CZ310456B6 - Způsob archivace DNA - Google Patents

Abstract

Způsob archivace DNA spočívá v tom, že se pro uchování DNA použije skleněná ampule. Pro stabilizaci DNA se použije stabilizační chemikálie na bázi HMIMCl, což je 1-hexyl-3-methyl-imidazolium chlorid. Stabilizační chemikálie dále obsahuje jako minoritní složku polyalkohol, kterým je d-sorbitol, d-xylitol, meso-erythritol nebo glycerin a také vhodný pufr. Po purifikaci a stabilizaci vzorku v ampuli a jejím vysušení se ampule jednoduše hermeticky uzavře zatavením a archivuje se za teploty místnosti.

Description

Způsob archivace DNA

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu archivace vzorků DNA (deoxyribonukleové kyseliny) různého původu, jako jsou vzorky DNA humánního, živočišného, rostlinného, mikrobiálního nebo jiného původu při běžné pokojové teplotě.

Dosavadní stav techniky

DNA, která je zpracovávána v molekulárně-biologických výzkumných, servisních či znaleckých laboratořích, musí být z důvodu následných experimentů či na základě požadavků ze stran nejrůznějších institucí, jako jsou zdravotnická zařízení, armáda, policie apod. dočasně či dlouhodobě uchovávána.

V současnosti se k archivaci DNA používají čtyři základní způsoby:

1. Způsob zamrazení vzorku:

Klasický způsob archivace DNA na dobu mnoha měsíců či let je založen na technologii zamrazení vzorku pomocí mrazicích boxů (-70 °C) nebo kapalného dusíku (-196 °C). Jedná se o způsob finančně náročný a zcela závislý na spolehlivosti technického vybavení, neboť dojde-li k výpadku elektrické energie či poruše chladicího zařízení, dochází k nevratnému zničení vzorků. Informace o uloženém vzorku se vzhledem extrémním teplotám omezují pouze na jednoduché kódové označení nosiče vzorku.

Opakované uchování DNA tímto způsobem je finančně velmi náročné.

2. Způsob archivace na tzv. FTA™ kartu:

FTA karty se vesměs používají k transportu vzorku DNA z místa odběru do laboratoře. V některých případech se FTA karty používají také jako dočasné archivační médium při pokojových teplotách. Nevýhodou této metody je, že ne vždy bezpečně garantuje dostatečné množství použitelné DNA a vzorky takto dlouhodobě uložené jsou náchylné na destrukci vlivem vnějšího prostředí jako je vlhkost, mikrobiální kontaminace apod. Další nevýhodou je rozsah informací o uloženém vzorku, který se většinou omezuje na popis vzorku na jednoduchém papírovém formuláři.

Způsob není vhodný pro dlouhodobou archivaci DNA.

3. Způsob archivace stabilizované DNA v plastových mikrozkumavkách:

Laboratorně zpracovaná DNA se dočasně či dlouhodobě uchovává při teplotách od -20°C v sériově vyráběných plastových mikrozkumavkách, které svojí konstrukcí a použitým materiálem dostatečně nezajišťují dlouhodobou stabilitu uloženého vzorku, a to zejména s ohledem na afinitu DNA k povrchu zkumavek či hydrolýze. Tyto zkumavky lze poměrně těžko vizuálně identifikovat a systematicky archivovat. Obsah zkumavek není dostatečně chráněn před vlivem vnějšího prostředí, v případě malfunkce mrazicího zařízení dokonce dojde k nezvratné degradaci.

4. Způsob archivace stabilizované DNA kombinací skleněného nosiče a plastového pouzdra (patent číslo CZ 304581)

- 1 CZ 310456 B6

Způsob slouží kjednorázové archivaci DNA za účelem dlouhodobého uložení. Konstrukce použitého nosiče nesplňuje podmínky jednoduché následné manipulace za účelem dalšího zpracování. Nosič archivované DNA je rozměrově objemný. Práce s nosičem vyžaduje zaškolený personál a speciální materiální vybavení.

Existuje tedy potřeba nalézt způsob archivace DNA vzorků, který splňuje následující požadavky:

- umožňuje archivaci DNA za účelem uložení genetických a epigenetických změn DNA;

- umožňuje uložení vybraných vitálních vzorků;

- je technicky i materiálově proveditelná v jakékoliv DNA laboratoři;

- konstrukčně i laboratorně umožňuje snadné a rychlé následné zpracování vzorku bez nutnosti použití zvláštních přístrojů a chemikálií (forma uložení READY-2B-TESTED);

- jako hlavní komponenta pro archivaci je použita vlastní stabilizační chemikálie, aby byla technologie nezávislá na dalších komerčních produktech;

- umožňuje časově neomezenou archivaci DNA vzorků;

- umožňuje archivaci DNA vzorků při běžných pokojových teplotách a běžných světelných podmínkách bez nutnosti použití chladicích zařízení;

- garantuje dostatečné množství a kvalitu archivované DNA pro následné rozbory;

- splňuje podmínky dlouhodobé ochrany vzorku před vnějšími vlivy (vlhkost, UV záření, kontaminace jinou DNA apod.) a zároveň před nepříznivým vlivem samotného materiálu nosiče, na kterém je DNA uložena;

- splňuje podmínky nezávislosti na energetickém zdroji;

- rozměry archivačního média (ampule) umožňují tvorbu rozsáhlých archivů;

- mechanická konstrukce archivačního média umožňuje automatizovanou obsluhu robotickými mechanismy ;

- systém je propojitelný s elektronickou datovou sítí;

- každé archivační médium jej ednoznačně identifikováno.

Podstata vynálezu

Výše uvedené požadavky splňuje řešení podle předkládaného vynálezu a odstraňuje tak veškeré nedostatky archivačních systémů podle dosavadního stavu techniky.

Způsob archivace DNA podle předkládaného vynálezu spočívá v tom, že se pro uchování DNA použije komerčně snadno dostupný nosič, kterým je skleněná ampule. Pro stabilizaci DNA je klíčové použití stabilizační chemikálie na bázi HMIMC1, což je l-hexyl-3-methyl-imidazolium chlorid. Stabilizační chemikálie dále obsahuje jako minoritní složku polyalkohol, kterým může být d-sorbitol, d-xylitol, meso-erythritol nebo glycerin a také vhodný pufr. Po purifikaci a stabilizaci vzorku se ampule jednoduše hermeticky uzavře zatavením, jednoznačně se identifikuje a archivuje se za teploty místnosti a v běžných světelných podmínkách. Technologie umožňuje dlouhodobou i krátkodobou archivaci nejen DNA, ale i vybraných vitálních vzorků. Technologie dále umožňuje snadné zpětné zpracování archivovaného vzorku.

Oproti dosavadním způsobům archivace DNA se jedná o technologii, která výrazně zjednodušuje proces archivace DNA i její zpětné zpracování za účelem dalšího laboratorního zpracování. Technologie používá komerčně snadno dostupný nosič, kterým je skleněná ampule, jejíž hermetické uzavření je velmi jednoduché. Pro stabilizaci DNA se použije snadno dostupná chemikálie.

Technologie je vhodná jak pro krátkodobou, tak pro dlouhodobou archivaci DNA. Umožňuje pro účely archivace DNA uchovávat také vybrané tělní tekutiny, jako je žilní krev, mozkomíšní mok, pupečníková krev, sliny apod. v původní „vitální“ podobě.

-2CZ 310456 B6

Technologie umožňuje tvorbu rozsáhlých archivů vyžadující minimální prostorové nároky. Archivace je vzhledem k použitým materiálům finančně nenáročná a komerčně dostupná a je využitelná v mnoha různých oborech.

Podrobný popis vynálezu

- Archivační médium

Podle způsobu archivace DNA podle vynálezu se příprava DNA pro archivaci provádí biochemickou metodou přímo ve skleněné ampuli, která je zároveň nosičem pro archivaci DNA. Předností skleněné ampule je to, že je vyrobena z materiálu vůči uloženému vzorku dlouhodobě zcela inertnímu. Archivačním médiem je ampule pro archivaci DNA s izolovanou a stabilizovanou DNA nebo ampule pro archivaci vitálních vzorků.

a) Ampule pro archivaci DNA je nosičem a ochranným pouzdrem stabilizované DNA. Je vyrobena z čirého borosilikátového skla s proužkem pro snadné odlomení. Ampule odpovídá požadavkům USP Type I, ASTM E 438 Type I, Class A a s výhodou má objem 1 ml.

b) Ampule pro archivaci vitálních vzorků je ochranným pouzdrem pro vitální vzorky. Je vyrobena z hnědého borosilikátového skla s proužkem pro snadné odlomení. Ampule odpovídá požadavkům USP Type I pro uchovávání látek citlivých na světlo a s výhodou má objem 1 až 2 ml podle typu archivované tkáně.

. Postup archivace DNA

Archivace vzorků sestává z následujících kroků:

a) Odběr vzorku

b) Izolace DNA

c) Stabilizace DNA

d) Archivace DNA.

a) Odběr vzorku

Vzorky biologického materiálu, jako je krev, stěr z dutiny ústní, části tkání, části rostlin atd. se odebírají způsobem zamezujícím kontaminaci vzorku cizí DNA.

b)Izolace

Izolace DNA ze vzorku se provádí standardním laboratorním postupem (např. soupravou Quick DNA Microprep Kit).

Izolovaná DNA se následně standardním způsobem kvantifikuje (např. pomocí soupravy Quantifiler™ HP DNA Quantification Kit)

c) Stabilizace:

Izolovaná DNA se smíchá se stabilizačním roztokem, kterým je chemikálie definovaná dále. Stabilizovaná DNA se pomocí mikropipety přenese do archivační DNA ampule a následně řádně vysuší, například pomocí vakuové odparky (60 až 120 minut, 30 °C).

d) Archivace

Rádně vysušená stabilizovaná DNA v ampuli se okamžitě uzavře, aby vlivem vzdušné vlhkosti nedošlo k destabilizaci a degradaci DNA.

- 3 CZ 310456 B6

Ampule se hermeticky uzavře zatavením v krčkové oblasti pomocí laboratorního hořáku.

Stabilizační chemikálie

Stabilizační chemikálie je klíčovým prvkem ve způsobu archivace DNA podle předkládaného vynálezu. Doposud byly k tomuto účelu používány cenově nákladné komerční produkty. Proto byla vyvinuta a otestována vlastní chemikálie určená speciálně pro účely archivace DNA.

Složení stabilizační chemikálie

1. Hlavní složkou stabilizační chemikálie je 4% HMIMC1, (l-hexyl-3-methyl-imidazolium chlorid)

2. Další složkou stabilizační chemikálie je Polyalkohol, kterým může být d-sorbitol, d-xylitol, meso-erythritol nebo glycerin s výhodou v koncentraci 1 % hmotnostní. Polyalkoholy při odpaření zabrání aglomeraci makromolekul DNA a usnadní opětovné rozpuštění vzorku

3. Další složkou je Tris-HCl pufr, který slouží k udržení hodnoty pH v požadovaném rozmezí.

Příprava stabilizační chemikálie je popsána v příkladové části.

Tuto stabilizační chemikálii lze použít i v dalších oblastech laboratorního zpracování DNA a nahrazuje tak komerčně drahé a v současnosti i těžko dostupné preparáty.

Uložení do ampule

Ampule, ve které se stabilizovaná DNA uchovává, slouží jednak jako nosič stabilizovaného materiálu a zároveň jako ochranné pouzdro. Stabilizovaná DNA se v pouzdru hermeticky uzavře.

Po vložení stabilizované vzorku DNA se ampule zataví pomocí laboratorního hořáku, čím vznikne hermeticky uzavřený nosič zamezující přístupu vzdušné vlhkosti.

Archivace vitálních vzorků

Do ampule je možné uložit také tělní tekutiny, jako je například žilní krev, slina, mozkomíšní mok, apod. Tělní tekutina se odebere standardním laboratorním postupem a okamžitě se uloží do sterilní ampule.

Odběr žilní krve se provede do odběrové zkumavky (např. VACUETTE® pro koagulační vyšetření). Zkumavky obsahují pufrovaný roztok citrátu sodného, jehož koncentrace je 0,109 mol/1 (3,2%). Jeden díl citrátu sodného je v poměru k devíti dílům krve.

Následně se ampule okamžitě uzavře zatavením.

Odběr vzorku slin se provede například pomocí odběrové sady DNA/RNA Shield - Saliva Collection Kit. Odebraný vzorek se pomocí sterilní stříkačky přenese do ampule.

Následně se ampule okamžitě uzavře zatavením.

Způsoby identifikace nosiče

Ampule s uloženou DNA se potom jednoznačně identifikuje. Je možné použít identifikaci pomocí unikátního alfanumerického kódu, volitelně se může identifikovat také QR kódem nebo miniaturním elektronickým bezdotykovým RFID čipem nebo jakýmkoli jiným způsobem umožňujícím jednoznačnou identifikaci vzorku.

-4CZ 310456 B6

a) Alfanumerický kód - každá ampule je identifikována jedinečným kódem, který je na ampuli „vypískován“ a je tudíž nesmazatelný (obr. 3).

b) QR kód - pro účely snadné identifikace může být ampule označena unikátním QR kódem (obr. 4).

c) RFID čip - pro potřeby robotické obsluhy rozsáhlých databází archivované DNA lze nosič (ampuli) opatřit NFC mikročipem, který nese veškeré informace o obsahu (obr. 5).

d) Dle potřeby daného pracoviště a účelu použití.

Poté se označená ampule uloží do prostoru pro skladování za pokojové teploty a za běžných světelných podmínek.

Oproti dosavadním způsobům archivace se jedná o technologii, která významně zjednodušuje proces dlouhodobé archivace DNA i její zpětné zpracování za účelem dalšího laboratorního zpracování.

Technologie používá pro stabilizaci DNA chemikálii vlastní výroby.

Technologie je vhodná pro opakované uložení DNA za účelem zachycení vývoje genetických a epigenetických změn DNA.

Touto technologií lze uchovávat tělní tekutiny, jako je krev, sliny, mozkomíšní mok atd. v původní „vitální“ podobě.

Varianty archivů DNA

Archivační modul (ampule) je základní jednotkou archivu DNA vzorků, (obr. 1). Variantou je ampule s obsahem „vitálních“ tělních tekutin, (obr. 2).

Archivace vzorků DNA podle vynálezu umožňuje vytváření „osobních“ archivů DNA pro potřeby následného výzkumu například potenciálních dědičných onemocnění (obr. 6 až 7).

Pomocí základního archivačního modulu (ampule) je možné vytvářet rozsáhlé archivy DNA v rámci státních a zdravotních institucí za účelem dalšího výzkumu a vývoje nových technologií.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje archivační modul (ampuli) se vzorkem DNA.

Obr. 2 znázorňuje ampuli s obsahem vitálních tělních tekutin.

Obr. 3 znázorňuje ampuli označenou vypískovaným alfanumerickým kódem.

Obr. 4 znázorňuje ampuli označenou QR kódem.

Obr. 5 znázorňuje ampuli označenou RFID čipem.

Obr. 6 a 7 znázorňují varianty osobních archivů DNA.

Obr. 8 znázorňuje rozsáhlý archiv DNA například v rámci zdravotních a státních institucí za účelem dalšího výzkumu a vývoje nových technologií.

- 5 CZ 310456 B6

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava vzorku DNA a jeho uložení do ampule

Vzorek biologického materiálu se odebere běžným způsobem zamezujícím kontaminaci vzorku cizí DNA. DNA se ze vzorku izoluje standardním laboratorním postupem pomocí soupravy Quick-DNA Microprep Kit. Izolovaná DNA se poté kvantifikuje pomocí soupravy Quantifiler™ HP DNA Quantification Kit. Izolovaná DNA se smíchá se stabilizačním roztokem obsahujícím 4% l-hexyl-3-methyl-imidazolium chlorid případně obsahujícím 1 % d-sorbitolu. Stabilizovaná DNA se pomocí mikropipety přenese do archivační ampule, řádně se vysuší a odpaří se na vakuové odparce po dobu 60 až 120 minut při 30 °C. Vysušená, stabilizovaná DNA se v ampuli ihned hermeticky uzavře pomocí zatavení v krčkové oblasti pomocí laboratorního hořáku.

Příklad 2

Příprava stabilizační chemikálie

Do každé z 5 2ml Eppendorfových zkumavek se odváží 80 mg l-hexyl-3-methyl-imidazolium chloridu (HMIMC1). Přidá se 20 mg příslušného polyalkoholu (odváženého do ampulky). Přidá se 1,9 ml 0,2M Tris-HCl pufru pH = 8. Po dokonalém rozpuštění se roztoky filtrují pomocí 5ml injekční stříkačky přes 0,45mikronový nylonový filtr do čisté 2ml Eppendorfovy zkumavky (low protein bind).

Příklad 3

Test vlivu materiálu nosiče na uloženou DNA

Ověřovacími pokusy, které spočívaly v uložení vzorku se standardní DNA o známé koncentraci do komůrky nosiče (ampule) po dobu 20 dní při stabilní laboratorní teplotě a 10 dní při střídajících se teplotách (2h laboratorní teplota, 72h -26 °C, 48h +65 °C, 48h -26 °C, 72h +65 °C). Bylo zjištěno, že použitý materiál nosiče při těchto podmínkách žádným způsobem neovlivňuje kvalitu a kvantitu stabilizované DNA.

Příklad 4

Test odolnosti ochranného pouzdra (ampule) a hermetického uzávěru

Uzavřená ampule se stabilizovanou DNA byla vystavována střídajícím se teplotám (2 h laboratorní teplota, 72 h -26 °C, 48 h +65 °C, 48 h -26 °C, 72 h +65 °C). Po této proceduře zůstal uzávěr pouzdra neporušen a po opětovném otevření ampule bylo zjištěno, že kvalita a kvantita stabilizované DNA nebyla nijak negativně ovlivněna.

Příklad 5

Test kvality uloženého vitálního vzorku

Po odběru vitálního vzorku se provedl jeho test na kvalitu DNA.

Následně se vzorek hermeticky uzavřel do ampule a skladoval se při běžných pokojových podmínkách. Po uplynutí 12 měsíců se vzorek opět testoval.

-6CZ 310456 B6

Kvalita obsažené DNA nebyla nijak negativně ovlivněna.

Průmyslová využitelnost

Způsob archivace DNA podle vynálezu je možné použít v oblastech, jako jsou zdravotní instituce (kliniky, nemocnice, laboratoře), kdy je výhodou jednoduchá archivace DNA bez potřeby dalšího přístrojového vybavení, možnost READY-2B-TESTED, tedy snadné zpětné zpracování v každé DNA laboratoři, garance kvality a množství uložené DNA a možnost elektronického propojení 10 vzorku s informacemi o jeho původu. Další oblastí využitelnosti jsou vědecké instituce (výzkumné ústavy, muzea), kde je výhodou časově neomezená archivace vzorků DNA různého původu bez nutnosti složité technologie uskladnění a možnost sdílení informací v elektronické podobě. Dále mohou způsob využívat různé státní instituce (armáda, policie, letectvo), kdy je možné vytvářet velké archivy s minimální náročností na prostor a podmínky uskladnění, s 15 garancí kvality a množství uložené DNA po neomezenou dobu při nezávislosti na energetických zdrojích.

Claims (8)

1. Způsob archivace DNA vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) získání a purifikace vzorku DNA;

(b) přenesení purifikovaného vzorku DNA do ampule;

(c) smísení purifikované DNA v ampuli se stabilizačním činidlem, které obsahuje l-hexyl-3methyl-imidazolium chlorid, tedy HMIMC1, polyalkohol a pufr;

(d) vysušení obsahu ampule;

(e) hermetické uzavření ampule; a (f) ložení ampule se vzorkem DNA při teplotě místnosti.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že polyalkoholem je d-sorbitol, d-xylitol, mesoerythritol nebo glycerin.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že pufrem je Tris-HCl.

4. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že polyalkohol je přítomen v množství 1 % hmotnostní.

5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se ampule jednoznačně identifikuje alfanumerickým kódem, QR kódem, RFID čipem.

6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že vzorkem DNA je DNA humánního, živočišného, rostlinného, mikrobiálního nebo jiného původů.

7. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že vzorkem DNA je vitální vzorek.

8. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že dalším krokem je vytvoření archivů DNA z ampuli se vzorkem DNA z kroku (f).