNA Vynález dále poskytuje způsob redukce vzniku jizev v lidské tkáni administrací terapeutický efektivního množství antisénsního oligonukleotidu protoonkogenu »·;- '· ‘ / ' ďo tkáně. Vynález také poskytuje způsob inhibíce vzniku fibrózní. pojivové tkáně administrací y . z .·.* *·. ...
terapeuticky efektivního množství antisénsního oligonukleotidu protoonkogenu.
Seznam sekvencí
Sekvence ID No: 1:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 15 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ID No: 1:
AACGTTGAGG GGCAT 15
Sekvence ID No:2:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 15 nukleotidů / (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ID No:2:
ATGCCCCTCA ACGTT 15
Sekvence ID No:3:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 15 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ID No;3:
AACGTGGATT GGCAG
Sekvence Dl) No:4:
(i) ,t sekvenční charakteristika: .
(A) Délka: 15 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ID No:4:
GAACGGAGAC ··
Sekvence ID No:5:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 24 nukleotidů k (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost:jednoduchá ______________ (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ID No: 5:
TATGCTGTGC CGGGGTCTTC GGGC24
Sekvence ID No:6:
(i) sekvenční charakteristika:. ' (A) Délka: 19 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá- (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence Π) No:6:
GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT20 * ;
Sekvence ID No:7:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 20 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ED No:7:
TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 20
Sekvence ID No:8:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 20 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineami (xi) Popis sekvence: sekvence ID No . 8:
TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 20
Sekvence ID No:9:
(i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 20 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence ID No:9:
GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 20
Sekvence ID Ňo: 10:
(i) sekvenční charakteristika;
(A) Délka: 17 nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina . .......(C) „.„Vláknitost:jednoduchá
...____(D)_„Topologie: lineární... „ .(xi) a Popis sekvence:.sekvenceJI).No:.10:..
CATTGTTTTC CAACTCC . Sekvence^ID No:ll:
,— -t·-· - ·» ·— - -T * —T·*- _· -r- — -- tS · >··=-· ι χ*ΐ'.· (i) sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 17 nukleotidu<··
................... λ. . .(B) -Typ: nukleovákyselina^ — ,_r. ...... ....----- - · í · > (C) Vláknitost: jednoduchá - -.'· v. . - · . Ti (D) Topologie: lineárníí ' , (xi) Popis sekvence: sekvence ID No;ll: ';
TTCATTGTTT TCCAATT
| 5 4 | .£ f | • ' - < K ' . . +: | < | |||
| .... | ||||||
| 4 |
Claims (54)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob prevence selhání místa hemodíalyzačního přístupu u hemodialyzovaného pacienta, vyznačující se t í m, že zahrnuje kontakt místa hemodíalyzačního přístupu s oligonukleotidem komplementárním k mRNA jaderného protoonkogenu.
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že místo hemodíalyzačního přístupu se vybírá ze skupiny skládající se z Brescia-Ciminovy píštěle, tabaterkové píštěle, brachiocefalové píštěle, PTFE hemodíalyzačního štěpu, štěpu hovězí koronární arterie a autogenních štěpů.
- 3. Způsob podle nároku 1,vy značující se tím, že kontakt zahrnuje injekci, katetrování nebo infuzi.
- 4. Způsob podle nároku ^vyznačující se t í m, že kontakt zahrnuje difúzi z implantátu nebo infuzi z reservoáru umístěného v perivaskulámí tkáni.
- 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že kontakt zahrnuje injekci do perivaskulámí tkáně buď perivaskulámí injekcí před uzavřením místa chirurgického zákroku nebo perkutánní injekci po uzavření místa chirurgického zákroku.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že kontakt se opakuje po konstrukci místa hemodíalyzačního přístupu.
- 7. Způsob terapie vaskulámich štěpů, vyznačující se t í m, že zahrnuje kontakt vaskulámího štěpu s oligonukleotidem komplementárním k mRNA jaderného protoonkogenu.
- 8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že kontakt zahrnuje difúzi z implantátu nebo infuzi z reservoáru umístěného v perivaskulámí tkáni.
- 9. - Způsob-podle.nároku 7, v y z n a č u j j £Í s e t í m, že kontakt zahrnuje injekci do rperivaskulámi tkáněbud’ perivaskulámi injekcí před uzavřením místa chirurgického.. zákroku, nebo perkutánní injekci po uzavření místa_chimrgickéh.o zákroku.λ , .
- 10. Způsob ex vivo prevence selhání vaskulárních Štěpů tvořených s žílami, vyznačující ·, τ s e t í m, že zahrnuje kontakt ex vivo žíly s oligonukleotidem komplementárním k mRNA jaderného protoonkogenu.* ’’í , • . ’ ‘ I >
- 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující setím, že kontakt zahrnuje inkubaci žíly ř ·, ' ’ f- s oligonukleolidem alespoň 10 minut ve sterilním fyziologicky přijatelném pufru.
- 12.
- 13.Způsob podle nároku 11, v ’y z n a Č u j í c í s e t í m, že fyziologicky přijatelný pufr má teplotu 20 až 3.7 °C.· ·'·--·· ť t ·· 1 ·« ft· · ’ Způsob podle nároku 12, vyzná Č u j í c í s e t í rii, že oligonukleotid má koncentraci7., 1Ó-až^OQ-pM,^i___ _ . ’’ < :•4
- 14.Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j í c í s e. t í m, že žíla se vybírá ze skupiny safenosních žil, cefalových žil, basilických žil, brachiálních žil a femorálních žil.
- 15.<ťV ‘ ' * lPřípravek v y z n a č u j í c i. s.e t í ni, že zahrnuje místo hemodialyzaČního přístupu a oligonukleotid komplementární k mRNA jaderného protoonkogenu lokalizovaný v alespoň jedné vrstvě místa hemodialyzaČního přístupu.
- 16.i18.Přípravek podle nároku 15, v y zn a č u j i c í s e tím, že místo hemodialyzaČního přístupu se vybírá ze skupiny Brescia-Ciminovy píštěle, tabatěrkové píštěle, brachiocefalové píštělé, PTFE hemodialyzaČního štěpu, štěpu hovězí koronární arterie a autogenních štěpů.Přípravek podle nároku 17, vyznačující se tím, že doména se vybírá ze skupinyPřípravek podle nároků 15, v y z n a č u j í c í se t i m, že vrstva se vybírá ze skupiny endotelové vrstvy, medie, adventicie a perivaskulámi tkáně.
- 17.PTFE štěpu, opětovně naplnitelného reservoáru, stentu, gelu a implantovatelných zařízení.
- 19. Přípravek podle nároku 15, v y z n a č u j í c í s e t í m, že oligonukleotid je lokalizován v reservoáru.
- 20. Přípravek podle nároku 19, v y z n a č u j í c í se t í m, že reservoár obsahuje 0,5 až 10 mg oligonukleotidů.
- 21. Přípravek podle nároku 20, v y z n a Č u j íc í se t í m, že reservoár je na venózní straně místa hemodialyzačního přístupu.
- 22. Přípravek vyznačující s e t í m, že zahrnuje vaskulámí Štěp a oligonukleotid komplementární k mRNA jaderného protoonkogenu lokalizovaný v alespoň jedné vrstvě vaskulámího štěpu.
- 23. Přípravek podle nároku 22, v y z n a Č u j í c í se t í m, že Štěp je prothetická pištěl, arteriovenózní shunt, přirozená žílová pištěl, venózní štěpy, imunosupresované allostepy, imunosupresované xenoštěpy a venózní autoštěpy.
- 24. Přípravek podle nároku 22, vyznačující se tím, že vrstva se vybírá ze skupiny endotelové vrstvy, medie, adventice a perivaskulámí tkáně.
- 25. Přípravek podle nároku 24, vyznačující se t í m, že oligonukleotid má koncentraci alespoň 10 μΜ v alespoň jedné vrstvě.
- 26. Přípravek podle nároku 25, v y z n a č u j í c í se t í m, že oligonukleotid má koncentraci alespoň 1 μΜ uvnitř buňky ve vrstvě.
- 27. Přípravek podle nároku 26, v y z n a č u j i c í se t i m, že buňka je buď buňka hladkého svalstva, myofibroblast, nebo fibroblast.
- 28. Přípravek vyznač u j ící se t í m, že zahrnuje vyříznutou s lidskou žilou kompatibilní žílu a oligonukleotid komplementární k mRNA jaderného protoonkogenu lokalizovaný ve stěně s lidskou žilou kompatibilní žily.
- 29. Přípravek podle nároku 28, v yznačující se tím, že vyříznutá s lidskou žilou kompatibilní žíla se vybírá ze skupiny safenosních žil, čefalových žil, basilických žil, brachiálních žil a femorálních žil.’ · - * * nároku 28, v yz n a č;u j í c í s e t í m, že oligonukleotid je lokalizovaný ve vrstvě stěny cévy vybrané ze skupiny endotelové vrstvy, mediie a • r V ··.' 7 .. - - · 11 ’ adventicie. ° z >
- 31. Přípravek podle nároku 30, v .y z n a č u j í c í sě t í m, že oligonukleotid má rkoncentraci alespoň 10 μΜ v alespoň jedné vrstvě. 'J. _ _____L J . _ . ________________‘ ______ / . . ‘
- 32. Způsob inhibice syntézy proteinů extracelulámí matrice v lidské tkáni, vyznačující s e t í m, že zahrnuje administraci do tkáně terapeuticky efektivního množství jednoho ’ nebo více antisensních oligonukleotidu specifických pro jaderný protoonkogen..· . ; . 7 i.- . . .. e
- 33. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u j í c í se tím, žejaderný protoonkogen se vybírá ze skupiny c-myč, c-myb, c-Fos, N-myc, L-myc,p53, c-řel, c-ski, o-ets-l a c-eís-2.• , Λ '
- 34. Způsob podle nároku 33, v y z n a č u j í c í se tím, žejaderný protoonkogen se vybírá ze skupiny c-myc a c-myba proteiny extracelulámí matrice se vybírají ze skupiny kolagenu.
- 35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že tkáň je arteriální stěna.
- 36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že krok administrace zahrnuje administraci antisensního, oligonukleotidu lokálně katetrem nebo obaleným stentem.
- 37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že jeden nebo více antisensnich oligonukleotidu se skládá z antisensního oligonukleotidu specifického pro c-myc a z antisensního oligonukleotidu specifického pro c-myb.
- 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že jeden nebo více antisensních oligonukleotidu specifických pro jaderný onkogen jsou fosforothioátové oligonukleotidy.
- 39. Způsob podle nároku 37, v y z n a č u j í c í s e t í m, že tkán zahrnuje kožní fibroblasty.
- 40. Způsob podle nároku 34, vyznačující se t í m, že antisensní látka se administruje povrchově.
- 41. Způsob podle nároku 40, v y z.n a č u j i c i s e t í m, že tkáň zahrnuje vnitřní orgán obsahující buňky hladkého svalstva nebo fibroblasty.
- 42. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u j í c í s e t í m, že syntéza proteinů extracelulámí matrice je sekrece proteinů extracelulámí matrice.
- 43. Způsob podle nároku 32, v y z n a Č u j í c í se t í m, že lidská tkáň je pojivová tkáň.
- 44. Způsob podle nároku 35, v y z n a č u j i c í se t i m, že jaderný onkogen je c-myc.
- 45. Způsob podle nároku 44, v y z n a č u j í c í se t í m, že proteiny extracelulámí matrice jsou buď prokolagen I, nebo prokolagen ΙΠ.
- 46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že tkáň zahrnuje lidské fibroblasty.
- 47. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že tkáň zahrnuje lidské buňky hladkého svalstva.
- 48. Způsob podle nároku 38, v y z n a Č u j í c í se t í m, že administrace zahrnuje lokální dodávání s použitím katetru.51;+ r62 'J i ř,Způsob podle nároku 48, v y z n a č u j í c i s e tím, že k inhibici syntézy dochází v absenci biologického procesu vybraného ze skupiny regulace Snižování transkripce genů kódujících prokolagen I a prokolagen lil extracelulámí matrice, regulace snižování translace mRNA prokolagenu I a prokolagenu HÍ extracelulámí matrice, regulace zvyšování intracelulárních degradačních procesů prekursoru prokolagenu I a prokolagenu IH extracelulámí matrice a regulace zvyšování degradace prokolagenu I a prokolagenu r —visr í- .¾.-tx' a*·*.·ΠΙ extracelulámí matrice. r ~· . .V .,... , . . ·y-Způsob-térapie sklerotických poruchy vy; zmac u jnxú„s;et;trmEŽerzahrnujefkrokxTz administrace efektivního množství antisensního oligonukleotidu specifického pro c-myc.Způsob inhibice syntézy kolagenu při restenose, vyznačující se t í m, že zahrnuje kroky lokální administrace efektivního množství antisensního oligonukleotidu specifického pro omyc.i..
- 52. Způsob podle nároku 51, v y z n a Č u j i c í se t í m, že redukce vzniku jizev zahrnuje pokles progrese vzniku proteinů extracelulámí matrice.' '
- 53. Způsob podle nároku 52, vyznačující se t í m, že krok lokální administrace . ' zahrnuje administraci katetřem nebo obaleným stentem. *71'
- 54. Způsob redukce vzniku jizev v lidské tkáni, v y z n a č u j ící setím, že zahrnuje administraci do lidské tkáně terapeuticky efektivního množství k protoonkogenu antisensního oligonukleotidu.
- 55. Způsob podle nároku 54, v y z n a č u j i c í se t i m, že krok lokální administraceX i zahrnuje lokální administraci kombinace antisensního oligonukleotidu specifického pro c-myc a antisensního oligonukleotidu specifického pro omyb.>1
- 56. ' Způsob inhibice vzniku fibrosní pojivové tkáně v lidech, vyznačující se t í m, že zahrnuje administraci lidem terapeuticky efektivního množství k protoonkogenu antisensního oligonukleotidu.
- 57. Farmaceutický přípravek použitelný pro inhibicí syntézy proteinů extracelulární matrice, vyznačující se t í m, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný excipient a ántisensní oligonukleotid specifický pro jaderný protoonkogen, který je přítomen v množství dostatečném pro inhibicí syntézy proteinů extracelulární matrice při administraci potřebnému subjektu
- 58. Přípravek podle nároku 57, vy z n a Ču j í cí se t í m, že ántisensní oligonukleotid je vybrán ze skupiny nukleotidů o sekvencích ID No: 1, 5, 6 a 7.
- 59. Způsob podle nároku 58, vyznačují cí se tí m, žeántisensní oligonukleotidje vybrán ze skupiny nukleotidů o sekvencích ID No. 1, 5, 6 a 7.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/424,991 US6323184B1 (en) | 1993-10-15 | 1995-04-19 | Arteriovenous and venous graft treatments: methods and compositions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ330297A3 true CZ330297A3 (cs) | 1998-03-18 |
| CZ295039B6 CZ295039B6 (cs) | 2005-05-18 |
Family
ID=23684702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19973302A CZ295039B6 (cs) | 1995-04-19 | 1996-04-19 | Přípravky pro terapii arteriovenózních a venózních štěpů |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6323184B1 (cs) |
| EP (1) | EP0871496B1 (cs) |
| JP (1) | JP3958362B2 (cs) |
| KR (1) | KR19990007864A (cs) |
| CN (1) | CN1177615C (cs) |
| AT (1) | ATE400301T1 (cs) |
| AU (1) | AU714658B2 (cs) |
| BR (1) | BR9608454A (cs) |
| CA (1) | CA2215631A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ295039B6 (cs) |
| DE (1) | DE69637593D1 (cs) |
| HU (1) | HU225244B1 (cs) |
| NO (1) | NO974824L (cs) |
| PL (1) | PL188628B1 (cs) |
| WO (1) | WO1996032966A1 (cs) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2324503T3 (es) | 1997-04-10 | 2009-08-07 | Stichting Katholieke Universiteit University Medical Centre Nijmegen | Pca3, genes pca3 y metodos de uso. |
| EP1173561A2 (en) * | 1999-01-29 | 2002-01-23 | Avi Biopharma, Inc. | Non-invasive method for detecting target rna |
| US6709465B2 (en) | 1999-03-18 | 2004-03-23 | Fossa Medical, Inc. | Radially expanding ureteral device |
| US7214229B2 (en) | 1999-03-18 | 2007-05-08 | Fossa Medical, Inc. | Radially expanding stents |
| JP2003510075A (ja) | 1999-09-29 | 2003-03-18 | ディグノキュアー・インコーポレーテッド | 良性および悪性の前立腺組織におけるｐｃａ３メッセンジャーｒｎａ種 |
| KR100860860B1 (ko) * | 2000-03-15 | 2008-09-29 | 오르버스네이치 메디칼 인코포레이티드 | 내피 세포 부착을 촉진하는 코팅 |
| EP2314293B1 (en) | 2001-01-16 | 2017-01-04 | Vascular Therapies, LLC | Implantable device containing resorbable matrix material and rapamycin for preventing or treating vasuloproliferative diseases |
| US20060241075A1 (en) * | 2001-05-18 | 2006-10-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of desmoglein gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US9994853B2 (en) | 2001-05-18 | 2018-06-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
| US20050282188A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20070042983A1 (en) * | 2001-05-18 | 2007-02-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20050159378A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-07-21 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20080161256A1 (en) * | 2001-05-18 | 2008-07-03 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20070270579A1 (en) * | 2001-05-18 | 2007-11-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US7144381B2 (en) * | 2001-06-20 | 2006-12-05 | The Regents Of The University Of California | Hemodialysis system and method |
| US7893248B2 (en) * | 2002-02-20 | 2011-02-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| EP1448590A4 (en) * | 2002-02-20 | 2004-12-15 | Sirna Therapeutics Inc | Inhibition of the myc and myb genes mediated by RNA interference mediated or genes of the corresponding synthetic pathways |
| US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| JP4824540B2 (ja) | 2003-02-07 | 2011-11-30 | ダイアノキュアー インク． | サンプル中の前立腺癌を検出する方法 |
| DK1638624T3 (da) | 2003-06-19 | 2014-02-03 | Vascular Therapies Llc | Vaskulær lukkeindretning |
| US10508277B2 (en) | 2004-05-24 | 2019-12-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference |
| CA2491067A1 (en) | 2004-12-24 | 2006-06-24 | Stichting Katholieke Universiteit | Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer |
| US20090176725A1 (en) * | 2005-08-17 | 2009-07-09 | Sirna Therapeutics Inc. | Chemically modified short interfering nucleic acid molecules that mediate rna interference |
| US9220837B2 (en) | 2007-03-19 | 2015-12-29 | Insuline Medical Ltd. | Method and device for drug delivery |
| US8622991B2 (en) | 2007-03-19 | 2014-01-07 | Insuline Medical Ltd. | Method and device for drug delivery |
| MX2009010000A (es) | 2007-03-19 | 2010-03-17 | Insuline Medical Ltd | Dispositivo para el suministro de farmaco. |
| US8409133B2 (en) | 2007-12-18 | 2013-04-02 | Insuline Medical Ltd. | Drug delivery device with sensor for closed-loop operation |
| EP2244740A1 (en) | 2008-02-19 | 2010-11-03 | Celladon Corporation | Compositions for enhanced uptake of viral vectors in the myocardium |
| CA2743027C (en) | 2008-11-07 | 2016-04-12 | Insuline Medical Ltd. | Device and method for drug delivery |
| US9260471B2 (en) | 2010-10-29 | 2016-02-16 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA) |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
| US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
| SE462364B (sv) | 1988-09-30 | 1990-06-18 | Goeran Hansson | Anvaendning av gamma-interferon foer beredning av ett preparat foer behandling av vaskulaer stenos |
| US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
| US5122048A (en) | 1990-09-24 | 1992-06-16 | Exxon Chemical Patents Inc. | Charging apparatus for meltblown webs |
| CA2082411A1 (en) | 1991-06-28 | 1992-12-29 | Robert D. Rosenberg | Localized oligonucleotide therapy |
| WO1993008845A1 (en) | 1991-11-08 | 1993-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
| US5756476A (en) * | 1992-01-14 | 1998-05-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibition of cell proliferation using antisense oligonucleotides |
| US5869462A (en) * | 1992-09-10 | 1999-02-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cell |
| US5821234A (en) | 1992-09-10 | 1998-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cell |
| AU5961094A (en) | 1992-12-31 | 1994-08-15 | Texas Biotechnology Corporation | Antisense molecules directed against a platelet derived growth factor receptor related gene |
| WO1994015645A1 (en) | 1992-12-31 | 1994-07-21 | Texas Biotechnology Corporation | Antisense molecules directed against genes of the raf oncogene family |
| CA2153158A1 (en) | 1993-01-07 | 1994-07-21 | Andrew Zalewski | Antisense inhibition of c-myc to modulate the proliferation of smooth muscle cells |
| JPH08511530A (ja) | 1993-06-11 | 1996-12-03 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 内因性酸化窒素生成又は活性の調節による血管変性疾患の治療 |
| AU8019694A (en) | 1993-10-15 | 1995-05-04 | Thomas Jefferson University | Inhibition of extracellular matrix synthesis by antisense compounds directed to nuclear proto-oncogenes |
-
1995
- 1995-04-19 US US08/424,991 patent/US6323184B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-04-19 CZ CZ19973302A patent/CZ295039B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 AT AT96912854T patent/ATE400301T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 DE DE69637593T patent/DE69637593D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 PL PL96323046A patent/PL188628B1/pl unknown
- 1996-04-19 WO PCT/US1996/005334 patent/WO1996032966A1/en not_active Ceased
- 1996-04-19 AU AU55532/96A patent/AU714658B2/en not_active Ceased
- 1996-04-19 KR KR1019970707387A patent/KR19990007864A/ko not_active Ceased
- 1996-04-19 EP EP96912854A patent/EP0871496B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 CA CA002215631A patent/CA2215631A1/en not_active Abandoned
- 1996-04-19 JP JP53188996A patent/JP3958362B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 CN CNB961933615A patent/CN1177615C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 HU HU9800729A patent/HU225244B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 BR BR9608454-5A patent/BR9608454A/pt not_active Application Discontinuation
-
1997
- 1997-10-17 NO NO974824A patent/NO974824L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11503911A (ja) | 1999-04-06 |
| NO974824L (no) | 1997-12-16 |
| AU5553296A (en) | 1996-11-07 |
| HU225244B1 (en) | 2006-08-28 |
| AU714658B2 (en) | 2000-01-06 |
| DE69637593D1 (de) | 2008-08-21 |
| KR19990007864A (ko) | 1999-01-25 |
| CN1181706A (zh) | 1998-05-13 |
| PL188628B1 (pl) | 2005-03-31 |
| PL323046A1 (en) | 1998-03-02 |
| HUP9800729A2 (hu) | 1998-07-28 |
| ATE400301T1 (de) | 2008-07-15 |
| CZ295039B6 (cs) | 2005-05-18 |
| HUP9800729A3 (en) | 2000-07-28 |
| EP0871496B1 (en) | 2008-07-09 |
| JP3958362B2 (ja) | 2007-08-15 |
| CN1177615C (zh) | 2004-12-01 |
| EP0871496A1 (en) | 1998-10-21 |
| CA2215631A1 (en) | 1996-10-24 |
| BR9608454A (pt) | 2002-02-05 |
| WO1996032966A1 (en) | 1996-10-24 |
| US6323184B1 (en) | 2001-11-27 |
| NO974824D0 (no) | 1997-10-17 |
| EP0871496A4 (cs) | 1998-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ330297A3 (cs) | Terapie arteriovenózními a venozními štěpy: způsoby a přípravky | |
| US6133242A (en) | Inhibition of extracellular matrix synthesis by antisense compounds directed to nuclear proto-oncogenes | |
| EP0690726B1 (en) | Antisense inhibition of c-myc to modulate the proliferation of smooth muscle cells | |
| CA2359317C (en) | Method of treating restenosis by antisense targeting of c-myc | |
| US5756476A (en) | Inhibition of cell proliferation using antisense oligonucleotides | |
| JPH09507381A (ja) | 血管平滑筋細胞の増殖の阻害 | |
| JPH09503651A (ja) | 血管内皮細胞増殖因子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 | |
| JP2011507855A (ja) | 外科的癒着の治療のための、単独のまたは抗コネキシンポリヌクレオチドと組み合わせた抗コネキシンペプチドの使用 | |
| EP0732940B1 (en) | Inhibition of extracellular matrix synthesis by antisense compounds directed to c-myc | |
| JP2007523839A (ja) | 血管新生性障害の治療法 | |
| Yamamoto et al. | Locally applied cilostazol suppresses neointimal hyperplasia and medial thickening in a vein graft model | |
| WO2004092378A2 (en) | Method for treatment of cancerous angiogenic disorders | |
| US7767652B2 (en) | Medical devices and methods for reducing localized fibrosis | |
| US7078390B1 (en) | Ribozymes to growth factor originating in human platelet | |
| Breitwieser et al. | Inhibition of miR-574-5p as innovative first-in-class disease-modifying treatment approach for osteoarthritis | |
| CA2377273A1 (en) | Antisense oligonucleotide modulating cyclin e gene expression and therapeutic uses thereof | |
| JP2001095573A (ja) | 血管細胞中の遺伝子の転写の調節 | |
| CN118178658A (zh) | Sox9作为靶点在筛选或制备抗腹主动脉瘤和/或血管平滑肌细胞衰老的药物中的应用 | |
| US20180126048A1 (en) | Nanoparticle-medicated genetic delivery of growth inhibiting genes on balloon angioplasty to suppress intimal hyperplasia | |
| JP2007135603A (ja) | 血管細胞中の遺伝子の転写の調節 | |
| JP2008545749A (ja) | 血管内膜過形成を阻害する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090419 |