CZ310423B6

CZ310423B6 - Směs pro přípravu lyofilizovaných tablet s antimikrobiálním účinkem proti bakteriím Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa s obsahem bakteriofágů a lytických enzymů s optimální stabilitou a efektivitou aktivních složek

Info

Publication number: CZ310423B6
Application number: CZ2023-293A
Authority: CZ
Inventors: Marek MOŠA; Moša Marek RNDr., Ph.D; Martin Benešík; Benešík Martin Mgr., Ph.D
Original assignee: MB PHARMA s.r.o
Priority date: 2023-07-31
Filing date: 2023-07-31
Publication date: 2025-06-04
Also published as: AU2024316796A1; CZ2023293A3; AU2024316796B2; EP4580655A1; JP2025539486A; WO2025026474A1

Abstract

Antimikrobiální směs pro přípravu lyofilizovaných tablet obsahující bakteriofágy a endolyzin, o sekvenci SEQ ID NO: 1, významných patogenů S. aureus a P. aeruginosa jako aktivní složky v terapeuticky aplikovatelné a stabilní dávce, a které lze uplatnit pro léčbu infekcí způsobených výše zmíněnými patogenními kmeny.

Description

Směs pro přípravu lyofilizovaných tablet s antimikrobiálním účinkem proti bakteriím Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa s obsahem bakteriofágů a lyrických enzymů s optimální stabilitou a efektivitou aktivních složek

Oblast techniky

Vynález se týká směsi pro přípravu lyofilizovaných jednodávkových forem (tablet), jejichž aktivní složkou jsou bakteriální viry (bakteriofágy anebo zkráceně fágy) ať už ve formě fágových lyzátů nebo purifikátů v kombinaci s jejich antimikrobiálně působícími enzymy (endolyziny). Složení této formy balancuje vyváženou kompozici jednotlivých složek, zajištující vhodné technické parametry pro lékovou/aplikační formu, při zachování maximální stability aktivních látek (fágů a endolyzinů) a zachování jejich dlouhodobé stability. Tato aplikační forma tak lze uplatnit při léčbě bakteriálních infekcí způsobených patogenními kmeny Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa v klinické praxi. Konkrétně se jedná o dva specificky působící fágy proti bakteriím .S', aureus a P. aeruginosa a endolyzin LysMBlO s unikátní aminokyselinovou sekvencí.

Dosavadní stav techniky

Světová zdravotnická organizace (WHO) zařadila rezistenci patogenních bakterií vůči antibiotikům mezi největší hrozby pro lidské zdraví v 21. století, způsobující nejen ztráty na životech, ale i značnou finanční zátěž zdravotnického systému (URL 1). Mezi nej nebezpečnější patogeny rezistentními k antibiotikům spadají bakterie .S', aureus a P. aeruginosa. Zástupci .S', aureus jsou původci celé řady vážných infekcí např. osteomyelitidy, sepse, taktéž infekcí ran a kůže. Podobně i P. aeruginosa zapříčiňuje širokou škálu onemocnění například infekce ran a pneumonic (obzvlášť nebezpečné u pacientů s cystickou fibrózou). Oba výše zmíněné patogeny jsou oportunní, tudíž ohrožují především imunokompromitované jedince, často v nemocničním prostředí (Barer 2018). Rezistence těchto patogenů tak komplikuje poskytování zdravotní péče, zejména omezuje možnosti antibiotické léčby infekcí a vede k nutnosti vyhledávat alternativy mezi které spadá i fágová terapie (Abedon et al. 2011).

Bakteriofágy (zkráceně fágy) jsou viry bakterií, způsobující bakteriální lyži. Fágová terapie využívá tuto vlastnost pro léčbu bakteriálních infekcí. Tento terapeutický přístup je zkoumán již od první poloviny 20. století, nicméně po objevu a rozšíření antibiotik byl zejména v západních zemích opomíjen (část výzkumu dodnes pokračuje v zemích bývalého Sovětského svazu např. v Gruzii). Fágy zůstaly předmětem zájmu pouze v rámci biotechnologie a molekulární biologie (Abedon et al. 2011). Důvodem této situace byl hlavně objev antibiotik. Fágová terapie má ale řadu výhod jako je např. menší riziko nežádoucích účinků (oproti antibiotikům), zejména v důsledku minimálního vlivu na přirozenou mikroflóru pacienta, dále jsou fágy schopny adaptace vůči obranným mechanismům bakterie (Loc-Carrillo and Abedon 2011). Původní nedostatečná znalost fágové biologie vedla k rozporuplným výsledkům terapeutické aplikace. S rozvojem moderních metod molekulární biologie, celogenomového sekvenování, genomiky aproteomiky již dostatečně rozumíme fágové biologii a jejich interakci s hostitelskými bakteriemi. S velkým rozsahem těchto znalostí ohledně bakteriofágů a také kvůli zvyšující se antibiotické rezistenci se zájem o fágovou terapii celosvětově zvyšuje (Abdelrahman 2021). Stejně tak se rozšiřuje zájem o antibakteriální aplikaci samotných fágových enzymů (tzv. endolyziny), které dovedou lyžovat hostitelskou buňku. Tyto enzymy se uplatňují ve fágovém životním cyklu v poslední fázi, kdy štěpí peptidoglykan buněčné stěny a tím zabít bakteriální buňku. U grampozitivních bakterií, jako je .S', aureus, je lze použít i při aplikaci zvnějšku bakteriální buňky (Abdelrahman 2021). U obou těchto biotechnologických postupů léčby bakteriálních infekcí je důležité, aby byla dosažena co nejdelší stabilita jejich antimikrobiálního účinku v čase a zároveň i stejnoměrné dávkování. Obě výše zmíněné vlastnosti jsou významné pro uplatnění fágů a jejich endolyzinů v praxi (Abdelrahman 2021).

- 1 CZ 310423 B6

Každý bakteriofág se liší spektrem bakterií, které je schopen úspěšně infikovat a posléze lyžovat. Fágy mohou být polyvalentní s širokým spektrem bakterií na které působí, ale na druhou stranu také vysoce specializované najeden patogenní mikroorganismus. Podobné je to u endolyzinů, ty však většinou působí na více druhů bakterií v rámci rodu, ale lišit se mohou svou aktivitou (Abdelrahman 2021). Právě kombinace různých fágů (koktejl) může vést k rozšíření spektra působení na bakterie. Navíc izolace specifických naturálních mutant může vést k antimikrobiálnímu působení na jinak rezistentní bakterie. V případě zde uvedených bakteriofágů se jedná o specifické fágy, které byly izolovány jako kmeny fágů účinné na rezistentní bakterie. Rozšiřují tak spektrum antimikrobiální aktivity na bakterie jak rezistentní antibiotikům, tak necitlivé k jiným fágům.

Použití fágů a endolyzinů v tekuté formě je běžné, ale velkou výzvou pro současnou vědu je příprava aplikačních/lékových/skladovacích forem. Dle dostupné literatury byly fágy zpracovány do tekutých, polotuhých i tuhých forem (Jault et al., 2019, Brown et al., 2018, Khanal et al., 2021). Tekuté formy jsou na přípravu finančně i časově nenáročné, nicméně mají větší náchylnost k mikrobiální kontaminaci a vyšší nároky na skladovací prostory, kdy je problém zachovat stabilitu jejich antibakteriálního účinku při vyšších teplotách (Malík et al. 2017). Navíc tekuté formy na rozdíl od polotuhých a tuhých lékových forem mají limitaci při určitých formách aplikací. U polotuhých forem je hlavní výhodou snazší aplikace, nicméně se k ní vztahují stejné komplikace jako u forem tekutých. V obou případech lze pro udržení mikrobiologické jakosti využít konzervační látky a antioxidanty, ale ty mohou mít negativní dopad na antimikrobiální efekt a jakost výsledného produktu (Subils et al., 2012). Tuhé formy mají obecně nižší riziko mikrobiální kontaminace, tudíž aplikace konzervantů není nutná. Navíc zajišťují vyšší stabilitu antibakteriálního účinku, přesnější dávkování a menší nároky na podmínky skladování. Hlavními nevýhodami je složitější optimalizace a vyšší finanční náročnost jejich přípravy (Komárek 2006). Ověřené metody pro zpracování fágů do pevné formy jsou sprejové sušení a lyofilizace (Malík et al. 2017).

Během sprej ového sušení se roztok pevné látky vystaví horkému a suchému plynu v sušící komoře a dojde k tvorbě prachových částic, které jsou ze sušící komory odsáty. Tento postup se uplatňuje především při přípravě inhalovatelných prachů (Hoe et al. 2014). V případě fágů byla tato metoda několikrát testována a bylo dosaženo dobré stability fágového titru (Malik et al. 2017). Nicméně, jak je zmíněno výše, výsledkem sprejového sušení jsou pouze prachové částice, které mají komplikovanější dávkování a skladovaní a vyžadují další zpracování např. lisování, což může mít negativní dopad na efektivitu fágů (Khanal et al., 2021) způsobenou hlavně teplotními výkyvy.

Ke zpracování bakteriofágů do pevné formy se standartně využívá lyofilizace (mrazové sušení). Tento proces zahrnuje zmrazení vzorku, následuje primární sušení, kdy dochází k sublimaci ledu, a nakonec se během sekundárního sušení při vyšších teplotách odpařuje zbytek vody (Malík et al. 2017). Fágy v lyofilizátu jsou schopny udržet efektivitu v rámci několika měsíců, dokonce i let (Clark 1962). Nicméně tato stabilita je ovlivněna mnoha faktory jako jsou podmínky procesu lyofilizace, použité pomocné látky (tj. zejména plniva akryoprotektiva), nebo skladování a rozpouštění výsledného lyofilizátu (Malik et al. 2017). Navíc na rozdíl od chemických látek se stabilita a efektivita fága liší u každého kmene, je tedy nutné experimentálně optimalizovat proces lyofilizace a najít nejlepší složení média, vhodné pro uchování maximální aktivity daného fága. Obdobný princip funguje také u enzymů.

Je potřeba zdůraznit, že fágy jsou standardně lyofilizovány v uzavřených vialkách do tzv. lyofilizačního koláče. Ten má však komplikovanější aplikaci a dávkování např. každý koláč se skladuje odděleně ve vialce, což zabírá více prostoru a před další manipulací je nezbytné jej převést do roztoku, čímž se redukují výhody lyofilizace. Řešením tohoto je příprava jednodávkových lyofilizátů na kovové formě, na kterou se nanese směs plniva a kryoprotektiva s fágovými lyzáty (případně purifikáty) a s roztokem fágových enzymů, ještě před zahájením

-2CZ 310423 B6 lyofilizace. Je tak dosažena vysoká stabilita jejich antibakteriálního efektu. Navíc vzniklé jednodávkové formy lze poté skladovat v jednom primárním obalu a snížit tak nároky na skladovací prostory a zároveň zjednodušit a upřesnit aplikaci jedné dávky.

Doposud existuje omezené množství studií týkající se jednodávkových tuhých forem s obsahem fágů a jejich enzymů, které umožňují upřesnit jejich dávkování a zvýšit stabilitu jejich účinku (Khanal et al., 2021). Tento patent se zaměřuje na metodiku přípravy lyofilizovaných jednodávkových forem s obsahem bakteriofágů a jejich enzymů, která usnadňuje aplikaci fágů a jejich enzymů v terapii infekcí, způsobených patogenními kmeny P. aeruginosa a .S', aureus.

NýŠQ zmíněné problémy se stabilizací aktivních složek v průběhu přípravy lyofilizovaných forem a spektra působení řeší jedinečné složení směsi na tablety s obsahem specifických antimikrobiálních složek (fágy a endolyzin).

Literatura

Abedon, Stephen T., Sarah J. Kuhl, Bob G. Blasdel, and Elizabeth Martin Kutter. 2011. Phage

Treatment of Human Infections. Bacteriophage 1 (2): 6 až 85.

https://doi.org/10.4161/bact.L2.15845.

Abdelrahman, F.; Easwaran, M.; Daramola, O.I.; Ragab, S.; Lynch, S.; Oduselu, T.J.; Khan, F.M.; Ayobami, A.; Adnan, F.; Torrents, E.; et al. 2021. Phage-Encoded Endolysins. Antibiotics 10 (124): https://doi.org/10.3390/antibioticsl0020124

Anany, H., Chen, W., Pelton, R., & Griffiths, M. W. (2011). Biocontrol of Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 in meat by using phages immobilized on modified cellulose membranes. Applied and Environmental Microbiology, 77(18), 6379 až 6387. https://doi.org/10.1128/AEM.05493-11

Barer a Irving. Medical Microbiology, 19th Edition: A Guide to Microbial Infections: Pathogenesis, Immunity, Laboratory Investigation and Control. 19. United Kingdom: Elsevier, 2018. ISBN 978-0-7020-7200-0.

Brown, T. L., Petrovski, S., Chan, Η. T., Angove, M. J., & Tucci, J. (2018). Semi-solid and solid dosage forms for the delivery of phage therapy to epithelia. Pharmaceuticals, 11(1), 1 až 12. https ://doi.org/10.3 3 90/ph 11010026.

Carlson, K. 2005. Working with bacteriophages: Common techniques and methodological approaches In: Kutter, E., Sulakvelidze, A, (ed.) Bacteriophages: Biology and Application, str. 437 až 494. CRC Press, Boca Raton, FL, USA.

Clark, William A. 1962. “Comparison of Several Methods for Preserving Bacteriophages,” no. 1951.

Fulgione, A., lanniello, F., Papaianni, M., Contaldi, F., Sgamma, T., Giannini, C., Pastore, S., Velotta, R., Ventura, B. Della, Roveri, N., Lelli, M., Capuano, F., & Capparelli, R. (2019). Biomimetic hydroxyapatite nanocrystals are an active carrier for salmonella bacteriophages. International Journal of Nanomedicine, 14, 2219 až 2232.

https://doi.org/10.2147/IJN.S190188.

Garbe, Julia, Andrea Wesche, Boyke Bunk, Marlon Kazmierczak, Katherina Selezska, Christine Rohde, Johannes Sikorski, Manfred Rohde, Dieter Jahn, and Max Schobert. 2010. Characterization of JG024, a Pseudomonas Aeruginosa PBl-like Broad Host Range Phage under Simulated Infection Conditions. BMC Microbiology 10: 1 až 10.

https://doi.org/10.1186/1471-2180-10-301.

- 3 CZ 310423 B6

Hoe, Susan, James W. Ivey, Mohammed A. Boraey, Abouzar Shamsaddini-Shahrbabak, Emadeddin Javaheri, Sadaf Matinkhoo, Warren H. Finlay, and Reinhard Vehring. 2014. Use of a Fundamental Approach to Spray-Drying Formulation Design to Facilitate the Development of Multi-Component Dry Powder Aerosols for Respiratory Drug Delivery. Pharmaceutical Research 31 (2): 449 až 465. https://doi.org/10.1007/sll095-013-1174-5.

Jault, P., Leclerc, T., Jennes, S., Pimay, J. P., Que, Y. A., Resch, G., Rousseau, A. F., Ravat, F., Carsin, H, Le Floch, R., Schaal, J. V., Soler, C., Fevre, C., Arnaud, I., Bretaudeau, L., & Gabard, J. (2019). Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat bum wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBum): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. The Lancet Infectious Diseases, 19((), 35 až 45. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30482-l.

Khanal, D., Chang, R. Y. K., Hick, C., Morales, S., & Chan, H.-K. (2021). Enteric-coated bacteriophage tablets for oral administration against gastrointestinal infections. International Journal of Pharmaceutics, 609(cervenec), 121206.

https: //do i. org/10.1016/j. ij pharm .2021.121206.

Komárek, Pavel a Miloslava Rabišková. Technologie léků: galenika. 3., přeprac. a dopl. vyd. Praha: Galén, c2006. ISBN 80-726-2423-7.

Kropinski, A.M., Mazzocco, A., Waddell, T.E., Lingohr, E., Johnson, R.P. 2009 Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. In: Clokie M.R., Kropinski A.M. (ed.) Bacteriophages: Methods and Protocols, Vol 1: Isolation, Characterization, and Interactions, str. 69 až 76. doi.org/10.1007/978-l-60327-164-6_7.

Loc-Carrillo, Catherine, and Stephen T. Abedon. 2011. Pros and Cons of Phage Therapy. Bacteriophage 1 (2): 111 až 114. https://doi.org/10.4161/bact.L2.14590.

Malik, Danish J. 2021. Approaches for Manufacture, Formulation, Targeted Delivery and Controlled Release of Phage-Based Therapeutics. Current Opinion in Biotechnology 68: 262 až 271. https://doi.Org/10.1016/j.copbio.2021.02.009.

Malik, Danish J., Ilya J. Sokolov, Gurinder K. Vinner, Francesco Mancuso, Salvatore Cinquerrui, Goran T. Vladisavljevic, Martha R.J. Clokie, Natalie J. Garton, Andrew G.F. Stapley, and Anna Kirpichnikova. 2017. Formulation, Stabilisation and Encapsulation of Bacteriophage for Phage Therapy. Advances in Colloid and Interface Science 249 (květen): 100 až 133. https://doi.Org/10.1016/j.cis.2017.05.014.

Mathias, J. R., Dodd, Μ. E., Walters, K. B., Yoo, S. K., Erik, A., & Huttenlocher, A. (2010). Phage-Bacterium War on Polymeric Surfaces-Anchored Eliminate Micobial Infections. Biomacromolecules, 33(11), 1212 až 1217. https://doi.org/10.1021/bm400290u.PhageBacterium.

Merabishvili M. Production of bacteriophages using bacterial suspension cultures for phagetherapy. In: Meyer HP, Schmidhalter DR, editors. Industrial scale suspension culture of living cells. 2014. Wiley VCH Verlag, Weinheim, Germany; 2014. str. 537 až 543.

Meyer HP, Schmidhalter DR, editors. Industrial scale suspension culture of living cells. 2014. WileyVCH Verlag, Weinheim, Germany; 2014. str. 537 až 543.

Subils, T., Aquili, V., Ebner, G., & Balagué, C. (2012). Effect of preservatives on Shiga toxigenic phages and Shiga toxin of Escherichia coli O157:H7. Journal of Food Protection, 75(5), 959 až 965. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-ll-332.

-4CZ 310423 B6

URL 1: Antimicrobial resistance, 17. 11. 2021, https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je směs pro přípravu lyofilizovaných tablet, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje fágový lyzát/purifikát bakteriofágů působících proti Staphylococcus aureus aPseudomonas aeruginosa o titru 10⁷ až 10¹¹ PFU/ml, 0,01 až 0,3 mg/ml endolyzinu LysMBlO produkovaného vE colt o sekvenci SEQ ID NO: 1, dále 5 až 50 g plniva a 4 až 13 g kryoprotektiva na 100 ml směsi.

Pro přípravu tablet se směs lyofilizuje po nanesení na formu opatřenou jamkami majícími tvar zamýšlené tablety.

Složení základu na tablety je optimalizováno tak aby napomáhalo stabilizaci fágů i enzymů a nedochází k redukci jejich koncentrace i aktivity. Tím je zajištěna optimální efektivita působení. Navíc kombinace endolyzinu LysMBlO (produkovaného kmenem E. coli CCM 9354) a bakteriofágů DSM 34648 (fág anti P. aeruginosa) a DSM 34647 (fág anti .S', aureus) napomáhá značně rozšířit spektrum běžně užívaných bakteriofágů a endolyzinů působících proti bakteriím .S'. aureus aP. aeruginosa. Fág DSM34648 i DSM34647 byly izolovány de novo z prostředí nebo připraveny selektivní laboratorní evolucí a jsou ojedinělé z hlediska lyrického spektra. Endolyzin LysMBlO je dosud nepopsaným antimikrobiálním enzymem, který působí na široké spektrum bakterií rodu Staphylococcus.

V rámci tohoto vynálezu je pro přípravu jednodávkové tuhé formy (lyofilizovaná tableta) s obsahem fágového lyzátu a endolyzinu využit specifický proces lyofilizace směsi s optimalizovaným složením, které zajišťuje stabilitu a vysokou aktivitu antimikrobiálních složek. Definovaná směs aktivních antimikrobiálních látek (fágové lyzáty a endolyzin), plniva (rybí želatina, maltodextrin, nebo polyvinylpyrrolidon (PVP)) a kryoprotektiva (manitol) se po nanesení na speciální kovovou formu (český užitný vzor č. PUV 31295), lyofilizuje při definovaných podmínkách. Tento postup zvyšuje stabilitu efektu aktivních složek zejména při vyšších teplotách, umožňuje výhodnější skladování a zvyšuje mikrobiologickou jakost výsledného produktu, který lze využít v léčbě bakteriálních infekcí způsobených bakteriemi .S', aureus a P. aeruginosa. Specifické fágy obsažené v tabletě mají ojedinělé lyrické spektrum zahrnující patogenní kmeny izolované z nemocničního prostředí a působí synergicky s endolyzinem LysMBlO - který nebyl doposud popsán (má jedinečnou aminokyselinovou sekvenci, uvedenou v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 1).

Popis uskutečnění vynálezu

Směs fágového lyzátu s hodnotou titru minimálně 1 x 10⁸ PFU/ml a endolyzinu o koncentraci (0,01 až 0,3 mg/ml) lze zpracovat do příslušného množství pevných dávek (tablet). Při tomto zpracování dochází ke zmražení aktivních složek s plnivem a kryoprotektivem na speciální formě, tak, aby došlo k tvorbě oddělených pevných dávek, které se následně v této formě lyofilizují. Výsledný lyofilizovaný produkt si zachovává strukturu tablety a lze uchovávat chráněný před světlem a vzdušnou vlhkostí pomocí vhodného obalu při teplotě 4 °C alespoň po dobu minimálně tří měsíců. U těchto vzniklých dávek je nutné zabezpečit titr fága, který dosahuje minimálně 10⁶ až 10⁷ PFU/ml, což je obecně uznávaná minimální hodnota titru fága pro terapeutické použití (Merabishvili 2014) a aktivitu endolyzinu vhodnou metodou purifikace.

- 5 CZ 310423 B6

Pro přípravu lze použít nepurifikovaný fágový lyzát nebo purifikát s hodnotou titru alespoň v řádu I / I0⁷ PFU/ml. Fágový lyzát je purifikován a převeden do SM pufru (složení SM pufru: 100 mM NaCl, 8 mM MgSOoVlLO. 50 mM Tris-Cl (pH 7,5) do 1000 ml destilované vody), který se využívá pro uchovávání fágů a zároveň je vhodný pro lyofilizační proces, jelikož u něj během lyofilizace nedochází ke změně pH. Pro purifikaci fágů lze aplikovat standardně využívané metody purifikace proteinů jako např. ultracentrifugace, tangenciální průtoková filtrace, chromatografie, či přečištění pomocí centrifugačních zkumavek s filtračním nástavcem. Bakteriofágy byly izolovány na kmenech, které nebyly citlivé k jiným testovaným bakteriofágům. Tyto dva zmíněné bakteriofágy DSM34648 a DSM34647, které jsou uložené ve sbírce DSMZ v Německu jako patentové úložky, mají tak unikátní spektrum, které rozšiřuje možnosti použití terapeutických fágů na další patogenní klinické izoláty. Jejich nukleotidové sekvence jsou uvedeny v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 2 (fág DSM 34647) a SEQ ID NO: 3 (fág DSM 34648). V případě endolyzinu LysMBlO, jehož produkční E. coli je uložena ve sbírce CCM v Brně jako patentová úložka, se jedná o zcela nový dříve neidentifikovaný protein, u něhož byla prokázána antimikrobiální aktivita proti bakteriím .S', aureus. Tento enzym podporuje antimikrobiální účinek bakteriofágů a proti bakterii S. aureus může být použit i bez bakteriofágů. Sekvence endolyzinu LysMBlO (SEQ ID NO: 1) je uvedena samostatně.

Pro přípravu produktu jsou využity fágy ze sbírky MB Pharma infikující P. aeruginosa a .S'. aureus a zároveň lytický enzym působící na .S', aureus. Bakteriofágy a kmen E. coli produkující LysMBlO jsou uloženy podle Budapešťské smlouvy v německé sbírce DSMZ, resp. v CCM (v případě E. coli) jako patentové úložky pod čísly CCM 9354, DSM 34648 a DSM 34647. Jejich základní vlastnosti jsou uvedeny v následujících tabulkách 1 a 2:

bakteriofág	hostiiel	rod	G+C (%)	velikost geuomii (kbp)
DSM 34647	S. ď&reuď	Rosenblumv irus	29,24	18,00
DSM 3464S	P, aeruginosa	Sqrtinsatrevirus	53.J74	42,97

Tabulka 1: Souhrn vlastností fágů

endslyzůi	cílový organismus	velikost sekvence	pí	kDa
LvsMBlO	Staphyiocoeeiis	259 amk	9,77	28,9

Tabulka 2: Souhrn vlastností endolyzinu LysMBlO

Testování antimikrobiálního efektu fágů a endolyzinů v dané dávce probíhá pomocí kapkové metody na dvouvrstvém agaru (Garbe et al. 2010), případně redukci OD v tekuté kultuře (konkrétně u endolyzinu). U bakteriofágů se jedna dávka před testováním rozpustí v 50 ml sterilní destilované vody, při pokojové teplotě a 150 rpm po dobu 3 až 5 minut. Vzniklý roztok se naředí a proběhne vykapání daných ředění. Měření se provede u několika dávek a zjistí se tak stejnoměrnost jejich efektu a zároveň stabilita antimikrobiálního účinku aktivních složek v čase, v ideálním případě minimálně po třech měsících.

Vliv endolyzinu se sleduje pomocí úbytku ODeoo tak, že se do kyvety 1 ml s obsahem kultury bakterie přidá jedna tableta (původně 0,5 ml tekuté směsi). Bakteriální kultura byla 2 x promyta v pufru a její denzita byla nastavena na hodnotu ODeoo = 0,5. Poté byla přenesena do kyvety, do ní byla vložena tableta a poté je měřen úbytek OD.

-6CZ 310423 B6

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Detailní snímek skenovací elektronové mikroskopie povrchu dávky připravené ze specifické antimikrobiální směsi.

Obrázek 2: Detailní snímek skenovací elektronové mikroskopie povrchu dávky připravené ze specifické antimikrobiální směsi.

Obrázek 3: Detail vrchní části dávky připravené ze specifické antimikrobiální směsi.

Obrázek 4: Detail spodní části dávky připravené ze specifické antimikrobiální směsi.

Obrázek 5: Detail boční strany dávky připravené ze specifické antimikrobiální směsi.

Obrázek 6: Ukázka primárního obalu.

Obrázek 7: Sekvence 1: Primární sekvence endolyzinu (SEQ ID NO: 1).

Příklady uskutečnění vynálezu

Složení lyofilizovaných tablet a způsob jejich přípravy jsou uvedeny v příkladech 1 až 3 kdy se u každého příkladu liší složení směsi kryoprotektiva a plniva, které jsou vhodný pro stabilizaci bakteriofágů a endolyzinu. Poměr jednotlivých složek je blíže specifikován v tabulce 3.

Plnivo [g]	Kiyoprotektivuni maníte»! [g]	Fág DSM 34648 [PFU/ml]	Fág DSM 34647 [PFU/ml]	Endolyzin [mg/ml]
Maltodextrin 35-50	4-6	1x10' — ;i 0^:1	1 · 11x10^{s 1}	0,01 - 0.3
Želatina 10-15	11-13	1X10’- 1 · 1 0^:1	1X1O⁷-1X1O“	0,01 - 0,3
p\?p 10	4-6	i 10' · .· 1 (Ú¹	1 10-1· i(i^;:	0,01 - 0,3
Mallodextrin 35-50	4-6			0,01 -0,3
Želatina 10-15	11-1.3			0.01 - 0,3
PVP 5-10	4-6			0.01 - 0.3

Tabulka 3: Složení 100 ml směsi na přípravu 200 tablet s obsahem bakteriofága/endolyzinu

Příklad 1

V 90 ml směsi fágových lyzátů/purifikátů o koncentraci minimálně 1 x 10⁹ PFU/ml se za stálého míchání při pokojové teplotě po dobu 30 minut rozpustí 43,75 g maltodextrinu a 5,00 g manitolu. Po rozpuštění pomocných látek se nastaví pH směsi pomocí roztoků HC1 a NaOH na hodnotu 7,5. Do směsi se přidá 10 ml roztoku endolyzinu o koncentraci 0,3 mg/ml. Výsledná směs se přefiltruje přes 0,45 pm PES filtr a následně se uchovává při pokojové teplotě a 150 rpm po dobu

-7CZ 310423 B6 minimálně 20 a maximálně 30 minut. Množství směsi se připraví dle požadovaného počtu dávek, jedna dávka odpovídá 0,5 až 1 ml směsi, tzn. ze 100 ml směsi se připraví 100 až 200 dávek.

Směs je nanesena na sterilní hliníkovou formu, vychlazenou na -80 °C. Forma je během nanášení udržována při teplotě -60 až -80 °C. Poté probíhá lyofilizace v daných krocích:

1. Namražení vzorku v -30 °C po dobu 20 minut.

2. Primární sušení při teplotě -30 °C po dobu 960 minut (tj. 16 hodin) a tlaku 19,99 Pa (150 mTorr).

3. Sekundární sušení probíhá z -30 °C do 20 °C při stoupání teploty 0,1 °C/min a tlaku 19,99 Pa (150 mTorr).

Vzniklé dávky (tablety) se po vyjmutí z lyofilizátoru a z formy přenesou do primárního obalu a skladují se optimálně při teplotě 4 °C (případně při pokojové teplotě).

Příklad 2

Jako plnivo lze využít taktéž rybí želatinu, kdy v 50 ml vody se za stálého míchání zahřeje 12 g manitolu a 12 g rybí želatiny přibližně na teplotu 70 °C. Tato směs se následně vytemperuje na 50 °C a po vytemperování se do ní vmíchají fágové lyzáty/purifikáty (tabulka 3) do celkového objemu 90 ml. Koncentrace fágů je minimálně I / 10'' PFU/ml. Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po rozpuštění pomocných látek se nastaví pH směsi pomocí roztoků HC1 aNaOH na hodnotu 7,5. Po úpravě pH směsi se přidá 10 ml roztoku endolyzinu, tak aby výsledná koncentrace u endolyzinu byla 0,02 mg/ml. Finální směs se přefiltruje přes 0,45 pm PES filtr a následně se uchovává při pokojové teplotě a 150 rpm po dobu minimálně 20 a maximálně 30 minut. Množství směsi se připraví dle požadovaného počtu dávek, jedna dávka odpovídá 0,5 až 1 ml směsi, tzn. ze 100 ml směsi se připraví 100 až 200 dávek.

1. Namražení vzorku v -30 °C po dobu 20 minut.

Příklad 3

Jako plnivo lze využít polyvinylpyrolidon K90 (PVP90). Ve 90 ml směsi fágových lyzátů/purifikátů o koncentraci minimálně 1 χ 10’ PFU/ml se za stálého míchání při pokojové teplotě po dobu 30 minut rozpustí 7,5 g PVP90 a 5,00 g manitolu. Po rozpuštění pomocných látek se nastaví pH směsi pomocí roztoků HC1 aNaOH na hodnotu 7,5. Po úpravě pH směsi se přidá 10 ml roztoku endolyzinu, tak aby výsledná koncentrace u endolyzinu byla 0,02 mg/ml. Finální směs se přefiltruje přes 0,45 pm PES filtr a následně se uchovává při pokojové teplotě a 150 rpm po dobu minimálně 20 a maximálně 30 minut. Množství směsi se připraví dle požadovaného počtu dávek, jedna dávka odpovídá 0,5 až 1 ml směsi, tzn. ze 100 ml směsi se připraví 100 až 200 dávek.

-8CZ 310423 B6

Směs je nanesena na formu, vychlazenou na -80 °C. Forma je během nanášení udržována při teplotě -60 až -80 °C. Poté probíhá lyofilizace v daných krocích:

1. Namražení vzorku v -30 °C po dobu 20 minut.

Příklad 4

V 90 ml směsi fágových lyzátů/purifikátů o koncentraci minimálně 1 x 10⁹ PFU/ml se za stálého míchání při pokojové teplotě po dobu 30 minut rozpustí 43,75 g maltodextrinu a 5,00 g manitolu. Po rozpuštění pomocných látek se nastaví pH směsi pomocí roztoků HC1 a NaOH na hodnotu 7,5. Po úpravě pH směsi se přidá 10 ml roztoku endolyzinu, tak aby výsledná koncentrace u endolyzinu byla 0,02 mg/ml. Finální směs se přefiltruje přes 0,45 pm PES filtr a následně se uchovává při pokojové teplotě a 150 rpm po dobu minimálně 20 a maximálně 30 minut. Množství směsi se připraví dle požadovaného počtu dávek, jedna dávka odpovídá 0,5 až 1 ml směsi, tzn. ze 100 ml směsi se připraví 100 až 200 dávek.

1. Namražení vzorku v -30 °C po dobu 20 minut.

Primární sušení při teplotě -30 °C po dobu 960 minut (tj. 16 hodin) a tlaku 19,99 Pa (150 mTorr).

Průmyslová využitelnost

Lyofilizované jednodávkové formy (tablety) s obsahem fágového lyzátu/purifikátu a endolyzinu připravené z předmětné směsi lze aplikovat při fágové terapii infekcí způsobené širokým spektrem antibioticky rezistentních kmenů patogenních bakterií .S', aureus a P. aeruginosa, které jsou vůči těmto aktivním složkám prokazatelně citlivé.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Antimikrobiální směs pro přípravu lyofílizováných tablet proti bakteriím Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa s obsahem bakteriofágů a lytických enzymů s optimální stabilitou a efektivitou aktivních složek, vyznačující se tím, že obsahuje fágový lyzát/purifikát bakteriofágů působících proti Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa o titru 10⁷ až 10¹¹PFU/ml, 0,01 až 0,3 mg/ml endolyzinu produkovaného v E. coli o sekvenci SEQ ID NO: 1, dále 5 až 50 g plniva a 4 až 13 g kryoprotektiva na 100 ml směsi.
2. Antimikrobiální směs podle nároku 1, vyznačující se tím, že bakteriofágem je alespoň jeden fág ze skupiny zahrnující fága DSM 34647 a fága DSM 34648.
3. Antimikrobiální směs podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že plnivo je vybráno ze skupiny zahrnující maltodextrin, rybí želatinu a póly viny Ipyrrolidon.
4. Antimikrobiální směs podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že kryoprotektivem je mannitol.
5. Antimikrobiální směs podle nároku 2 pro použití při léčbě bakteriálních infekcí způsobených patogenními kmeny Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa v humánní i veterinární oblasti.