CZ309658B6 - Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada - Google Patents
Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309658B6 CZ309658B6 CZ2021-53A CZ202153A CZ309658B6 CZ 309658 B6 CZ309658 B6 CZ 309658B6 CZ 202153 A CZ202153 A CZ 202153A CZ 309658 B6 CZ309658 B6 CZ 309658B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- solution
- sds
- concentration
- pcr
- ionic detergent
- Prior art date
Links
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 61
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract description 25
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 62
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 20
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 20
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 20
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 13
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 11
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 9
- 239000003708 ampul Substances 0.000 claims description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract description 23
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 8
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011981 development test Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- -1 anionic amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- NLVRHQFXQFSBQK-XWGVYQGASA-N tert-butyl N-[1-[(2S)-1-[[(2S)-4-(benzylamino)-3,4-dioxo-1-[(3S)-2-oxopyrrolidin-3-yl]butan-2-yl]amino]-3-cyclopropyl-1-oxopropan-2-yl]-2-oxopyridin-3-yl]carbamate Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)NC(C([C@H](C[C@H]1C(NCC1)=O)NC([C@H](CC1CC1)N1C(C(=CC=C1)NC(OC(C)(C)C)=O)=O)=O)=O)=O NLVRHQFXQFSBQK-XWGVYQGASA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229940054937 valstar Drugs 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F24—HEATING; RANGES; VENTILATING
- F24F—AIR-CONDITIONING; AIR-HUMIDIFICATION; VENTILATION; USE OF AIR CURRENTS FOR SCREENING
- F24F12/00—Use of energy recovery systems in air conditioning, ventilation or screening
- F24F12/001—Use of energy recovery systems in air conditioning, ventilation or screening with heat-exchange between supplied and exhausted air
- F24F12/006—Use of energy recovery systems in air conditioning, ventilation or screening with heat-exchange between supplied and exhausted air using an air-to-air heat exchanger
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F24—HEATING; RANGES; VENTILATING
- F24F—AIR-CONDITIONING; AIR-HUMIDIFICATION; VENTILATION; USE OF AIR CURRENTS FOR SCREENING
- F24F13/00—Details common to, or for air-conditioning, air-humidification, ventilation or use of air currents for screening
- F24F13/20—Casings or covers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Combustion & Propulsion (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Předmětem vynálezu je roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR pro medicínské diagnostické soupravy a odběrová sada s tímto roztokem. Roztok obsahuje iontový detergent v koncentraci 0,01 až 0,1 % obj. a neiontový detergent v koncentraci 1 až 4 % obj. Iontový detergent zabezpečí dekompozici virových partikulí a nukleové kyseliny jsou uvolněny do roztoku. Zároveň slouží jako konzervant pro uvolněné nukleové kyseliny. Přídavek neiontového detergentu zvyšuje účinnost iontových detergentů při extrakci RNA. Díky tomu je možné snížit obsah SDS v roztoku na hodnotu, při které je jeho inhibiční vliv na qPCR snížen natolik, že je reakci možné provést s dostatečnou citlivostí, aniž by bylo potřeba předem SDS z roztoku precipitovat.
Description
Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti medicínských diagnostických souprav a přípravy vzorku odebraného pacientovi k detekci přítomnosti daného typu viru.
Dosavadní stav techniky
Hojně používanou metodou pro molekulární diagnostiku virových infekcí je v dnešní době kvantitativní PCR. Základní podmínkou pro použití této i jakékoli jiné metody založené na detekci nukleových kyselin je jejich uvolnění z virové kapsidy.
Jsou známy různé metody pro dekompozici virů, ale u většiny je v dalším kroku potřebná izolace/pročištění uvolněné RNA nebo DNA. Je nutné daný chemický inzult ze vzorku odstranit tak, aby nedocházelo k ovlivnění následných analytických kroků, např. právě k inhibici PCR. Chemikálie schopné rozložení/deaktivace virových částic totiž deaktivují i enzymy, které jsou esenciální k úspěšnému průběhu PCR. Potřeba odstraňování takových chemikálií (např. thiokyanát) více či méně pracnými metodami izolace RNA/DNA prodlužují čas celého procesu molekulární diagnostiky a vzhledem k užívání izolačních kitů i zvyšují náklady. Ne vždy se ze vzorku povede úplně odstranit nevhodné pomocné látky, což může vyústit až ve falešně negativní výsledek vyšetření a nutnost opakovat RNA/DNA izolaci.
Většina současných RNA izolačních kitů pro diagnostiku virových infekcí vychází ve svých protokolech z cca 200 pl biologického vzorku. Ten se během procesu teoreticky zahustí 3 až 4x elucí do vody nebo elučního pufru. Nicméně je všeobecně známo, že silica adsorpční metody izolace nukleových kyselin (viz např. Boom et al., 1996) mají velké ztráty (až 60 %), které se promýváním mohou zvýšit až na 80 %. Klasické precipitační metody vedou k podobným kvantitativním ztrátám, ale především i ke snížené kvalitě RNA a často je nutné je extenzivně optimalizovat, zejména když se jedná o analýzu RNA s relativně málo kopiemi ve vzorku (viz např. Huma et al., 2020).
Iontové detergenty, včetně sodiumdodecylsulfátu (SDS), jsou obecně známé v molekulární biologii pro svoje účinky na obal virů, buněčnou stěnu a jsou proto hojně využívány právě pro extrakci RNA/DNA. Navíc se jedná o dostupný a šetrný prostředek. Sám o sobě však už při relativně nízkých koncentracích inhibuje následné enzymatické reakce, a proto je nutné do extrakčního roztoku přidávat další látky, které iontový detergent neutralizují nebo jinak jeho inhibiční účinek eliminují. Je známo, že neiontový detergent zvyšuje účinek iontového detergentu při extrakci RNA/DNA, přesto však zatím není známo řešení, které by dokázalo využít výhody iontového detergentu, ale zároveň eliminovalo jeho inhibiční účinky na enzymatické reakce. Účinností různých chemikálií na rozpad virových partikulí se vědci systematicky zabývají už více než 100 let. Zatímco však byla v dávnější minulosti primárním cílem deaktivace virů z důvodu desinfekce, v 60. letech minulého století se už dekompozice virové kapsidy pomocí chemických, fyzikálních nebo biologických zásahů začala využívat i pro studie virů (např. elektronovou mikroskopií). Inaktivace virů se využívá například i pro zabezpečení bezpečnější práce s biologickým materiálem nebo pro jeho transport do laboratoří. K dispozici je několik metod na výběr, u kterých záleží na jejich kompatibilitě s následnými aplikacemi. Inaktivace teplem byla používaná pro několik virů (Patterson et al., 2018; Song et al., 2010) a je běžnou metodou používanou pro konzervaci antigenu virových a bakteriálních patogenů. K uchování proteinů v biologickém vzorku lze použít detergenty a UV záření (Wang et al., 2004; Rabenau et al., 2005). Detergenty jsou běžnou součástí činidel používaných k inaktivaci virů nebo extrakci RNA z biologických vzorků včetně virů. Jiné studie ukázaly, že kombinace 0,1% SDS a 0,1% NP-40
- 1 CZ 309658 B6 (Darnell et al., 2004) nebo 0,3% tri(n-butyl)fosf (TNBP) s 1% Triton X-100 (Rabenau et al, 2005) také dokážou viry inaktivovat.
Nedávno bylo ukázáno, že detergenty SDS, Triton X-100 a NP-40 v koncentracích 0,5 % jsou schopné inaktivovat SARS-CoV-2 po 30 min. inkubaci. Na druhou stranu, Tween 20 o stejné koncentraci virus neovlivnil (Patterson et al., 2020). Detergenty o těchto koncentracích sice mohou inaktivovat viry ve smyslu virulence - narušují lipidový povrch virů, proteiny kapsidy však zůstávají intaktní bez uvolnění nukleových kyselin do okolního prostředí a je nutno pro jejich PCR analýzu izolačního kroku.
V patentovém dokumentu EP 1399459 autoři popisují extrakční roztok zahrnující mimo jiné iontový a neiontový detergent a dále chelatační, redukční a antibakteriální činidlo. Iontový a neiontový detergent zde není použit přímo pro izolaci nukleových kyselin a vzorek je poté nutné laboratorně zpracovat, aby bylo možné ho použít pro PCR. Konkrétně je zde navrženo odsolování chloroformovou extrakcí na kolonce nebo vysolováním a chloroformovou extrakcí. Iontový detergent slouží pouze k uvolnění RNA z jádra.
WO 200918034 A1 popisují metodu izolace nukleových kyselin pomocí roztoku s obsahem soli, iontového detergentu (SDS) a neiontového detergentu (výhodně TWEEN 20). Neiontový detergent je zde přidán jen kvůli zvýšení rozpustnosti SDS (0,5 až 2 %) v roztoku s vysokým obsahem solí. Navíc SDS při nízkých teplotách krystalizuje a před použitím pro extrakci virových RNA je nutné ho zahřívat na vysokou teplotu. Ani zde není možné vzorek použít rovnou ke qPCR analýze.
Dokument EP 671473 B1 popisuje způsob potlačení inhibice enzymatické reakce způsobené iontovým detergentem. Autoři před enzymatickou reakcí přidávají do roztoku pro analýzu přídavek neiontového detergentu, který určitým způsobem neutralizuje iontový detergent. Nicméně ani tato metoda není použitelná pro zpracování vzorku pro qPCR. Uvedené koncentrace detergentů s jistotou zcela znemožní provedení analýzy pomocí PCR.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je spojit v rámci molekulární diagnostiky virových infekcí dva úkony v jednom kroku, kde vzorek odebraný pacientovi je možno analyzovat přímo po odebrání z odběrové ampule bez nutnosti dalších chemických či fyzikálních zásahů, jako je odstranění detergentu z roztoku, precipitace složek negativně ovlivňujících enzymatické reakce v procesu PCR, tepelné zpracování vzorku a další postupy, které prodlužují a zdražují diagnostický proces. Předkládaný vynález zajišťuje snížení časové, finanční i instrumentální náročnosti diagnostické metody. Další výhodou je omezení použití nebezpečných chemických látek běžně používaných, jako např. antimikrobiální činidla či konzervanty apod., se kterými může pracovník odběrové služby, laboratoře nebo přímo pacient při odběru během postupu přijít do kontaktu, stejně tak omezení styku pracovníků s biologickým materiálem, který může být potenciálně nebezpečný.
Uvedeného cíle je dosaženo použitím roztoku pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR obsahuj ícího iontový detergent v koncentraci 0,01 až 0,1 % obj. a neiontový detergent v koncentraci 1 až 4 % obj. a dále obsahuje Na3PO4 a/nebo NaHCO3 jako precipitační činidlo pro Ca2+ ze slin.
Iontový detergent při relativně vysoké koncentraci zabezpečí dekompozici virových partikulí a nukleové kyseliny jsou uvolněny do roztoku. Zároveň slouží jako konzervant pro uvolněné nukleové kyseliny. Vzorek je tak použitelný pro PCR reakci až několik dnů i při uchovávání za běžných podmínek. Není nutné skladovat vzorek v náročných podmínkách, jako je extrémní chlad. Je však známo, že iontový detergent inhibuje enzymatické reakce a je nutné ho z roztoku odstranit, ať už precipitací minerálními solemi, či dalšími laboratorními kroky, které však zvyšují finanční i
- 2 CZ 309658 B6 laboratorní náročnost procesu. Těmito kroky může dojít také ke snížení výtěžnosti postupu a následnému snížení citlivosti testu a falešně negativním výsledkům.
Bylo zjištěno, že přídavek neiontového detergentu zvyšuje účinnost SDS a jiných iontových detergentů (včetně sodium deoxycholátu a cholátu, sarkosylu) při extrakci RNA. Z tohoto důvodu je možné snížit obsah SDS v roztoku na hodnotu, při které je jeho inhibiční vliv na qPCR snížen natolik, že je reakci možné provést s dostatečnou citlivostí, aniž by bylo potřeba předem SDS z roztoku precipitovat pomocí draselných, vápenatých nebo jiných solí.
Pro zvýšení citlivosti PCR a výtěžnosti metody je přidán Na3PO4 a/nebo NaHCO3, které jsou schopny vázat Ca2+. Tento krok pomáhá v odebraných slinách vyvázat kalcium, které jinak může precipitovat SDS a tím snížit jeho účinnost při dekompozici virových partikulí.
Výhodou směsi iontového a neiontového detergentu pro zpracování odebraného biologického materiálu je snadný pracovní postup, eliminace nadbytečného kontaktu personálu s infekčním biologickým materiálem, snížení finanční i procesní náročnosti, šetrnější postup s lepší výtěžností a tím spolehlivější metoda, jak je ukázáno ve validační studii níže.
Na základě experimentů je jako iontový detergent výhodně použit dodecylsíran sodný v koncentraci 0,025 %. Dodecylsíran sodný (SDS) je jako iontový detergent používán ve většině molekulárních aplikací v koncentraci v rozmezí od desetin po jednotky procent obj. Kinetická data rovnováhy a zastaveného toku ukazují, že rozvinutí terciární struktury proteinů v submicelárním a expanze řetězce v micelárním rozhraní koncentrace SDS jsou dva hlavní mechanismy při narušení struktury proteinu. Expanze proteinového řetězce při micelární koncentraci SDS je řízena coulombickým odpuzováním mezi micelami vázanými na protein. Micely zase reagují s postranními řetězci aniontových aminokyselin. Povaha interakce mezi detergentem a proteinem je převážně hydrofobní v submicelárních a výhradně hydrofobní při micelárních koncentracích SDS. SDS je schopno reagovat i s vysoce denaturovanými a negativně nabitými proteiny, tudíž je jeho interakce nezávislá na struktuře, konformaci a ionizačním stavu proteinu (Bhuyan, 2010). Pro následné enzymatické reakce je však žádoucí použití co nejnižší koncentrace SDS z důvodu možné denaturace enzymů a inhibice celé reakce.
V biomolekulárních aplikacích jsou účinky SDS při dekompozici virových partikulí dobře známy, a proto je pro tyto účely hojně využíván. SDS je schopen efektivně rozrušit obalené i neobalené viry, kdy denaturací dochází k disociaci virové obálky a kapsidových proteinů (Piret et al., 2002). V rámci vývojové studie představovaného vynálezu však bylo experimentálně zjištěno, že iontový detergent SDS při koncentracích vyšších než 0,1 % inhibuje qPCR reakci do té míry, že není možné ji provést. Precipitační kroky pomocí draselných, vápenatých nebo jiných solí sice vedly k částečnému odstranění SDS z roztoku, citlivé enzymatické reakce qPCR však byly pořád inhibovány.
Pro dosažení co nejnižší koncentrace iontového detergentu, který je schopen denaturovat proteiny a narušovat protein-proteinové interakce, byl do roztoku přidán neiontový detergent, který má schopnost narušit lipid-lipidové a protein-lipidové interakce. Na rozdíl od iontových detergentů však mají limitovaný vliv na denaturaci proteinů a jejich interakce s jinými proteiny. Na rozdíl od iontových detergentů, které reagují s opačně nabitými úseky proteinů, asociace neiontových detergentů s proteiny je založena čistě na bázi hydrofobní interakce (Gelamo et al., 2004; Chakraborty et al., 2009; Valstar et al., 2000). Proces denaturace je tedy zahájen elektrostatickou interakcí iontového detergentu s proteinem, jehož uspořádání se rozloží a exponují se jeho hydrofobní oblasti, se kterými pak reagují i neiontové detergenty.
Přidáním neiontových detergentů do roztoku tak mohlo být dosaženo nižší koncentrace (zvýšení účinnosti při rozpadu virových partikulí) iontového detergentu, který denaturuje proteiny včetně enzymů (polymeráz, které musí zůstat v nativním stavu) v následné PCR reakci. V roztoku pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR je možné jako neiontový detergent použít
- 3 CZ 309658 B6
Tween-20, Tween-80, Triton X-100, NP-40 (Igepal) nebo Nonidet P. Principiálně však lze použít kterýkoli neiontový detergent, případně i jejich kombinaci.
Na základě experimentů je jako neiontový detergent výhodně použit Tween 20 v koncentraci 3 % obj., který ve vývojových testech dosahoval nejlepších výsledků s ohledem na citlivost PCR reakce.
Popsaný roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR je použit v odběrové sadě pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR, která zahrnuje uzavíratelnou ampuli, např. se šroubovacím uzávěrem, s roztokem pro molekulární diagnostiku pomocí PCR a tampon pro odběr biologického vzorku ve sterilním balení. Tato odběrová sada je vhodná pro odběr biologického materiálu jako jsou stěry z oblasti nosohltanu, krku, ušní, kožní či vaginální stěry, a stejně tak i stěry z prostředí/povrchů, které je potřeba monitorovat z hlediska výskytů infekcí jako jsou školy, nemocnice apod. Přináší významné zjednodušení práce při zpracování testů, jelikož v jediné ampuli jsou extrahovány RNA do roztoku, je v ní možné roztok uchovat několik dní při běžných podmínkách, směs detergentů RNA konzervuje, a zároveň je možné roztok se vzorkem rovnou analyzovat pomocí qPCR reakce, aniž by bylo nutné izolovat RNA dalšími laboratorními kroky.
Objasnění výkresů
Podstata vynálezu je dále objasněna na příkladech jeho uskutečnění, které jsou popsány s využitím připojených výkresů, kde:
Obr. 1 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 1 až 5 % SDS a přídavkem KCl.
Obr. 2 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 0,1 až 2 % SDS a přídavkem KCl v zeleném fluorescenčním kanálu.
Obr. 3 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 0,1 až 2 % SDS a přídavkem KCl ve žlutém fluorescenčním kanálu.
Obr. 4 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 0,1 % SDS s přídavkem KCl a inputem 5x108 až 1x103 kopií SARS-CoV-2/ml bez izolace RNA.
Obr. 5 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 0,1 % SDS s přídavkem KCl a inputem 5x108 až 1x103 kopií SARS-CoV-2/ml s izolací RNA.
Obr. 6 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 0,025 % SDS s přídavkem KCl a Tween 20 nebo Triton X-100.
Obr. 7 znázorňuje graf amplifikačních křivek vzorků s koncentrací 0,025 % SDS s přídavkem Tween 20 nebo Triton X-100 a Na3PO4.
Obr. 8 ukazuje výsledky validační studie srovnávající záchyt pozitivit ve vzorcích odebraných pomocí standardního odběrového setu a pomocí odběrové sady s roztokem dle vynálezu.
Příklady uskutečnění vynálezu
Uvedená uskutečnění znázorňují příkladné varianty provedení vynálezu, která však nemají z hlediska rozsahu ochrany žádný omezující vliv.
- 4 CZ 309658 B6
Uskutečněním představovaného vynálezu je vodný roztok iontového a neiontového detergentu a případných aditiv, jak bude popsáno v následujících příkladech. Vzhledem k účelu použití je vodou myšlena voda pro injekce, která splňuje požadavky na absenci DNA/RNA a nukleáz a zajišťuje sterilitu produktu.
Roztok byl úspěšně testován na různých PCR kitech od různých výrobců - včetně GeneProof, Generi Biotech, Elisabeth Pharmacon, BAG Diagnostics, iNtRON Biotechnology, Shanghai ZJ Bio-Tech. Stejně tak byl úspěšně odzkoušen na LAMP testu (Aumed).
Koncentrace iontového detergentu byla zvolena na základě experimentu, kdy byly qPCR testovány vzorky s 1 až 5 % SDS, do nichž bylo přidáno 5x107 kopií SARS-CoV-2/ml, poté přidáno KCl s finální koncentrací 200 až 400 mM, viz tab. 1.
Vzorky byly testovány metodou qPCR a odezva byla sledována ve dvou fluorescenčních kanálech 15 - zelený kanál pro amplifikované úseky RdRP (RNA-dependentní RNA polymeráza) a genu E a žlutý kanál pro kapsidový gen N. Pokud není uvedeno jinak, veškerá % uvedená v následujícím textu jsou považována za objemová.
| Vzorek | SDS | KCl | Pozitivní signál qPCR |
| 1 | 1 % | 200 mM | ANO |
| 2 | 2 % | 200 mM | NE |
| 3 | 3 % | 200 mM | NE |
| 4 | 4 % | 300 mM | NE |
| 5 | 5 % | 400 mM | NE |
Tab. 1: Testování různých koncentrací SDS a jeho precipitace pomocí KCl.
Výsledné amplifikační křivky jednotlivých vzorků na obr. 1 ukazují, že pozitivní signál qPCR identifikující přítomnost viru byl pozorován pouze u koncentrace 1 % SDS precipitovaného 200 mM KCl. Naopak lze konstatovat, že vyšší koncentrace SDS inhibují qPCR reakci do té míry, že není možné ji provést ani po precipitaci pomocí KCl ve vyšší koncentraci.
Dalším experimentem bylo srovnání různých koncentrací SDS ve smyslu uvolnění RNA do roztoku a inhibice qPCR. Do vzorků s 0,1 až 2 % SDS bylo přidáno 5x105 kopií SARS-CoV-2/ml, poté přidáno KCl s finální koncentrací 200 mM, viz tab. 2.
| Vzorek | SDS | KCl | Pozitivní signál qPCR v obou kanálech |
| 1 | 0,1 % | 200 mM | ANO |
| 2 | 0,5 % | 200 mM | NE |
| 3 | 1 % | 200 mM | NE |
| 4 | 2 % | 200 mM | NE |
Tab. 2: Porovnání různých koncentrací SDSpro uvolnění RNA do roztoku a inhibice qPCR.
Pozitivní signál qPCR identifikující přítomnost viru byl pozorován u koncentrací 0,1 %, 0,5 % a 1 % SDS (obr. 2, zelený fluorescenční kanál), přičemž nejcitlivější se jeví koncentrace SDS 0,1 %, u které byl pozorován signál v obou vyšetřovaných fluorescenčních kanálech (obr. 3, žlutý 35 fluorescenční kanál). Z toho vyplývá, že SDS o koncentraci 0,5 až 2 % způsobuje i pro precipitaci úplnou nebo částečnou inhibici PCR.
Roztok SDS s koncentrací 0,1 % byl poté podroben zkoumání z hlediska citlivosti a průkazu záchytu i menšího obsahu templátu. Do roztoku 0,1 % SDS roztoku bylo přidáno 5x108 až 1x103 40 kopií SARS-CoV-2/ml a poté 200 mM KCl. PCR bylo provedeno přímo ze vzorků a pro kontrolu a potvrzení přítomnosti viru i po izolaci RNA klasickým postupem, viz tab. 3.
- 5 CZ 309658 B6
| Vzorek | Input SARSCoV-2 v 1 ml vzorku | SDS | KCl | Pozitivní signál qPCR bez izolace RNA | Pozitivní signál qPCR s izolací RNA |
| 1 | 5x108 | 0,1 % | 200 mM | ANO | ANO |
| 2 | 1x107 | 0,1 % | 200 mM | ANO | ANO |
| 3 | 1x106 | 0,1 % | 200 mM | ANO | ANO |
| 4 | 1x105 | 0,1 % | 200 mM | NE | ANO |
| 5 | 1x104 | 0,1 % | 200 mM | NE | ANO |
| 6 | 1x103 | 0,1 % | 200 mM | NE | NE |
Tab. 3: Evaluace citlivosti/záchytu roztoku SDS u různých koncentrací templátu.
Přítomnost viru bez izolace RNA byla zachycena u koncentrací 5x108 až 1x106, jak lze vidět na obr. 4. Po RNA izolaci (viz obr. 5) pak PCR reakce zachytila koncentraci až 1x104/ml a při nejnižší koncentraci viru byl výsledek reakce negativní.
Na základě předchozích experimentů bylo zjištěno, že koncentrace SDS v rozmezí 0,025 až 0,1 % je vhodná pro PCR reakce. Na základě vývojových testů je však zřejmé, že rozsah vhodných koncentrací SDS lze rozšířit až na 0,01 až 0,1 %. V následujících příkladných uskutečněních jsou uvedeny použitelné varianty roztoku.
Příklad 1
SDS je v roztoku v koncentraci 0,025 % obj. Pro eliminaci inhibičního působení SDS na PCR je přidán neiontový detergent. Do roztoků 0,025 % obj. SDS v kombinaci s 2, 3 nebo 4 % Tween 20 nebo Triton X-100 bylo přidáno 1x104 kopií SARS-CoV-2/ml (nejnižší koncentrace virů zachycena klasickým postupem RNA izolace a PCR reakce), poté byla přidána precipitační sůl KCl (200 mM), viz tab. 4.
| Vzorek | SDS (%) | Tween20 (%) | Triton X-100 (%) | KCl | Ct |
| PK | 0,025 | - | - | 200 mM | 25,08 |
| 1. | 0,025 | - | - | 200 mM | 38,27 |
| 2. | 0,025 | 2 | - | 200 mM | 29,74 |
| 3. | 0,025 | 3 | - | 200 mM | 28,38 |
| 4. | 0,025 | 4 | - | 200 mM | 28,50 |
| 5. | 0,025 | - | 2 | 200 mM | 30,64 |
| 6. | 0,025 | - | 3 | 200 mM | 29,21 |
| 7. | 0,025 | - | 4 | 200 mM | 30,27 |
Tab. 4: Evaluace roztoku iontového (SDS) a neiontového detergentu (Tween 20 nebo Triton X100) roztoku citlivosti/záchytu roztoku SDS u různých koncentrací templátu.
Obr. 6 ukazuje kvantifikační data, která jsou sumarizována v tab. 4. Z výsledků je zřejmé, že neiontové detergenty zvýšily citlivost PCR reakce, přičemž Tween 20 se jeví jako vhodnější varianta. (PK - pozitivní kontrola)
Příklad 2
Do roztoků 0,025 % SDS v kombinaci s přibližně 3 % Tween 20 nebo Triton X-100, 10 % slin (pro simulaci odběru biologického vzorku) a přibližně 10 mM Na3PO4 bylo přidáno 1x105 nebo 1x103 kopií SARS-CoV-2/ml. Vzorky byly analyzovány přímo bez precipitace SDS pomocí KCl, viz tab. 5.
- 6 CZ 309658 B6
| Vzorek | Počet virů/ml | SDS (%) | Tween 20 (%) | Triton X100 (%) | Na3PO4 (10 mM) | Ct |
| PK | 105 | - | - | - | - | 22,91 |
| 1. | 105 | 0,025 | - | - | - | 32,14 |
| 2. | 105 | 0,025 | 3 | - | - | 25,36 |
| 3. | 105 | 0,025 | 3 | - | v | 23,09 |
| 4. | 105 | 0,025 | - | 3 | - | 31,11 |
| 5. | 105 | 0,025 | - | 3 | v | 30,51 |
| 6. | 103 | 0,025 | - | - | - | 35,98 |
| 7. | 103 | 0,025 | 3 | - | - | 33,74 |
| 8. | 103 | 0,025 | 3 | - | v | 33,34 |
Tab. 5: Evaluace roztoku iontového (0,025 % SDS) a neiontového detergentu (3 % Tween 20 nebo Triton X-10C) roztoku s přidáním soli pro vychytávání dvoumocných iontů ze slin
Obr. 7 ukazuje kvantifikační data, která jsou sumarizována v tab. 5. Výsledky potvrzují aditivní efekt neiontových detergentů a ukazují i mírné zvýšení citlivosti při přidání Na3PO4 (PK - pozitivní kontrola).
Výsledky tohoto experimentu opět ukazují, že Tween 20 vykazuje mírně lepší vlastnosti pro danou aplikaci. Přídavek soli pro precipitaci kalcia ze slin taktéž mírně zvýšil citlivost reakce.
Na základě provedených experimentů byl jako nejvýhodnější uskutečnění zvolen roztok o koncentraci 0,025 % SDS a 3 % Tween 20.
Experimentálně bylo potvrzeno, že lze použít i jiné neiontové detergenty v koncentraci 1 až 4 %, nicméně nejlepších výsledků bylo dosaženo s Tween 20. Stejně tak lze pro precipitaci Ca2+ ze slin využít i přídavek NaHCO3.
Příklad 3
Jako výhodné uskutečnění je zvolen roztok obsahující SDS o koncentraci 0,025 %, Tween 20 o koncentraci 3 % a 10 mM Na3PO4. Roztok je odběrovým zařízením distribuován v plastových šroubovacích ampulích se stěrovým tamponem ve sterilním balení.
Po provedení stěru biologického materiálu je tampon zalomen v ampuli, ampule zašroubována a připravena k transportu do laboratoře k dalšímu zpracování. Pracovník laboratoře vzorek zpracuje pomocí zvoleného qPCR kitu, provede analýzu a kvantifikuje virové RNA ve vzorku. Je možné vzorek před zpracováním centrifugovat (12 000 otáček za minutu, 3 až 5 minut). Dojde k sedimentaci debris z biologického materiálu, což mírně zvýší citlivost qPCR reakce.
Příklad 4
Při validační studii bylo otestováno 113 vzorků paralelně odebraných standardním odběrovým setem a odběrovým setem s roztokem dle vynálezu ve složení 0,025 % SDS + 3 % Tween 20 + Na3PO4 a NaHCO3. U každého subjektu byly provedeny 3 odběry - standardním způsobem (odběr z ústní dutiny a nosohltanu do standardního odběrového setu), výtěr z nosohltanu do odběrového setu s roztokem dle vynálezu a odběr slin do odběrového setu s roztokem dle vynálezu. U vzorků ze standardního odběrového setu byla provedena RNA izolace (automatizovaný izolátor Zybio a EliGene izolační kit) a byla provedena qPCR analýza. Vzorky v roztoku dle vynálezu byly analyzovány pomocí qPCR přímo do qPCR bez izolace RNA.
- 7 CZ 309658 B6
Set s roztokem dle vynálezu zachytil více pozitivit než standardní odběrový set. Ze 113 vzorků byla standardním postupem detekována přítomnost viru SARS-CoV-2 u 27 vzorků. Všechny pozitivní nálezy byly detekovány i ve vzorcích odebraných pomocí odběrového setu s inovovaným roztokem, navíc však byla nákaza odhalena v dalších 12 vzorcích (z toho u 3 osob jen výtěrem z nosohltanu a u 1 osoby jen ze slin).
| Shoda | Poznámky | |
| Standardní odběrový set vs. odběrová sada dle vynálezu (nosohltan) | 100 % | Odběrová sada dle vynálezu (nosohltan) odhalila o 11 pozitivit navíc |
| Standardní odběrový set vs. odběrová sada dle vynálezu (sliny) | 100 % | Odběrová sada dle vynálezu (sliny) odhalila o 8 pozitivit navíc |
| Odběrová sada dle vynálezu (nosohltan vs sliny) | 92 % | 3x jen nos; 1x jen sliny; paralelní výsledek ze standardního odběrového setu byl vždy negativní |
Průmyslová využitelnost
Výše popsané lze využít pro diagnostiku virových infekcí z biologického materiálu odebraných z různých lokací (např. sliny, výtěr z nosohltanu atd.). Ač je vynález testován především pro stanovení virové nákazy SARS-CoV-2, dá se na základě teoretických znalostí předpokládat, že je způsobilý ke stanovení i jiných virových i nevirových infektů.
Seznam literatury
Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL et al.: Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990, 28:495-503.
Huma N, Sahar S, Iftikhar Y et al.: RNA isolation efficacy of commercial and modified conventional methods for Citrus tristeza virus and mRNA internal control amplification. Biologia. 2020, 75:1195-1202.
Patterson EI, Warmbrod KL, Bouyer DH, Forrester NL. Evaluation of the inactivation of Venezuelan equine encephalitis virus by several common methods. J Virol Methods. 2018, 254:31 34.
Song H, Li J, Shi S et al.: Thermal stability and inactivation of hepatitis C virus grown in cell culture. Virol J. 2010, 7:40. Wang J, Mauser A, Chao SFc et al.: Virus inactivation and protein recovery in a novel ultraviolet-C reactor. Vox Sang. 2004, 86:230-238.
Rabenau HF, Biesert L, Schmidt T et al.: SARS-coronavirus (SARS-CoV) and the safety of a solvent/detergent (S/D) treated immunoglobulin preparation. Biologicals. 2005, 33:95-99.
Darnell MER, Subbarao K, Feinstone SM, Taylor DR: Inactivation of the coronavirus that induces severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV. J Virol Methods. 2004, 121:85-91.
Patterson EI, Prince T, Anderson ER et al.: Methods of inactivation of SARS-CoV-2 for downstream biological assays. J Infect Dis. 2020, 222:1462-1467.
Bhuyan AK: On the mechanism of SDS-induced protein denaturation. Biopolymers. 2010, 93:186199.
- 8 CZ 309658 B6
Piret J, Désormeaux A, Bergeron MG: Sodium lauryl sulfate, a microbicide effective against enveloped and nonenveloped viruses. Current Drug Targets. 2002, 3:17-30.
Gelamo EL. Itri R.; Alonso A et al.: Small-angle X-ray scattering and electron paramagnetic 5 resonance study of the interaction of bovine serum albumin with ionic surfactants. J. Colloid Interface Sci. 2004, 277:471-482.
Chakraborty T, Chakraborty I, Moulik SP, Ghosh S: Physicochemical and conformational studies on BSA-surfactant interaction in aqueous medium. Langmuir. 2009, 25:3062-3074.
Valstar A, Almgren M, Brown W, Vasilescu M: The Interaction of Bovine Serum Albumin with Surfactants Studied by Light Scattering. Langmuir. 2000, 16:922-927.
Claims (5)
1. Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR, vyznačující se tím, že obsahuje iontový detergent v koncentraci 0,01 až 0,1 % obj. a neiontový detergent v koncentraci 1 5 až 4 % obj. a dále obsahuje NatPO4 a/nebo NaHCOt, které jsou precipitačním činidlem pro Ca2+ ze slin.
2. Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR podle nároku 1, vyznačující se tím, že iontovým detergentem je dodecylsíran sodný v koncentraci 0,025 % obj.
3. Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR podle kteréhokoliv 10 z předchozích nároků, vyznačující se tím, že neiontovým detergentem je Tween-20, Tween-80,
Triton X-100, NP-40 - Igepal, nebo Nonidet P.
4. Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že neiontovým detergentem je Tween-20 v koncentraci 3 % obj.
5. Odběrová sada pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR, vyznačující se tím, 15 že obsahuje uzavíratelnou ampuli s roztokem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a tampon pro odběr biologického vzorku v aseptickém balení.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-53A CZ309658B6 (cs) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada |
| PCT/CZ2022/050014 WO2022167017A1 (en) | 2021-02-08 | 2022-02-07 | Liquid composition for molecular diagnostics by pcr |
| US18/274,888 US20240093266A1 (en) | 2021-02-08 | 2022-02-07 | Liquid composition for molecular diagnostics by pcr |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-53A CZ309658B6 (cs) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ202153A3 CZ202153A3 (cs) | 2022-08-17 |
| CZ309658B6 true CZ309658B6 (cs) | 2023-06-21 |
Family
ID=80625131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2021-53A CZ309658B6 (cs) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240093266A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ309658B6 (cs) |
| WO (1) | WO2022167017A1 (cs) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013050881A2 (en) * | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Spartan Bioscience Inc. | Direct nucleic acid analysis |
| EP3636769A1 (en) * | 2017-04-28 | 2020-04-15 | Leadway (HK) Limited | Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof |
| CN111139313A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-12 | 深圳市尚维高科有限公司 | 一种高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒及方法 |
| CN112176029A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-01-05 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种拭子核酸样本释放剂及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004523229A (ja) * | 2001-01-16 | 2004-08-05 | インヴィトロジェン コーポレーション | Ｒｎａ単離のための試薬 |
| CA2901406A1 (en) * | 2014-02-04 | 2015-08-13 | Syngenta Participations Ag | Genomic dna extraction reagent and method |
| CN109371121A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-02-22 | 成都凡迪医疗器械有限公司 | 一种用于产前诊断染色体异常的试剂盒 |
-
2021
- 2021-02-08 CZ CZ2021-53A patent/CZ309658B6/cs unknown
-
2022
- 2022-02-07 WO PCT/CZ2022/050014 patent/WO2022167017A1/en not_active Ceased
- 2022-02-07 US US18/274,888 patent/US20240093266A1/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013050881A2 (en) * | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Spartan Bioscience Inc. | Direct nucleic acid analysis |
| EP3636769A1 (en) * | 2017-04-28 | 2020-04-15 | Leadway (HK) Limited | Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof |
| CN111139313A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-12 | 深圳市尚维高科有限公司 | 一种高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒及方法 |
| CN112176029A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-01-05 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种拭子核酸样本释放剂及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JØRGENSEN, Rikke Lind, a kol. An in-well direct lysis method for rapid detection of SARS-CoV-2 by real time RT-PCR in eSwab specimens. Journal of Virological Methods, 8.1.2021, 289: 114062. ISSN: 0166-0934, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2021.114062 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240093266A1 (en) | 2024-03-21 |
| WO2022167017A1 (en) | 2022-08-11 |
| CZ202153A3 (cs) | 2022-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108291250B (zh) | 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法 | |
| JP5290987B2 (ja) | 核酸増幅用サンプルの調製方法及び調製キット | |
| NL8900725A (nl) | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. | |
| CN111088319B (zh) | 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法 | |
| JP2017093464A (ja) | イオン性界面活性剤による細胞の選択的溶解 | |
| Abd-Elghaffar et al. | Inactivation of rabies virus by hydrogen peroxide | |
| Pérez-Sancho et al. | Development and evaluation of an IS711-based loop mediated isothermal amplification method (LAMP) for detection of Brucella spp. on clinical samples | |
| IL197139A (en) | A product and methods for identifying a biological organism | |
| Daum et al. | A clinical specimen collection and transport medium for molecular diagnostic and genomic applications | |
| WO2022031992A1 (en) | Lysis buffer compositions and methods for preparing a viral biological sample useful for covid-19 testing | |
| WO2021010239A1 (ja) | Ｒｎａウイルス検出方法 | |
| CZ309658B6 (cs) | Roztok pro molekulární diagnostiku virových infekcí pomocí PCR a odběrová sada | |
| CN113699144B (zh) | 一种pt-1或其有效成分在病原微生物检测的新用途及病原微生物检测样本的处理方法 | |
| CA2923833C (en) | Methods for measuring cell-free virus particles from dried blood spots | |
| Lalonde et al. | Effect of storage media, temperature, and time on preservation of Cryptosporidium parvum oocysts for PCR analysis | |
| US6670116B2 (en) | Methods for the detection, quantification and differentiation of infectious versus non-infectious pathogens in a sample | |
| WO2023057422A1 (en) | Universal buffer in methods for safe and rapid detection of pathogen infection | |
| JP2018000124A (ja) | ウイルスからの核酸抽出増幅キット及びそれを用いた抽出増幅方法 | |
| EP4288563B1 (en) | Liquid composition for molecular diagnostics by pcr | |
| CN111926055B (zh) | 一种hpv样品采集保存卡及其制备方法 | |
| US6649339B1 (en) | Method for producing a quality assured biological sample and composition containing the same | |
| Yang et al. | Collection and disinfection of forensic biological specimens in five cases concerning COVID-19 in Guangzhou, China | |
| WO2023052798A1 (en) | New virus transport medium | |
| KR100481357B1 (ko) | 바이러스 핵산 추출용 조성물 | |
| Esnault et al. | Optimisation of rapid untargeted nanopore DNA virus metagenomics using cell cultures and calves experimentally infected with bovine herpes virus-1 |