CZ300616B6 - Farmaceutický prostredek - Google Patents

Abstract

Použití CDP-cholinu nebo jeho farmaceuticky prijatelných solí pro výrobu farmaceutického prostredku pro profylaxi mozkové ischemie, pricemž CDP-cholin nebo jeho farmaceuticky prijatelná sul se podávají nemocným s vysokým rizikem akutní ischemické príhody pred prípadným zacátkem ischemické epizody, kde akutní ischemickou príhodou je mrtvice a vysoké riziko vzniká v dusledku rizikových faktoru ze skupiny, zahrnující predchozí výskyt ischemických epizod, zvýšený arteriální krevní tlak, hypercholesterolemie, kourení, fibrilace síní a jiná embolická srdecní onemocnení.

Description

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká použití cytidindifosfátcholinu pro výrobu farmaceutického prostředku pro profylaxi mozkové ischemie.

Dosavadní stav techniky

Existuje řada faktorů, které mohou ovlivnit výskyt a rozsah poruch na bázi mozkové ischemie po fokální ischemii. Těmito faktory jsou zejména ztráta homeostázy nervových přenašečů a kationtů, indukce a exprese časných genů a mobilizace cytokinů, v důsledku těchto faktorů dochází ke změnám funkce mozkomíšní bariéry a k infiltraci leukocytů a v důsledku toho k rychlému uhynutí buněk v centrální oblasti infarktu a také k oddálenému uhynutí buněk, často spojenému s apoptózou v periferní oblasti poškození. Mimoto dochází k indukci nebo k expresi trofických faktorů a jejich receptorů, které podporují reparativní jevy a novotvorbu cév.

Znalost mechanismů uhynutí buněk po ischemické poruše je nezbytné k umožnění léčení této poruchy. Genetické potlačení programovaného uhynutí buněk bylo sledováno převážně u nematodu Caenorhabditis elegans a je spojeno s geny ced-3, ced-4 a ced-9. Kaspázy, které je možno označit za savčí proteázy, závislé na cysteinu, odpovídají na některé typy produktu genu ced-3 a mají zásadní význam pro vznik apoptózy. Kaspázy se diferenciálně účastní u několika modelů uhynutí buněk a působí na různé substráty pro přežívání buněk s jejich následnou desintegrací. Kaspáza 1, 2, 3, 6 a 8 jsou spojeny s různými chorobami centrálního nervového systému. V publikacích Τ. E. Andreoli, Am. J. Med., 107, 488-506, 1999 a B. C. Albensi, Drug News Perspect., 12(8), 453-457, 1999 je uveden souhrn jevů při apoptóze a je souhrnně popsána úloha kaspáz,

Existuje několik málo literárních údajů, které se týkají exprese kaspáz po poškození, vyvolaném přechodnou nebo fokální ischemii. Současné studie prokazují různou expresi pro každou z kaspáz v závislosti na buněčném typu. Bylo prokázáno, že se kaspázy účastní ischemické příhody jak v lidském mozku, tak na krysím modelu fokální ischemie, přičemž exprese kaspáz je zvláště zvý35 šena v periferní oblasti poškození v prvních dnech po vzniku tohoto poškození.

Cytidindifosfátcholin, označovaný také jako citicolin nebo CDP-cholin je klíčový prekurzorem pro syntézu fosfatidylcholinu v buněčných membránách. Na experimentálním modelu dochází při exogenním podání CDP-cholinu ke zpomalenému rozrušování buněčných membrán při součas40 ném zvýšení syntézy fosfatidylcholinu a snížení koncentrace volných mastných kyselin. Při léčení CDP-cholinem došlo ke zlepšení u ischemických stavů nebo hypoxie na živočišných modelech. Z tohoto důvody byly antiapoptotické, neuroprotektivní a antiamnesické účinky CDPcholinu pokusně sledovány na krysách, výsledky jsou uvedeny v publikaci X. A. Alvarez a další, Mcthods and Findings in Experimetnal and Clinical Pharmacology: 21(8), 535-540, 1999.

4? Neuroprotektivní mechanismus působení CDP-cholinu dosud není zcela znám. V současné době se předpokládá, že tento účinek je spojen se snížením koncentrace volných mastných kyselin, snížením produkce volných radikálů, se stabilizací membrán nervových buněk, snížení toxicity, vyvolané glutamátem a tím se zvýšením přežívání nervových buněk. Dosud nebylo vysvětleno, zdaje možno příznivý vliv CDP-cholinu u ischemických příhod spojovat se snížením uhynutí buněk apoptózou v periferních oblastech příslušného ložiska.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že v případě podání CDP-cholinu před vznikem mozkové ischemie je možno dosáhnout většího příznivého účinku vzhledem k tomu, zeje takto možno zabránit závažnosti důsledků mozkové ischemie.

- 1 CZ 300616 B6

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří použití CDP-cholinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí pro výro5 bu farmaceutického prostředku pro profylaxi mozkové ischemie, přičemž CDP-cholin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se podávají nemocným s vysokým rizikem akutní ischemické příhody před případným začátkem ischemické epizody, kde akutní ischemickou příhodou je mrtvice a vysoké riziko vzniká v důsledku rizikových faktorů ze skupiny, zahrnující předchozí výskyt ischemických epizod, zvýšený arteriální krevní tlak, hypercholesterolemie, kouření, fibrilace síní a jiná embolická srdeční onemocnění.

Při podávání takového farmaceutického prostředku tedy běží o neuroprotektivní léčení. Toto léčení chrání mozkovou tkáň před poškozením, zvláště před vznikem mozkového infarktu.

CDP-cholin a jeho farmaceuticky přijatelné soli je tedy možno použít pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci velkého rozsahu poškození mozkové tkáně.

Mozková ischemie zahrnuje ischemii určitých úseků mozkové tkáně, tuto poruchu je možno definovat jako snížení krevního zásobení příslušné tkáně. Mozková ischemie tedy může vzniknout snížením nebo přerušením krevního zásobení z tepny, která přivádí krev do mozkových tkání.

CDP-cholin má inhibiční účinek na aktivaci kaspázy a snižuje míru apoptózy nervových buněk v periferních oblastech ischemického ložiska.

Podle dalšího provedení vynálezu je tedy možno při použití CDPcholinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí dosáhnout inhibice aktivace kaspázy. Vzhledem k tomu, že tento účinek byl vyšší u subjektů, jimž byla účinná látka podávána před vznikem mozkové ischemie je možno uzavřít, že CDP-cholin má profylaktický neuroprotektivní účinek u mozkových ischemických příhod. CDP-cholin je tedy účinnější v případě podávání před vznikem ischemie, kdy může pod30 statně snížit závažnost ischemických komplikací. Takovéto podávání účinné látky je tedy výhodnější než běžné podávání až po vzniku ischemického ložiska.

CDP-cholin nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo směsi těchto látek je možno podávat nebo popřípadě společně podávat současně s dalšími účinnými látkami nebo také následně s dal35 šími účinnými látkami ve farmaceuticky přijatelné formě, například ve směsi s farmaceutickými nosiči a/nebo pomocnými látkami. Při podávání těchto látek u člověka je denní dávka s výhodou v rozmezí 0,5 až 4 g volného CDP-cholinu, s výhodou 1 až 2 g volného CDP-cholinu při perorálním i parenterálním podání v závislosti na celkovém stavu nemocného.

Farmaceuticky přijatelné soli CDP-cholinu zahrnují adiční soli s bázemi, zvláště soli alkalických kovů nebo soli kovů alkalických zemin, například soli sodné, draselné, vápenaté nebo horečnaté a také adiční soli s anorganickými nebo organickými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, octovou, trifluoroctovou, citrónovou, mléčnou, jablečnou, vinnou, akrylovou, methakrylovou, malonovou, maleinovou, fumarovou, benzoovou, salicylo45 vou, skořicovou, methansulfonovou, benzensulfonovou, p-toluensulfonovou nebo nikotinovou.

CDP-cholin nebo jeho soli je možno použít v bezvodé formě nebo ve formě solvátu, zvláště hydrátu.

Sloučeninu je možno podávat perorálně ve formě tablet, kapslí, prášku, granulátu, tablet pro rozpuštění pod jazykem, roztoků, suspenzí, emulzí, sirupů, gelu a podobně nebo také parenterálně ve formě roztoku, suspenze, emulze a podobně pro nitrožilní nebo nitrosvalové podání.

Subjekty, které je možno léčit účinnou látkou svrchu uvedeným způsobem jsou zvláště:

- Nemocní po velkých chirurgických zákrocích, to znamená zejména nemocní před, v průběhu a zvláště po chirurgickém zákroku, při němž dochází ke krvácení, k manipulacím cév nebo k vyvolané a udržované hypotenzi, jako tomu je u chirurgických zákroků na nervové tkáni, na srdci a na cévách, v případě transplantace orgánů, implantace orthopedických protéz a podobně. V těchto případech je výhodné posunout začátek podávání na dobu 24 až 48 hodin před chirurgickým zákrokem a podávat účinnou perorální dávku například 1 až 2 g denně. Podávání má ío probíhat i v průběhu chirurgického zákroku v účinné dávce například 1 až 2 g nitrožilně v okamžiku vyvolání anestezie a pak ještě 1 týden se doporučuje podávání účinné látky například 1 až 2 g denně perorálně nebo nitrožilně v závislosti na celkovém stavu nemocného.

- Nemocní s vysokým rizikem nebo nemocní, kteří již trpí akutní ischemickou příhodou, napří15 klad mrtvicí, zejména nemocní s několika známými rizikovými faktory, s historií přechodných epizod mozkové ischemie, se zvýšeným krevním tlakem, s hypercholesterolemií, kuřáci, nemocní s fíbrilací předsíní nebo s dalšími embolickými srdečními chorobami. V těchto případech se podává účinná dávka 1 až 2 g denně perorálně i po předpokládaném záchvatu mozkové mrtvice.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Dále bude uvedeno složení některých farmaceutických prostředků, které je možno připravit s použitím CDP-cholinu. Je zřejmé, že ve složení těchto prostředků by bylo možno ještě učinit řadu úprav, rovněž spadajících do rozsahu vynálezu, takže vynález nemůže být na popsaná provedení omezen.

Příklad 1. Tablety s obsahem 500 mg CDP-cholinu

Sodná sůl CDP-cholinu 35 Mastek

Stearan hořečnatý

Oxid křemičitý

Sodná sůl zesítěné karmelázy

Kukuřičný škrob

Mikrokrystalická celulóza

522.5 mg 30,9 mg 3,0 mg

2.5 mg 20,0 mg 20,0 mg do 780,0 mg

Příklad 2. 25% roztok pro perorální podání

Sodná sůl CDP-cholinu 70% sorbitol

Methyl-p-hydroxybenzoát Propyl-p-hydroxybenzoát Citronan sodný

Sodná sůl sacharinu Jahodová esence

26,12 mg 20,00 g 0,16 mg 0,04 g

0,60 g 0,02 g 0,04 g

-3CZ 300616 B6

Red Punzo 4R

Bezvodá kyselina citrónová Čištěná voda

0,50 g 0,05 g do 100,00 ml

Příklad 3. Roztok pro nitrožilní podání

Sodná sůl CDP-cholinu 522,50 mg

Kyselina chlorovodíková do pH 6,0 až 6,5 ío Voda do 4,00 ml

Příklad 4. Neuroprotektívní účinek

Účinek CDP-cholinu na opožděné uhynutí nervových buněk (apoptózu) byl sledován na modelu ischemie mozkové kůry u krysy následujícím způsobem:

1) Pokusná zvířata

Všechny pokusy s mozkovým infarktem byly provedeny na krysách kmene Sprague-Dawley s hmotností 220 až 270 g. Zvířata byla umístěna do klecí, voda a krmivo byly podávány podle libosti, v klecích byla řízená teplota a vlhkost, světelný cyklus byl upraven na 12 hodin světla a 12 hodin tmy.

2) Model uzávěru centrální mozkové tepny

Mozková ischemie byla vyvolána trvalým proximálním uzávěrem centrální mozkové tepny pomocí elektrokoagulace. Za hluboké anestezie byla hlava krysy upevněna a byl proveden řez mezi levým uchem a levým okem. Pak byla exponována lebka rozříznutím spánkového svalu.

V tomto místě byla provedena kraniotomie při použití vrtáčku s průměrem 1 až 2 mm. Tvrdá plena byla odvrtána tak, aby bylo možno exponovat větev centrální mozkové tepny, která pak byla natrvalo koagulována.

3) Léčení:

Krysy byly náhodně rozděleny do tří skupin

a) Po 30 minutách ischemie byl zvířatům této skupiny podán CDP-chol in v dávce 500 mg/kg v 0,1 ml 0,9% sterilního fyziologického roztoku intraperitoneálně. Výsledky pokusu v této skupi40 ně jsou zaznamenány na obr. 1 až 5 v prvním sloupci.

b) 24 hodin před ischemií a 30 minut po ischemii byla zvířatům této skupiny podána stejná dávka jako ve skupině a). Výsledky pokusu v této skupině jsou zaznamenány na obr. 1 až 5 v prostředním sloupci.

c) Zvířata této skupiny byla použita jako kontrola. Po vzniku ischemie byl těmto zvířatům podán 0,9% fyziologický roztok chloridu sodného v množství 0,1 ml intraperitoneálně. Výsledky pokusu v této skupině jsou zaznamenány na obr. 1 až 5 v pravém sloupci.

4) Příprava vzorků pro morfologické studie

Nejprve byla provedena příprava pro sledování značené fragmentované DNA a pro imunohistochemii kaspázy. Zvířata byla ponechána po koagulaci tepny 30 minut nebo 1, 4, 8, 12, 24 a 48 hodin, načež byla usmrcena ethyletherem. Mozky zvířat byly okamžitě promývány PBS

-4CZ 300616 B6 s teplotou 4 °C zavedením kanyly do levé srdeční komory a pak byly promyty 4% paraformaldehydem. Pak byly mozky rychle vyjmuty a fixovány ponořením do téhož fixačního roztoku na dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Po kryoprotekci s použitím 30% sacharózy byly mozky zmrazený v isopentanu, zchlazeném kapalným dusíkem a pak uchovávány při -70 °C. Pak byly při použití kryostatického zařízení mozky rozřezány na řezy s tloušťkou 50 pm. Tyto řezy mozkové tkáně byly uchovávány rovněž při -70 °C. Řezy pak byly použity jako vzorky pro imunohistochemické sledování, pro sledování morfologických změn a pro označení apoptotických buněk in šitu. Morfologie infarktu byla sledována na za sebou jdoucích řezech včetně začátku a konce infarktu při použití barvení hematoxylínem a eosinem a při použití Nisslova barvení (křesylová violeť), ío Apoptotické buňky byly značeny pomocí fragmentované DNA in šitu. Exprese kaspázy byla sledována imunohistochemicky při použití avidinu, biotinu a peroxidázy spolu se specifickými primárními protilátkami proti kaspáze 1, 2, 3, 6 a 8 (Santa Cruz Biotechnology).

5) Elektroforéza na gelu a analýza Western blot

Příprava vzorků je obdobná jako v odstavci 4). Zvířata byla v hluboké anestezii usmrcena oddělením hlavy a mozky byly okamžitě vyjmuty. V každém z mozků byly pak vyjmuty následující oblasti: a) šedá hmota z oblasti infarktu, b) bílá hmota z oblasti infarktu, c) šedá hmota z bezprostředního sousedství infarktu a d) bílá hmota z bezprostředního sousedství infarktu. V každém z případů byly odebrány vzorky z obou polovin mozku. Tyto vzorky pak byly použity pro analýzu Western blot s použitím protilátek proti kaspáze a protilátek proti různým substrátům kaspázy, aby bylo možno odhadnout jejich možnou degradaci po ischemickém poškození.

6) Výsledky

Pro zjištění účinnosti léčení byla 12 hodin po vyvolání infarktu sledována exprese kaspázy 1, 2, 3, 6 a 8 jako markérů apoptózy, výsledky těchto zkoušek jsou shrnuty na obr. 1, 2, 3, 4 a 5. Bylo prokázáno, že existují významné rozdíly mezi léčenými a kontrolními zvířaty, pokud jde o expresi těchto markérů. Mimo to jsou tyto rozdíly významnější u zvířat, jimž byla účinná látka podává30 na před vznikem ischemie než u zvířat která byla léčena až po vyvolání ischemie. Toto zjištění je velmi důležité. Všechny tyto pokusy prokazují, že v případě, zeje CDP-cholin podán před vyvoláním infarktu, dochází k významnějšímu snížení koncentrace kaspázy než v případě, že je tato účinná látka podávána až po vzniku ischemického ložiska.

7) Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1, 2, 3, 4 a 5 jsou znázorněny graíy, na nichž jsou uvedeny průměrné hodnoty pro kaspázy 1, 2, 3, 6 a 8 ve formě imunofluorescenčních jednotek. Meze spolehlivosti jsou 95 %, statistická významnost ve srovnání s kontrolní skupinou zvířat je *p<0,05, **p<0,025, ***p<0,01.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 1. Použití CDP-cholinu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro profylaxi mozkové ischemie, přičemž CDP-cholin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se podávají nemocným s vysokým rizikem akutní ischemické příhody před případným začátkem ischemické epizody, kde akutní ischemickou příhodou je mrtvice a vysoké riziko vzniká v důsledku rizikových faktorů ze skupiny, zahrnující předchozí výskyt ischemických epizod, ío zvýšený arteriální krevní tlak, hypercholesterolemie, kouření, fibrilace síní a jiná embolická srdeční onemocnění,
2. 2. Použití podle nároku 1, při němž se CDP-cholin podává v denních dávkách, které jsou ekvivalentní 1 až 2 g volného CDP-cholinu,
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, při němž je farmaceuticky přijatelnou solí CDP-cholinu sůl alkalických kovů nebo soli kovu alkalických zemin nebo sůl s anorganickými nebo organickými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, octovou, trifluoroctovou, citrónovou, mléčnou, jablečnou, vinnou, akrylovou, meth akry lovou, malonovou, malei20 novou, fumarovou, benzoovou, salicylovou, skořicovou, methansulfonovou, benzensulfonovou, p-toluensulfonovou nebo nikotinovou, v bezvodé nebo hydratované formě.