CZ305223B6

CZ305223B6 - Způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene

Info

Publication number: CZ305223B6
Application number: CZ2014-269A
Authority: CZ
Inventors: Irena Vopálenská; Zdenka Palková; Libuše Váchová
Original assignee: Univerzita Karlova V Praze; Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2015-06-17
Also published as: CZ2014269A3

Abstract

Řešení popisuje způsob cílené modifikace kvasinkového kmene umožňující detekci těžkých kovů či jiných škodlivin v životním prostředí, popřípadě dalších látek významných průmyslově, medicínsky, biotechnologicky. Tento systém využívá kvasinkové indukovatelné promotory a přerušení AMP biosyntetické dráhy delecí genu ADE2 nebo ADE1, které vyvolá zčervenání kvasinkové kultury v přítomnosti konkrétní škodliviny/látky. Součástí řešení je rovněž způsob detekce, velmi jednoduchý, rychlý a nenáročný na přístrojové vybavení. Detekční kvasinkový kmen, imobilizovaný v alginátových kuličkách, je nejdříve přes noc staticky inkubován v přítomnosti testovaného vzorku. Poté jsou kuličky vystaveny působení kyslíku a během několika minut je možné určit, zda byla v testovaném vzorku přítomna testovaná látka a případně i přibližně kvantifikovat její množství.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká testování přítomnosti toxických, případně jiných látek (např. cukrů apod.) v životním prostředí (či jinde) pomocí modifikovaného kvasinkového kmene. Metoda založená na modifikovaných kvasinkových kmenech využívá indukovatelné kvasinkové promotory a přerušení biosyntetické dráhy adenosinmonofosfátu (AMP) delecí genu ADE2. Delece genu ADE2 způsobí červenání kvasinkové kultury. Paralelní výměna přirozeného promotoru pro gen ADE5,7 na jiném místě téhož genomu za promotor indukovatelný určitou testovanou látkou pak vede k hromadění červeného barviva pouze v přítomnosti této látky. Množství produkovaného barviva a tedy intenzita zbavení kvasinkových buněk je úměrná množství testované látky. Díky tomu, že kvasinkový kmen obsahující mutace zavedené do biosyntetických drah (AMP), které zodpovídají za tvorbu červeně zbarveného pigmentu, a za zbarvení kvasinky může být indukován promotory citlivými k různým látkám, je tento systém universální.

Dosavadní stav techniky

Kontaminace těžkými kovy představuje pro lidské zdraví (a další suchozemské i vodní organizmy) závažný problém. Některé těžké kovy jsou toxické již při velmi malých koncentracích a nejsou přirozeně odbouratelné, a proto zůstávají a hromadí se v životním prostředí. Značná část těžkých kovů se dostává do systému povrchových vod a hromadí se v sedimentech.

Pro stanovení těžkých kovů je používáno mnoho analytických metod od spektrofotometrických až po elektrochemické. Běžné analytické metody pro stanovení těžkých kovů (např. AAS, ICPOES, 1CP-MS) jsou časově a finančně náročné a vyžadují vysoce kvalifikovaný personál. Velice spolehlivě měří celkovou koncentraci kovových iontů (včetně nerozpustných forem těžkých kovů), neposkytují však žádnou informaci o koncentraci kovů schopných interagovat s biologickou molekulou nebo živým organizmem. Tuto vlastnost mají biosenzory, umožňující rychlé, citlivé a specifické stanovení látek. Moderní biosenzory umožňují sledovat změny koncentrace analytu v reálném čase a in šitu.

Biosenzor je analytické zařízení obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem, nebo jeho součástí. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupin) chemických látek ve vzorku (Rechnitz 1991).

První skupinou biosenzorů jsou biosenzory založené na enzymech, které využívají schopnosti těžkých kovů vázat se na proteiny. Využívá se toho, že těžké kovy (Cu, Pb, Hg, Zn) inhibují (popřípadě aktivují) enzymy, především reakcí s postranními řetězci cysteinu.

Pro konstrukci biosenzorů se využívají rovněž neenzymové proteiny, které mají schopnost vázat kovy. Jsou to například protein GST-SmtA, syntetický fytochelatin a proteiny zodpovědné za rezistenci ke rtuti u baktérií (transkripční aktivátor MerR a periplazmatický protein MerP).

Vysoce senzitivní jsou jak imunochemické senzory využívající vazbu antigenu a protilátky, tak i DNA biosenzory, využívající afinity těžkých kovů k DNA.

Důležitou skupinou jsou biosenzory založené na celých buňkách. Často využívají stejné enzymatické reakce jako senzory enzymatické, jsou však levnější a rozlišují mezi škodlivinami nebezpečnými pro biologické systémy a neškodnými formami těchto látek (např. nerozpustné sloučeniny těžkých kovů). Není také potřeba zajišťovat vhodné podmínky pro fungování enzymů, protože uvnitř buněk mají přirozeně optimální prostředí.

- 1 CZ 305223 B6

Jako součást senzorů pro detekci těžkých kovů byly použity následující nemodifikované bakterie. Luminiscenční bakterie Photobacterium phosphoreum byla imobilizována a použita jako biosenzor pro stanovení glukózy a toxických molekul včetně chrómu Cr^VI. Stanovení je založeno na měření intenzity světla emitovaného bakteriemi. V přítomnosti glukózy luminiscence rostla, v přítomnosti toxických látek naopak klesala I₅₀ bylo dosaženo při koncentraci 0,85 mmol.l¹ Cr^VI(LeeeZo/. 1992).

Inhibici bakteriálního růstu (halotolerantní Microbacteriaceae) v přítomnosti Cu¹¹ iontů monitoroval piezoelektrický biosenzor. Inhibiční efekt na biomasu byl zaznamenán při koncentraci v rozmezí 18,0-25,0 ppm (pg/l) (0,28-0,39 mmol.l ’). (Yamasaki et al. 2004).

Široké uplatnění mají geneticky modifikované organizmy. Nejdříve byly využívány pro přípravu bioluminiscenčních biosenzorů. Tauriainen et al. (1998) připravili plazmid nesoucí luciferázový reportérový gen (lucFF) pod kontrolou cadA promotoru (gen cadA je nezbytný pro rezistenci ke kadmiu u S. aureus). Expresi reportérového genu v závislosti na extracelulámě přidaných těžkých kovech studovali u grampozitivních (Staphylococcus aureus) i gramnegativních bakterií (Bacillus subtilis). Nejnižší detekovatelné koncentrace pro Cd¹¹ a Pb¹¹ byly 10 a 33 mmol.E¹ (u kmene 5. aureus). Doba stanovení byla 2 až 3 hodiny.

Corbisier et al. (1999) použili bakterii Alcaligenes eutrophus (nejnověji Ralstonia metallidurans) a luxCDABE (z Vibrio fischeri) reportérový systém. Jako promotor posloužily těžkými kovy indukovatelné oblasti promotoru σ-54. Bakterie byla imobilizována v alginátu. Nejnižší detekovaná koncentrace byla 1,0 pmol.l¹ pro Cu¹¹ (doba detekce - 1,5 h) a Cr¹¹ a 0,5 pmol.l ¹ pro Pb¹¹.

Podobný bioluminiscenční biosenzor založený na Alcaligenes eutrophus imobilizovaném v alginátu a reportérovém operonu luxCDABE pod kontrolou promotoru indukovatelného mědí popsali rovněž Leth et al. (2002). Systém zdokonalili použitím optického vlákna a nejnižší detegovatelná koncentrace měďnatých iontů byla 1 pmol.l ¹

Stoyanov et al. (2003) použilo pro konstrukci bioluminiscenčního biosenzorů reportérový lux gen (E fischeri) pod kontrolou promotoru a aktivátoru copA/CueR (E. coli; viz kapitola 2.2.). Detekovali tak pomocí E. coli přítomnost Cu¹¹, Ag¹ a Au¹¹¹.

Jako bioluminiscenční biosenzor se rovněž používá bakterie Burkholderia s lux markérem, s detekčními limity 1,7 pg.ml“¹ a 0,09 pg/ml pro Zn¹¹ a Cu¹¹ (Chinalia et al. 2008).

První mikrobiální ampérometrický biosenzor vyvinuli Lehmann et al. (2000). Použili rekombinantní kvasinku Saccharomyces cerevisiae s plazmidy s lacZ genem (z E. coli) regulovaným promotorem CUP1 (ze 5. cerevisiae), který je indukovatelný mědí. Přítomnost mědi v médiu umožňuje kvasince využívat laktózu jako zdroj uhlíku, což vede ke změně spotřeby kyslíku v buňce. Senzor detekoval Cu¹¹ v rozmezí 0,5 až 2 pmol.l ¹ CuSO₄; potřebná doba inkubace byla 20 minut.

Podobný ampérometrický detekční systém založený na rekombinantní Saccharomyces cerevisiae (CUPl promotor fúzovaný s lacZ genem) a průtokové vstřikovací analýze (F1A; metoda automatické analýzy) vyvinuli Tag et al. (2007).

Mědí indukovatelný CUPl promotor použili pro konstrukci biosenzorů rovněž Shetty et al. (2004). Do kvasinky S. cerevisiae vnesli plazmid s genem pro GFPuv pod kontrolou promotoru CUPl. V přítomnosti měďnatých iontů dochází k aktivaci promotoru CUPl (prostřednictvím transkripčního aktivátoru Acel) a produktu GFPuv. Množství produkovaného GFPuv bylo monitorováno prostřednictvím jeho fluorescence. Systém je schopen detekovat Cu¹¹ ionty už od koncentrace 0,5 pmol.l¹. Promotor není indukovatelný jinými kovovými ionty s výjimkou stříbra.

-2 CZ 305223 B6

Jiná kvasinka Rhodotorula mucilaginosa byla použita pro konstrukci voltametrického biosenzoru, který využívá vlastnosti kvasinkové biomasy adsorbovat těžké kovy z vodného roztoku. Uhlíková pastová elektroda byla modifikována lyofilizovanými buňkami R. mucilaginosa. Biosenzor vykazoval pro ionty Cu¹¹ lineární závislost v rozmezí koncentrací 10⁷-10 ⁵ mol.1“' (0,00640,64 mg/1); doba inkubace byla 15 minut (Yůce et al. 2010).

Biologickou složkou biosenzorů pro detekci těžkých kovů mohou být i mikrořasy. Např. neživá biomasa Tetraselmis chuii, jako součást uhlíkové pastové elektrody, pomocí pasivní adsorpce váže Cu¹¹ z roztoku. Detekční limit tohoto voltametrického biosenzorů pro Cu¹¹ je 4,6.10“¹⁰ mol.l¹ (Alpat et al. 2007). Řasu Chlorella vulgaris využívá např. fluorometrický biosenzor (Nguyen-Ngoc et al. 2009) a konduktometrický biosenzor (Chouteau et al. 2005) pro stanovení Cd¹¹.

Tekaya et al. (2013) připravili konduktometrický biosenzor měřící aktivitu alkalické fosfatázy (APA) sinice Arthrospira platensis (Spirulina). Buňky byly imobilizovány (adsorbovány) na keramickou část zlatého interdigitálního převodníku. V přítomnosti těžkých kovů byla aktivita APA inhibována. Detekční limit pro Cd¹¹ a Hg¹¹ byl 10 ²⁰ mol.l“¹.1₅₀ bylo dosaženo při koncentraci 10“¹⁹ mol.l¹ pro kadmium a 10“¹⁷ mol.l“¹ pro rtuť. Životnost biosenzorů byla 25 dní.

Námi připravený senzor je založený na celých buňkách a má výše popsané výhody buněčných senzorů. Jeho hlavní předností je, že nepotřebuje žádný fyzikálně-chemický převodník. Kvasinkové buňky mění barvu z bílé na červenou a detekce je pouze vizuální.

Jediný dosud popsaný senzor bez převodníku využívající celé buňky a vizuální detekci popisuje Yoshida et al. (2008). Tento senzor využívá červenou bakterii Rhodopseudomonas palustris k detekci jediné látky, arsenu. Vlastní detekce se výrazně odlišuje od námi vyvinutého detekčního systému. Senzor podle Yoshidy využívá kmen R. palustris s delecí genu crtl, který netvoří βkaroten a má proto modrozelené zbarvení. Tento kmen nese plazmid s genem crtl umístěným za promotorem Pars. V přítomnosti arsenu dochází k obnovení exprese genu crtl a buňky se zbarví červeně.

Námi připravený senzor se neomezuje na detekci jediné chemické látky. Promotor regulující gen ADE5,7 může být nahrazen i jinými promotory, specificky indukovatelnými odlišnými látkami. Předkládaný senzor je proto variabilní, využitelný pro detekci spektra různých látek, pro něž jsou k dispozici specifické promotory. Zde předkládaný senzor vykazuje rovněž vyšší stabilitu než senzor s modifikovaným plazmidem, neboť změna genetické informace při záměně promotorů je provedena přímo v genomu detekčního organismu. Skutečnost, že delece genu ADE2 postihuje důležitou metabolickou dráhu syntézy purinových nukleotidů, zajišťuje zároveň i vyšší bezpečnost nyní předkládaného senzoru. Jedná se o jedinečné řešení, které umožní snadnou a jednoznačnou detekci, zvláště při použití imobilizované verze detekčního systému.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene či rodu s konzervovanou drahou biosyntézy purinů, který umožní použití tohoto kmene pro detekci konkrétních látek v prostředí, zahrnující následující kroky:

A) u kvasinkového kmene se provede delece genu ADE2 či ADE1, jež vede k přerušení biosyntetické dráhy adenosinmonofosfátu a tím k hromadění červeného pigmentu,

B) do genomu kvasinkového kmene s touto delecí se před gen, zvolený ze skupiny zahrnující geny ADE5,7; ADE4, ADE8 a ADE6, jehož produkt se uplatňuje v biosyntetické dráze adenosinmonofosfátu dříve než produkt zmíněného deletovaného genu, vnese kvasinkový či jiný promotor,

-3 CZ 305223 B6 který je indukovatelný látkou, jež má být detekována a který si v kvasinkách zachovává svoji funkčnost.

Význakem předkládaného vynálezu je způsob modifikace zmíněného detekčního kvasinkového kmene, v němž se použije kmen Saccharomyces cerevisiae.

Význakem předkládaného vynálezu je dále způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene, při němž se provede delece genu ADE2.

Význakem předkládaného vynálezu je i způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene, při němž se zmíněný promotor vnese před gen ADE5,7.

Předmětem vynálezu je také cíleně modifikovaný kvasinkový kmen pro detekci konkrétních látek v prostředí, jehož biosyntetická dráha adenosinmonofosfátu je přerušena delecí genu ADE2 nebo ADE1 a současně je do jeho genomu před kódující sekvenci genu zvoleného ze skupiny, zahrnující geny ADE5,7; ADE4, ADE8 &ADE6, vložen promotor indukovatelný detekovanou látkou.

Význakem předkládaného vynálezu je nadto cíleně modifikovaný kvasinkový kmen, jehož biosyntetická dráha pro adenosinmonofosfát je přerušena delecí genu ADE2.

Význakem předkládaného vynálezu je také cíleně modifikovaný kvasinkový kmen, jehož vložený promotor je indukovatelný ionty Cu, Cd, Fe, galaktózou, nebo metabolity zvolenými ze skupiny zahrnující steroly, aminokyseliny, purinové a pyrimidinové báze.

Předmětem vynálezu je konečně i způsob detekce konkrétních látek v prostředí za použití cíleně modifikovaného kvasinkového kmene popsaného výše, který zahrnuje kroky, v nichž se:

a) připraví imobilizovaná kultura kvasinkového detekčního kmene imobilizací do alginátových kuliček nebo jiných matic, používaných pro imobilizací mikroorganismů,

b) připraví definované živné médium neobsahující adenin jako roztok A;

c) připraví roztok B doplněním živného média A testovaným vzorkem, a to v případě tekutého vzorku náhradou destilované vody v živném médiu, nebo ve formě další složky v případě pevného vzorku;

d) připraví roztok C doplněním roztoku A definovaným přídavkem detekované látky, sloužící jako kontrola;

e) připraví roztok D doplněním roztoku C definovaným přídavkem testovaného vzorku;

f) do každé ze zkumavek čtyřsložkové testovací sady připravené podle bodů b) až e) se vloží několik kuliček či jiné matrice s imobilizovaným detekčním kmenem;

g) všechny zkumavky s roztoky A až D, obsahujícími imobilizovaný detekční kmen, uloží do termostatu při 28 °C až 30 °C a inkubují se přes noc;

h) kuličky či jiné matrice s imobilizovaným detekčním kmenem se vyjmou z roztoků A až D a inkubují se na vzduchu při teplotě místnosti po dobu 5 až 20 minut, během níž dojde k zabarvení detekčního kmene v tom případě, že v testovaném vzorku byla přítomna detekovaná látka;

ch) z intenzity zabarvení kuliček či matric s imobilizovaným detekčním kmenem, kterého je dosaženo po 30 až 60 minutách při teplotě místnosti, se vyhodnotí koncentrace detekované látky.

-4CZ 305223 B6

Testovaným vzorkem se rozumí vzorek (např. odpadní nebo pitná voda, znečištěná půda a pod.), ve kterém je žádoucí stanovit, zda obsahuje testovanou látku (např. Cu¹¹, galaktózu či jinou chemickou látku).

Význakem předkládaného vynálezu je i způsob detekce, při níž je testovaným vzorkem voda, půdní vzorek nebo jiný průmyslově, biotechnologicky či medicínsky významný vzorek, např. roztoky při chemické přípravě nebo kultivační médium při biotechnologické přípravě některých látek nebo biologický materiál, ve kterých lze stanovit např. přítomnost cukrů či jiných metabolitů, sterolů a podobně. Medicínsky významným vzorkem se rozumí například krev, krevní plazma, krevní sérum, mozkomíšní mok, moč, tkáňový nebo buněčný lyzát, synoviální tekutina, plodová voda, ascites, pleurální tekutina, perikardiální tekutina, extrakt stolice, sliny, pot a semenná plazma.

Význakem předkládaného vynálezu je také způsob detekce, při němž inkubace v termostatu zahrnuje jak statickou kultivaci, tak i inkubaci za třepání.

Předkládaný vynález detekce je velmi rychlý a nenáročný na přístrojové vybavení. Detekovat je možné některé těžké kovy (například měďnaté ionty), případně i jiné látky, například galaktózu. Modifikovaný kmen v přítomnosti detekované látky změní barvu z bílé na červenou. Jedná se tedy o vizuální detekci bez potřeby jakéhokoliv speciálního zařízení. Na rozdíl od biosenzorů pro detekci těžkých kovů popsaných v literatuře je tato detekce velmi levná - nevyžaduje použití speciálních přístrojů. Potřebný je pouze modifikovaný kvasinkový kmen, s výhodou v imobilizované podobě, skladovatelný při cca 4 °C (v běžné chladničce), definované živné médium a termostat.

Kvasinky se imobilizují běžným způsobem, například do alginátových kuliček (Smidsrod et Skják-Braek 1990). Připravené alginátové kuličky jsou bílé. Při vlastní detekci jsou kuličky inkubovány ve zkumavce s definovaným médiem obsahujícím navíc vzorek (např. vzorek vody nebo půdní vzorek), v němž chceme stanovit přítomnost testované látky (např. měďnatých iontů).

Systém neumožňuje stanovit zcela přesnou hodnotu koncentrace detekované látky. Přesto je možné její koncentraci přibližně určit, pokud se pro detekci použije více kontrolních vzorků s různými koncentracemi detekované látky a případně i testovaný vzorek ve více různých koncentracích. Poté stačí porovnat zbarvení kvasinek (kuliček) v testovaném vzorku se zbarvením kvasinek v kontrolních vzorcích. Pro odlišení jemných odstínů růžové a červené je vhodné vyhodnotit zbarvení kuliček po 30 až 60 minutách kontaktu se vzduchem.

Detekci je možné provádět i při obvyklé inkubaci při 28 °C v třepačce. V tomto případě se kuličky vybarvují postupně a nejpozději po 18 hodinách kultivace je možné vyhodnotit zbarvení kuliček.

Výhodou statické kultivace je skutečnost, že k detekci množství např. Cu¹¹ iontů dojde velice rychle (do několika minut), a to až poté, co jsou kuličky vyjmuty z kultivačního média. Při statické kultivaci je na rozdíl od kultivace s třepáním eliminována možnost popraskání alginátových kuliček.

Popsaná modifikace kmene je založena na odstranění genu ADE2 z genomu. Delece genu ADE2 způsobuje přerušení dráhy biosyntézy purinů (dále AMP dráha; viz obr. 1). Nepřítomnost produktu genu ADE2 (AIR karboxylázy) je příčinou hromadění jejího substrátu AIR (P-ribosylaminoimidazolu). Za podmínek oxidativního metabolizmu se intermediát AIR mění na červený pigment, který se hromadí ve vakuolách. Kvasinkové buňky s ade2 delecí jsou proto červené, a to pokud respirují na živném médiu s nedostatkem adeninu (Ugolini et al. 1996). Pokud jsou stejné buňky kultivovány na živném médiu s dostatkem adeninu, dochází k zpětnovazební inhibici Ade4p koncovými produkty ADP a ATP. Dráha AMP se v takovém případě nespouští, nedochází k hromadění AIR intermediátu a ve výsledku jsou buňky bílé.

-5 CZ 305223 B6

Kmen s delecí ade2 je následně upraven vnesením indukovatelného promotoru před gen ADE5,7 (produkt tohoto genu se uplatňuje na počátku AMP dráhy; obr. 1). Výsledný kmen spouští AMP dráhu pouze v přítomnosti konkrétního induktoru, tj. látky, jejíž přítomnost má být detekována. V přítomnosti induktoru (např. Cu¹¹ iontů) a za podmínky nedostatku adeninu dochází ke hromadění intermediátu AIR a k červenému zbarvení buněk. Pokud induktor v kultivačním médiu není, protein Ade5,7p nevzniká a AMP dráha je zastavena dříve, než může vzniknout AIR intermediát. Kvasinkové buňky zůstávají bílé.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob detekce testované látky v testovaném vzorku (např. voda, půdní vzorek nebo další průmyslově, biotechnologicky či medicínsky významné vzorky). Detekce je s výhodou prováděna pomocí imobilizované kultury kvasinkového detekčního kmene, připravené např. běžně používanou imobilizaci do alginátových kuliček (Smidsrod et Skják-Braek, 1990) nebo jiných matric používaných pro imobilizaci mikroorganismů, případně dalších vhodných nosičů.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje dráhu biosyntézy purinů (AMP dráha; upraveno podle Rébora et al. 2001).

Obr. 2 znázorňuje kolonii kmene s delecí ADE2 genu (Saccharomyces cerevisiae BS) na komplexním YPD médiu a na komplexním médiu se zvýšenou koncentrací adeninsulfátu (YPAD).

Obr. 3 znázorňuje alginátové kuličky s imobilizovanými kvasinkami po statické kultivaci (19 h) v přítomnosti různých koncentrací měďnatých iontů (0 až 100 pmol.l¹) a po vystavení působení kyslíku (7 až 60 minut), a) kmen S. cerevisiae BSCu b) kmen S. cerevisiae BS.

Obr. 4 - znázorňuje buňky S. cerevisiae BSgal a S. cerevisiae BS kultivované 20 h na médiu s glukózou (SD médium) a na médiu s galaktózou (SDgal).

Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam používaných zkratek:
AAS	atomová absorpční spektrometrie
dsDNA	dvouřetězcová DNA
bo	50% inhibice
ICP-OES	optická emisní spektrometrie s buzením v indukčně vázané plazmě
ICP-MS	hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem
ppm	10 ⁴ % (tj. částí z milionu)
ssDNA	jednořetězcová DNA
AMP dráha	dráha biosyntézy purinů
AIR	P-ribosylaminoimidazol
LiAc	octan lithný
PEG	polyethylenglykol
NTC	nourseothricin
G418	geneticin
PCR	polymerázová řetězová reakce.

-6CZ 305223 B6

Princip stanovení

Značnou výhodou předkládaného vynálezu je skutečnost, že kuličky nebo jiné matrice imobilizující kvasinkový kmen nemusejí být inkubovány za třepání, ale jen staticky. Jsou ponořeny do média s testovaným vzorkem a přes noc umístěny v termostatu při zvýšené teplotě, s výhodou při teplotě 28 až 30 °C. Paralelně je třeba inkubovat další 3 různá kontrolní stanovení, tj. kuličky či jiné matrice v čistém živném médiu bez přídavků, v živném médiu s definovanou koncentrací testované látky a v živném médiu s definovanou koncentrací testované látky a zároveň s testovaným vzorkem (viz tab. 1).

Všechny kuličky či matrice ponořené v živných médiích zůstávají po celou dobu inkubace bílé. Zbarvují se až po vyjmutí z média, tedy po vystavení účinku kyslíku. Po několika minutách na vzduchu dojde k růžovému až červenému zbarvení kvasinkových buněk v těch kuličkách či matricích, které byly přes noc inkubovány v médiu, v němž byla přítomna detekovaná látka. Intenzita zbarvení je pak úměrná koncentraci detekované látky v médiu.

Správnost stanovení se ověřuje podle tří kontrolních stanovení (tab. 1). Kuličky či matrice po inkubaci v čistém médiu musejí být bílé. Kuličky či matrice po kultivaci v médiu s definovanou koncentrací detekované látky musejí být červené. Pokud jsou kuličky či matrice po kultivací v médiu s testovaným vzorkem bílé a zároveň jsou bílé i kuličky či matrice po inkubaci v médiu s testovaným vzorkem a detekovanou látkou, je pravděpodobné, že došlo k inhibici metabolizmu kvasinek. Příčinou může být příliš vysoká koncentrace detekované látky v testovaném vzorku, anebo vysoká koncentrace jiné neznámé škodliviny v testovaném vzorku. V tomto případě je třeba snížit koncentraci testovaného vzorku v živném médiu.

Tab. 1: Uspořádání stanovení cizorodé látky

	stanovení	kontrolní stanovení	vyhodnocení
	médium + test. vzorek; (B)	médium + test. vzorek, test. látka; (D)	médium + test. látka; (C)	médium (A)
zbarvení mobilizova- ných kvasinek	bílá	bílá	červená	bílá	inhibice metabolizmu; je potřeba snížit koncentraci testovaného vzorku v médiu
bílá	červená	červená	bílá	vzorek neobsahuje testovanou látku
červená	červená	červená	bílá	vzorek obsahuje testovanou látku
červená	bílá	červená	bílá	vzorek obsahuje testovanou látku v hraniční koncentraci*

(* v médiu s testovaným vzorkem patrně došlo v souhrnu s detekovanou látkou k překročení kritické koncentrace detekované látky a k inhibici metabolizmu kvasinek)

Použité kmeny kvasinek:

BY4742 (AÍATa, his3A 1; leu2A 0; lys2A 0; ura3A 0) - kmen zakoupený ze sbírky Euroscarf.

-7 CZ 305223 B6

BS (MATa; ade2A) - na našem pracovišti připravený kmen.

BSCu (MATa; ade2A; Pcupl-ADE5,7) - na našem pracovišti připravený kmen, uložený v České sbírce mikroorganismů (Česká sbírka mikroorganismů, Masarykova universita, Přírodovědecká fakulta, Kamenice 5, budova A25, Brno, dále jen CCM) pod přírůstkovým č. 8521.

BSgal (MATa; ade2A; Pgall-ADE5,T) - na našem pracovišti připravený kmen, uložený v CCM pod přírůstkovým č. 8520.

Použitá média:

YPD - 0,5% kvasničný autolyzát, 1% pepton, 2% glukóza

YPAD - 0,5% kvasničný autolyzát, 1% pepton, 2% glukóza, 40 mg.r¹ adeninsulfátu

Plotny s pevným YPD a YPAD médiem byly připraveny s 2% agarem. V případě, potřeby, byla média doplněna geneticinem (Sigma-Aldrich; 400pg.mr'; YPD-G418); nebo nourseothricinem (Werner BioAgents; lOOpg.ml¹; YPD-NTC).

MM - 0,5% (NH₄)₂SO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,1% Wickerhamův roztok (Wickerham 1943-51; Burkholder 1943), 2% glukóza

SD - 0,17% YNB bez aminokyselin a (NH₄)₂SO₄ - YNB bez aminokyselin (Difco), 0,5% (NH₄)₂SO₄, 2% glukóza

SDgal - 0,17% YNB bez aminokyselin a (NH₄)₂SO₄ - YNB bez aminokyselin (Difco), 0,5% (NH4)₂SO₄, 2% galaktóza

Auxotrofní aminokyseliny a báze do MM, SD a SDgal médií byly přidány v koncentraci 50 mg.l“¹ (L-histidin, L-leucin, L-lysin), 30 mg.l¹ (uráčil) a případně 4 mg.r¹ (adeninsulfát). Cu¹¹ ionty byly přidávány v koncentraci 0-100 μΜ.

Veškeré procentní údaje jsou procenta hmotností vztažená k objemu (hmotn./objem).

Transformace kvasinek:

Buňky kmenů BY4742 a BS byly transformovány LiAc/ssDNA/PEG metodou (Gietz et Woods 2002). Před výsevem na selekční médium (YPD-G418 nebo YPD-NTC) byly buňky inkubovány 3 hodiny v tekutém YPD v třepačce při 28 °C. Plotny byly inkubovány 4 dny při 28 °C. Imobilizace kvasinek v alginátu:

Kvasinkové buňky byly kultivovány do stacionární fáze (6 dní) v tekutém YPAD za třepání při 28 °C. Poté byly 0,2 ml kultury smíchány s 5 ml 3% roztoku alginátu ve vodě. Alginátové kuličky byly připraveny odkapáváním suspenze z pipetovací špičky (o objemu 1 ml) do roztoku 5% CaCl₂. Kuličky byly inkubovány 30 min při 4 °C. Po vytvrzení alginátu byly kvasinkové buňky v kuličkách pomnoženy při kultivaci v tekutém YPAD v třepačce při 28 °C. Kultivace trvala 1 nebo 2 dny. Poté byly kuličky uloženy v destilované vodě při teplotě 4 °C.

Delece genu ADE2\

Delece genu ADE2 byla provedena pomocí disrupční kazety využívající Cre/loxP systém (Gueldener et al. 2002). Kazeta byla amplifikována pomocí PCR s primery ADE2delFW (CAATCAAGAAAAACAAGAAAATCGGACAAAACAATCAAGTcagctgaagcttcgtacgc) a ADE2delRV

-8CZ 305223 B6 (ATAATTATTTGCTGTACAAGTATATCAATAAACTTATATAgcataggccatagtggatctg), které jsou homologní k přilehlým oblastem genu ADE2 a komplementární k plazmidu pUG6 (nesoucímu reportérový gen kanMX). Kazeta byla transformována do kvasinkových buněk. Transformanty byly pozitivně selektovány na YPD-G418 médiu. U selektovaných klonů byla pomocí PCR (PCR na celých buňkách) ověřena přítomnost kanMX a nepřítomnost genu ADE2. Získaný kmen byl označen BS.

Vložení promotoru CUP1-1 a GALE.

Vložení promotoru CUP1-1 a promotoru GAL1 před gen ADE5,7 bylo provedeno pomocí PCR kazet (Janke et al. 2004). Kazety byly amplifikovány pomocí PCR s příměry ADE5,7-S1FW (TCTTAATCATAGCTTAAGAGAACCATTCTCCCTCCCCTCACAATGcgtacgctgcaggtcgac) a ADE,57-S4RV (CAAGAACGTGTTCTCTTGCACCGTTTCCTAAAACGAGAATGTTGAGcatcgatgaattctctgtc g), které jsou homologní k okolí ATG tripletu genu ADE5,7 a komplementární kplazmidům pYM-N2 (nesoucímu promotor CUP1-E) a pYM-N23 (nesoucímu promotor GAL1). Oba plazmidy obsahují reportérový gen natNT2. Kazety byly transformovány do kvasinkových buněk. Transformanty byly pozitivně selektovány na YPD-NTC médiu. U selektovaných klonů byla pomocí PCR (PCR na celých buňkách) ověřena přítomnost natNT2. Kmen s promotorem CUP11 byl označen BSCu. Kmen s promotorem GAL1 byl označen BSgal. U kmene BSCu bylo sekvenováním ověřeno správné umístění promotoru CUP1-1 před genem ADE5,7.

Příklad 1

Detekce měďnatých iontů - kmen S. cerevisiae BSCu

Gen ADE2 byl deletován pomocí Cre/loxP systému (Gueldener et al. 2002) u kmene S. cerevisiae BY4742. Získaný kmen (S. cerevisiae BS) se při kultivaci na médiu s omezeným množstvím adeninu (YPD médium) zbarvuje dočervena a na médiu s nadbytkem adeninu (YPAD médium) je bílý (obr. 2).

Kmen BS s delecí ade2 byl dále upraven vnesením promotoru indukovatelného Cu¹¹ ionty (promotor CUPE, Janke et al. 2004) před gen ADE5,7 (produkt tohoto genu se uplatňuje na počátku AMP dráhy; obr .1). Výsledný kmen S. cerevisiae BSCu spouští AMP dráhu pouze v přítomnosti Cu¹¹ iontů. V přítomnosti Cu¹¹ tedy dochází ke hromadění intermediátů AIR a k červenému zbarvení buněk. Pokud Cu¹¹ ionty v kultivačním médiu nejsou, protein Ade5,7p nevzniká a dráha je zastavena dříve, než může vzniknout AIR intermediát. Kvasinkové buňky zůstávají bílé. Promotor CUP1 není indukovatelný jinými kovovými ionty s výjimkou stříbra.

Kvasinky kmene BSCu a kontrolního kmene BS byly imobilizovány v alginátových kuličkách. Kvasinky v kuličkách narostly během 40 hodin kultivace v třepačce v tekutém YPAD. V YPAD médiu kvasinky nezčervenají díky vysoké koncentraci adeninsulfátu. Předkultivované kuličky byly uskladněny ve 4 °C (v lednici).

Kuličky byly inkubovány staticky v termostatu při 28 °C v tekutém MM médiu bez adeninu s přídavkem Cu¹¹ iontů o různých koncentracích (0 až 100 μιηοΙ.Γ¹). Protože kultivace probíhala bez aerace (tedy s omezeným přístupem kyslíku), všechny kuličky obou kmenů byly i po 19 hodinách bílé (bez ohledu na koncentraci měďnatých iontů). Po této kultivaci byly bílé kuličky vyndány z média na podložní sklíčko. Už po několika minutách na vzduchu začaly všechny kuličky kmene BS a kuličky kmene BSCu kultivované v přítomnosti vyšších koncentrací Cu¹¹ iontů měnit barvu. Po 30 minutách bylo možno u kmene BSCu pozorovat růst intenzity zbarvení v závislosti na koncentraci Cu¹¹ iontů (od 0,2 do 100 μιηοΙ.Γ¹). Po 1 h kultivace byly rozdíly v odstínech ještě nápadnější (obr. 3a). Kontrolní kmen BS se vybarvoval intenzivně a bez ohledu na koncentraci mědi (obr. 3b).

-9CZ 305223 B6

Příklad 2

Detekce galaktózy - kmen S. cerevisiae BSgal

Gen ADE2 byl deletován pomocí Cre/loxP systému (Gueldener et al. 2002) u kmene 5. cerevisiae BY4742. Získaný kmen (& cerevisiae BS) se při kultivaci na médiu s omezeným množstvím adeninu (YPD médium) zbarvuje dočervena na médiu s nadbytkem adeninu (YPAD) je bílý (obr. 2).

Kmen BS s delecí ade2 byl dále upraven vnesením promotoru indukovatelného galaktózou (promotor GALE, Janke et al. 2004) před gen ADE5,7 (produkt tohoto genu se uplatňuje na počátku AMP dráhy; obr. 1). Výsledný kmen S. cerevisiae BSgal spouští AMP dráhu pouze v přítomnosti galaktózy. V přítomnosti galaktózy tedy dochází ke hromadění intermediátu AIR a k červenému zbarvení buněk. Pokud galaktóza v kultivačním médiu není, protein Ade5,7p nevzniká a dráha je zastavena dříve, než může vzniknout AIR intermediát. Kvasinkové buňky zůstávají bílé.

Kvasinky kmene BSgal byly 1 den kultivovány na pevném YPAD médiu. Hustá suspenze čerstvě narostlých buněk byla potom nanesena na pevná média bez adeninu: SD s 2% glukózou, SDgal s 2% galaktózou. Kontrolní kmen BS zčervenal na obou médiích. Kmen BSgal zčervenal pouze na médiu s galaktózou (obr. 4). BSgal tedy detekuje přítomnost galaktózy v médiu.

Průmyslová využitelnost

Vyvinutý systém je určen pro detekci těžkých kovů a jiných škodlivin, případně i jiných látek významných průmyslově, medicínsky, biotechnologicky. Je plně funkční, jak bylo ověřeno na kmenu V cerevisiae BSCu, který je schopen detekovat Cu¹¹ ionty v koncentraci 0,2 až 100 pmol.l¹ (vyšší koncentrace nebyla testována).

Měď patří mezi těžké kovy a při zvýšených koncentracích v životním prostředí působí toxicky. Zvýšené koncentrace antropogenního původu jsou nalézány v oblastech těžby mědi a v blízkosti továren, které se zabývají jejím zpracováním. Příčinou kontaminace pitné vody v domácnostech mohou být měděné vodovodní rozvody. Hygienický limit obsahu mědi v pitné vodě je 1 mg/1 (15,7 pmol.r¹). Tuto koncentraci je námi vyvinutý systém schopen detekovat. Při použití kontrolního vzorku s 15,7 pmol.l¹ koncentrací měďnatých iontů je možné snadno určit, zdaje koncentrace měďnatých iontů v testovaném vzorku vyšší nebo nižší než povolený limit.

Metodu je možno použít i pro velmi znečištěné vzorky. Díky použití výše popsaných kontrolních testů je snadné určit, že kontaminace inhibuje detekční kmen a je tedy třeba testovaný vzorek vhodně naředit. Detekce měďnatých iontů je prvním příkladem použití tohoto systému. Využití zahrnuje i detekci dalších škodlivin, např. kademnatých iontů.

Optimální pro tento způsob detekce je použití imobilizovaných kvasinek, které s sebou nese mnoho výhod. Detekční kmen imobilizovaný v alginátových kuličkách (nebo imobilizovaný jiným způsobem) se snadno skladuje ve zkumavkách se sterilní destilovanou vodou v lednici. Kvasinková kultura v kuličkách je odolná vůči kontaminaci, snadno se dávkuje, snadno se s ní manipuluje, snadno se přepravuje. Díky imobilizaci je detekce měďnatých iontů po inkubaci v živném médiu velice rychlá - výsledek je možné odečíst jen několik minut po vyjmutí kuliček s mobilizovaným kmenem z testovacího média.

- 10CZ 305223 B6

Použitá literatura:

Alpat S. K., Alpat §., Kutlu B., Ózbayrak Ó., Buyiiki§ik Η. B.: Development of biosorptionbased algal biosensor for Cu(II) using Tetraselmis chuii. Sensors and Actuators B, vol. 128, no. l,pp. 273-278 (2007).

Corbisier P., Lelie D., Borremans B., Provoost A., Lorenzo V., Brown N. L.; Lloyd J. R., Hobman J. L., Csoregi E., Johansson G., Mattiasson B.: Whole cell-and protein-based biosensors for the detection of bioavailable heavy metals in environmental samples. Anal Chim Acta 387, 235— 244 (1999).

Chinalia F. A., Paton G. I., Killham K. S.: Physiological and toxicological characterization of an engineered whole-cell biosensor. Bioresource Technology, vol. 99, no. 4, pp. 714-721 (2008).

Chouteau C., Dzyadevych S., Durrieu, C., Chovelon J. M.: A bi-enzymatic whole cell conductometric biosensor for heavy metal ions and pesticides detection in water samples. Biosensors and Bioelectronics, vol. 21, no. 2, pp. 273-281 (2005).

Lee S., Sodě K., Nakanishi K., Marty J. L., Tamiya E., Karube I.: A novel microbial sensor using luminous bacteria. Biosens Bioelectron. 7(4):273-7 (1992).

Lehmann M., Riedel K., Adler K., Kunze G.: Amperometric measurement of copper ions with adeputy substráte using a novel Saccharomyces cerevisiae sensor. Biosens. Bioelectron. Jun; 15(3-4):211-9(2000).

Leth S., Maltoni S., Simkus R. et al.·. Engineered bacteria based biosensors for monitoring bioavailable heavy metals. Electroanalysis, vol. 14, no. 1, pp. 35-42 (2002).

Nguyen-Ngoc H., Durrieu C., Tran-Minh C.: Synchronous-scan fluorscence of algal cells for toxicity assessment of heavy metals and herbicides. Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 72, no. 2, pp. 316-320 (2009).

Rechnitz G. A.: Biosensors into the 1990s. Electroanalysis 3: 73-76 (1991).

Shetty R. S., Deo S. K., Liu Y., Daunert S.: Fluorescence-based sensing systém for copper using genetically engineered living yeast cells. Biotechnol Bioeng. Dec 5;88(5):664—70 (2004).

Stoyanov J. V., Magnani D., Solioz M.: Measurement of cytoplasmic copper, silver, and gold with a lux biosensor shows copper and silver, but not gold, efflux by the CopA ATPase of Escherichia coli. FEBS Letters, vol. 546, no. 2-3, pp. 391-394 (2003).

Tag K., Riedel K., Bauer H. J., Hanke G., Baronian K. H. R., Kunze G.: Amperometric detection of Cu²⁺ by yeast biosensors using flow injection analysis (FIA). Sensors and Actuators B, vol. 122, no. 2, pp. 403-409 (2007).

Tauriainen S., Karp M., Chang W., Virta M.: Lumuniscent bacterial sensor for cadmium and lead. Biosensors and Bioelectronics, vol. 13, no. 9, pp. 931-938 (1998).

Tekaya N., Saiapina O., Ouada Hat. Ben, Lagarde F., Ouada Haf. Ben, Jaffrezic-Renault N.: Ultra-sensitive conductometric detection of heavy metals based on inhibition of alkaline phosphatase activity from Arthrospiraplatensis. Bioelectrochemistry. 90, Pages 24-29 (2013).

Yamasaki A., Cunha M. A., Oliveira J. A., Duarte A. C., Gomes Μ. T.: Assessment of copper toxicity using an acoustic wave sensor. Biosens Bioelectron 19(10), 1203-1208 (2004).

-11 CZ 305223 B6

Yoshida K., Inoue K., Takahashi Y., Ueda S., Isoda K.., Yagi K., Maeda I.: Novel carotenoidbased biosensor for simple visual detection of arsenite: characterization and preliminary evaluation for environmental application. Appl. Environ. Microbiol. Nov;74(21):6730-8 (2008).

Yiice Μ., H. Nazir H., Dónmez G.: A voltammetric Rhodotorula mucilaginosa modified microbial biosensor for Cu(II) determinativ. Bioelectrochemistry, vol. 79, no. 1, pp. 66-70 (2010).

Gueldener U., Heinisch J., Koehler G. J., Voss D., Hegemann J. H.: A second set of loxP markér cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast. Nucleic Acids Res. Mar 15;30(6):e23 (2002).

Janke C., Magiera Μ. M., Rathfelder N., Taxis C., Reber S., Maekawa H., Moreno-Borchart A., Doenges G., Schwob E., Schiebel Ε., Knop M.: A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promotér substitution cassettes. Yeast. Aug;21 (11):947-62 (2004).

Rébora K., Desmoucelles C., Bome F., Pinson B., Daignan-Fomier B.: Yeast AMP pathway genes respond to adenine through regulated synthesis of a metabolic intermediate. Mol Cell Biol. Dec;21(23):7901-12 (2001).

Smidsrod O., Skják-Braek G.: Alginate as immobilization matrix for cells. Trends Biotechnol. Mar;8(3):71-8 (1990).

Ugolini S., Bruschi C. V.: The red/white colony color assay in the yeast Saccharomyces cerevisiae·. epistatic growth advantage of white ade8-18, ade2 cells over red ade2 cells. Curr Genet. Dec;30(6):485-92 (1996).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene či rodu s konzervovanou drahou biosyntézy purinů, který umožní použití tohoto kmene pro detekci konkrétních látek v prostředí, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

A) u kvasinkového kmene se provede delece genu ADE2 či ADE1, \qž vede k přerušení biosyntetické dráhy adenosinmonofosfátu a tím k hromadění červeného pigmentu,

B) do genomu kvasinkového kmene s touto delecí se před gen, zvolený ze skupiny zahrnující geny ADE5,7; ADE4, ADE8 a ADE6, jehož produkt se uplatňuje v biosyntetické dráze adenosinmonofosfátu dříve než produkt zmíněného deletovaného genu, vnese kvasinkový či jiný promotor, který je indukovatelný látkou, jež má být detekována, a který si v kvasinkách zachovává svoji funkčnost.
2. Způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Saccharomyces cerevisiae.
3. Způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se provede delece genuADE2.
4. Způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že zmíněný promotor se vnese před gen ADE5,7.

- 12CZ 305223 B6
5. Cíleně modifikovaný kvasinkový kmen pro detekci konkrétních látek v prostředí, jehož biosyntetická dráha adenosinmonofosfátu je přerušena delecí genu ADE2 nebo ADE1 a současně je do jeho genomu před kódující sekvenci genu zvoleného ze skupiny, zahrnující geny ADE5,7; ADE4, ADE8 a ADE6, vložen promotor indukovatelný detekovanou látkou.
6. Cíleně modifikovaný kvasinkový kmen, podle nároku 5, jehož biosyntetická dráha adenosinmonofosfátu je přerušena delecí genu ADE2.

Ί. Cíleně modifikovaný kvasinkový kmen, podle nároku 5 nebo 6, jehož vložený promotor je indukovatelný ionty Cu, Cd, Fe, galaktózou, nebo metabolity zvolenými ze skupiny zahrnující steroly, aminokyseliny, purinové a pyrimidinové báze.
8. Způsob detekce konkrétních látek v prostředí za použití cíleně modifikovaného kvasinkového kmene podle nároků 5, 6 nebo 7, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, v nichž se:

a) připraví imobilizovaná kultura kvasinkového detekčního kmene imobilizací do alginátových kuliček nebo jiných matric, používaných pro imobilizací mikroorganismů,

b) připraví definované živné médium neobsahující adenin jako roztok A;

c) připraví roztok B doplněním živného média A testovaným vzorkem, a to v případě tekutého vzorku náhradou destilované vody v živném médiu, nebo ve formě další složky v případě pevného vzorku;

d) připraví roztok C doplněním roztoku A definovaným přídavkem detekované látky, sloužící jako kontrola;

e) připraví roztok D doplněním roztoku C definovaným přídavkem testovaného vzorku;

f) do každé ze zkumavek čtyřsložkové testovací sady připravené podle bodů b) až e) se vloží několik kuliček či jiné matrice s imobilizovaným detekčním kmenem;

g) všechny zkumavky s roztoky A až D, obsahujícími imobilizovaný detekční kmen, uloží do termostatu při 28 °C až 30 °C a inkubují se přes noc;

h) kuličky či jiné matrice s imobilizovaným detekčním kmenem se vyjmou z roztoků A až D a inkubují se na vzduchu při teplotě místnosti po dobu 5 až 20 minut, během níž dojde k zabarvení detekčního kmene v tom případě, že v testovaném vzorku byla přítomna detekovaná látka;

ch) z intenzity zabarvení kuliček či matric s imobilizovaným detekčním kmenem, kterého je dosaženo po 30 až 60 minutách při teplotě místnosti, se vyhodnotí koncentrace detekované látky.
9. Způsob detekce podle nároku 8, vyznačující se tím, že testovaný vzorek se zvolí ze skupiny, zahrnující vodu, půdní vzorek, roztok používaný při chemické přípravě, kultivační médium, krev, krevní plazmu, krevní sérum, mozkomíšní mok, moč, tkáňový nebo buněčný lyzát, synoviální tekutinu, plodovou vodu, ascites, pleurální tekutinu, perikardiální tekutinu, extrakt stolice, sliny, pot a semennou plazmu.
10. Způsob detekce podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že inkubace v termostatu se provádí statickou kultivací nebo inkubací za třepání.