CZ302216B6

CZ302216B6 - Process for preparing quercetin-3-beta-D-glucopyranoside under formation of L-rhamnose

Info

Publication number: CZ302216B6
Application number: CZ20090720A
Authority: CZ
Inventors: Kren@Vladimír; Weignerová@Lenka; Marhol@Petr
Original assignee: Mikrobiologický ústav AV CR, v. v. i.
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2010-12-29
Also published as: CZ2009720A3

Abstract

In the present invention, there is disclosed a process for preparing quercetin-3-{beta}-D-glucopyranoside (isoquercitrin) by enzymic digestion of rutin under formation of L-rhamnose as a by-product wherein the preparation process is characterized in that rutin suspension in an aqueous solution with concentration in the range of 11 to 350 g/l is treated with an enzyme being selected from the group consisting of glycosidases comprising {alpha}-L-rhamnosidase and naringinase, at a temperature ranging from 60 to 90 degC and at pH within the range of 8.05 to 10.1. After completion of the reaction, isoquercitrin is separated, optionally purified by recrystallization from strong basic solutions such as sodium hydroxide. After separation of isoquercitrin, the remaining reaction solution containing L-rhamnose can be further used for the preparation of {alpha}-L-rhamnosidase enzyme by submersible culturing of Aspergillus or Penicillium microorganism strain and preferably Aspegillus terreus within a medium requiring L-rhamnose as an inducer. In addition, the remaining reaction solution still containing active glycosidase can be again used, after dilution and pH adjustment, for further rutin conversion to isoquercitrin. The glycosidase used is preferably {alpha}-L-rhamnosidase in both forms as commercially available as well as prepared by submersion.

Description

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká enzymové přípravy quercetin-3-p-D-glukopyranosídu (isoquercitrinu) s velmi nízkým obsahem rutinu i quercetinu z výchozí látky rutinu pomocí glykosidas, získaných z mikroorganismů rodu Aspergillus a Penicillium. Ceněným vedlejším produktem reakce je Lrhamnosa.The invention relates to the enzymatic preparation of quercetin-3-β-D-glucopyranoside (isoquercitrin) with very low levels of both rutin and quercetin starting from rutin by glycosidase, obtained from microorganisms of the genus Aspergillus and Penicillium. An appreciated by-product of the reaction is Lrhamnosa.

Quercetin-3-p-D-glukopyranosid je účinný antioxidant a je využitelný v nutraceutikách a dalších ochranných přípravcích (např. kosmetice, chemoprotektivních látkách a funkčních potravinách).Quercetin-3-β-D-glucopyranoside is a potent antioxidant and is useful in nutraceuticals and other protective products (eg cosmetics, chemoprotective agents and functional foods).

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Flavonoidy, které se hojně vyskytují v rostlinách, jsou obecně považované za účinné antioxidanty a chemoprotektivní látky. Mnoho flavonoidů je v přírodních zdrojích přítomno ve formě glykosi20 dů. Quercetin a jeho glykosidy quercetin-3_fl-D-glukopyranosid (isoquercitrin) a quercetin-3β-D-glukopyranosid (isoquercitrin) a quercetin-3-p-D-rutinosid (rutin) mají širokou škálu pozitivních účinků na lidský organismus. Konkrétně všechny tyto látky vykazují díky přítomnosti aglykonu quercetinu silné antioxidační účinky (Bors et al., Methods Enzymol. 186, 343, 1990). Quercitin se v přírodních zdrojích vyskytuje prakticky výhradně ve formě výše zmíněných i dal25 ších glykosidů. Samotný tento aglykon má také významné negativní účinky, především pozitivní reakci vAmesově testu, která implikuje mutagenitu a případnou karcinogenitu této látky (Manach et al., Nutr. Research 16, 517, 1996). Popsaná mutagenita quercetinu je mj. způsobena inhibici enzymu topoisomerasy Π (Webb & Ebeler, Biochem. J. 384, 527, 2004), schopnou vyvolat chybný přepis DNA a tím i mutace.Flavonoids, which are abundant in plants, are generally considered to be effective antioxidants and chemoprotective agents. Many flavonoids are present in natural sources in the form of glycosides. Quercetin and its glycosides quercetin-3-β-D-glucopyranoside (isoquercitrin) and quercetin-3β-D-glucopyranoside (isoquercitrin) and quercetin-3-β-D-rutinoside (rutin) have a wide range of positive effects on the human body. In particular, all of these compounds exhibit potent antioxidant effects due to the presence of quercetin aglycone (Bors et al., Methods Enzymol. 186, 343, 1990). Quercitin is found in natural sources almost exclusively in the form of the above-mentioned and other glycosides. This aglycone itself also has significant negative effects, in particular a positive reaction in the Ames test, which implicates the mutagenicity and eventual carcinogenicity of the substance (Manach et al., Nutr. Research 16, 517, 1996). The described mutagenicity of quercetin is due, inter alia, to the inhibition of the topoisomerase Π enzyme (Webb & Ebeler, Biochem. J. 384, 527, 2004), which is capable of inducing erroneous transcription of DNA and hence mutations.

Nadto je quercetin velmi málo rozpustný ve vodě. Oproti tomu glykosidy quercetinu nereagují v Amesově testu (tj. nejsou mutagenní). Jsou podstatně lépe rozpustné ve vodě a tedy lépe biologicky dostupné (Webb & Ebeler, viz výše).In addition, quercetin is poorly water soluble. In contrast, the quercetin glycosides do not react in the Ames test (i.e., they are not mutagenic). They are substantially better soluble in water and thus better bioavailable (Webb & Ebeler, supra).

Rutin je běžně připravován extrakcí z přírodních materiálů a rozsáhle využíván v mnoha terapeutických aplikacích, např. při léčbě křehkosti cévních kapilár, cerebrální trombosy, retinitidy a jako systémový chemoprotektant (Pisha & Pezuto, Economic and Medical Plant Research 6, 189, 1994; Yildzole-Ari et. al., Phytotherapy Res. 5, 9, 1991). Quercetin-3-p-D-glukopyranosid (isoquercitrin), hlavní zdroj antioxidantu quercetinu, je typicky přítomný v běžných plodinách západní diety (např. cibuli, jablkách), avšak přímo z přírodních zdrojů se dá získat jen velmi obtížně a v nedostatečné čistotě, takže jej pro výrobu funkčních potravin prakticky nelze využít. Vzhledem k výše uvedeným nežádoucím účinkům quercetinu je cílem získat quercetin-3-(3-Dglykopyranosid s co nejnižším obsahem kontaminujícího volného aglykonu.Rutin is commonly prepared by extraction from natural materials and is widely used in many therapeutic applications, such as in the treatment of vascular capillary fragility, cerebral thrombosis, retinitis, and as a systemic chemoprotectant (Pisha & Pezuto, Economic and Medical Plant Research 6, 189, 1994; Ari et al., Phytotherapy Res. 5, 9, 1991). Quercetin-3-β-D-glucopyranoside (isoquercitrin), the main source of the antioxidant quercetin, is typically present in conventional crops of western diets (eg, onions, apples), but it is difficult to obtain directly from natural sources and inadequate purity, practically cannot be used for the production of functional foods. In view of the above-mentioned side effects of quercetin, the goal is to obtain quercetin-3- (3-D-glycopyranoside) with the lowest possible content of contaminating free aglycone.

Quercetm-3-p-D-glykopyranosid, dále uváděný jako isoquercitrin, lze připravit enzymovým štěpením komerčně dostupného rutinu za použití např. naringinasy, což je směs glykosidas, obsahující hlavně α-L-rhamnosidasu a β-D-glukosidasu. Tento enzym odštěpuje L-rhamnosu za vzniku isoquercitrinu, zároveň však přítomná β-glukosidasa tento produkt dále hydrolyzuje na nežádoucí quercetin; viz Obr. la. β-Glukosidasa je navíc nežádoucí příměsí téměř všech prepa50 rátů samotné α-L-rhawnosidasy. Proto jsou preparáty flavonoidů, připravované k obohacení isoquercitrinem tímto způsobem, kontaminovány podstatným množstvím výchozího rutinu a především nežádoucího quercetinu.Quercetm-3-β-D-glycopyranoside, hereinafter referred to as isoquercitrin, can be prepared by enzymatic cleavage of commercially available rutin using, for example, naringinase, a mixture of glycosidases containing mainly α-L-rhamnosidase and β-D-glucosidase. This enzyme cleaves L-rhamnose to form isoquercitrine, but the present β-glucosidase further hydrolyzes this product to the undesirable quercetin; see FIG. la. In addition, β-glucosidase is an undesirable admixture of almost all prepa50s of α-L-rhawnosidase alone. Therefore, flavonoid preparations prepared for enrichment with isoquercitrine in this manner are contaminated with a substantial amount of the starting rutin and especially the undesirable quercetin.

-1 CZ 302216 B6-1 CZ 302216 B6

Rovněž chemická hydrolýza rutinu na isoquercitrin není použitelná, neboť za odštěpení obou cukerných jednotek vznikne vždy quercetin. (Formica & Regelson, ΛΖ Chem. Toxic. 33, 1061, 1995).Also, the chemical hydrolysis of rutin to isoquercitrin is not applicable, since the cleavage of both sugar units always produces quercetin. (Formica & Regelson, Chem. Toxic. 33, 1061, 1995).

β-Glukosidasu, odpovědnou za hydrolýzu isoquercitrinu na quercetin, lze odstranit purifikací enzymového preparátu, např. proteinovou chromatografií, což je však extrémně náročné na přístrojové zařízení, materiál a práci, a tedy pro průmyslovou produkci zcela nevhodné. Další možností je inhibice β-glukosidasy in silu glukonolaktonem (Chang & Muír, US patent appi. 2006/0099690), případně jinými inhibitory glukosidas, což znamená nejen další materiálové io nároky, ale především tato inhibice není zcela účinná.β-Glucosidase, responsible for the hydrolysis of isoquercitrin to quercetin, can be removed by purification of the enzyme preparation, for example by protein chromatography, which is extremely demanding in terms of instrumentation, material and work, and thus completely unsuitable for industrial production. Another possibility is the inhibition of β-glucosidase in strength by gluconolactone (Chang & Muir, US patent appi. 2006/0099690) or other glucosidase inhibitors, which means not only additional material requirements but above all, this inhibition is not completely effective.

Dalším problémem existujících postupů je velmi nízká rozpustnost rutinu (při pH 5 rozpustnost rutinu cca 5 g/l; při pH 8 rozpustnost rutinu cca 15 g/l), která vede k nutnosti použití buď nízkých koncentrací reaktantů (typicky 5 až 10 g/l), nebo přídavku organických rozpouštědel (např. etha15 nolu) pro zlepšení rozpustnosti (Chang & Muír. viz výše). Nízké koncentrace substrátu limitují objemovou produktivitu procesu a přídavky organických rozpouštědel kromě jiného částečně inhibují použité enzymy a snižují jejich stabilitu. Způsoby, které pracují s rozpuštěným rutinem, mají nejen velmi nízkou objemovou produktivitu ale nadto neumožňují ani vícenásobné použití enzymu, s výjimkou jeho případné imobilizace (která vyžaduje další výrobní náklady a dochází ke snížení celkové aktivity enzymu).Another problem with existing processes is the very low solubility of rutin (at pH 5, the solubility of rutin is about 5 g / l; at pH 8 the solubility of rutin is about 15 g / l), resulting in the need to use either low concentrations of reactants ), or the addition of organic solvents (e.g., ethanol 15) to improve solubility (Chang & Muir, supra). Low substrate concentrations limit the bulk productivity of the process, and the addition of organic solvents, among other things, partially inhibit the enzymes used and reduce their stability. Methods that work with dissolved rutin not only have very low volumetric productivity but also do not allow multiple uses of the enzyme, except for its possible immobilization (which requires additional manufacturing costs and reduces the overall activity of the enzyme).

Existující postup podle přihlášky vynálezu WO 2004/027074 využívá rutin jako substrát pouze v nízké koncentraci, a to 10,9 g v 1 1 reakčního média za podmínek kyselého až slabě alkalického pH (pH 4 až 8) a při teplotě 50 až 55 ^e'C, nebo 27 g v 1 1 reakčního média za podmínek kombi25 nace kyselého pH (tj. nižšího než pH 7) a teploty 80 °C. Výše uvedené kombinace podmínek neumožňují dobré rozpuštění substrátu rutinu, ani nezaručují inaktivaci β-glukosidasy, přítomné ve většině preparátů oc-L-rhamnosidasy (jako nečistota) i naringinasy.Existing process according to patent application WO 2004/027074 uses routines as a substrate only at a low concentration, and 10.9 g in 1 1 of reaction medium under acidic to weakly alkaline pH (pH 4-8) and at a temperature of 50 to 55 ^e 'C or 27 g per liter of reaction medium under conditions of combining an acidic pH (i.e. less than pH 7) and a temperature of 80 ° C. The above combinations of conditions do not allow good dissolution of the rutin substrate, nor do they guarantee the inactivation of β-glucosidase present in most α-L-rhamnosidase (as an impurity) and naringinase preparations.

Samotné enzymy pro konverzi lze získat buď komerčně (např. naringinasu, která je směsí a-L30 rhamnosidasy, β-D-glukosidasy a dalších hydrolytických enzymů, z mikroorganismu Penicillium decumbens}, nebo fermentaci příslušných mikroorganismů. Tyto enzymy se dají použít pouze jednou (při izolaci produkci se zničí), nebo v imobilisované formě, což však vyžaduje úplné rozpuštění rutinu. Úplného rozpuštění rutinu je dosaženo při použití nízké koncentrace substrátu nebo přidáním organických rozpouštědel, která jsou hořlavá, toxická a zvyšují náklady na proces a navíc enzymy denaturují.The enzymes themselves for conversion can be obtained either commercially (e.g., naringinase, which is a mixture of α-L30 rhamnosidase, β-D-glucosidase and other hydrolytic enzymes, from Penicillium decumbens}, or by fermentation of the respective microorganisms. In isolation, production is destroyed), or in immobilized form, but requires complete dissolution of the rutin.Full dissolution of the rutin is achieved by using a low substrate concentration or by adding organic solvents that are flammable, toxic and increase process costs and, in addition, denature the enzymes.

Z výše popsaného je zřejmé, že dosavadními metodami isoquercitrin (quercetin-3-f3-D-glukopyranosid) nelze ekonomicky výhodným způsobem z přírodního materiálu přímo izolovat. Vhodným komerčně dostupným prekursorem je rutin. Chemická hydrolýza rutinu ovšem není vhodná, protože vznikne výhradně quercetin, který má nevhodné, až zdraví škodlivé účinky. Selektivním enzymovým Štěpením se sice získá isoquercitrin, ale dostupné enzymové preparáty (zejména narínginasa) obsahují i kontaminující β-glukosidasy, katalyzující štěpení produktu opět na nežádoucí quercetin.It is apparent from the above that isoquercitrin (quercetin-3-β-D-glucopyranoside) cannot be isolated directly from the natural material in an economically advantageous manner. A suitable commercially available precursor is routine. However, chemical hydrolysis of rutin is unsuitable, since quercetin is produced solely, which has inappropriate or even harmful effects. While isoquercitrin is obtained by selective enzymatic cleavage, the available enzyme preparations (especially narininase) also contain contaminating β-glucosidases, catalysing the cleavage of the product again to undesirable quercetin.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Uvedené nevýhody dosavadních metod odstraňuje způsob podle předkládaného vynálezu. Rutin se v koncentraci 11 až 350 g/I rozmíchá na roztok či suspenzi ve vodném prostředí (pufrované kultivačním médiem pro submerzní fermentaci), které obsahuje vhodný enzym a jeho hodnota pH je vyšší než 8,05. Enzymová reakce pak probíhá při teplotě nad 60 °C, přičemž se odštěpí Lrhamnosa za vzniku čistého quercetin-3-(3-D-glukopyranosidu, isoquercitrinu (obr. lb). Ten se k ukončení reakce oddělí a supematant, obsahující stále aktivní enzym, se po naředění vodou a úpravě pH na hodnotu 8,05 a vyšší pomocí roztoku hydroxidu, s výhodou hydroxidu draselného,These disadvantages of the prior art are overcome by the method of the present invention. The routine is mixed at a concentration of 11 to 350 g / L into a solution or suspension in an aqueous medium (buffered by culture medium for submerged fermentation) containing a suitable enzyme and having a pH of greater than 8.05. The enzyme reaction then proceeds above 60 ° C, cleaving Lrhamnosa to form pure quercetin-3- (3-D-glucopyranoside, isoquercitrin (Fig. 1b)), which is separated to terminate the reaction and the supernatant containing the still active enzyme, after diluting with water and adjusting the pH to 8.05 or higher with a solution of hydroxide, preferably potassium hydroxide,

-2CZ 302216 B6 případně použije pro další konverzi. Vhodným enzymem je a-L-rhamnosidasa, připravená submersní kultivací mikroorganismu běžně dostupného rodu Aspergillus nebo Penicillium, s výhodou druhu Aspergillus terreus, v médiu obsahujícím L-rhamnosu jako induktor. L-Rhamnosu je možno od média dodat buď jako komerčně dostupnou chemikálii, nebo lépe přímo ve formě odpadního roztoku z výroby ísoquercitrinu, který L-rhamnosu obsahuje.-2GB 302216 B6 may be used for the next conversion. A suitable enzyme is α-L-rhamnosidase, prepared by submersive culture of a microorganism of commercially available Aspergillus or Penicillium, preferably Aspergillus terreus, in a medium containing L-rhamnos as an inducer. L-Rhamnos can be supplied from the medium either as a commercially available chemical or, more preferably, directly in the form of a waste solution from the production of isoquercitrine containing L-rhamnos.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy způsob výroby quercetin-3-3-D-glukopyranosidu za vzniku L-rhamnosy, jehož podstata spočívá v tom, že na rutin v koncentraci 11 až 350 g/l ve vodném prostředí se při pH v rozmezí od 8,05 do 10,1 a při teplotě od 60 do 90 °C působí enzymem zvoto leným ze skupiny glykosidas, sestávající z α-L-rhamnosidasy a naringinasy, produkt quercetin3-β-D-glukopyranosíd se z reakční směsi oddělí centrifugací, filtrací nebo dekantací a případně se přečistí rekrystalizací.Accordingly, the present invention provides a process for the production of quercetin-3-3-D-glucopyranoside to form L-rhamnose, comprising: rutin at a concentration of 11 to 350 g / l in an aqueous medium at a pH in the range of 8, 05 to 10.1 and at a temperature of 60 to 90 ° C, acting on an enzyme selected from the group of glycosidases, consisting of α-L-rhamnosidase and naringinase, quercetin3-β-D-glucopyranoside is separated from the reaction mixture by centrifugation, filtration or decantation and optionally purified by recrystallization.

Význakem předkládaného způsobu výroby je rovněž skutečnost, že zbylý reakční roztok po 15 odstranění quercetin-3-[3-D—glukopyranosidu se použije při opakovanou výrobu quercetin-3-βD-glukopyranosidu a/nebo pro submersní fermentační přípravu používaného enzymu.It is also a feature of the present process that the remaining reaction solution after 15 removal of quercetin-3- [3-D-glucopyranoside is used in the repeated production of quercetin-3-βD-glucopyranoside and / or for submersional fermentation preparation of the enzyme used.

Význakem předkládaného způsobu výroby je dále skutečnost, že získaný quercetin-3-p-D-glukopyranosid se přečistí rekrystalizací z roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 50 ažA further feature of the present process is that the quercetin-3-β-D-glucopyranoside obtained is purified by recrystallization from a sodium hydroxide solution of 50-50

500 mmol.r¹ a za teploty v rozmezí od 20 do 100 °C.500 mmol.r ^-1 and at a temperature ranging from 20 to 100 ° C.

Význakem podle předmětného způsobu výroby je také skutečnost, že se použije a-L-rhamnosidasa.A feature of the present process is also that α-L-rhamnosidase is used.

Význakem podle předmětného způsobu výroby je dále skutečnost, že se použije a-L-rhamnosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus nebo Penicillium.A further feature of the present process is that α-L-rhamnosidase from a microorganism of the genus Aspergillus or Penicillium is used.

Význakem podle předkládaného vynálezu je ί skutečnost, že se použije a-L-rhamnosidasa z mikroorganismu rodu Aspergillus, připravená submerzní kultivací tohoto mikroorganismu v kapalném médiu s obsahem rhamnosy jako induktoru v koncentraci od 0,5 do 15 g/ml.A feature of the present invention is the use of α-L-rhamnosidase from a microorganism of the genus Aspergillus, prepared by submerged cultivation of the microorganism in a liquid medium containing rhamnose as an inducer at a concentration of 0.5 to 15 g / ml.

Význakem předkládaného způsobu výroby je také skutečnost, že se použije a-L-rhamnosidasa obsažená ve filtrátu ze submerzní kultivace mikroorganismu rodu Aspergillus, po úpravě pH tohoto filtrátu alkalickým činidlem na hodnotu od 8,05 do 10,1.A feature of the present production method is also the fact that α-L-rhamnosidase contained in the filtrate from the submerged culture of Aspergillus is used, after adjusting the pH of the filtrate with an alkaline reagent to a value of from 8.05 to 10.1.

Význakem předkládaného způsobu výroby je i skutečnost, že rhamnosa se jako induktor do kapalného média přidá ve formě reakčního roztoku zbylého po odstranění quercetin-3—β-Dglukopyranosidu.A feature of the present process is that rhamnose is added as an inducer to the liquid medium in the form of a reaction solution left after removal of quercetin-3-β-D-glucopyranoside.

Význakem předkládaného způsobu výroby je rovněž skutečnost, že se použije a-L-rhamnosidasa z mikroorganismu Aspergillus terreus.A feature of the present process is also that α-L-rhamnosidase from Aspergillus terreus is used.

Předkládaný vynález nárokuje enzymatický způsob výroby za použití zcela neobvyklých reakčních podmínek. Překvapivě bylo zjištěno, že použití kombinace alkalického pH vyššího než pH 8 a zvýšení teploty na 60 až 90 °C vyvolává u použité glykosidasy inaktivaci pouze její β-glukosidasové složky. Každá z uvedených podmínek (tj. pH 8 a vyšší a teplota 60 až 90 °C) je zcela neíyziologická a proto při práci s enzymy běžně nepoužívaná (viz např. WO 2004/027074); jejich kombinace je pak ještě neobvyklejší. Zcela zásadním poznatkem je tedy skutečnost, že ačkoliv při této kombinaci podmínek dochází k selektivní inhibici a dokonce k následné destrukci nežá50 doučí β-glukosidasy, aktivita α-L-rhamnosidasy je nečekaně pouze snížena.The present invention claims an enzymatic process using completely unusual reaction conditions. Surprisingly, it has been found that using a combination of an alkaline pH higher than pH 8 and raising the temperature to 60-90 ° C induces only the β-glucosidase component of the glycosidase used. Each of the above conditions (i.e., pH 8 and above and temperature 60-90 ° C) is completely non-physiological and therefore not commonly used when working with enzymes (see, eg, WO 2004/027074); their combination is then even more unusual. Thus, a fundamental finding is that although this combination of conditions results in selective inhibition and even subsequent destruction of β-glucosidase, then α-L-rhamnosidase activity is unexpectedly only reduced.

Nečekané bylo též zjištění, že za podmínek, při nichž je většina substrátu i produktu reakce přítomna v pevné fázi (suspenze), enzymová reakce probíhá za průběžného rozpouštění substrátu a precipitace produktu. Jde tedy o nový přístup, kdy se na imobilizovaný substrát (přítomnýIt was also unexpected to find that under conditions in which most of the substrate and reaction product are present in the solid phase (suspension), the enzyme reaction proceeds with continuous dissolution of the substrate and precipitation of the product. It is therefore a new approach, where the immobilized substrate (present

-3 CZ 302216 B6 v reakční směsi převážně jako pevná fáze) působí enzymem v roztoku. Takové uspořádání umožňuje použití vysokých koncentrací substrátu, které jsou o řád a více vyšší než koncentrace v dosud popsaných postupech (pro srovnání viz WO 2004/027074), čímž se objemová produktivita procesu řádově zvyšuje. Tento neobvyklý, ale velmi účinný koncept také umožňuje snadné oddělení velmi čistého produktu od použitého enzymu prostou filtrací a použitý enzym obsažený v (odpadním) roztoku lze navíc, po jednoduché úpravě reakčních podmínek, výhodně opět použít k další reakci.In the reaction mixture (mainly as a solid phase) acts by the enzyme in solution. Such an arrangement allows the use of high substrate concentrations which are of an order of magnitude or more than those of the processes described so far (for comparison, see WO 2004/027074), thereby increasing the bulk productivity of the process by an order of magnitude. This unusual but very effective concept also allows easy separation of the very pure product from the enzyme used by simple filtration, and the enzyme used in the (waste) solution can, in addition, after simple modification of the reaction conditions, be advantageously reused for the next reaction.

Podstatnou výhodou nárokovaného způsobu je tedy skutečnost, že enzymové štěpení rutinu lze io provádět i v heterogenním systému, kdy se výchozí rutin a též produkovaný isoquercitrin nacházejí v suspenzi a vlastní reakce pak probíhá v nasyceném roztoku nebo na mezifázovém prostředí za vzniku ekvimolámího množství L-rhamnosy. Zvýšená rozpustnost substrátu způsobená vyšší teplotou a vyšším pH zvyšuje nepřímo i rychlost reakce, neboť se zvýší termodynamická koncentrace substrátu; celková koncentrace substrátu v reakční směsi je ovšem součtem rozpuštěné a ts suspendované látky.Thus, the essential advantage of the claimed process is that the enzymatic cleavage of rutin can also be carried out in a heterogeneous system where the starting routine as well as the produced isoquercitrin are suspended and the reaction then proceeds in a saturated solution or interfacial medium to produce equimolar amounts of L-rhamnose. . Increased substrate solubility due to higher temperature and higher pH also indirectly increases reaction rate by increasing thermodynamic concentration of substrate; however, the total substrate concentration in the reaction mixture is the sum of the dissolved and ts suspended matter.

Rozpustnost rutinu i isoquercitrinu je zvýšena tím, že se reakce provádí při pH převyšujícím hodnotu 8,05, neboť alkalické pH silně zvyšuje rozpustnost polyfenolů bez nutnosti přídavku organických kosolventů. Dále se rozpustnost a též reakční rychlost podstatně zvýší tím, že se reakce provádí za zvýšené teploty, s výhodou při 70 °C. Při těchto podmínkách, především při vyšším pH, je aktivita β-glukosidasy prakticky nulová; její pH optimum se pohybuje kolem hodnoty 4,5 (viz obr. 2a). Naopak α-L-rhamnosidasa, a to jak získaná z komerčních preparátů, tak i připravená způsobem zde popsaným, je při pH 8 a vyšším dostatečně aktivní, i když tato aktivita je nižší než při hodnotě pH optima, které se přibližně rovná pH 5 (viz obr. 2b). β-Glukosidasa je při alkalickém pH a vyšší teplotě nestabilní a rychle se rozkládá, zatímco α-L-rhamnosidasa, která je velmi stabilní, si uchovává i za těchto podmínek aktivitu desítky hodin. Proto při výše popsaných podmínkách reakce prakticky vůbec nedochází k nežádoucímu následnému štěpení isoquercitrinu na quercetin a získaný produkt pak vykazuje vysokou čistotu. Nadto není třeba použité enzymy čistit, ani přidávat inhibitory β-glukosidasy, neboť tato se při přípravě isoquercitrinu podle popsaného způsobu inaktivuje.The solubility of both rutin and isoquercitrine is increased by carrying out the reaction at a pH above 8.05, as the alkaline pH strongly increases the solubility of the polyphenols without the need for the addition of organic cosolvents. Furthermore, the solubility and also the reaction rate are substantially increased by carrying out the reaction at an elevated temperature, preferably at 70 ° C. Under these conditions, especially at higher pH, β-glucosidase activity is virtually nil; its pH optimum is around 4.5 (see Figure 2a). In contrast, α-L-rhamnosidase, both obtained from commercial preparations and prepared as described herein, is sufficiently active at pH 8 and above, although this activity is lower than at an optimum pH approximately equal to pH 5 ( see Fig. 2b). β-Glucosidase is unstable and rapidly degrades at alkaline pH and higher temperature, while α-L-rhamnosidase, which is very stable, retains activity for tens of hours even under these conditions. Accordingly, under the reaction conditions described above, virtually no undesirable subsequent cleavage of isoquercitrine to quercetin occurs and the product obtained exhibits high purity. Furthermore, it is not necessary to purify the enzymes used, nor to add β-glucosidase inhibitors, since this is inactivated in the preparation of isoquercitrin according to the method described.

Další významnou výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je jednoduchá izolace produktu, který se z reakční směsi oddělí pouze odstředěním, filtrací nebo dekantací, promyje se vodou a usuší. Filtrát po reakci obsahuje odštěpenou L-rhamnosu, kterou je možno izolovat, nebo se filtrát po příslušných úpravách (pH, naředění, přídavek živných solí) může použít přímo jako médium pro fermentaci mikroorganismu. S výhodou jde o mikroorganismus Aspergillus terreus, který byl rozsáhlým screeningem vybrán jako nejvhodnější, neboť poskytuje nejvyšší poměr produkované α-L-rhamnosidasy vůči β-D-glukosidase (Monti et al., Biotechnol. Bioeng. 87, 763, 2004). Stopy polyfenolů v roztoku (ve filtrátu) při fermentaci nevadí, mikroorganismus je schopen je rozložit a využít. Tím se celá technologie velmi výhodně stává prakticky bezodpadovou a ušetří se náklady za L-rhamnosu, kteráje nejdražší složkou média pro fermentaci.Another important advantage of the process of the present invention is the simple isolation of the product which is separated from the reaction mixture only by centrifugation, filtration or decantation, washed with water and dried. The filtrate after reaction contains the cleaved L-rhamnose which can be isolated, or the filtrate, after appropriate adjustments (pH, dilution, addition of nutrient salts), can be used directly as a medium for fermentation of the microorganism. Preferably, it is the microorganism Aspergillus terreus, which has been selected by large screening as the most appropriate because it provides the highest ratio of α-L-rhamnosidase produced to β-D-glucosidase (Monti et al., Biotechnol. Bioeng. 87, 763, 2004). Traces of polyphenols in solution (in the filtrate) do not matter during fermentation, the microorganism is able to decompose and utilize them. This makes the whole technology very advantageously virtually waste-free and saves on the cost of L-rhamnos, which is the most expensive component of the fermentation medium.

Filtrát z enzymové reakce rovněž obsahuje stále aktivní α,-L-rhamnosidasu, takže ho lze po naředění a úpravě pH znovu použít jako enzymovou složku k opakované konverzi rutinu na isoquercitrin. Tento postup je možné opakovat, přičemž vyprodukovaná L-rhamnosa se z procesu odvětví ředěním filtrátu a využije se k fermentační produkci a-L-rhamnosidasy.The enzyme reaction filtrate also contains still active α, -L-rhamnosidase, so that after dilution and pH adjustment, it can be reused as an enzyme component to repeatedly convert rutin to isoquercitrin. This process can be repeated, whereby the produced L-rhamnose is removed from the industry by dilution of the filtrate and used for the fermentation production of α-L-rhamnosidase.

Příprava vysoce čistého isoquercitrinu se provede rekrystalizaci hrubého produktu po enzymové konverzi, který obsahuje typicky přes 95 hmotnostních % isoquercitrinu, malou část (přibližně 2 % hmotnostní) nezreagovaného rutinu, stopy quercetinu a další (neidentifikované) nečistoty.The preparation of high purity isoquercitrin is accomplished by recrystallization of the crude product after enzyme conversion, which typically contains over 95% by weight of isoquercitrin, a small portion (about 2% by weight) of unreacted rutin, traces of quercetin, and other (unidentified) impurities.

Rekry stal izace se provede tak, že se surový isoquercitrin rozpustí za varu v roztoku NaOH o koncentraci 0,1 až I mol.l¹, pH se za tepla upraví na hodnotu pH 9 až 10 a za chladnutí probíhá krystalizace. Výsledný produkt, který má obsah přes 99 % hmotnostních isoquercitrinu, se pro-4CZ 302216 B6 myje zředěnou kyselinou sírovou v koncentraci 0,05 mol.l ¹ a poté trojnásobně vodou. Rekrystalizace se může opakovat, Čímž se čistota produktu dále zvyšuje.Recrystallization is carried out by dissolving the crude isoquercitrin at boiling in a 0.1 to ¹ mol / l NaOH solution, adjusting the pH to 9-10 with heat, and crystallizing while cooling. The resulting product, having a content of over 99% by weight of isoquercitrine, is washed with dilute sulfuric acid at a concentration of 0.05 mol / ^l and then three times with water. The recrystallization can be repeated, further increasing the purity of the product.

Jako enzym pro štěpení rutinu je možné použít komerčně dostupný preparáty obsahujících a-L5 rhamnosidasu, např. naringinasu. Ekonomicky a technicky výhodnější je však příprava a-Lrhamnosidasy submersní fermentací běžně dostupných mikroorganismů rodu Aspergillus neboAs an enzyme for cleavage of rutin, commercially available preparations containing α-L5 rhamnosidase, eg naringinase, can be used. However, the preparation of α-Lrhamnosidase by submersal fermentation of commonly available Aspergillus microorganisms or

Penicillium. Nejvhodnějším producentem tohoto enzymu je druh A. terretis, což bylo zjištěno rozsáhlým testováním a screeningem mnoha druhů mikroorganismů rodů Aspergillus nebo Penicillium vzhledem k extracelulámí produkci α-L-rhamnosidasy a β-D-glukosidasy (D. Monti et. io al., viz výše). Fermentace se provádí sterilně za aerobních podmínek, za míchání a při teplotě nejlépe 28 °C v třepaných baňkách nebo v míchaném fermentoru. Podstatné je přidání L-rhamnosy do média, kde v nižších koncentracích působí jako induktor produkce enzymu (Obr. 5).Penicillium. The most suitable producer of this enzyme is A. terretis, which has been found by extensive testing and screening of many species of Aspergillus or Penicillium species for the extracellular production of α-L-rhamnosidase and β-D-glucosidase (D. Monti et al., Cf. above). The fermentation is carried out sterile under aerobic conditions, with stirring and preferably at a temperature of 28 ° C in shake flasks or in a stirred fermenter. It is essential to add L-rhamnose to the medium, where it acts as an inducer of enzyme production at lower concentrations (Fig. 5).

Optimální koncentrace přídavku L-rhamnosy v médiu Činí 15 g/1. Tato koncentrace zvyšuje produkci enzymu více než 10 x oproti médiu bez induktoru. L-Rhamnosa se do média dodá bud’ jako komerčně získaný produkt, nebo se přidá ve formě použitého média po štěpení rutinu.The optimum concentration of L-rhamnose addition in the medium is 15 g / l. This concentration increases the production of the enzyme more than 10-fold over the medium without inducer. L-Rhamnosa is added to the medium either as a commercially obtained product or added as a medium used after cleavage of the routine.

Po fermentací, která trvá typicky 4 až 7 dní, se mycelium mikroorganismu odstraní odstředěním nebo filtrací. Zbylé médium s obsahem α-L-rhamnosidasy se po úpravě pH na hodnotu nejméně 8,05 a ohřátí na reakční teplotu v rozmezí od 60 do 90 °C a s výhodou 70 °C použije přímo pro reakci, tj. rozmíchá se v něm rutin a reakce se za konstantních podmínek a za míchání nechá proběhnout do požadované konverze.After fermentation, which typically lasts 4 to 7 days, the mycelium of the microorganism is removed by centrifugation or filtration. The remaining α-L-rhamnosidase-containing medium, after adjusting the pH to at least 8.05 and warming to a reaction temperature in the range of 60 to 90 ° C and preferably 70 ° C, is used directly for the reaction, i.e. the routine is mixed therein and the reaction is allowed to proceed to the desired conversion under constant conditions and with stirring.

Nejvýhodnější používaná kultura mikroorganismu Aspergillus terreus byla uložena pod číslemThe most preferred culture of Aspergillus terreus was deposited under number

3059 dne 25. 4. 2008 v České sbírce mikroorganismů (Masarykova universita, Přírodovědecká 25 fakulta, Tvrdého 14, 602 00 Brno).3059 on 25 April 2008 in the Czech Collection of Microorganisms (Masaryk University, Faculty of Science, Tvrdého 14, 602 00 Brno).

Přehled obrázků na výkresechOverview of the drawings

Obr. la: Schéma enzymového štěpení rutinu a chemického štěpení rutinu na quercetin.Giant. 1a: Scheme of enzymatic cleavage of rutin and chemical cleavage of rutin into quercetin.

Obr. lb: Schéma štěpeni rutinu působením specifické glykosidasy.Giant. 1b: Scheme of cleavage of rutin by specific glycosidase.

Obr. 2a: Graf závislosti aktivity β-D-glukosidasy z A. terreus na hodnotě pH, měřené při teplotě 35 °C v citrát v citrát-fosfátovém (-♦-) a borátovém (-—) pufru. Na ose x jsou vyneseny hodnoty pH, na ose y aktivita enzymu v procentech vzhledem kjeho aktivitě v pH optimu při teplotě 35 °C.Giant. Figure 2a: Graph of pH dependence of A. terreus β-D-glucosidase activity measured at 35 ° C in citrate in citrate-phosphate (- ♦ -) and borate (-—) buffer. On the x-axis, the pH values are plotted, on the y-axis, the activity of the enzyme in percent relative to its activity at the pH optimum at 35 ° C.

Obr. 2b: Graf závislosti aktivity α-L-rhamnosidasy z A. terreus na hodnotě pH, měřené při teplotě 35 °C v citrát-fosfátovém (-♦-) a borátovém (--) pufru. Na ose x jsou vyneseny hodnoty pH, na ose y aktivita enzymu v procentech vzhledem kjeho aktivitě v pH optimu při teplotě 35 °C.Giant. 2b: Plot of A. terreus α-L-rhamnosidase activity versus pH measured at 35 ° C in citrate-phosphate (- ♦ -) and borate (-) buffer. On the x-axis, the pH values are plotted, on the y-axis, the activity of the enzyme in percent relative to its activity at the pH optimum at 35 ° C.

Obr. 2c: Poměr aktivit α-L-rhamnosidasy a β-D-glukosidasy z A. terreus v závislosti na hodnotě pH, měřeno při teplotě 35 °C v citrát-fosfátovém (-♦-) a borátovém (--) pufru. Na ose x jsou vyneseny hodnoty pH, na ose y poměr aktivit obou enzymu při teplotě 35 °C.Giant. 2c: pH-dependent ratio of α-L-rhamnosidase and β-D-glucosidase from A. terreus, measured at 35 ° C in citrate-phosphate (- ♦ -) and borate (-) buffer. The x-axis shows the pH values, the y-axis the activity ratio of both enzymes at 35 ° C.

Obr. 3: Graf závislosti a-L-rhamnosidasy (-♦-) a β-D-glukosidasy (--) na teplotě reakční směsi. Na ose x je vynesena teplota ve °C, na ose y aktivita enzymů v procentech vzhledem k jejich aktivitě v teplotním optimu při pH 7.Giant. 3: Graph of α-L-rhamnosidase (- ♦ -) and β-D-glucosidase (-) dependence on reaction mixture temperature. The x-axis shows the temperature in ° C, the y-axis the activity of the enzymes in percent relative to their activity in the temperature optimum at pH 7.

Obr. 4: Příklad průběhu enzymové konverze rutinu na isoquercitrin za použití enzymu a-Lrhamnosidasy z Aspergillus terreus, a výchozí koncentrace rutinu 150 g/1, při teplotě 80 °C a pH 8.L; -♦- (RUT) = rutin, (IQ) = isoquercitrin, - A- (Q) = quercetin. Na so ose x je vynesena reakční doba jako čas v minutách a na ose y konverze rutinu, v procentech vzhledem k výchozí koncentraci rutinu v reakční směsi.Giant. 4: Example of the course of the enzymatic conversion of rutin to isoquercitrin using α-Lrhamnosidase enzyme from Aspergillus terreus, and a starting rutin concentration of 150 g / l, at 80 ° C and pH 8.L; - ♦ - (RUT) = rutin, (IQ) = isoquercitrin, - A- (Q) = quercetin. On the x-axis, the reaction time is plotted as time in minutes, and on the y-axis, the conversion of rutin, as a percentage of the starting rutin concentration in the reaction mixture.

-5CZ 302216 B6-5GB 302216 B6

Obr. 5: Závislost aktivity α-L-rhamnosidasy na koncentrací L-rhamnosy v médiu jako induktoru při fermentační produkci tohoto enzymu. Použité výchozí koncentrace Lrhamnosy v médiu byly 0 g/1 (-), 5 g/1 (-♦-), 10 g/1 (--), 15 g/1 (-A-), 25 g/1 (-x-), 35 g/1 (-*-), 50 g/1, (-·-), 70 g/I (-+-). Na ose x je vynesena doba kultivace ve dnech, na ose y aktivita α-L-rhamnosidasy v nkat.Giant. 5: Dependence of α-L-rhamnosidase activity on L-rhamnose concentration in medium as inducer in fermentative production of this enzyme. The initial concentrations of Lrhamnos used in the medium were 0 g / l (-), 5 g / l (- ♦ -), 10 g / l (-), 15 g / l (-A-), 25 g / l (- x -), 35 g / l (- * -), 50 g / l, (- · -), 70 g / l (- + -). The x-axis shows the cultivation time in days, the y-axis shows the activity of α-L-rhamnosidase in nkat.

Obr. 6: HPLC chromatogram dokládající průběh enzymového štěpení rutinu. Kolona Monolithic column Chromolite Speed ROD, RP-18e, 50x4,6mm (Merck) + předkolona stejného typu; mobilní fáze: A - 80% acetonitril 0,1% kyselina trifluoroctová (TFA); B5% acetonitril, 0,1% TFA, v H₂O (objem/objem); gradientová eluce 0 až 3 min 20 až 65 % A, 3 až 4,5 min 65 % A, 4,5 až 5 min 65-20 % A; průtok 1 ml/min; teplota místnosti a detekce při 360 nm.Giant. 6: HPLC chromatogram illustrating the course of enzyme cleavage of rutin. Monolithic Chromolite Speed ROD column, RP-18e, 50x4.6mm (Merck) + same type pre-column; mobile phase: A - 80% acetonitrile 0.1% trifluoroacetic acid (TFA); B5% acetonitrile, 0.1% TFA, in H ₂ O (v / v); gradient elution 0 to 3 min 20 to 65% A, 3 to 4.5 min 65% A, 4.5 to 5 min 65-20% A; flow rate 1 ml / min; room temperature and detection at 360 nm.

- rutin, 2 - isoquercitrin, 3 - neidentifikovaná nečistota, 4 - quercetin. Na ose x je vynesena odezva UV detektoru v mV, na ose y čas v minutách.rutin, 2 - isoquercitrin, 3 - unidentified impurity, 4 - quercetin. The x-axis shows the UV detector response in mV, the y-axis the time in minutes.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

1340 g rutinu bylo za míchání vneseno do předehřátého média (8,94 1; pH 8,10; 70 °C, složení odpovídalo kultivačnímu médiu viz př. 5), obsahujícího α-L-rhamnosidasu získanou submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus terreus podle příkladu 5 a reakční směs byla dále míchána 24 h. Průběh reakce (Obr. 4) byl sledován metodou HPLC, prováděnou za následujících podmínek: byla použita kolona Monolithic column Chromolith Speed ROD, RP-18e, 50 x 4,6mm (Merck, DE) a předkolona stejného typu. Mobilní fázi A představoval 80% acetonitril a 0,1% trifluoroctová kyselina, mobilní fázi B 5% acetonitril a 0,1% trifluoroctová kyselina; všechny údaje jsou objemová procenta v H₂O. Gradientová eluce vykazovala následující průběh: 0 až 3 minuty 20 až 65 % A, 3 až 4,5 minuty 65 % A, 4,5 až 5 min 65 až 20 % A; průtok 1 ml/min; teplota místnosti; UV detekce: 360 nm (viz Obr. 6). Reakce byla ukončena oddělením pevné a kapalné fáze filtrací. Filtrační koláč byl promyt vodou (3 x 101 vody, 40 °C) k odstranění volné L-rhamnosy a dalších nečistot. Poslední promývání bylo provedeno vodou o teplotě 90 až 100 °C pro dokonalé odstraněni nečistot a sterilizaci produktu. Filtrační koláč byl poté resuspendován v destilované vodě (20 1) a vysušen ve sprašové sušárně za následujících podmínek: vstupní teplota 230 °C, výstupní teplota 85 °C.1340 g of rutin were introduced with stirring into a preheated medium (8.94 L; pH 8.10; 70 ° C, composition corresponding to culture medium see Example 5) containing α-L-rhamnosidase obtained by submerged fermentation of Aspergillus terreus according to Example 5 and the reaction mixture was further stirred for 24 h. The progress of the reaction (Fig. 4) was monitored by HPLC, under the following conditions: Monolithic column Chromolith Speed ROD, RP-18e, 50 x 4.6mm (Merck, DE) was used and precolumn of the same type. Mobile phase A consisted of 80% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid, mobile phase B 5% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid; all data are volume percentages in H ₂ O. Gradient elution showed the following: 0 to 3 minutes 20 to 65% A, 3 to 4.5 minutes 65% A, 4.5 to 5 min 65 to 20% A; flow rate 1 ml / min; room temperature; UV detection: 360 nm (see Fig. 6). The reaction was quenched by separating the solid and liquid phases by filtration. The filter cake was washed with water (3 x 101 water, 40 ° C) to remove free L-rhamnose and other impurities. The last wash was performed with water at 90-100 ° C to completely remove impurities and sterilize the product. The filter cake was then resuspended in distilled water (20 L) and dried in a spray dryer under the following conditions: inlet temperature 230 ° C, outlet temperature 85 ° C.

Získaný jemný žlutý prášek (938 g) obsahovat 97,5 % isoquercitrinu; 0,7 % rutinu; 0,2 % quercetinu a 1,6% neidentifikovaných nečistot (všechny údaje jsou v hmotnostních procentech). Konverze rutinu při zachování reakčních podmínek (teplota, pH, koncentrace rutinu a objemová aktivita enzymu) nezávisí na objemu reakce (testovány byly objemy 0,5 až 10 1 a počáteční koncentrace rutinu 11 až 500 g/1, výsledky nejsou uvedeny). Při použití vyšší koncentrace, převyšující 150 g/1 výchozího rutinu, bylo třeba pro dosažení odpovídající, tj. minimálně 95% konverze, sledované analytickým HPLC jak uvedeno výše, prodloužit reakční dobu na 48 až 60 hodin. Molekulární struktura isoquercitrinu byla potvrzena pomocí NMR 'H a ¹³C (v CD3OD) (data viz Tabulka 1: srovnání NMR údajů /300,07 MHz pro ^]H, 74,45 MHz pro ^l3C, CD3OD, 24 °C/ pro isoquercitrin získaný podle postupu s údaji publikovanými v literatuře) a pomocí hmotové spektrometrie MALDI MS (data m/z: [M+H]' C₂iH_2IOi₂: teoretická hodnota 465,1 a naměření hodnota 465,4; [M+Na] ‘ C₂₁H₂₀Oi₂Na: teoretická hodnota 487,1 a naměřená hodnota 487,3; [M+K] ’ C₂₁H₂oO_]2K: teoretická hodnota 503,2 a naměřená hodnota 503,3). Čistota produktu byla určena pomocí HPLC výše uvedenou metodou (viz Obr. 6).The obtained fine yellow powder (938 g) contained 97.5% isoquercitrin; 0.7% rutin; 0.2% quercetin and 1.6% unidentified impurities (all percentages by weight). Conversion of rutin while maintaining reaction conditions (temperature, pH, rutin concentration and enzyme activity activity) does not depend on the reaction volume (volumes of 0.5 to 10 L and initial rutin concentrations of 11 to 500 g / L were tested, results not shown). At a higher concentration exceeding 150 g / l of the starting routine, it was necessary to extend the reaction time to 48 to 60 hours to achieve a corresponding, i.e. at least 95%, conversion by analytical HPLC as described above. The molecular structure of isoquercitrin was confirmed by 1 H and ¹³ C NMR (in CD 3 OD) (data see Table 1: NMR data comparison / 300.07 MHz for ¹ H, 74.45 MHz for ¹³ C, CD 3 OD, 24 ° C) for isoquercitrin obtained according to the process with the published literature) and by means of MALDI MS (data m / z: [m + H] + C ₂ H _{2 I} ₂ Oi: theoretical value and measured value 465.1 465.4 [m + Na ] 'C ₂₁ H ₂₀ Na ₂ Oi: theoretical value and measured value 487.1 487.3 [M + K] + C ₂₁ H oO _{_2]} K _2: theoretical value and measured value 503.2 503.3). The purity of the product was determined by HPLC as described above (see Fig. 6).

-6CZ 302216 B6-6GB 302216 B6

Příklad 2Example 2

Použité reakční médium (2 1) po konverzi rutinu a oddělení ísoquercitrinu dle příkladu 1 bylo zředěno přídavkem 1 1 vody (ke snížení koncentrace L-rhamnosy přibližně o 30 %, neboť tato ve vyšších koncentracích zpětnovazebně inhibuje α-L-rhamnosidasu), a znovu použito pro konverzi rutinu (210 g), reakční podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Vzhledem ktomu, že objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v reakčním médiu byla nižší v důsledku naředění reakčního média, bylo nutno prodloužit reakční dobu na 55 hodin. Po ukončení a zpracování produktu (viz to příklad 1) bylo získáno 165 g žlutého prášku, který obsahoval 85,3 % Ísoquercitrinu; 12,9 % rutinu; 0,3 % quercetinu a 1,5% neidentifikovaných nečistot (všechny údaje jsou v hmotnostních procentech), jak bylo určeno pomocí HPLC podle příkladu 1.The reaction medium used (2 L) after rutin conversion and isoquercitrin separation according to Example 1 was diluted by adding 1 L of water (to reduce L-rhamnose concentration by approximately 30% as this inhibits α-L-rhamnosidase at higher concentrations), and again used for the conversion of rutin (210 g), the reaction conditions were the same as in Example 1. Since the volume activity of α-L-rhamnosidase in the reaction medium was lower due to dilution of the reaction medium, the reaction time had to be extended to 55 hours. After completion and work-up of the product (see Example 1), 165 g of a yellow powder were obtained which contained 85.3% isoquercitrin; 12.9% rutin; 0.3% quercetin and 1.5% unidentified impurities (all percentages by weight) as determined by HPLC according to Example 1.

is Příklad 3is Example 3

Isoquercitrin o čistotě vyšší než 99 hmotnostních % byl získán opakovanou krystalizací produktu získaného dle příkladu 1. Žlutý prášek (140 g, 97,5 % hmotnostních Ísoquercitrinu) byl rozmíchán v 1 litru 0,25 mol.L¹ NaOH. Směs byla za stálého míchání přivedena k varu pro rozpuštění ísoquercitrinu a poté byl horký roztok filtrován. Následovalo pomalé chlazení (20 h při teplotě místnosti, poté 4 h při 5 °C). Žluté krystaly, které vypadly, byly odfiltrovány, promyty vodou o teplotě 40 °C (500 ml) a rozpuštěny v 100 ml 1 mokl^-’ NaOH. Následovalo pomalé chladnutí (20 h při teplotě 25 °C) a po dosažení této teploty chlazení (4 h pri 5 °C). Vyloučené krystaly byly odfiltrovány a resuspendovány ve vodě. Vodná suspenze byla okyselena zředěnou kyselinou sírovou na pH 3,5 a nerozpustný materiál byl odfiltrován a sušen; při této operaci se ze suspenze Ísoquercitrinu oddělily zbytky alkálií (sodné ionty) z předchozí krystalizace. Získaný žlutý prášek (6 g) obsahoval 99,85 % hmotnostních ísoquercitrinu a 0,15 % hmotnostních rutinu, což bylo stanoveno analýzou za využití HPLC podle příkladu 1. Veškerý quercetin a další neidentifikované nečistoty byly takto odstraněny. Isoquercitrin o nižší čistotě lze získat další precipitací z matečných louhů, a to zvláště dalším stáním v chladu a/nebo okyselením.Isoquercitrin having a purity greater than 99% by weight was obtained by repeated crystallization of the product obtained according to Example 1. The yellow powder (140 g, 97.5% by weight of isoquercitrin) was stirred in 1 liter of 0.25 mol.L of ¹ NaOH. The mixture was brought to boiling with stirring to dissolve the isoquercitrin and then the hot solution was filtered. Slow cooling (20 h at room temperature followed by 4 h at 5 ° C) followed. The yellow crystals that fell out were collected by filtration, washed with water at 40 ° C (500 ml) and dissolved in 100 ml of 1 mokl ^- 'NaOH. Slow cooling (20 h at 25 ° C) followed by cooling (4 h at 5 ° C). The precipitated crystals were filtered off and resuspended in water. The aqueous suspension was acidified with dilute sulfuric acid to pH 3.5 and the insoluble material was filtered off and dried; in this operation, alkali residues (sodium ions) from the previous crystallization were separated from the isoquercitrin suspension. The obtained yellow powder (6 g) contained 99.85% by weight of isoquercitrin and 0.15% by weight of rutin as determined by HPLC analysis according to Example 1. All quercetin and other unidentified impurities were thus removed. Isoquercitrin of lower purity can be obtained by further precipitation from the mother liquors, in particular by further standing in the cold and / or by acidification.

Příklad 4Example 4

Postup byl stejný iako v příkladu 1 s tím, že 1340 g rutinu bylo za míchání vneseno do předehřátého 100 mmol.Γ* fosfátového pufru (KH₂PO4/Na₂HPO₄, 8,941; pH 8,10; 70 °C), obsahujícího naringinasu z mikroorganismu Penicillium decumbens (Sigma, 89,4 g, výsledná aktivita a-Lrhamnosidasy 33 nkat) reakční směs byla poté míchána 24 h. Dále bylo postupováno jako v příkladu 1. Byl získán jemný žlutý prášek (927 g), který obsahoval 96,5 % ísoquercitrinu;The procedure was the same as in Example 1 except that 1340 g of rutin was introduced with stirring into a preheated 100 mmol.Γ * phosphate buffer (KH ₂ PO 4 / Na ₂ HPO ₄ , 8.941; pH 8.10; 70 ° C) containing naringinase from Penicillium decumbens (Sigma, 89.4 g, final α-Lrhamnosidase activity 33 nkat) was then stirred for 24 h. The procedure was as in Example 1. A fine yellow powder (927 g) was obtained which contained 96 g 5% isoquercitrin;

1,6% rutinu; 0,2 % quercetinu a 1,6% neidentifikovaných nečistot (všechny údaje označují hmotnostní procenta). Výsledná konverze tak byla přibližně o 1 % nižší než v příkladu 1.1.6% rutin; 0.2% quercetin and 1.6% unidentified impurities (all data refer to weight percent). Thus, the resulting conversion was approximately 1% lower than in Example 1.

Příklad 5Example 5

Enzym α-L-rhamnosidasa byl připraven submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus terreus v kapalném médiu. Nejdříve bylo připraveno inokulaění médium pro hlavní fermentací o pH = 6,0, mající následující složení (1 1): 15,0 g/1 KH₂PO₄; 4,0 g/1 NH4CI; 0,5 g/l KC1; 5,0 g/1 kvasinkového extraktu; 1,0 g/1 hydrolyzátu kaseinu; 1 ml roztoku stopových prvků; 10,0 g/I L50 rhamnosy; po sterilizaci v autoklávu při teplotě 121 °C a po dobu 30 minut pak byly přidány 3,0 ml sterilního 10% (hmotnost/objem) roztoku MgSO₄.7H₂O. (Stopové prvky, tj. 50,00 g/1 EDTA; 22,00 g/1 ZnSO₄ · 7 H₂O; 5,54 g/1 CaCl₂; 5,06 g/1 MnCl₂ · 4 H₂O; 4,99 g/1 FeSO₄ · 7 H₂O; 1,10 g/1 (NH4)6Mo₇O₂₄ · 4 H₂O; 1,57 g/1 CuSO₄ · 5 H₂Oa 1,61 g/1 CoCl₂ · 6 H₂O, byly rozpuštěny v destilované vodě a přidány do média po úpravě pH roztoku prostřednictvímThe α-L-rhamnosidase enzyme was prepared by submerged fermentation of Aspergillus terreus in liquid medium. First, inoculation medium for main fermentation at pH = 6.0 was prepared having the following composition (1 L): 15.0 g / L KH ₂ PO ₄ ; 4.0 g / L NH 4 Cl; 0.5 g / l KCl; 5.0 g / L yeast extract; 1.0 g / l casein hydrolyzate; 1 ml of trace element solution; 10.0 g / L L50 rhamnose; After sterilization in an autoclave at 121 ° C and for 30 minutes, 3.0 ml of sterile 10% (w / v) MgSO ₄ .7H ₂ O solution were added. (Trace elements, ie 50.00 g / 1 EDTA ; 22.00 g / 1 ZnSO ₄ · 7 H ₂ O; 5.54 g / 1 CaCl ₂ ; 5.06 g / 1 MnCl ₂ · 4 H ₂ O; 4.99 g / 1 FeSO ₄ · 7 H ₂ O; 1.10 g / l (NH4) 6Mo ₇ O ₂₄ · 4 H ₂ O; 1.57 g / l CuSO ₄ · 5 H ₂ O and 1.61 g / l CoCl ₂ · 6 H ₂ O were dissolved in distilled water and added to the medium after adjusting the pH of the solution via

40% KOH, hmotnost/objem, na hodnotu 6,0). Ke kultuře mikroorganismu narostlé na šikmém40% KOH, w / v, to 6.0). To the culture of a microorganism grown on an incline

-7CZ 302216 B6 agaru (agar se sladinovým extraktem v koncentraci 53,3 g/1) bylo sterilně napipetováno 6 ml 0,1% roztoku polysorbátu 80 a seškrábnutím mikroorganismu Aspergillus terreus do roztoku byla vytvořena suspenze spor a ěástí mycelií. Do l 1 inokulačního média bylo zaočkováno 5 ml této suspenze (10⁷ spor/ml). Zaočkované inokulační médium bylo kultivováno v Erlenmayerově baňce o objemu 5 1 při teplotě 28 °C po 4 dny za stálého míchání (200 ot/min). Při fermentací ve fermentoru o objemu 10 1 byl 11 takto získaného inokula použit pro zaočkování produkční fermentace ve fermentoru (objem kultivačního média 8,45 1, složení totožné jako inokulační médium, vzdušnění 10 l/min, otáčky míchadla 150 ot./min, teplota 28 °C). Šestý den po inokulaci kultivačního média bylo mycelium odstraněno filtrací. Přídavkem roztoku 50% (hmotnost/objem) ίο KOH bylo upraveno pH zfiltrovaného média na pH 8,1 a toto bylo zahříváno 20 min. při teplotě 70 °C pro destrukci nežádoucí β-D-glukosidasy. Tato upravené médium je možno přímo použít pro konverzi rutinu na isoquercitrin podle příkladu 1. Extracelulámí produkce a-L-rhamnosidasy při zachování kultivačních podmínek nezávisela na objemu kultivačního média (testovány byly objemy 50 ml až 10 1); šestý den kultivace měla objemová aktivita a-L-rhamnosidasy v médiu obdobnou hodnotu 33 až 42 nkat/ml ve všech testovaných objemech.The agar (wort extract agar at 53.3 g / l) was sterile pipetted with 6 ml of a 0.1% polysorbate 80 solution and scraped of spores and mycelial parts by scraping the Aspergillus terreus microorganism into solution. 5 ml of this suspension (10 ⁷ spores / ml) was inoculated into 1 L of inoculation medium. The inoculated inoculum medium was cultured in a 5 L Erlenmeyer flask at 28 ° C for 4 days with stirring (200 rpm). When fermented in a 10 L fermenter, 11 of the inoculum thus obtained was used to inoculate the production fermentation in the fermenter (culture medium volume 8.45 L, composition identical to inoculation medium, aeration 10 L / min, stirrer speed 150 rpm, temperature 28 ° C). On the sixth day after inoculation of the culture medium, the mycelium was removed by filtration. The pH of the filtered medium was adjusted to pH 8.1 by addition of a 50% w / v solution of KOH and this was heated for 20 min. at 70 ° C to destroy undesirable β-D-glucosidase. This conditioned medium can be directly used for the conversion of rutin to isoquercitrin according to Example 1. Extracellular production of α-rhamnosidase, while maintaining the culture conditions, did not depend on the volume of the culture medium (50 ml to 10 L volumes were tested); on the sixth day of culture, the α-rhamnosidase volume activity in the medium had a similar value of 33-42 nkat / ml in all volumes tested.

Příklad 6Example 6

Pro kultivaci mikroorganismu J. terreus podle příkladu 5 byla optimalizována koncentrace Lrhamnosy (induktoru). Přídavek L-rhamnosy do výsledné koncentrace 1 až 15 g/1 média zvýšil produkci α-L-rhamnosidasy až desetkrát (Obr. 5). Vyšší koncentrace L-rhamnosy (25 až 70) g/1 vedla k snížení aktivity α-L-rhamnosidasy a poklesu pH (počáteční hodnota pH 6,0 poklesla 7. až 8. den kultivace na pH 2,5).The concentration of Lrhamnose (inducer) was optimized for the cultivation of J. terreus according to Example 5. Addition of L-rhamnose to a final concentration of 1 to 15 g / l medium increased α-L-rhamnosidase production by up to ten-fold (Fig. 5). Higher concentrations of L-rhamnose (25-70) g / L resulted in a decrease in α-L-rhamnosidase activity and a decrease in pH (baseline pH 6.0 dropped to pH 2.5 on days 7-8).

Příklad 7Example 7

Reakční médium (2 I) po konverzi rutinu dle příkladu 1 bylo k dosažení finální koncentrace L30 rhamnosy 15 g/1 zředěno přídavkem destilované vody (přibližně 2 1). Do tohoto roztoku bylo přidáno 20 g kvasinkového extraktu, hodnota pH byla upravena 20% (hmotnost/objem) roztokem NaOH na pH 6 a po sterilizaci v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 30 minut byly přidány 3,0 ml sterilního 10% (hmotnost/objem) roztoku MgSO₄.7H₂O na litr média. Výsledný roztok byl znovu použit jako kultivační médium podle příkladu 5. Šestý den kultivace A. terreus na tomto médiu měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v médiu hodnotu 31 až 40 nkat/ml.The reaction medium (2 L) after the conversion of the rutin of Example 1 was diluted by addition of distilled water (approximately 2 L) to achieve a final concentration of L30 of rhamnose of 15 g / L. To this solution was added 20 g of yeast extract, the pH was adjusted to pH 6 with 20% (w / v) NaOH solution and after sterilization in an autoclave at 121 ° C for 30 minutes, 3.0 ml of sterile 10% ( weight / volume) of MgSO ₄ .7H ₂ O solution per liter of medium. The resulting solution was reused as the culture medium of Example 5. On day 6 of the cultivation of A. terreus on this medium, the volume activity of α-L-rhamnosidase in the medium was 31-40 nkat / ml.

Příklad 8Example 8

Enzym α-L-rhamnosidasa byl připraven submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus nidulans v kapalném médiu způsobem popsaným v příkladu 5 s tím, že šestý den kultivace měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v médiu hodnotu 25 až 37 nkat/ml.The α-L-rhamnosidase enzyme was prepared by submerged fermentation of Aspergillus nidulans in liquid medium as described in Example 5, with a volume activity of α-L-rhamnosidase in the medium of 25 to 37 nkat / ml on the sixth day of culture.

Příklad 9Example 9

Enzym α-L-rhamnosidasa byl připraven submerzní fermentací mikroorganismu Aspergillus aculeatus v kapalném médiu způsobem popsaným v příkladu 5 s tím, že šestý den kultivace měla objemová aktivita α-L-rhamnosidasy v médiu hodnotu 23 až 25 nkat/ml.The α-L-rhamnosidase enzyme was prepared by submerged fermentation of Aspergillus aculeatus in a liquid medium as described in Example 5, with a volume activity of α-L-rhamnosidase of 23-25 nkat / ml on the sixth day of culture.

-8CZ 302216 B6-8EN 302216 B6

Průmyslové využitíIndustrial use

Isoquecitrin je účinný antioxidant s vysokým chemoprotektivním potenciálem a je využitelný v nutraceutikách, funkčních potravinách, pro zlepšení nutriční hodnoty potravin a dále např.Isoquecitrin is a potent antioxidant with a high chemoprotective potential and is useful in nutraceuticals, functional foods, to improve the nutritional value of foods and further e.g.

v kosmetických přípravcích.in cosmetic products.

Claims

PATENT CLAIMS

A process for the production of quercetin-3-β-D-glucopyranoside to produce L-rhamnose, characterized in that at a pH of 11 to 350 g / l in an aqueous medium,

15 in the range of from 8.05 to 10.1 and at a temperature of from 60 to 90 ° C acts with an enzyme selected from the group of glycosidases, consisting of α-L-rhamnosidase and naringinase, and the quercetin-3-β-D-glucopyranoside product from the reaction mixture. separating by centrifugation, filtration or decantation; optionally, recrystallize.

20 May

2. Method of production of quercetin-

3-β-D-glucopyranoside according to claim 1, characterized in that the remaining reaction solution after removal of quercetin-3-β-D-glucucranoside is used for repeated production of quercetin-3-β-D-glucopyranoside and / or for submersional fermentation preparation of the enzyme used.

25 3. A process for producing quercetin-3-β-D-glucopyranoside according to claim 1, characterized in that the obtained quercetin-3-β-D-glucopyranoside was purified by recrystallization from a NaOH solution having a concentration of 50-500 mM.] Per ^-1 temperatures ranging from 20 to 100 ° C.

A process for the preparation of quercetin-3- (3-D-glucopyranoside) according to claim 1, characterized by

The method of claim 30, wherein α-L-rhamnosidase is used.

Process for the production of quercetin-3- (3-D-glucopyranoside) according to claims 1 and 4, characterized in that α-L-rhamnosidase from a microorganism of the genus Aspergillus or Penicillium is used.

Process for the production of quercetin-3-β-γ-glucopyranoside according to claims 1,4 and 5, characterized in that α-L-rhamnosidase is used from a microorganism of the genus Aspergillus prepared by submerged cultivation of the microorganism in a liquid medium containing rhamnose as an inducer in a concentration of 0.5 to 15 g / ml.

Process for the preparation of quercetin-3- (3-D-glucopyranoside) according to claim 6, characterized in that α-L-rhamnosidase contained in the filtrate from the submerged culture is used after adjusting the pH of the filtrate with an alkaline agent to a value of

8.0 to 10.1.

A process for the production of quercetin-3-β-D-glucopyranoside according to claim 6 or 7, characterized in that rhamnose is added as an inducer to the liquid medium in the form of the remaining reaction solution of claim 2.

A process for the preparation of quercetin-3-β-D-glucopyranoside according to claims 1 to 8, characterized in that α-L-rhamnosidase from Aspergillus irreus is used.