CZ315094A3 - Immunoassay - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká imunologických testů.

Dosavadní stav techniky

Testování vzorků tělesných tekutin nebo tuhých vzorků, například buněk nebo tkání, získaných z těla, na přítomnost různých organizmů, zvláště bakterii, virů, parazitů a jiných patogenních (infekčních) organizmů, se provádí rutinní cestou. Testování se provádí ve dvou hlavních souvislostech. Jednou z nich je testování vzorků tělesných tekutin a tuhých vzorků za účelem diagnózy choroby, sledování průběhu choroby a/nebo sledování ošetřování jedince. Tento typ testování se· často označuje jako klinické'¹ testování. Klinické laboratoře obvykle provádějí testování pro velký počet odlišných organizmů. Výraz patogen, popřípadě patogenní organizmus se zde používá k označeni organizmu, který je příčinou onemocnění.

Jiný hlavní typ testování spočívá v orientačním zkoušeni krve získané od dárců, za účelem uchováni dodávky krve a krevních produktů, které jsou prosty patogenní kontaminace. Předpisy úřadů v každé zemi upřesňuji patogennní organizmy, pro které se má provádět testování. Ve většiňe * zemí se v současné době orientační zkoušeni provádí závazně na HIV, hepatitidu C (ne-A ne-B hepatitidu), hepatitidu B a syfilis. Ve většině zemi jsou nyní závazné testy ke stanovení jak HIV-1, tak HIV-2. Krev určená k použití při transfuzi pacientům, kteří obdrželi nebo kteří mají obdržet trasplantát nebo jsou jinak ohroženi z hlediska imunity se obecně testuje na přítomnosti CMV (cytomegaloviru). Ježto byly nalezeny nové patogeny a nové podtypy známých patogenů, které jsou hrozbou pro dodávky krve, závazně se vyžaduje, aby se testování dárců krve rozšířilo na tyto patogenní organizmy., .

Nejrozšířeněji používané testy pro orientační zkoušení krve jsou imunologické testy. Pro velký počet virových patogenních organizmů v krvi je velmi obtížné získat požadovanou citlivost, pokud se testování krve provádí v přítomnosti jiných antigenů než jaké se vyskytují, pokud se testuje na přítomnost protilátek. Obecně testování na HIV, HTLV, HCV a CMV spočívá v testech ke stanovení protilátky.

Pro hepatitidu B existují dva testy: antigenová zkouška pro povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg) a test na protilátky pro jaderný antigen hepatitidy B (HBc). V současnosti HBsAg; testování je závazné ve většině zemí, testování jaderné protilátky u hepatitidy B je závazné pouze v některých zemich a může být zaváděno ve stále větším jejich počtu. Existuje jak test protilátky, tak test antigenů pro stanovení syfilisu.

Orientační zkoušení krve se provádí ve velkém měřítku a je zvláště důležité, aby se výsledky dosáhly rychle, protože krev má relativně krátký čas skladování. Za účelem úspory jak času, tak peněz, byly navrženy zkoušky schopné rozeznat více než jeden patogenní organizmus v jediném testovacím vzorku. -...... >

Testy protilátky ke stanovení dvou podtypů stejného patogenů, zvláště pro HIV-1 a HIV-2 (HIV-1+2) a také HTLV-I a HTLV-II (HTLV-I+IIj jsou k dostání na trhu. Je však třeba poznamenat, že často nastává značné zkřížení reaktivity mezi podtypy stejného druhu, například stupeň imunologicky zkřížené reaktivity mezi HIV-1 a HIV-2 je takový, že HIV-1 testy zpočátku dostupné na trhu ve skutečnosti vedly k detekci velmi velkého podílu HIV-2 obsaženého v krvi.

Proto, jak je také vysvětleno v evropském patentovém spisu č.

484 787A, je velmi žádoucí technický rozdíl umožňující testování protilátky pro dva subtypy stejného viru a testy protilátky pro dva zcela odlišné patogeny, které nemají žádnou imunologicky zkříženou reaktivitu. Výraz kombinační zkouška, který se zde používá, označuje test pro detekci neboli stanovení, při jediném testu na vzorku, dvou nebo většího počtu patogenních organizmů, které nemají v podstatě žádnou imunologicky zkříženou reaktivitu. Výraz rozdílné patogeny, který se zde používá, označuje partogenní

-organizmy-,—které_nema-jí_-V_jpodstaté žádnou imunologicky__

--zkříženou - reaktivitu. - --- - -——

Evropský patentový spis č. 0 484 787 navrhuje kombinační test protilátky pro virové patogeny, které mohou působit v dárcově krvi (virové patogeny krve), zvláště kombinační zkoušku na HIV a HCV (virus hepatitidy C).

Navržený test v heterogenní fázi zahrnuje použití většího počtu peptidů povlečených na tuhém povrchu k zachycení příslušných protilátek. Výsledné komplexy antigenu s protilátkou se mohou potom detekčně stanovit.

Hlavní.nevýhoda takového kombinačního testu a také kombinačního testu krve pro stanovení HIV-1+2 a'HTLV-1+ΙΓ, které jsou nyní na trhu, spočívá v požadavku na spolupovlékáni většího počtu antigenů na tuhý povrch. Nejen že se musí

-antigeny ( peptidy a/nebo proteiny ) - celé -pov-léka-t , ale také musí být povlečeny takovým způsobem, že epitopy budou schopné vázat protilátky. Kromě toho nesmi docházet k interakci mezi různými antigeny. Kontrolní testování jakosti, které se musí provádět k zajištěni, že antigeny jsou povlečeny uspokojivým

-------způsobem -zvyšuje-výda je, ..jak s. ohledem „na „cenu . samotného^. ..

testování, tak s ohledem na náklady způsobené vadným zbožím. Většina antigenů se proto musí povlékat, co zhoršuje problém /

X' /' a způsobuje vyšší náklady. Každý přídavný patogen, určený ke stanovení, vyžaduje přítomnost alespoň jednoho dalšího zmobilizovaného antigenu. Pro některé patogeny je nezbytné umožnit detekci většího počtu protilátek. V případě HCV například v současné době komerčně dostupné testy zahrnují čtyři rozdílné antigeny. Pro kombinační test ke stanovení HIV-1+2/HCV se vyžaduje přinejmenším šest antigenů.

Kromě toho pro zvláštní výrobní problémy spojené se spolupovlékáním může být obtížné dosáhnout požadované specifičnosti. Vyžaduje se velmi vysoká čistota antigenů, které projevují silnou antigeničnost, viz evropský patentový spis č. 0 484 787.

Kombinační testy protilátka/antigen byly navrženy pro HIV a povrchový antigen hepatitidy B. Evropský patentový spisč. 0 286 264A například navrhuje povlékání tuhé fáze peptidem schopným vázat se k HIV protilátce a povlékání tuhé látky protilátkou specifickou pro HBsAg. Obě tuhé fáze mohou být odlišné nebo jak peptid, tak protilátka se mohou povlékat na stejnou tuhou fázi. Patentová publikace W091/10747 navrhuje zlepšeni typu testu popsaného v evropském patentovém spisu č.

286 264, kde zlepšení spočívá v povaze peptidů použitých * pro povlékání a pro detekci HIV protilátky a v charakteru detekčního systému.

iA · ...

Je však zapotřebí poznamenat, že pouze při komerčně dostupném kombinačním testu pro stanovení HIV a HBsAg, založeném na podstatě uvedené v evropském patentovém spisu č.

286 264 se různé problémy spojené se spolupovlékáním daří obejít tím, že se povlékaji HIV peptidy na vnitřní povrch malých zkumavek a proti-HBsAg protilátky na kuličky použité v souvislosti se zkumavkou. Kromě toho test není opravdovým kombinačním testem ve smyslu zde uváděném, protože po uvedení vzorku do kontaktu s kuličkami ve zkumavkách se kuličky odstraní a detekční stupeň se provádí odděleně na kuličkách a ve zkumavce. Proto se vyhne jakýmkoli potenciálním problémům s ohledem na interakci mezi značenou protilátkou a značeným antigenem použitým pro detekci a jakýmkoli potenciálním problémům mezi (značenými) detekčními systémy během detekce jakýchkoli vzniklých imunitních komplexů.

Podle tohoto vynálezu problémy ze spolupovlékání většího počtu antigenů na tuhý povrch a z toho vyplývající důsledky, se pro kombinační testováni protilátky překonají jednoduchým a příjemným způsobem za použití struktury umo žnu j íc i—z a chy c o vá n-í—i-munog-l-o bu-l-i-nu. —---Struktura umožňující zachycování imunoglobulinu je známa jako taková po řadu let a byla popsána W. Duermeyerem a kol. v Journal of Medical Virology 4, 25-32 /1979/ pro detekci specifických igM protilátek v ELISA pro hepatitidu A. Podstata popsaného testu pro vzorek získaný od člověka spočívá v tom, že se tuhá fáze, například jamky mikrotitirační plotny, povléknou anti-lidským imunoglobulinem, vzorek se přidá k povlečeným jamkám a inkubuje, jamky se promyjí a poté se antigen přidá k jamkách a inkubuje a nakonec se jakýkoli vázaný antigen stanoví detekci za použiti enzymem značené protilátky. Autoři tohoto pracovního postupu navrhli použití testu pro jakékoli individuální IgM protilátky, například proti zarděnkám, prostému oparu, CMV, EBV, Toxicoplasma gondii, jadernému antigenů hepatitidy B nebo jiným antigenúm.

Testy využívající technický postup zachycování imunoglóbulinu pro detekci jednotlivých patogenů v krvi, například test ke stanoveni zarděnek a test pro zjištěni hepatitidy A, jsou dostupné po několik let.

Patentová publikace W088/07680 popisuje aplikaci technického postupu zachycování imunoglobulinu pro detekci protilátek v tělesných kapalinách odlišných od krve, zvláště ve slinách a moči. Komerčně dostupný test HIV-1+2 pro sliny a moč využívá popsaný technický postup zachycování imunoglobulinu.

Předpokládá se, že je obecné zaujetí v oboru proti technickému postupu zachycováni imunoglobulinu, co dokládá skutečnost, že i když. je dostupný technický postup již od roku 1979, jek dispozici pouze velmi malý počet testů využívající technický postup dostupný z komerčního hlediska, ve srovnání s velkým počtem komerčně dostupných testů používajících antigen k zachycování protilátek. Zvláště se předpokládá, že existuje obecná představa, podle které technický postup by v praxi nepůsobil účinně, bud s ohledem na specifičnost nebo s ohledem na citlivost.

Podle technického postupu zachycování imunoglobulinu ΐ, by se dala očekávat žádoucí úroveň nevhodných interakcí, které by vedly k porušení specifičnosti. Patentová publikace WO89/12231 například popisuje test zachycování protilátky pro.· detekci většího počtu protilátek, který vyjadřuje >;

koncentraci, s ohledem na narušení specifičnosti, jehož příčinou jsou neimunologické interakce protein - protein mezi antigeny a Fc oblastí imunoglobulinů, a který navrhuje technický postup zachycování imunoglobulinu, kdy protilátky povlečené na tuhém povrchu jsou anti-Fc protilátky. Imunoglobuliny jsou proto zachycovány- specificky v oblasti Fc, která je tím nedostupná pro nespecifické interakce protein - protein.

Na citlivost se také pohlíží jako na potenciální problém s testem zachycování imunoglobulinu. Například .. imunoglobuliny se nezachycuji selektivně, takže nenastává obohacení specifickými druhy protilátky, která je předmětem zkoumáni. Pokud tyto specifické druhy protilátky jsou přítomny ve velmi malých množstvích, jak z absolutního hlediska, tak z relativního hlediska, vzhledem k jiným druhům protilátky přítomné ve vzorku sera, dalo by očekávat, že detekce protilátky, která je předmětem zkoumání, by byla obtížná a nespolehlivá a zvláště by se dalo očekávat, že test by narušil citlivost.

V protikladu k očekávání a s překvapením původci tohoto vynálezu zjistili, že za použití technického postupu zachycování imunoglobulinu protilátky ke dvěma nebo většímu počtu rozdílných pategennich organizmů ve vzorcích, které ^_jsou~předmětem^—zkoumání—se-mohou-stanovit-současně-s-vyn-i-ka— ~j ící citlivostí a^ specifičností Τ ~ '^π” ~

Podstata vynálezu

Tento vynález skýtá použití technického postupu zachycování imunoglobulinu při stanovení protilátek u dvou nebo většího počtu patogenních organizmů v jediném Vzorku pro testování.

Proto tento vynález poskytuje způsob stanoveni specifických protilátek k dvěma nebo většímu počtu patogenů v_testovaném vzorku kapaliny, který-spočívá v tom, _tže se

i) uvede do styku vzorek s tuhou fází, na které jsou imobilizovány protilátky k jedné nebo většímu počtu skupin imúnóglobuliňů, přičemž imunóglobuíiriy ž příslušně skupiny nebo skupin přítomné ve vzorku se zachycují na tuhé fázi, ii) současně nebo následné uvede do styku tuhá fáze, na které byly zachyceny imunoglobuliny ze vzorku, s dvěma nebo”větším počtem rozdílných antigenů, přičemž každý antigen je schopen selektivně se vázat k protilátce specifické pro jeden z patogenů, které jsou předmětem zkoumání, přičemž každý antigen dodává prostředek, který umožňuje přímo nebo nepřímo detekovatelný signál, a iii) stanoví libovolný výsledný komplex imunoglobulinu a antigenu vzniklý na tuhé fázi.

Imobilizované protilátky mohou být zaměřeny proti IgG, IgM nebo IgA nebo se mohou použít směsi protilátek proti různým skupinám imunoglobulinů. Směs anti-IgG a anti-IgM protilátek je zvláště výhodná.

. Test podle tohoto vynálezu, neboli kombinační test má neomezenou všestrannost, v důsledku použiti univerzální tuhé fáze pro zachycování protilátek. Uživatel může volit které protilátky, a proto které patogeny se mají detekčně stanovit ve vzorku, jež je předmětem zkoumáni, jednoduše za použití příslušných reakčních činidel pro detekci antigenů.

To je v úplném protikladu k běžným testům, které používají antigeny k zachycování protilátek, kde rozdílná.tuhá fáze povlečená an.tigenem se vyžaduje pro každou kombinaci protilátky, která je předmětem zkoumání.

Všestrannost použití univerzální tuhé fáze je hlavní výhodou jak pro výrobce, tak pro uživatele testů pro stanovení většího počtu patogenů, zvláště pro krevní testy, prováděné formou orientačního zkoušení, á pro klinické zkoušky. Jak již bylo naznačeno výše, univerzální tuhá fáze povlečená protilátkou, například povlečené kuličky nebo povlečené jamky mikrotitrační plotny, se mohou použít pro testování protilátky na libovolný z patogennních organizmů nebo všechny takové kombinace patogenních organizmů, protože selektivita libovolného zvláštního testu protilátky se stanovuje kombinací reakčních činidel použitých pro detekci antigenů.

Tato všestrannost je výhodná pro výrobce testů, protože se univerzální tuhá fáze povlečená protilátkou může použít pro všechny kombinace testů k určení protilátek, at jde o orientační zkoušeni krve nebo o klinické testování.

V současnosti závazné požadavky na testování protilátkek v krvi dárců se mění od jedné země k druhé. Pro rozdílná teritoria jsou proto požadovány rozdílné tuhé fáze povlečené antigenem. Opatření univerzální tuhé fáze povlečené protilátkou pro všechna teritoria významně snižuje výrobní náklady. Pro klinické testováni se vyžaduje rozdílná tuhá fáze povlečená protilátkou pro každý a velmi odlišný

—.-----—kombinační—test-ke- stanovení—protilátky-. -Opět,-opatření-----------------— ' univerzální“ tuhé-fáze povlečené*protilátkou 'významně-snižuje-----— výrobní náklady.

Další výhodnou pro výrobce je snížení počtu složek určených k povlékání na tuhou fázi, a proto snížení výrobních nákladů. Testy využívající antigeny k zachycování protilátky vyžadují větší počet antigenů pro kombinační testování protilátky, již v případě dvou patogenních organizmu. Pro kombinační test HCV/HIV-1+2 se například vyžaduje alespoň šest rozdílných antigenů. Pokud se má detekčně stanovit větší počet patogenních organizmů, musí se povléknout větší počet antigenů na tuhou fázi. Podle tohoto vynálezu není však nezbytné imobilizovat další protilátky na tuhé fázi k detekci dalších patogenů, přítomnost samotného anti-IgG umožňuje detekci většího počtu patogenů. Kromě toho protilátky používané k povlékání jsou obecné levnější než vysoce čisté antigeny vyžadované pro úspěšné povlékání, zvláště pro povlékání větším počtem antigenů.

Všestrannost kombinačního testu podle tohoto vynálezu je také výhodná pro uživatele, protože se například testování libovolné zvláštní kombinace patogenních organizmů muže provádět jednoduše za použití vhodné kombinace reakčních činidel pro antigen. To je zvláště vhodné v klinické laboratoři, protože je zapotřebí zakoupit a skladovat pouze jednu univerzální tuhou fázi povlečenou protilátkou, aby se umožnilo testování libovolné požadované kombinace patogenů.

Pro účely orientačního zkoušení je nezbytné znát povahu kontaminujícího organizmu. V případě orientačního zkoušení krve, pokud je vzorek krve positivní na protilátky k některému ze zakázaných patogenních organizmů, krev je nevhodná k použiti pro transfuze nebo pro výrobu krevních produktů, například plasmy nebo faktoru Vlil, a měla by se odložit.

Schopnost testovat vzorek krve dárce při jednom testu na všechny virové protilátky v krvi, ustanovený libovolným zvláštním národním předpisem, je hlavním pokrokem, a poskytuje krevní banky s velmi podstatnou jistotou jak z hlediska g času, tak nákladů. Doba bezpečnosti je důležitá nejen pro úsporu doby techniků, a proto další úsporu nákladů, ale je také důležitá s ohledem na relativně krátký čas skladování celé krve. _;

Test zachycování imunoglobulinu podle tohoto vynálezu má vynikající specifičnost a citlivost. Původci vynálezu dosáhli zajímavých výsledků u vzorků obsahujících směs protilátek, který je v podstatě součtem výsledků dosažených pro odpovídající vzorky sera nebo plasmy, z nichž každý obsahuje pouze jeden druh protilátky. Nemohlo se předpokládat, že kombinační test podle tohoto vynálezu, každý o větším počtu protilátek, zaměřený na rozdílné organizmy, reaguje, jako kdyby byl přítomen pouze jeden druh protilátky. Pozorováni přídavného účinku s ohledem na počet druhů protilátek určených k detekci je neočekávanou, ale hlavní praktickou výhodou. Také se neočekávalo, že test podle tohoto vynálezu, který se může provádět za použiti obvyklého testovacího zařizení, například mikrotitrační plotny, je tak citlivý.

Test podle tohoto vynálezu může být testem ke stanovení IgG, testem ke stanovení IgM nebo, pro zvláštní účely, testem ke stanovení IgA. Podle jiného provedení se pro povlékání tuhé fáze může použít směs protilátek k imunoglobulinům z rozdílných skupin. Zvláště výhodné je použití směsi anti-IgG a anti-IgM protilátek.

Další důležitá výhoda testu podle tohoto vynálezu v porovnání s testy za použití povlečených antigenů pro —zachycování-pr-oti-lát-k-y—je-v—tom-,—že-př-i-použití-imobilizova=_ něho anti-IgM se může snadno spolehlivě ~rózě znát časné stadium infekce. To je důležité jak při orientačním zkoušení krve, tak při klinických vyšetřeních.

IgM je první skupinou imunoglobulinů, které se mají produkovat v odezvu na infekci. Hladiny specifických IgM protilátek stoupají v prvních několika týdnech po infekci, a poté se produkuje o něco později specifický IgG. Odezva IgG protilátky je trvalá a může trvat mnoho let nebo rovněž po celý život. Uvedeno teoreticky, IgM může se detekovat obvyklými testy, pokud se protilátka, o kterou je zájem, zachycuje na povrchu povlečeném antigenem a přítomnost ; zachycené protilátky se detekčně určí za použití například značených anti-lidských IgM protilátek. V praxi však takové IgM testy obvykle narušují specifičnost, protože IgM je lepkavého charakteru, to znamená; že IgM má sklon vázať-se nespecificky na zachycující antigen. Značená anti-IgM protilátka používaná k detekci komplexu antigen-IgM nemůže rozlišit mezi specifickými komplexy antigen-IgM a nespecificky vázaným IgM. Z tohoto důvodu, běžné testy používající

- -i-mobilizované -antigeny,--obecné-používá jí- anti-IgG protilátky pro detekci, to jest zkoušky jsou pouze pro IgG.

Při zkouškách podle tohoto vynálezu anti-IgM protilátky se mohou povlékat na tuhou fázi. Tyto protilátky potom zachycují IgM imunoglobuliny specificky ze vzorku, a zachycený IgM se detekuje specificky pomocí značeného antigenu. Původci tohoto vynálezu s překvapením zjistili, že systém nemá lepkavý charakter a že specifičnost není problémem, jako je tomuu běžných testů zachycování antigenu pro detekci IgM protilátky.: Jak je uvedeno výše, k povlékání tuhé fáze je zvláště výhodné použít směsi anti-IgG protilátek a anti-IgM protilátek. Přítomnost anti-IgM protilátek na tuhé fázi zajistí, že se detekčně stanoví libovolná časná přítomnost protilátek ve vzorku a přítomnost anti-IgG protilátek zajistí, že se provede detekce trvalých protilátek. ·

-s . - · ·

Protilátky imobilizované na tuhé fázi mohou být póly-_ť klonni protilátky, například polyklonni anti-lidské protilátky, které budou obsahovat’ protilátky ke všem skupinám irounoglobulinů. Při jiném provedení se mohou používat polyklonni , protilátky zaměřené proti zvláštní skupině imunoglobulinů, například polyklonni anti-IgG a polyklonni anti-IgM protilátky. Polyklonni protilátky se mohou čistit, například afinitní chromatografii. Pokud je to žádoucí, mohou být použity monoklonni protilátky. Imunoglobuliny mohou být specifické pro imunoglobulinové τ, μ nebo α řetězce IgG, IgM a IgA.

- - -Polyk-lonní-a monoklonni protilátky používané pro ; povlékání tuhé fáze se mohou připravovat způsoby, které jsou známé jako takové. Různé anti-imunoglobuliny jsou dostupné na trhu, například polyklonni anti-IgG a anti-IgM imunoglobuliny získané z králíka, ovce a kozy, a polyklonni anti-IgG a anti-IgM imunoglobuliny 2iskané z myši. Pokud se používá směs rozdílných protilátek pro povlékání, poměr rozdílných protilátek ve směsi se může měnit, jak je zapotřebí. Tento vynález není omezen na vyšetřováni vzorků od lidí a také nachází použiti při veterinárních aplikacích. Proto protilátky používané pro povlékání by měly být zaměřeny proti imunoglobulinům druhů, jejichž vzorky jsou předmětem zkoumání.

V případě vzorků získaných od lidí například protilátky pro povlékání by měly být anti-lidské protilátky.

Jak již bylo uvedeno, zvláště výhodný znak testu podle tohoto vynálezu spočívá v tom, že se používá prostředek tvořený univerzální tuhou fází povlečenou protilátkou, bez ohledu na počet nebo povahu patogenů, které jsou předmětem zkoumání. Protilátky používané jako protilátky pro povlékání _—jsou.zaměřenyuproti jedné nebo většímu počtu skupin imunoglo-__

-bulinů, -zvláště- proti-IgG-a-IgM-a-zachycují-representativní..^..

podíl imunoglobulinů z příslušného souboru ze vzorku. Volbou libovolné zvláštní kombinace specifických, antigenů uživatel může při testu testovat libovolnou kombinaci patogenních organizmů. Činidlo ke stanovení antigenů se může dostat snadno smícháním, nebo uživatel může použit oddělená činidla ke stanovené antigenů, v libovolné požadované kombinaci.

Pokud se používá individuálně, činidla ke stanovení antigenů se mohou uvádět do styku současně,nebo postupně v jakémkoli pořadí s tuhým povrchem nesoucím zachycené imunoglobuliny. Je však obecně vhodnější přidat požadovanou směs činidel v jednom stupni.

. . Antigenem určeným k použiti při zkoušce podle tohoto vynálezu může být antigen z libovolné entity, u které nastává

- se-lek-t-ivní interakce -s protilátkou, -jež-je předmětem zkoumáni. Například antigenem může být peptid nebo polypetid a může jít o syntetický nebo rekombinantní antigen, nebo o čištěný antrigen z buněčné kultury, například z virového lyzátu. V určitých případech může být zvláště vhodné,

------například pro HCV,..použit, rekombinantně.spojený polypeptid, který obsahuje více než jednu antigenovou oblast ze zvláštního organizmu.

Antigen může být sám značen prostředkem schopným přímo nebo nepřímo poskytnout detekovatelný signál, který umožňuje detekčně stanovit libovolný komplex imunoglobulinu s antigenem. Značený antigen se označuje jako antigenový konjugát.

* i·¹ I

Detekovatelný signál může být optický, radioaktivní nebo fyzikálně chemický a může se dostat přímo značením antigenu, například barvivém, zbarvenými částicemi; radiologickým značením, elektroaktivními prostředky, magnetickými resonančnimi prostředky nebo fluoroforem, nebo nepřímo značením antigenu enzymem, který sám je schopen zvýšit měřitelnou změnu libovolného druhu. Při jiném provedení signál může být měřítkem aglutinace, difrakčniho jevu nebow? dvojlomu, zahrnujícího antigenový konjugát.

Podle dalšího provedení, prostředek schopný poskytnout nepřímo detekovatelný signál zahrnuje protilátku,. která se váže k antigenu. Tak protilátka (Abl) může být poskytnuta přímo nebo nepřímo značenými prostředky jak je popsáno výše· pro antigen (jediný protilátkový detekční systém) nebo může být značena prostředkem z ještě jiné protilátky (Ab2), která se váže k Abl a je sama značena přímo nebo nepřímo, jak .je popsáno výše pro antigen (podvojný protilátkový detekční systém). Jediný nebo podvojný protilátkový. systém pro detekci zachyceného komplexu protilátky a antigenu je zvláště vhodný, pokud je obtížné produkovat vhodný antigenový konjugát. Některé antigenové komnjugáty, například mají sklon být nedostatečně stabilní pro komerční použití a některé antigeny ztrácejí antigenitu při konjugaci.

Jediný protilátkový detekční systém má výhodu v tom, že zahrnuje méně promývacích a inkubačních kroků, ale má nevýhodu v tom, že je nezbytné produkovat protilátkový konjugát (značenou protilátku Abl) pro každý antigen určený k detekci. Podvojný protilátkový detekční systém má výhodu spočívající v tom, že příslušnou volbou Abl a Ab2 je možné použit jediný protilátkový konjugát (značenou protilátku Ab2) pro detekci všech zachycených protilátek, jak je uvedeno dále. Pokud každá protilátka (Abl) je vyvolána u stejného druhu zvířete, druhou protilátkou (Ab2) může být anti-druhová protilátka. Například jestliže každá protilátka Abl je protilátkou ovce, potom se značená proti-ovčí protilátka může použít jako Ab2. Výhodou pro uživatele vyžadujícího pouze jeden protilátkový konjugát k detekci všech analytů obecně

-převaž uj e -n evýhodu-potřeby—z vlá š tn i_i nkubace a zvláštních___

---'promývacíchkroků,-zvláště-pokud- se -používá-autoinatického..-—.

systému. Výhoda spočívající ve vyžadování pouze jediného protilátkového konjugátu je jiným významným přínosem pro výrobce.

Značící systém, který je zvláště výhodný pro antigenový nebo protilátkový konjugát je enzymový značici systém, zvláště systém, ve kterém antigen nebo protilátka je konjugována k enzymu, který katalýzuje detekovatelnou změnu barvy v přítomnosti vhodného substrátu. Tento předpis, imunologický test s vázáním enzymu nebo ELISA, se široce používají v komerčním měřítku. Přitom jsou dostupná automatická zařízení pro provádění takových testů, například mikrotitrační plotny, chráněné systémy na bázi kuliček nebo IMX (ochranná známka) nebo systémy používající dutá vlákna nebo špičky pipety; počítačový software-umožňuje-dosáhnout výsledků.

Používané systémy na bázi enzymů jsou dobře známé jako takové, viz například ELISA and Other Solid Phase

-Immunoassays,- Theoretical-and -Practical. Aspects , „vyd.__D. __M. _ Řemeny a S. J. Challacombe.

Příklady typických enzymových systémů jsou systémy používající alkalickou fosfatázu, β-galaktosidázu, ureázu nebo peroxidázu, například peroxidázu z křenu selského.

Tuhá fáze, na které se protilátka zachycuje, jsou například kuličky, jamky nebo kalíšky mikrotitrační plotny nebo mohou být v jiné formě, například jako tuhá nebo dutá vlákna nebo pipety, zvláště například o průměru od 0,1 μιη do 5 mm. (Takové částice se často označuji jako částice latexu bez ohledu na to, z jakého materiálu jsou zhotoveny.)

Tuhou fázi mohou být plastické hmoty nebo polymerní materiály, například nitrocelulóza, polyvinylchlorid, polystyren, polyamid, polyvinylidenfluorid nebo jiné syntetické polymery. Částicemi mohou kromě toho být přírodní polymery , například latex nebo protein. Mikrotitrační plotna a kuličky se používají jak pro orientační zkoušení krve, tak pro klinické testování a jsou široce komerčně dostupné.

Mezi jiné tuhé fáze, které se mohou používat, se > zahrnují membrány, listy a proužky, například z porézního, vláknitého nebo savého materiálu, například nylonu, polyvinylchloridu nebo jiného syntetrického polymeru, z přírodních polymerů, například celulózy, derivátů přírodních polymerů, například acetátu celulózy nebo nitrocelulózy nebo skleněných vláken. Papír, jako například diazotovaný papír, se též může použít« Filmy a povlaky, například z vláknitého nebo savého materiálu, například jako jsou popsány výše, se mohou použít jako tuhá fáze.

Má se vzít v úvahu, že výše zmíněné příklady tuhých fází jsou uvedeny pouze k ilustrativním účelům a vynález není omezen na použití takových tuhých fází. Vynález se může. provádět na libovolné tuhé fázi, která je vhodná pro použití při imunologických,testech.

Tuhá fáze, například membrána, list, pásek, film nebo povlak, se mohou vložit do zařízení pro vyhodnocení většího počtu vzorků nebo obvykle vzorku jediného.

Výraz testovací zařízeni se zde používá k označení zařízení, ve kterém se provádějí imunologické testy a zahrnuje tuhou fázi, obvykle tuhou fázi ve formě destičky, jako je například membrána, list, pásek, povlak, film nebo jiný laminární prostředek, na kterém jsou zmobilizovány protilátky z jedné nebo většího počtu skupin imunoglobulinů.

__Imob i 1 i z o v.ané_ pr o.t i 1 á tky_j s.o.u_výho.dně_pří tomny v definované

- - zóně , označované-zde-jakO¹zónak-zachycování--antigenu7t.-j--^™-.

Testovací zařízení může zahrnovat tuhou fázi v tuhém základu nebo plášti, které mohou také obsahovat některá nebo všechna reakční činidla vyžadovaná k provedení testu. Vzorek se obvykle aplikuje na testovací zařízení do předem určené aplikační zóny vzorku, například vylitím nebo nakapáním vzorku do zóny nebo pomořením příslušné části zařízení do ' vzorku. Pokud aplikační zóna vzorku je na různých stranách od zóny k zachycování protilátky, uspořádáni zařízení je obecně takové, že protilátky ve vzorku migrují do zóny k zachycování . protilátky. Vyžadovaná činidla se potom aplikují ve vhodném pořadí do požadovaných aplikačních zón/ které’mohou nebo nemusí být stejné jako aplikační zóny vzorku. Opět, pokud . některá aplikační zóna rěakčního činidla je nebo libovolné ' aplikační- zóny reakčních-činidel -jsou na rozdílné straně-od zóny k zachycování antigenu, uspořádání zařízení je obecně takové, že reakční činidlo migruje nebo reakční činidla migrují do zóny k zachycování protilátky, kde se provede deketce libovolného vzniklého komplexu antigenu a protilátky.

— Všechna.nebo některá .reakční .činidla vyžadovaná, pro .... .. .... imunologické testy se mohou vpravit do zařízení v kapalné nebo suché formě. Pokud je tomu tak, zařízení se obvykle uspořádá takovým způsobem, že nastávají interakce mezi různými částmi zařízení, přičemž interakce mohou nastávat automaticky během provozování zařízení nebo se mohou vyvolat uživatelem zařízení tím,, že se uvedou do styku různá reakční činidla s jinými reakčními činidly ve správném pořadí pro prováděný imunologický test.

široce rozmanitá testovací zařízení jsou popsána v literatuře zaměřené na imunologické testy. Příklady membránových zařízení jsou popsány-v US patentech-č.

623 461 a 4 693 984. V závislosti na jejich konstrukci a rychlosti jejich účinku se některá zařízení označují jako měřicí tyčinky a některá se označují jako zařízení pro rychlé testování. Zařízení pro rychlé testování obvykle poskytuje výsledky během 10 minut od aplikace vzorku.

(Obvyklý test s použitím mikrotitrační plotny nebo kuliček vyžaduje inkubační stupně a obecně potřebuje nejméně 1 hodinu k poskytnutí výsledků.) Proto třebaže testovací zařízení jsou obecně mnohem nákladnější než mikrotitrační nebo kuličkové provedení, jsou zejména používána při klinickém testování, například pokud se výsledky vyžadují rychle, jako například v případě chirurgického ošetření náhlé příhody.

Testovací zařízení mají hlavní výhodu, v tom, že se mohou používat, aniž by byla zapotřebí vysoká laboratorní zručnost nebo dokonce bez potřeby jakéhokoli laboratorní . zručnosti. Tato zařízeni se mohou používat například pro testováni s jedinou skvrnou, například v místech první pomoci, lékaři - chirurgy, ve farmacii nebo v určitých případech při testování doma. Tato zařízení jsou zvláště vhodná v teritoriích, kde se nedostává laboratorní zručnosti nebo ta je k dispozici ve velké vzdálenosti.

v

Jak je uvedeno výše, kombinační test podle tohoto vynálezu je zvláště vhodný pro orientační zkoušení krve dárců. Tento test se proto může používat k testování protilátek na alespoň dva viry vybrané z HIV, například HIV-1,

HIV-2 a HIV podtypy, například HIV-1 podtyp 0, HCV, hepatitidy B (protilátky k jadernému antigenu), HTLV, například HTLV-I a HTLV-II, CMV, EBV, (Epstein-Barrův vir) a popřípadě také pro syfilis. Zvláště výhodné jsou kombinace dvou nebo většího počtu virů vybraných z HIV, například HIV-1+2, HCV, HTLV, například HTLV-I+II, a jaderné hepatitidy B (HBc), například HIV a HCV, HIV a HTLV, HLTV a HCV, HIV,

HCV a HTLV, HIV, HCV a HBc, HIV, HTLV a HBc, HTLV, HCV a HBc, HIV, HCV, HTLV a HBc. Syfilis se může zahrnout do libovolné

------z—výše—popsaných-kombinaci..—Z v.olené_kombinace budou ovlivňo-_Vat -zvláštní—nářodní-předpisy. -V* určitých-připadech--dárce~^—krve může být také testován na další patogennní organizmy, například na zarděnky.

Kromě toho požadavky na' orientační zkoušení krve se zaměřují na nové patogeny (nové organizmy a nové podtypy známých organizmů, v popisné části tohoto patentu označováno též souhrnně jako patogenní organizmy) jak jsou objevovány. Přitom závazné testy jsou rozšiřovány k pokrytí těchto patogenu. Například v současné době vyžaduje mnoho zemí testování jak na HIV-1, tak na HIV-2. Nedávné objeveni HIV-1 podtypu 0 vedlo k požadavku, aby testy byly také zaměřeny na tento podtyp. Proto kombinace patogenu určených k detekci bude skoro určitě do budoucna rozšířena. Tento vynález zahrnuje testy takových kombinací patogenu.

Pokud še používá dvousložkového systému na bázi zkumavky a kuliček, další všestrannost může přinést například to, že poté co se zkumavka a kuličky uvedou do styku se vzorkem, kuličky se odstraní, uvedou do styku s antigenem

-nebo-antigeny -jednoho-nebo .většího -počtu odlišných, druhů _____

patogenů a zkumavka se přivede do styku s odlišným antigenem nebo kombinací antigenu.

Při další variantě provedení dvousložkového systému na bází zkumavky a kuličky je imobilizována jedna nebo větší počet skupin anti-imunoglobulinů na jedné ze složek a dále imobilizována anti-hepatitida B povrchového antigenů (anti-HBsAg) na jiné složce, například anti-IgG a popřípadě také anti-IgM se může povléknout na vnitřní povrch malých zkumavek a anti-HBsAg na kuličky nebo naopak. Kuličky a zkumavky se mohou potom používat dohromady při kombinovaném testu HBsAg a většího počtu protilátek, zvláště zkoušce na HBsAg, HIV, HCV a popřípadě jeden nebo větší počet analytů zvolených z (jaderné) hepatitidy B, HTLV a syfilisu.

Peptidy á polypetidy, které podléhají interakci zvláště s HIV-1 a HIV-2 jsou dobře známé a jsou popsány například v evropském patentu č. 0 347 148. Původci tohoto vynálezu zjistili, že jsou zvláště vhodné syntetické HIV peptidy k blokování merkaptoskupin z cysteinových částí blokujícími činidly (viz například evropský patent č.

30 7 149A), co má za výsledek značný peptid, zvláště peptidznačený enzymem, který má větší imunologicku aktivitu při testu než odpovídající neblokovaný peptid.

Antigen určený k použití při detekci jaderné protilátky hepatitidy B je jaderný antigen. DNA a očekávaná proteinová sekvence pro různé seroťypy.hepatitidy B byly již publikovány (například Ono a kol., Nuc. Acids Res. 11, 1747 /1983/) a vhodné jaderné antigeny peptidů a polypeptidů, jak syntetické, tak rekombinantní, se mohou odvodit od publikovaných sekvenci.

V současné době se nezdá, že by hepatitida C měla jeden imunodominantni epitop, a proto je výhodné testovat na protilátky více než jedinou oblast. Například může být výhodné použít jako antigen fúzovaný protein, který obsahuje více než jeden epitop, například aminokyselinovou sekvenci z alespoň jedné strukturní oblasti a z alespoň jedné nestrukturni oblasti, například jako je popsáno v britském patentu č. 2 239 245. Antigeny z jádra a obalových oblastí jsou výhodnými strukturními antigeny. Nestrukturni antigeny se mohou zvolit například z oblastí NS3, NS4 a NS5.

HTLV antigenem může být například p21e nebo gp46 rekombinantní protein nebo peptid odvozený od p21e nebo gp46 (viz například US patent č. 4 743 678). Vyčištěný p21e je dostupný u Cambridge Biotech Corporation, 1600 East Gude

--Drive.,-Rockvi 11 e -,-Ma ryl and-2 0 8 50-5 300., —USA.. _gp.41 —j e_dos tupný

Repligen Corporation/ 1 Kendal Squaréý~Building-7OCl·,—

Cambridge, Máryland 02139, USA.

Pro detekci CMV protilátek se mohou používat vyčištěné kultivované CMV jaderné proteiny, například p66, nebo rekombinantní pplSO, který je dominantní ve Western skvrnách. Pro detekci EBV protilátek se může používat kapsid nebo počáteční antigeny. Vyčištěný T. pallidum antigen sé může používat pro detekci protilátek syfilisu.

Kombinační test podle tohoto vynálezu se může používat při klinické diagnóze, jako.předběžném testu při orientačním zkoušení několika patogenních organizmů. Jestliže je tento test positivní, potom se může provést oddělený test pro každý patogeň. Pokud výsledek je negativní, není vyžadována žádná další akce.- Celkově se uspoří čas a peníze. Příkladem takové kombinace je používání tak zvané orientační zkoušení TORCH těhotných žen v mnoha zemích. Kombinace patogenních organizmů, které se vyšetřují, se mění od jedné země k druhé, analogicky jako při orientačním zkoušení krve, ale obecně se . ------ vybírá ze- zarděnek, toxoplasmózy, CMV a-oparu... Je zvláště ......

výhodné, pokud se použije směsi imobilizovaných anti-IgG a anti-IgM protilátek aby se dosáhlo jistoty, že se zjistí čerstvá infekce.

Kombinační test podle tohoto vynálezu prováděný v testovacím zařízení, zvláště zařízení pro rychlé testování, je zejména vhodný, pokud výsledky orientačního zkoušení se vyžadují urychleně, například v případě úrazové chirurgie. Například rychlé testování dvou nebo většího počtu virových patogenů v krvi, jak je například popsáno výše, jako v případě HIV-1+2 a HBc, bude informovat chirurga o tom, zda je vyžadována zvláštní.opatrnost,

Testovací zařízení pro kombinace sledovaných patogenů se používají například pro testování na jediné skvrně u lékaře - chirurga, aby se pomohla stanovit diagnóza a mohl' se celkově uspořit čas a peníze jak při klinickém laboratorním testování, tak aby se podařilo vyhnout opakovaným návštěvám u chirurga. Kromě toho testovací zařízení jsou vhodná pro testování v situaci, kdy není snadno dosažitelná laboratorní zručnost, například ve venkovských oblastech a v rozvojových zemích. Příklady kombinace patogenních organizmů jsou CMV a HIV, stejné jako TB a HIV.

Všestrannost použití univerzální tuhé fáze povlečené protilátkou pro detekci většího počtu antigenů se může využít dalším způsobem při klinickém testování. Při klinickém testování předmětem je obecně identifikace patogenů nebo patogenů ve vzorku. Nyní pokud se má testovat řada vzorků na přítomnost různých patogenních organizmů za použití obvyklé mikrotitrační plotny nebo kuliček, je běžné připravit alikvoty různých vzorků a provést sérii testů, každý pro rozdílný patogenní organizmus. Tomu je tak proto, že obvyklé testy používají prostředek povlečený antigenem k zachycení protilátek specifických pro patogen. Proto je nezbytné použít různé prostředky povlečené antigenem, obecně bud kuličky nebo mikrotitrační plotnu, pro každý patogenní organizmus. Tím vzrůstá doba potřebná k dosažení výsledků pro zvláštní vzorek a také se projevuje riziko, že alikvoty vzorků budou odloženy nebo dojde k jejich zmatení, přitom kdy se tyto všechny různé testy budou provádět.

Kromě toho prostředek povlečený antigenem je obecně přítomen s jinými reakčními činidly, například positivními a negativními kontrolními činidly, promývacími roztoky a ředidly, ve formě soustavy. Uživatel proto má mít velký počet rozdílných soustav.

------P-ři-použi-tí—testu-podle-tohoto—vynálezu_se-~univerzální ·* prostředek povlečený-protilátkou, napřiklad-mikrotitráční-— plotna, může použít pro současné, ale oddělené stanoveni každého z většího počtu patogenních organizmů jednoduše při použiti vhodného reakčního činidla pro antigen. Současně může být testována řada rozdílných vzorků, některé ha jeden a některé na jiný patogenní organizmus. Je zvláště výhodné testovat alikvoty z jediného vzorku současně, ale odděleně na rozdílné patogeny, například testovat každý alikvot v oddělené jamce mikrotitrační plotny na rozdílný patogenní organizmus. Tyto výsledky spoří čas a peníze, a také snižují riziko chyb v důsledku ztráty nebo záměny vzorků.

Proto tento vynález se také týká způsobu současného, ale odděleného stanoveni protilátek specifických dvěma nebo většímu počtu rozdílných patogenních organizmů v kapalném

.....testovacím vzorku, který -spočívá v tom; že..... .....

i) přivede se do styku každý vzorek s jednou nebo větším počtem jednotek, například v jediném modulu, přičemž každá jednotka obsahuje tuhou fázi s imobilizovanými proti- -látkami pro-jednu-nebo-větší-počet--skupin-imunoglobulinu., - ... kde imunoglobuliny z příslušné skupiny nebo skupin přítomné v každém vzorku jsou zachycovány na tuhé fázi, přičemž imobilizované protilátky jsou ze stejné skupiny nebo skupin ve všech jednotkách modulu, ii) uvede se do styku každá jednotka, která byla předem kontaktována se vzorkem, s antigenem schopným selektivního vázání k protilátce specifické pro jeden z patogenních organizmů, které jsou předmětem zkoumání, přičemž každý antigen poskytuje prostředek schopný přímo nebo nepřímo poskytnout signál stanovitelný detekčně, a iii) stanoví se libovolný výsledný komplex imunoglobulinu a antigenů na tuhé fázi.

Počet použitých rozdílných jednotek, a proto použitých antigenů, bude záviset na počtu patogenních organizmů, kterém, jsou předmětem zkoumání, každá jednotka může například být jednou z jamek mitrotitračni plotny nebo nádobou obsahující kuličky.

Při jiném provedeni každá jednotka může být definovanou oblastí na membráně, pásku, listu, filmu nebo povlaku, zvláště pokud je přítomna v testovacím zařízeni. Zařízení mají předem stanovené oblasti pro zachycování složek ze vzorku, který je předmětem zkoumáni, a jsou známa jako taková. Je nejjednodušší, když testovací zařízení, které je ve formě pásku pro součané, ale oddělené testováni podle tohoto vynálezu, může zahrnovat například pásek ze savého materiálu, který má pás zachycujícího imunoglobulin příčně k šířce pásku, co se zde označuje jako zóna k zachycování protilátky. Pás je výhodně rozdělen do sekcí pomocí oblasti, které nejsou povlečeny imunoglobulinem k zachycování. Každá sekce imobilizovaného imunoglobulinu se může považovat za jednotkovou zónou k zachycováni protilátky.

Testovací zařízeni pro současné, ale oddělení testová25 ní, je například obdobné zařízení, jako je popsáno výše v souvislosti s kombinačními testy.

Všestrannost testovacího zařízení podle tohoto vynálezu pro současné, ale oddělené testování rozdílných patogenních organizmů skýtá zvláštní výhody jak pro výrobce, tak pro uživatele. Hlavní výhodou je to, že jediné zařízení, opatřené řadou rozdílných zón zachycujících protilátku, může být dodáváno dohromady s větším počtem reakčních činidel pro antigen, pro současné testování řady rozdílných protilátek ve vzorku. Jako je uvedeno dříve, výrobce má výhodu v tom, že

------------------pro všechny-analy-ty—je-zapotřebí-zho-tovi-t.pouze jediné_____________ ‘ zařízení. Uživatel má také-výhodu v tom, že se vyžaduje pouzejediné zařízení, a má další výhodu ve volné volbě kombinace analytů určených ke stanovení.

Jak je uvedeno výše, současné, ale oddělení testování podle tohoto vynálezu na rozdílné patogenní organizmy se může provádět pro stanovení libovolné zvláštní kombinace patogenů ve vzorku. Například vzorek od pacienta trpícího hepatitidou se může současně testovat na antijaderné protilátky hepatitidy A a hepatitidy B a na HCV, vzorek od pacienta s nespecifickým zánětem močové trubice se může testovat na kapavku, chlamydii a kandidiózu..

Ve variantě současného, ale odděleného testování podlé tohoto vynálezu, místo každé jednotky obsahující imobilizované protilátky ze stejné skupiny nebo-skupin, jedna nebo větší počet jednotek mohou mít na sobě imobilizovanou rozdílnou skupinu imunoglobulinů. Například se může dostat soubor ze dvou jednotek, kde jedna jednotka má imobilizovaný anti-IgG a jiná imobilizovaný anti-IgM. Řada současných testů na

----- zvláštní protilátku, prováděných během časového období za...

využití soupravy se dvěma jednotkami, na vzorcích získaných od stejného jedince je zvláště výhodná pro stanovení časného stadia infekce a po proběhnutí choroby, zvláště pro dále uvedenou serokonverzi, například HIV as HCV. Souprava ze tří jednotek, kde jedna má imobilizovaný anti-IgG, druhá má imobilizovaný anti-IgM a třetí obsahuje imobilizovaný anti-IgA je zvláště vhodná pro stanovení zda dítě trpí HIV. Krev dítěte má jak vlastní dětskou protilátku, tak protilátky matky, takže při použití obvyklých testů je obtížné stanovit, zda dítě má své vlastní HIV protilátky, které jsou ukazatelem infekce.

Další příklad použití více než jedné skupiny protilátek je v tak zvaných TORCH testech prováděných v mnoha zemích u těhotných žen. Patogenní organizmy jsou vybrány ze zarděnek, toxoplasmózy, CMV a oparu. Kombinace se mění od země k zemi. Test na zarděnky má zahrnovat testování IgM za účelem stanovení blízké infekce, která je potenciálně nebezpečná. Proto pro testováni TORCH zahrnující stanovení zarděnek, alespoň jedna jednotka v použité soupravě by měla mít anti-IgM povlak.

Modul zahrnující dvě nebo větší počet jednotek, které mají imobilizované protilátky proti rozdílným skupinám , imunoglobulinů, je sám částí tohoto vynálezu. Proto tento vynález poskytuje modul zahrnující dvě nebo větší počet jednotek k použití při současném, ale odděleném testování rozdílných patogenních organizmů, kde jednotky obsahují imobilizované protilátky proti imunoglobulinům, a kde alespoň jedna jednotka má imobilizované protilátky zaměřené proti různým skupinám imunoglobulinů z imobilizovaných imunoglobulinů v jiných jednotkách, například jedna jednotka může mít imobilizovaný anti-IgM a druhá nebo další jednotky mohou mít imobilizovaný IgG. Při jiném provedení, modul zahrnuje tři jednotky, jedna jednotka má imobilizovaný anti-IgG, druhá jednotka má imobilizovaný anti-IgM a třetí jednotka má imobilizovaný anti-IgA.

Modul obsahující dvě nebo větší počet jednotek může být přítomen v testovacím zařízení, například jako uspořádání dvou nebo většího počtu zón zachycujících protilátky, například zóny zachycující IgG a zóny zachycující IgM. Takové testovací zařízení se může použít pro současné, ale oddělené testování rozdílných patogenních organizmů, například pro některá ze zvláštních použití, která jsou popsána výše.

I

Při jiném provedení, modul může zahrnovat dvě nebo větší počet souprav z jednotek (kde každá souprava obsahuje ___identické jednotky). Řada souprav z rozdílných jednotek múže

-χ-- —být· přítomna- jako-modul.^Například 'souprava-z—jednotek-může^..

být přítomna jako pásek z mikrojamek. Takové pásky se mohou být sestaveny jak je popsáno u modulů obsahujících dva nebo větší počet souprav jednotek, například modul může zahrnovat dva pásky z mikrojamek, jeden povlečený anti-lidským IgG a druhý povlečený anti-lidským IgM. Může se přidat třetí pásek, obsahující imobilizovaný anti-lidský IgA. Pásky z mikrojamek, to znamená souprava jednotek, se může sestavit . jak je žádoucí za vzniku obvyklé mikrotitračni plotny. Například plotna může mít střídající se řady nebo sloupce z mikrojamek povlečených anti-IgM a anti-IgG, například pro následující serokonverzi. Opět se projevují výhodné výrobní náklady a také je výhodné všestranné použiti, zvláště pro ‘ pásky z mikrojamek nebo pro analogické soupravy sestavené z jednotek. ' _r

Pokud není uvedeno jinak, dále uvedený popis se aplikuje jak na kombinační, tak na současné, ale oddělené testování podle tohoto vynálezu.

.............Pro klinické, testování, může. být kapalnýmJtestovacím vzorkem libovolná tělesná kapalina, například krev, plasma, sérum, sliny, moč, cerebrospinálni tekutina, mléko, lymfatic28 ká tekutina nebo pot. Při jiném provedeni se tuhé vzorky, například buněk nebo tkání, mohou převést do kapalné formy pro testování, například jako tkáňový exudát.

Pro orientační zkoušení krve (které se s výhodou provádí jako kombinační testování), sledované patogenní organizmy jsou tak zvané krevní virové patogeny (HIV, .......* hepatitida B, hepatitida C, popřípadě také HTLV, CMV a EBV) a také syfilis. Pro klinické testování je zajímavé mnohem širší rozmezí patogenních organizmů včetně.organizmů uvedených výše a také jiné viry, bakterie a jiné typy patogenních organizmů. Formou příkladů, které neomezuji jejich výčet, se uvádějí:

zarděnky, spalničky, opar (prostý a genitální), chlamydie, ..k.* kapavka, hepatitida A, plané neštovice, příušnice, lidský parvovirus, Mycobacteria tuberculosis, Mycobacteria leprae, Mycobacteria avium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis (antigen/toxiny), Actinomycetes (například Streptomyces, Nocardia, Rhodococcus), Saímonella typhi, Yersinia enterocolifica, Helicobacter pylori, Campylo-f. bacter jejuni, Pseudomonas mallei a pseudomallei, Pseudomonas⁴?. aeroginosa, Legionella pneumophilla á spp., Francisella tolarensis, Brucella melitenis, Mycoplasma pnenumoniae, Leptospira interrogans, Borelia spp., Třeponema pallidům, Candida albicans a choroby způsobené protozoálními pathogeny, například amoebiasis ,< babesiosis , Chagasova choroba , leishmanióza, malarie a toxoplasmóza.

Imobilizované anti-imunoglobuliny mohou být z jedné nebo většího počtu skupin, kterými jsou skupiny IgG, IgM a IgA. Jak bylo již uvedeno výše, IgG je nejhojnější imunoglobulin v seru. IgM je první imunoglobulin vyprodukovaný v odezvu na infekci, takže poskytuje dřívější indikaci infekce než IgG. Pro testování krve (plasmy nebo sera) se obecně může použít bud samotného IgG nebo samotného IgM, podle účelu testu, nebo se může použit směs anti-IgG a anti-IgM v jedné jednotce pro kombinační testováni, nebo anti-IgG a anti-IgM mohou být přítomny v oddělených jednotách pro současné, ale oddělené testy. Pro testování slin je také výhodné zachycovat IgG a/nebo IgM, Pro testování moči se výhodně používá anti-IgG, popřípadě v kombinaci s IgM a/nebo IgA.

Pro tyto formy testů podle tohoto vynálezu, které používají dvousložkového předpisu kuličky a zkumavka, je ___mo.ž né._r.o vně.ž_z výš i.t_da 1 š i _adap.t ibi 1 i tu_te s.tu_pod 1 e_toho_t o__,___

-—- vynálezu-imobilizaci-·jedné -nebo 'dvou-skupl·n- antiτmunoglob^l·i- -nů na vnitřním povrchu zkumavky z plastické hmoty a imobilizovat jednu nebo dvě skupiny anti-imunoglobulinů na kuličkách, kde kuličky se mají použit ve zkumavce. Například anti-IgG se může povléknout na jednu ze dvou složek a anti-IgM na druhou.

Kromě toho se může použit kombinovaného předpisu kuličky a zkumavka a po.uvedení.zkumavky a kuliček,do.styku se vzorkem, se kuličky mohou odstranit a uvést do styku s jedním antigenem a zkumavka se může uvést do styku s druhým antigenem, co umožňuje, aby se testy dvou protilátek prováděly ha jediném vzorku.

Třebaže orientační zkoušení krve a klinické testy jsou - popsány výše, v podstatě -nen-í -rozdíl v použitém- testování nebo v typu použitého materiálu. Pro orientační zkoušení krve , je zvláštní rozsah analytů specifikován jednotlivými národními úředními předpisy a testování směřuje k tomu, aby se stalo plné automatizované, ve srovnání s klinickým testo__________váním,_ jednoduše proto.že existuje větší, počet identických .. testů.“ Kromě toho je třeba rozumět, že v popise, pokud není uvedeno jinak, všechny popisy se týkají testování podle tohoto vynálezu obecně a zahrnuji testování prováděné za testovacím zařízení, stejně jako například na mikrotitračních plotnách nebo na kuličkách.

Testováni podle tohoto vynálezu se může provádět obvyklým způsobem, viz například ELISA and other Solid Phase Immunoassays Theoretical and Practical Aspect, vyd. D. M. Kemeny & S. J. Challacombe. Imunoglobuliny se mohou imobilizovat na tuhé fázi, například stykem tuhé fáze s roztokem imunoglobulinů o vhodné koncentraci. a hodnotě pH, například při hodnotě pH v rozmezí od 7 do 11, zvláště od 9 do 10. Výhodně se používá pufru, například pufru na bázi uhličitanu sodného a hydrogenuhličitanu sodného. Jak je uvedeno výše, vhodné imunoglobulinové přípravky jsou dostupné komerčně, a vhodné ředění komerčního roztoku protilátky je například pd 1:200 do 1:4000, uvedeno objemově.

Značené reakční činidlo pro antigen (konjugát) se může připravit libovolnou z řady metod, viz například D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, citováno výše. Obecně se používají konjugáty antigenů a enzymu.

Vzorky se mohou ředit. Například v případě vzorků krve a plasmy mohou být vzorky ředěny v poměru 1:1, uvedeno objemově, tedy se například 50 μΐ vzorku přidá k 50 μΐ ředidla v mikrojamce. Mělo by se vzít v úvahu, že libovolné použité,-ředidlo vzorku nemá obsahovat lidské imunoglobuliny ze skupiny nebo skupin, které se mají zachycovat. Při testu na mikrotitračni plotně nebo kuličkách se vzorek obecně potom inkubuje s tuhou fázi. Teplota a čas inkubace jsou nezávislé, avšak delší čas se vyžaduje při nižších teplotách. Obvyklé inkubační podmínky jsou doba v trváni 1 hodiny za teploty 37 °C. Po Inkubaci, plotny nebo kuličky se mají důkladně promýt před inkubaci reakčním činidlem pro antigen (konjugátem). Obvyklé inkubační podmínky pro konjugát jsou doba 30 minut za teploty 37 °C. Po inkubaci s konjugátem se provádí další promývací stupeň, následovaný inkubací se substrátem pro enzym v případě ELISA. Obvyklé inkubační podmínky jsou znovu doba 30 minut za teploty 37 ’C. Roztok působící zastavení pochodu se obvykle přidává na konci inkubace. V případě ELISA se výsledky obecné dostanou s ohledem na absorbanci každé jednotky ve spektrofotometru. Pokud se použije jiného systému značeni, metoda se příslušně modifikuje, například v případě radioimunologického testu nebo fluorescenčního testu se výsledky dostanou po inkubaci s radioaktivně nebo fluorescenčně značeným antigenovým konjugátem. V případě barevných částic, může byt možné stanovit positivní nebo negativní . .. výsledky .vizuálním-pozorovnáním.--<—--—

V případě testovacího zařízení pro použití mimo laboratoř, zbarvené částice jsou zvláště vhodné jako značkovač, protože positivní nebo negativní výsledek se může stanovit okem s minimálním počtem reakčních stupňů. Pro citlivější testování se může použít systému ELISA.

Tento vynález se také týká soupravy, která zahrnuje

a) tuhou fázi, zvláště kuličky z plastické hmoty nebo mikrotitrační plotnu z plastické hmoty, nesoucí imobilizované protilátky k jedné nebo většímu počtu skupin imunoglobuliriů, zvláště směs anti-IgG a anti-IgM protilátek,

..........b)- dvě nebo větší počet-reakčních činidel pro antigen, které jsou schopny selektivně se vázat k protilátce, specificky pro jeden ze sledovaných patogenů, který je předmětem zkoumání, a každý antigen dodává prostředek schopný přímo nebo nepřímo poskytovat signál schopný detekce, a popřípadě zahrnuje jednu „nebo větší počet.z dále.uvedených.. složek:

c) reakční činidla ke kontrolnímu sledováni positivní nebo negativní odezvy, promývací roztoky a ředidla.

Souprava může být provedena jako taková nebo složka povlečená protilátkou a složka reakčního činidla pro antigen mohou být poskytovány odděleně.

Tento vynález se také týká tuhé fáze vhodné pro použití při imunologickém testu, na,které je imobilizována směs anti-IgG a anti-IgM protilátek. Směs protilátek může dodatkově obsahovat anti-IgA protilátky. Protilátkami jsou zvláště anti-lidské protilátky. Tuhá fáze je například libovolná z tuhých fází popsaných výše, jako například mikro titrační plotna nebo kuličky, a zahrnuje tuhou fázi vhodnou pro použiti v testovacím zařízení.

Výrazy stanovení nebo detekce se zde oba používáj k označení kvalitativních, kvantitativních nebo semikvantita tivních testů patogenních organizmů.

Použití předpisu k zachycováni imunoglobulinů pro stanoveni protilátek k většímu počtu patogenních organizmů v rozdílných vzorcích (kombinační testováni) nebo pro současné, ale oddělené stanovení většího počtu rozdílných protilátek v alikvotech ze stejného vzorku (současné testování) skýtá výhody, jak z hlediska času, tak nákladů. Potenciální všestrannost předpisu v tom, že se může stanovit větší počet patogenních organizmů současně bud v jedné jednotce nebo v řadě paralelních jednotek jednoduše volbou reakčního činidla pro antigen, nebyl dříve vysoko hodnocen. Velmi reálné praktické a ekonomické výhody spočívající v možnosti použít univerzální prostředek povlečený protilátkou, například mikrotitrační plotny povlečené protilátkou, kuličky povlečené protilátkou a imobilizované protilátky v testovacím zařízení, pro libovolnou testovanou protilátku by neměly být podceňovány.

Využitelnost

Samozřejmě je třeba ocenit, že tento vynález není omezen na stanovení patogenních organizmů. Tento vynález se může aplikovat na detekci libovolné zajímavé protilátky, i když povaha antigenů, který zvyšuje protilátku, je například spojená s nepatogenními organizmy. Příklady stavů zvyšujících takové protilátky zahrnují autoimunitní choroby a alergie, například autoimunitní choroby nespecifické pro určité orgány, jako je například reumatoidni artritida,__ íupus ~erythematosus-a-~reumatická- horečka,_a.autoimunitní ™ choroby a choroby, u nichž se předpokládá, že mají určitou souvislost s autoimunitními komplikacemi;, jako . jsou například autoimunitní choroby štítné žlázy, myasthenia.gravis, . autoimunní hemolytičká anemie, roztroušená skleróza, aftózní vřed, perniciózní anemie a vředovitá kolitida. Ve všech případech je žádoucí entita schopná vázat se specificky k libovolné protilátce, která je předmětem zkoumání.

Proto je třeba vzít v úvahu, že vysvětleni obsažená v tomto popisu jsou jak významná pro detekci protilátek souvisejících s nepatogenními organizmy, ták se týkají protilátek k patogenním organizmům a že tento vynález zahrnuje všechna taková provedení.

- Tento- vynález se -může použít pro stanovení, neboli ... detekci lidských nebo zvířecích patogenních organizmů a nachází jak humánní, tak veterinární aplikace, včetně použití při obchodování s masnými výrobky.

Příklady provedeni vynálezu ................... .................

Dále uvedené příklady ilustrují vynález, který těmito příklady není nijak omezen.

Příklady

Reakční činidla

Reakční činidla popsaná dále se používají pro test, jehož popis následuje.

1. Tuhá fáze: Mikrotitrační plotna s 96 jamkami (Nunc) povlečena směsi polyklonniho anti-lidského IgG (DAKO) a polyklonniho anti-lidského IgM (DAKO). (Produkty Nunc jsou dostupné u firmy Life Technologies, PO Box 35,

Washington Road, Abbotts Inch Industríal Estate, Paisley, Renfrewshire, TA3 4EF, Skotsko a produkty DAKO u firmy DAKO-, 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks *· HP3 5RE, Anglie).· 2. HIV-1 rekombinantní protein obsahující jádro a obalové antigeny z CBL-1 isolátu z HIV-1 (Q. J. Sattentau a kol., Science 234. 1120 /1986/) konjugováného k peroxidáze z křenu selského (HRP) (HIV-l konjugát).

3. HIV-2 peptid zahrnující gp36 obalový antigen konjugovaný k peroxidáze z křenu selského (HIV-2 konjugát).

4. Jaderná antigen hepatitidy konjugovaný k peroxidáze z křenu selského.

5. Positivní vzorky:

a) HIV-1, interní referenční číslo 4034, ředěno v HIV-1 negativním šerem,

b) HIV-2, interní interní referenční číslo 91/174

6.

ředěno v HIV-2 negativním šerem,

c) Positivní vzorky anti-HBc jádra, ředěno v-HBc negativním šerem.

Negativní vzorky:

normální lidské sérum získané z krve dárce.

Metoda ________100 μΐ zředěného vzorku (10 μΐ vzorku a 90 μΐ ředidla pro-vzorek) se -vnese -do-jamky-mikrotitrační-plotny..a_.inkubu je ve vlhkém prostředí za teploty 37 ’C po dobu 60 minut. Jamky se potom, pětkrát důkladně promyjí promývacím. roztokem, přičemž každý promývací stupeň zahrnuje odstranění obsahu každé jamky odsáváním, naplnění jamky promývacím roztokem, (glycerinborátovým pufrem obsahujícím Tween) a namáčení po dobu 30 sekund. Po konečném promývacím stupni se obsah jamek odstraní a jamky se invertují a vypustí dosucha na papírovou osušku nebo tkáň. Do jamek se přidá 50 μΐ roztoku příslušného konjugátu nebo příslušných konjugátů o pracovní koncentraci v HEPES pufru obsahujícím hovězí sérový albumin a povrchově aktivní látky, bud jednotlivě nebo v kombinaci jak je popsáno dále, a plotny se inkubuji ze teploty 37 “*C po dobu 30 minut ve vlhkém prostředí. Po dalším promývacím stupni, jako je popsán výše, se do každé jamky přidá 100 μΐ substrátového roztoku obsahujícího TMB-(3,3',5,5’^tetramethylbenzimidinu) . a peroxid vodíku a plotny se inkubuji za teploty 37 'C po dobu 30 minut ve vhlkéra prostředí. Reakce se potom zastaví použitím 50 μΐ 2-molární kyseliny sírové. Absorbance v jamkách se potom zaznamená při vlnové délce 450 nm s referenční...vlnovou délkou_.69_0 nm_....................

Přiklad 1

Řada positivních vzorků, z nichž každý obsahuje jeden druh sledované protilátky (anti-HIV-1, anti-HIV-2 a anti-HBc) se zředí a testuje podle výše uvedeného pracovního návodu, za použití svrchu popsaných HIV-l, HIV-2 a HBc konjugátů, bud samotných nebo v různých kombinacích, jak je uvedeno v tabulce dále. HIV-1 vzorky se sériově ředí v poměru 1:40, 1:80, 1:160 a 1:320. HIV-2 vzorky se ředí v poměru 1:32, 1:64, 1:128 a 1:256; Určitý počet různých HBc-positivních vzorků se ředí v poměru 1:2.

i) Každý HIV-1 positivní vzorek se při zvyšujícím ředění testuje s dále uvedenými konjugáty: HIV-1, HIV-1 + HIV-2, HIV-1 + HBc, HIV-1 + HIV-2 + HBc. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Vzorek ->	HIV-1	HIV-l	HIV-1		HIV-1
zvyšující	>3	2,897	>3		>3
se ředěni	2,015	1,905	2,011		1,847
	1,282	1,148	1,214		1,129
	0,694	0,663	0,695		0,672
	0,41	0,378	0,412		0,378
	0,232	.0,230	0,282		0,235
negativní	0,058	0,061	0,068		0,076
negativní	0,060	0,064	0,075		0,075
konjugáty	HIV-1	HIV-1	HIV-1	+	HIV-1	+
		HIV-2	HIV-2		HIV-2	+
					HBC
ii) Každý HIV-2	* positivní vzorek	se při	zvyšujícím :	ředění
testuje s	dále uvedenými konjugáty:	HIV-2,	HIV-2	+ HIV	-i,

HIV-2 + HBc, HIV-1 + HIV-2 + HBc, Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2,

Tabulka 2

Vzorek —>	HIV-2	HIV-2	HIV-2	HIV-2
zvyšující	0,099	1,045	1,009	1,002
se ředění	0,588	0,635	0,619	0,619
	0,386	0,397	0,386	0,383
	0,232	0,252	0,249	0,251
	0,158	0,167	0,171	0,183

-, 111- 0, 12 4 —0 ,12 6.^—~---0/13

negativní	0,053	0,060	0,061	0,072
negativní	0,053	0,062	0,063	0,075
konjugáty	HIV-2	HIV-2 +	HIV-2 +	HIV-2 +
		HIV-1	HIV-1	HIV-1 +
				HBc

iii) Každý ze šesti rozdílných HBc-positivních vzorků se testuje s dále uvedenými konjugáty: HBc, HBc + HIV-1, HBc + HIV-2, HBc + HIV-1 + HIV-2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce

Tabulka 3

Vzorek ->	HBc	HBc	HBC	HBc
	0,956	1,072	0,970	0,926
	0,980	1,073	0,986	0,913
	0,994	1,053	0,966	0,032
	1,072	1,189	1,058	1,030
	1,062	1,177 .	1,066	1,025
	1,058’	1,156	1,062	1,005
negativní	0,056	0,070	0,061	0,074
negativní	0,060	0,069	0,063	0,073
konjugáty	HBc	HBc + HIV-1	HBC + HIV-2	HBc + HIV-1 + HIV-2

Diskuze

Výsledky uvedené v tabulkách 1 až 3 výše jasně ukazuji, že různé antigenové konjugáty mohou sloužit k detekci příslušných protilátek jak účinně v kombinaci, tak když se použijí samotné. Je jen malý rozdíl, pokud se použiji dva nebo rovněž tři konjugáty. Pouze malý vzrůst v úrovni pozadí se pozoruje u negativních vzorků, pokud se použije dvou nebo většího počtu konjugátů.

Příklad 2

Připraví se řada vzorků A až D, obsahující HIV-1, HIV-2 a HBc protilátky, ředěním původního jediného vzorku, jak je ukázáno v tabulce 4.

protilátek, co ukazuje, že přítomnost nerelevantních protilátek nemá nepříznivý vliv na detekci relevantních protilátek. Kromě toho výsledky dosažené při nižších ředěních ilustruji kvalitativně přítomnost třetí specifické protilátky a při větším ředěni jsou dosažené výsledky v podstatě aditivní.

Dosažené výsledky ukazují, že specifičnost není ohrožena, pokud se provádí detekce protilátky ke dvěma rozdílným patogenům a také ukazují, že sensitivita kombinačního testu je pozoruhodně vysoká.

- 41 < ΐ

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob stanovení specifických protilátek k dvěma nebo většímu počtu patogenů v testovaném vzorku kapaliny, vyznačující s e ’ t i m, že se

   i) uvede do styku vzorek s tuhou fází, na které jsou zmobilizovány protilátky k jedné nebo většímu počtu skupin imunoglobulinu, přičemž imunoglobuliny z příslušné skupiny nebo skupin přítomné ve vzorku se zachycují na tuhé fázi, ii) současně nebo následné uvede do styku tuhá fáze, na které byly zachyceny imunoglobuliny ze vzorku, s dvěma nebo větším počtem rozdílných antigenů, přičemž každý antigen je schopen selektivně se vázat k protilátce specifické pro jeden z patogenů, které jsou předmětem zkoumáni, přičemž každý antigen dodává prostředek, který umožňuje přímo nebo nepřímo detekovatelný signál, a iii) stanoví libovolný výsledný komplex imunoglobulinu a antigenu vzniklý na tuhé fázi.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že imobilizované protilátky jsou anti-IgG, anti-IgM nebo anti-IgA protilátky nebo jsou směsí dvou nebo většího počtu protilátek,
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tim, že směs anti-IgG a anti-IgM protilátek se zmobilizuje na tuhé fázi.
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačuj 4c i se tím, že zmobilizované protilátky jsou afinitně čištěné polyklonní protilátky nebo monoklonní protilátky.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že každý antigen je značen přímo prostředkem, který je schopen poskytnout detekovatelný signál.
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že prostředek, který je schopen poskytnout detekovatelný'signál pro antigen,

   i) ______zahrnuje protilátku Abl, která je schopna vázat se k tomuto.antigenu, přičemž..proti látka. Abl _ sama,poskytuje ......~ prostředek schopný poskytovat detekovatelný signál nebo ii) zahrnuje protilátku Abl, která je schopna vázat se k tomuto antigenu, a druhouprotilátku Ab2, která je schopna vázat se k protilátce Abl, přičemž protilátka Ab2 poskytuje prostředek schopný poskytovat detekovatelný signál.
7. 7. Způsob podle některého z nároků laž 6, vyznačující se tím, že prostředek, který je předmětem zkoumání, je vzorek krve získané od dárce.
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyzná čujicí se tím, že dva nebo větší počet patogenů, které jsou předmětem zkoumáni, je zvolen z HIV, viru hepatitidy B, viru hepatitidy C, HTLV, cytomegalovirů, Epstein-Barrova viru a syfilisu.
9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že dva nebo větší počet patogenů, které jsou předmětem zkoumání, je zvolen ze zarděnek, spalniček, oparu (prostého a genitálniho), chlamydie, kapavky, viru hepatitidy A, planých neštovic, příušnic, lidského parvoviru,

   Mycobacteria tuberculosis, Mycobacteria leprae, Mycobacteria avium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis (antigen/toxiny), Actinomycetes, Salmonella typhi, Yersinia enterocolifica, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Pseudomonas mallei a pseudomallei, Pseudomonas aeroginosa, Legionella pneumophilla a spp., Francisella tolarensis, Brucella melitenis, Mycoplasma pnenumoniae, Leptospira interrogans, Borelia spp., Treponema pallidum, Candida albicans a chorob způsobených protozoálnimi pathogeny.
10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyzná čující se tím, že dva nebo větší počet patogenů, které jsou předmětem zkoumání, je zvolen ze zarděnek, toxoplasmózy, cytomegaloviru a virového oparu.
11. 11. Způsob současného, ale odděleného stanovení protilátek individuálně specifických dvěma nebo většímu počtu rozdílných patogenů v kapalném testovacím vzorku, vyznáčujícísetxm, že

    i) přivede se do styku každý vzorek s jednou nebo větším počtem jednotek v jediném modulu, přičemž každá jednotka obsahuje tuhou fázi s imobilizovanými protilátkami pro jednu nebo větší počet skupin imunoglobulinu, kde imunoglobuliny z příslušné skupiny nebo skupin přítomné v každém vzorku jsou zachycovány na tuhé fázi, přičemž imobilizované protilátky jsou ze stejné skupiny nebo skupin ve všech jednotkách modulu, ii) uvede se do styku každá jednotka modulu, která byla předem kontaktována se vzorkem, s antigenem schopným selektivního vázání k protilátce specifické pro jeden z patogenů, které jsou předmětem zkoumání, přičemž každý antigen poskytuje prostředek schopný přímo nebo nepřímo poskytnout signál stanovitelný detekčně, a iii) stanoví se libovolný výsledný komplex imunoglobu linu a antigenů na tuhé fázi.
12. 12. Způsob podle nároku ll,vyznačující se t i m, že alespoň jedna jednotka obsahuje tuhou fázi, která má imobilizované anti-IgG protilátky, alespoň jedna jednotka obsahuje tuhou fázi, která má imobilizované anti-IgM protilátky a popřípadě alespoň jedna jednotka obsahuje tuhou fázi, která má imobilizované anti-IgA protilátky._ ' ____
13. 13. Způsob podle některého z nároků 11 a 12, vyznačujíčí se tím, že vzorky, které jsou ‘ předmětem zkoumání, jsou alikvoty jediného vzorku.
14. 14. Způsob podle některého z nároků l až 13, vyznačující se tím, že tuhá fáze zahrnuje kuličky, jamky nebo kalisky mikrotitračních ploten, tuhá nebo dutá vlákna, nebo pipety nebo částice, nebo zahrnuje membrány, listy, proužky, filmy nebo povlaky z porézního, vláknitého nebo savého materiálu, popřípadě vpravené do testovacího zařízení.
15. 15. Modul zahrnující dvě nebo větší počet jednotek, k použití při současném, ale odděleném testování rozdílných patogenů, v y z na ču j i. cíše tím, že jednotky obsahují imobilizované protilátky proti imunoglobulinům, a kde alespoň jedna jednotka má imobilizované protilátky zaměřené proti různým skupinám imunoglobulinů'z imobilizovaných imunoglobulinů v jiných jednotkách.
16. 16. Modul podle nároku 15,vyznačující se tím, že zahrnuje jednu jednotku obsahující imobilizovaný anti-IgM a jednu nebo další jednotky obsahující zmobilizovaný IgG.
17. 17. Modul podle nároku 15,vyznačující se tím, že zahrnuje tři jednotky, jedna jednotka má zmobilizovaný anti-IgG, druhá jednotka má zmobilizovaný anti-IgM a třetí jednotka má zmobilizovaný anti-IgA.
18. 18. Tuhá fáze vhodná k použití při imunologickém testu, na které je zmobilizována směs anti-IgG a anti-IgM protilátek.
19. 19. Tuhá fáze podle nároku 18, vyznačující se t i m, že na této fázi je také zmobilizována anti-IgA protilátka.
20. 20. Tuhá fáze podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že zahrnuje kuličky, jamky nebo kalíšky mikrotitračních ploten, tuhá nebo dutá vlákna nebo pipety nebo částice, nebo zahrnuje membrány, listy, proužky, filmy nebo povlaky z porézního, vláknitého nebo savého materiálu, popřípadě vpravené do testovacího zařízení. '
21. 21. Způsob stanovení specifických·protilátek ke dvěma nebo většímu počtu rozdílných antigenů v kapalném testovacím vzorku, vyznačující se tím, že

    i) přivede se do styku vzorek s tuhou fázi, na které jsou zmobilizovány protilátky k jedné nebo většímu počtu skupin imunoglobulinu, kde imunoglobuliny z příslušné skupiny nebo skupin přítomné v každém vzorku jsou zachycovány na tuhé fázi, ii) současně nebo následně uvede do styku tuhá fáze, na které byly zachyceny imunoglobuliny ze vzorku, s dvěma nebo větším počtem rozdílných antigenů, přičemž každý antigen je schopen selektivně se vázat k protilátce specifické pro jeden z patogenů, které jsou předmětem zkoumáni, přičemž každý antigen poskytuje prostředek schopný přímo nebo nepřímo poskytnout signál schopný detekce, a iii) stanoví libovolný výsledný komplex imunoglobulinu a antigenů vzniklý na tuhé fázi.
22. 22. Způsob současného, ale odděleného stanovení protilátek specifických dvěma nebo většímu počtu rozdílných antigenů v kapalném testovacím vzorku, vyznačujíc í s-eť-t-í-m-,-že^;-_H__— . ... 2,· ,. .

    i) přivede se do styku každý vzorek s jednou nebo větším počtem jednotek v jediném modulu, přičemž každá jednotka obsahuje tuhou fázi s zmobilizovanými protilátkami pro jednu nebo větší počet skupin imunoglobulinu, kde imunoglobuliny z příslušné skupiny nebo skupin přítomné v každém vzorku jsou zachycovány na tuhé fázi, přičemž imobilizované protilátky jsou ze stejné skupiny nebo skupin ve všech jednotkách modulu, ii) uvede se do styku každá jednotka*modulu, která byla předem kontaktována se vzorkem, s antigenem schopným ’ selektivního vázání k protilátce specifické pro jeden z patogenů, které jsou předmětem zkoumání, přičemž každý anfe-igen-poskytuje prostředek schopný, přímo, .nebo nepřímo poskytnout signál schopný detekce, a iii) stanoví se libovolný výsledný komplex imunoglobulinu a antigenů na tuhé fázi.
23. 23. Způsob podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že protilátky, které jsou předmětem