CZ299567B6 - Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho - Google Patents
Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299567B6 CZ299567B6 CZ20080247A CZ2008247A CZ299567B6 CZ 299567 B6 CZ299567 B6 CZ 299567B6 CZ 20080247 A CZ20080247 A CZ 20080247A CZ 2008247 A CZ2008247 A CZ 2008247A CZ 299567 B6 CZ299567 B6 CZ 299567B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- acetylcholinesterase inhibitor
- inhibitor according
- isolation
- acetylcholinesterase
- acetone
- Prior art date
Links
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000192673 Nostoc sp. Species 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 34
- 229940100578 Acetylcholinesterase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 30
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims abstract 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 2
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 2
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims 2
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 claims 1
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 claims 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 abstract description 3
- MCFZBCCYOPSZLG-UHFFFAOYSA-N cyclopent-4-ene-1,3-dione Chemical compound O=C1CC(=O)C=C1 MCFZBCCYOPSZLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 abstract 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 2
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 abstract 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 abstract 1
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 13
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 108010053652 Butyrylcholinesterase Proteins 0.000 description 7
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 description 7
- ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N galanthamine Chemical compound O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CC[C@]23[C@@H]1C[C@@H](O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- HPOIPOPJGBKXIR-UHFFFAOYSA-N 3,6-dimethoxy-10-methyl-galantham-1-ene Natural products O1C(C(=CC=2)OC)=C3C=2CN(C)CCC23C1CC(OC)C=C2 HPOIPOPJGBKXIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LPCKPBWOSNVCEL-UHFFFAOYSA-N Chlidanthine Natural products O1C(C(=CC=2)O)=C3C=2CN(C)CCC23C1CC(OC)C=C2 LPCKPBWOSNVCEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003980 galantamine Drugs 0.000 description 3
- BGLNUNCBNALFOZ-WMLDXEAASA-N galanthamine Natural products COc1ccc2CCCC[C@@]34C=CCC[C@@H]3Oc1c24 BGLNUNCBNALFOZ-WMLDXEAASA-N 0.000 description 3
- ASUTZQLVASHGKV-UHFFFAOYSA-N galanthamine hydrochloride Natural products O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CCC23C1CC(O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IYVSXSLYJLAZAT-NOLJZWGESA-N lycoramine Natural products CN1CC[C@@]23CC[C@H](O)C[C@@H]2Oc4cccc(C1)c34 IYVSXSLYJLAZAT-NOLJZWGESA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229940123923 Butyrylcholinesterase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000277305 Electrophorus electricus Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000192656 Nostoc Species 0.000 description 2
- 101001003192 Vigna unguiculata Bowman-Birk type seed trypsin and chymotrypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N donepezil Chemical compound O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000208197 Buxus Species 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000192534 Dolichospermum flos-aquae Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-SEQYCRGISA-N Huperzine A Natural products N1C(=O)C=CC2=C1C[C@H]1/C(=C/C)[C@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-SEQYCRGISA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241000228168 Penicillium sp. Species 0.000 description 1
- XSVMFMHYUFZWBK-NSHDSACASA-N Rivastigmine Chemical compound CCN(C)C(=O)OC1=CC=CC([C@H](C)N(C)C)=C1 XSVMFMHYUFZWBK-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 240000002418 Sarcococca saligna Species 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-UHFFFAOYSA-N Shuangyiping Natural products N1C(=O)C=CC2=C1CC1C(=CC)C2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000186988 Streptomyces antibioticus Species 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960003530 donepezil Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- YREQHYQNNWYQCJ-UHFFFAOYSA-N etofenprox Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C(C)(C)COCC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 YREQHYQNNWYQCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- KDCIHNCMPUBDKT-UHFFFAOYSA-N hexane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCCCCC KDCIHNCMPUBDKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-YQEJDHNASA-N huperzine A Chemical compound N1C(=O)C=CC2=C1C[C@H]1\C(=C/C)[C@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-YQEJDHNASA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- -1 ketone aliphatic hydrocarbon Chemical class 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- RGQUDRQSJYJYAQ-UHFFFAOYSA-O nostocarboline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2C3=CC=[N+](C)C=C3NC2=C1 RGQUDRQSJYJYAQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000009116 palliative therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-BMIGLBTASA-N rac-huperzine A Natural products N1C(=O)C=CC2=C1C[C@@H]1C(=CC)[C@@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-BMIGLBTASA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 229960004136 rivastigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960001685 tacrine Drugs 0.000 description 1
- YLJREFDVOIBQDA-UHFFFAOYSA-N tacrine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=C(CCCC3)C3=NC2=C1 YLJREFDVOIBQDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N β-carboline Chemical group N1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Predmetem rešení je produkcní kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97, proces izolace nové biologickyaktivní látky z tohoto kmene a vlastní bioaktivnílátka vykazující inhibicní aktivitu vuci enzymu acetylcholinesterasa. Proces izolace spocívá v extrakci biomasy produkcního kmene methanolem, odparení surového methanolického extraktu do sucha, rozpuštení odparku v acetonu a vysrážení aktivní látky prídavkem nadbytku alifatického uhlovodíku. Aktivní látka se dále chromatograficky cistí postupne nasloupci polyamidu, silikagelu a pomocí semipreparativní HPLC na reverzní fázi C.sub.18.n.. Tím se získá inhibitor acetylcholinesterasy o strukturním vzorci 2,2´-bis[4,5-bis(4-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyfenyl)cyclopent-4-en-1,3-dion] o cistote vyšší než 98 %.
Description
Kmen sinice Nostoc sp, Lukešová 27/97 a způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z něho
Oblast techniky
Vynález se týká struktury bioaktivní látky s inhibiční aktivitou vůči acetylcholinesterase a metody izolace této látky z biomasy sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97.
Dosavadní stav techniky
Alzeimerova choroba je progresivní neurodegenerativní porucha centrální nervové soustavy, v současné době 10-15 % starší populace trpí různými formami demence z čehož okolo 70 % zahrnuje právě Alzeimerovu chorobu. Jelikož přesná příčina vzniku Alzeimerovy choroby není dosud zcela objasněna, uplatňují se při její paliativní léčbě především reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy.
Rada přírodních látek, které snižují aktivitu acetylcholinesterasy, byla izolována především z vyšších rostlin. Mezi typické příklady takovýchto látek patří různé alkaloidy, terpenoidy, glykosidy a kumariny izolované např. z Sarcococca saligna, Halonyxon recurvum nebo Buxus papillosa. Oproti tomu u mikroorganismů bylo nalezeno doposud jen několik producentů látek s inhibičním účinkem vůči acetylcholinesterase. Na základě výsledků testování více než 7000 mikroorganismů, především bakterií a hub, byly např. z kultivačního média Penicillium sp.
FO-4259 izolovány dva meroterpenoidy s vysoce selektivním inhibičním účinkem vůči acetylcholinesterase. Jako další příklady inhibitorů acetylcholinesterasy izolované z mikroorganismů mohou sloužit Streptomyces antibioticus a Streptomyces levandulae produkují cyklické organofosfáty. Z farmakologického hlediska jsou však tyto látky nevyužitelné, neboť v případě meroterpenoidů se jedná o látky s vedlejšími toxickými účinky a cyklické organofosfáty se na enzym vážou ireverzibilně.
Sekundární metabolity sinic se oproti vyšším rostlinám, houbám i baktériím liší nejen chemickou strukturou (např. alkaloidy, peptidy, fenoly, terpenoidy, polyethery), ale i spektrem biologických aktivit, jako je např. antibakteriální, aleopatická, antivirová, fungicidní nebo inhibiční účinky vůči řadě enzymů. Navzdory tomu nebyl dosud proveden prakticky žádný průzkum sinic na produkci inhibitorů acetylcholinesterasy. V současné době jsou známy pouze dva kmeny sinic, které produkují inhibitory cholinesteráz. Anabaena flos aquae)e producentem ireverzibilního inhibitoru acetylcholinesterasy anatoxinu-a(s). Druhým producentem je Nostoc 78-12A, který syntetizuje nostocarbolin, kvartémí β-karbolinový alkaloid, jehož inhibiční aktivita byla publikována pouze pro butyrylcholinesterázu, ale nikoliv pro acetylcholinesterasu.
Příkladem přírodních látek užívaných v současnosti v klinické praxi jsou donepezil, galanthamin, huperzin A nebo rivastigmin. Hlavní nevýhodou nejen všech dosud nově objevených látek vykazujících inhibiční aktivitu vůči acetylcholinesteráze, ale i výše zmíněných látek již schválených pro léčbu Alzeimerovy choroby, však zůstávají jejich různé nežádoucí vedlejší efekty. Mezi typické vedlejší účinky těchto látek patří svalová dystrofie, nespavost, toxicita kjaterním buňkám, průjmy, nevolnost a bolesti hlavy. Proto trvá neustálý zájem o vyhledávání nových sloučenin vykazujících inhibiční aktivitu vůči acetylcholinesteráze s minimem nežádoucích účinků.
Podstata vynálezu:
Výše uvedené nedostatky jsou odstraněny inhibitorem acetylcholinesterasy podle tohoto vynálezu, jehož strukturní vzorec je následující:
-1 CZ 299567 B6
OH
Tento inhibitor acetylcholinesterasy byl zjištěn v novém kmeni sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97, který je uložený ve Sbírce kultur řas a sinic na Botanickém ústavu AVCR v Třeboni.
Inhibitor acetylcholinesterasy svýše uvedeným strukturním vzorcem je chemicky 2,2'-bis[4,5bis(4-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyfenyl)cyklopent-4-en-l,3-dion]. Jedná se o neselektivní reverzibilní inihibitor s rozdílným typem inhibice acetylcholinesterasy a butyrylcholinesterasy. Jedná se o ^-parabolický /-parabolický nekompetitivní inhibitor acetylcholinesterasy ío s IC50=5,3 μΜ a S-parabolický /-parabolický smíšený inhibitor butyrylcholinesterasy s IC5o=6,8 μΜ. Porovnání inhibičních účinků inhibitoru butyrylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzorcem s galanthaminem a takrinem je uvedeno v Tabulce 1.
Tabulka 1: Inhibiční účinek inhibitoru acetylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzor15 cem a porovnávacích standardů na acetylcholinesterasu (AChE) z elektrického úhoře a butyrylcholinesterasu (BChE) z koňského séra in vitro.
| Látka | ICso ΙμΜ) | Selektivita (BChE/AChE) | |
| AChE aktivita | BChE aktivita | ||
| inhibitor acetylcholinesterasy | 5,5 | 1,4C | |
| Galanthamin | 0,30-0,54“ | 8,6 - 37.9h | 70,2c |
| Takrin | 0,057 | 0,0062 - 0,0122” | 0,2c |
a pro rozsah koncentrací ATCI 0,062-1,25 mM,b pro rozsah koncentrací BTCI 0,159-2,27 mM, c pro 1,25 mM ATCI a 2,27 mM BTCI
Proces izolace inhibitoru acetylcholinesterasy spočívá ve zpracování surového methanolického extraktu připraveného z biomasy sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97. Surový methanolický extrakt se zahustí do sucha a odparek se rozpustí rozpouštědlem a surový inhibitor acetylcholinesterasy se po té vysráží přídavkem nadbytku alifatického uhlovodíku s výhodou hexanu, čímž se odstraní nepolární balastní látky. Jako rozpouštědlo může být použit aceton nebo methanol. Sraženina se rozpustí v roztoku vodného alkoholu a chromatografuje na sloupci polyamidu směsí voda-alkohol. Jako alkohol je možno použít methanol. V takovém případě je výhodné použít směs methanokvoda v poměru 7:3 objemových jednotek. Aktivní frakce se zahustí na odparek, který se nás30 ledně rozpustí ve směsi acetonu a hexanu a chromatografuje na silikagelové koloně směsí ketonalifatický uhlovodík (například aceton-hexan). Výhodný poměr acetonu a hexanu je 5:4 objemovým jednotkám. Vzniklá aktivní frakce se zahustí na odparek, který se rozpustí ve vodném organickém rozpouštědle a chromatografuje se pomocí semipreparativní HPLC (high performance liquid chromatography) na reverzní fázi (například Ci8) směsí voda-organické roz35 pouštědlo jako mobilní fáze. Jako organické rozpouštědlo pro HPLC chromatografii je možno použít acetonitril. Tím se získá inhibitor acetylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzor-2CZ 299567 B6 cem o čistotě vyšší než 98 %. Jedná se o pevnou látku žluté barvy, která rozpustná v alkoholech, acetonu, ethylcetátu a nerozpustná v uhlovodících, halogenovaných uhlovodících nebo vodě.
Postup izolace a stanovení biologických aktivit blíže vysvětlí následující příklad:
Příklad provedení izolace inhibitoru acetylcholinesterasy
66,7 g lyofilizované biomasy sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 se homogenizuje mořským pískem a extrahuje 800,0 ml methanolu. Směs se centrifuguje (5 000 RPM, 10 min) a supematant se ío oddělí. Extrakce sedimentu se opakuje ještě třikrát, ale objem methanolu pro extrakci se sníží na
530 ml. Spojené surové extrakty se zahustí na odparek, který se rozpustí ve 30 ml acetonu. Ke vzniklému roztoku se přidá 600 ml hexanu, vyloučená sraženina obsahující inhibitor acetylcholinesterasy s výše uvedeným strukturním vzorcem se separuje centrifugací (5 000 RPM, 10 min) a supematant se vyřadí z procesu. Sraženina se po rozpuštění ve 20 ml acetonu přesráží přídavkem
500 ml hexanu ještě dvakrát. Takto získaná sraženina (4,50 g) se rozpustí v 10 ml 70 % vodného methanolu (V/V) a roztok se nanese na kolonku 15 g polyamidu. Přední frakce eluovaná 280 ml 70 % vodného methanolu (V/V) se zahustí na odparek (2,5 g), ke kterému se přidá 15 ml acetonu a 12 ml hexanu. Vzniklý roztok se chromatografuje na sloupci 80 g silikagelu směsí acetonhexan (5:4, V/V) a frakce se jímají po 150 ml. Třetí frakce se zahustí na odparek (1,5 g), který se rozpustí v 50 % vodném acetonitrilu (V/V) na koncentraci 21 mg/ml a chromatografuje za následujících podmínek:
Kolona·. Reprosil 100 C)8, 250x8 mm, 5 μΜ Teplota'. 30 °C
Detekce'. 280 nm
Objem nástřiku·. 500 μΐ Průtok: 3 ml/min Gradienť.
| Čas [min] | 0 | 11 | 12 | 15 | 16 | 20 |
| Acetonitril [%| | 47 | 47 | 90 | 90 | 47 | 47 |
| Voda [%[ | 53 | 53 | 10 | 10 | 53 | 53 |
Frakce obsahující inhibitor acetylcholinesterasy se jímají jako pík s retenčním časem 8,510,4 min. Jednotlivé frakce se spojí a zahustí na odparek (1,15 g), čímž se získá inhibitor acetylcholinesterasy o čistotě 99,4 %.
Biologické studie In Vitro
Inhibiční aktivita vůči acetylcholinesterase byla stanovena na enzymu izolovaném z elektrického úhoře. Inhibiční aktivita vůči butyrylcholinesterase byla stanovena na enzymu izolovaném z koňského séra. Pro stanovení byla použita Ellmanova metoda (G. L. Ellman et al., Biochem. Pharmacol., 7, 88 (1961)) optimalizovaná pro 96-ti jamkové mikrodestičky. Výsledky in vitro testů jsou uvedeny v Tabulce 1 a na obrázcích 1-3.
Průmyslová využitelnost
Inhibitor acetylcholinesterasy s nahoře uvedeným strukturním vzorcem je vhodný pro využití jako potencionální léčivo Alzheimerovy choroby nebo Myasthenia gravis.
Claims (13)
1. Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 uložený ve Sbírce kultur řas a sinic na Botanickém ústavu AVČR v Třeboni.
2. Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že ío obsahuje inhibitor acetylcholinesterasy o strukturním vzorci
3. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 2, vyznačující se
15 t í m , že se extrahuje z biomasy sinice kmene Nostoc sp. Lukešová 27/97 organickým rozpouštědlem a po převedení do jiného vhodného rozpouštědla se vysráží přídavkem nadbytku alifatického uhlovodíku.
4. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 3, vyznačující se
20 tím, že jako extrakční rozpouštědlo se použije methanol.
5. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 3, vyznačující se tím, že jako rozpouštědlo, ze kterého se provádí srážení se použije aceton.
25
6. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 3, vyznačující se t í m , že alifatický uhlovodík je hexan.
7. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároků 3, 4, 5, 6, vyznačující se tí m , že vysrážený surový inhibitor acetylcholinesterasy se chromatograficky čistí na poly30 amidovém sorbentu směsí voda-alkohol, potom na silikagelu směsí keton-alifatický uhlovodík a nakonec HPLC chromatografií na reverzní fázi směsí voda-organické rozpouštědlo jako mobilní fáze.
8. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se
35 t í m , že alkohol jako složka mobilní fáze pro chromatografii na polyamidu je methanol.
9. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 8, vyznačující se t í m , že pro chromatografii na polyamidu je poměr methanokvoda 7:3 (obj.).
40
10. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se t í m , že v mobilní fázi pro chromatografii na silikagelu je alifatickým uhlovodíkem hexan a jako keton je použit aceton.
-4CZ 299567 B6
11. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 10, vyznačující se t í m , že pro chromatografií na silikagelu je směs acetonu a hexanu v poměru 5:4 (obj.).
12. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se 5 t í m , že reverzní fáze je silikagel s navázanými oktadecylovými řetězci (C]8).
13. Způsob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy podle nároku 7, vyznačující se t í m , že organické rozpouštědlo pro HPLC chromatografii je acetonitril.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080247A CZ299567B6 (cs) | 2008-04-22 | 2008-04-22 | Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080247A CZ299567B6 (cs) | 2008-04-22 | 2008-04-22 | Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2008247A3 CZ2008247A3 (cs) | 2008-09-03 |
| CZ299567B6 true CZ299567B6 (cs) | 2008-09-03 |
Family
ID=39739206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20080247A CZ299567B6 (cs) | 2008-04-22 | 2008-04-22 | Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ299567B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ304337B6 (cs) * | 2012-04-18 | 2014-03-12 | Univerzita Palackého v Olomouci | Použití nostotrebinu 6 pro léčbu bakteriálních infekcí |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040065508A (ko) * | 2003-01-14 | 2004-07-22 | 강순아 | 쥐눈이콩 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스터라제 저해제그리고 이를 포함하는 약학적 제제 및 식품 |
| KR20040098785A (ko) * | 2003-05-15 | 2004-11-26 | 김미자 | 속단 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스터라제 저해제그리고 이를 포함하는 약학적 제제, 식품 및 사료 |
| WO2006025708A2 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Unigen, Inc. | Inhibitor for acetylcholinesterase containing gamma-viniferin or visitin a |
-
2008
- 2008-04-22 CZ CZ20080247A patent/CZ299567B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040065508A (ko) * | 2003-01-14 | 2004-07-22 | 강순아 | 쥐눈이콩 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스터라제 저해제그리고 이를 포함하는 약학적 제제 및 식품 |
| KR20040098785A (ko) * | 2003-05-15 | 2004-11-26 | 김미자 | 속단 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스터라제 저해제그리고 이를 포함하는 약학적 제제, 식품 및 사료 |
| WO2006025708A2 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Unigen, Inc. | Inhibitor for acetylcholinesterase containing gamma-viniferin or visitin a |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Becher P.G. et al.: "Nostocarboline: Isolation and Synthesis of a New Cholinesterase Inhibitor from Nostoc 78-12A", J. Nat. Prod., Vol. 68, 1793-1795, 2005 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ304337B6 (cs) * | 2012-04-18 | 2014-03-12 | Univerzita Palackého v Olomouci | Použití nostotrebinu 6 pro léčbu bakteriálních infekcí |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2008247A3 (cs) | 2008-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lee et al. | Acetylcholinesterase inhibitors from the twigs of Vaccinium oldhami Miquel | |
| CN106831898B (zh) | 具有蛋白激酶抑制活性的化合物及其制备方法和应用 | |
| Wangchuk et al. | Phytochemical and biological activity studies of the Bhutanese medicinal plant Corydalis crispa | |
| Cahlíková et al. | Alkaloids from some Amaryllidaceae species and their cholinesterase activity | |
| Vaněčková et al. | Isolation of Amaryllidaceae alkaloids from Nerine bowdenii W. Watson and their biological activities | |
| Ashour et al. | Indole alkaloid from the Red Sea sponge Hyrtios erectus | |
| CN104262445B (zh) | 金花茶皂苷a及其制备方法和抗肿瘤用途 | |
| CZ299567B6 (cs) | Kmen sinice Nostoc sp. Lukešová 27/97 a zpusob izolace inhibitoru acetylcholinesterasy z neho | |
| Afzal et al. | Acetyl cholinesterase and butyryl cholinesterase inhibitory activities of Zaleya pentandra | |
| CN108084205B (zh) | 一种吲哚咔唑类生物碱及其制备方法和应用 | |
| CN118702611A (zh) | 马齿苋中一种亚硝基吲哚类生物碱化合物及其提取分离方法与用途 | |
| Martinez et al. | Alkaloids from Rauwolfia cubana stem bark | |
| CN111303164B (zh) | 一类星孢菌素类衍生物及其制备方法和应用 | |
| Munasaroh et al. | Isolation and Identification of α-Glucosidase Inhibitor from Aspergillus terreus F38 | |
| Dymek et al. | Methods of isolation and bioactivity of alkaloids obtained from selected species belonging to the Amaryllidaceae and Lycopodiaceae families | |
| Lin et al. | A new diketopiperazine alkaloid isolated from an algicolous Aspergillus flavus strain | |
| CN107325142A (zh) | 一种十字孢碱类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN108676013B (zh) | 具有自噬激活活性的黄醇酮类化合物、其制备方法及其制药应用 | |
| CN112125918A (zh) | 芳香聚酮类化合物Talaromyoxaones A和B及其制备方法和应用 | |
| CN113480557B (zh) | 聚酮类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN108383889A (zh) | 开环星孢菌素衍生物及其制备方法和应用 | |
| AU2016100495A4 (en) | Method of isolating phenanthroindolizidine alkaloids from tylophora atrofolliculata, compositions comprising them and their medical use | |
| CN116874417B (zh) | 一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用 | |
| Tousif et al. | Anti-urease secondary metabolites from Seriphidium quettense | |
| Chien et al. | Microbial transformations of natural antitumor agents. 9. O-Demethylation of 9-methoxyellipticine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180422 |