CZ298806B6 - Použití slouceniny schopné alespon cástecne inhibovat onkogenní aktivitu, virální vektor obsahujícísekvenci nukleové kyseliny kódující tuto slouceninu a farmaceutická kompozice obsahující tuto slouceninu - Google Patents

Abstract

Rešení se týká použití slouceniny schopné alesponcástecne inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro prípravu farmaceutické kompozice urcené prolécení rakovin v souvislosti s p53 nul, virálníhovektoru obsahujícího sekvenci nukleové kyseliny kódující slouceninu schopnou inhibovat alespon cástecne onkogenní aktivitu proteinu Mdm2, jakož i farmaceutické kompozice urcené pro lécení rakovin v souvislosti s p53 nul a obsahující slouceninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových metod léčení hyperproliferativních patologií (rakovin, restenóz, atd.) a odpovídajících farmaceutických kompozic.

Dosavadní stav techniky

Velký počet rakovin je způsoben úplně nebo zčásti genetickými anomáliemi, které se projevují buď silnou expresí jednoho nebo více genů nebo/a expresí jednoho mutovaného genu nebo mutovaných genů nebo genů nenormálních. Například exprese onkogenů generuje ve většině případů rakovinu. Jedná se o onkogen genu geneticky určeného, jehož produkt exprese narušuje biologickou funkci normálních buněk, iniciující tak nově vytvořený stav. V současné době byl identifikován a částečně charakterizován velký počet onkogenů, zejména geny ras, myc, fos, erb, neu, raf, src, fms, jun a abl, jejichž mutované formy odpovídají poruchám proliferačních buněk.

V souvislosti s normálními buňkami, proliferace těchto onkogenů je pravděpodobně potlačena alespoň zčásti vytvořením genu řečeného supresoru tumorů jako p53 a Rb. Nicméně určité jevy mohou porušit tento mechanizmus buněčné autoregulace a upřednostnit tak vývoj nově vytvo25 řeného stavu. Jeden z těchto dějů spočívá v mutacích na úrovni genů supresorů tumorů. Tímto způsobem takto mutovaná forma delecí nebo/a mutací genu p53 je zahrnuta do vývoje většiny lidských rakovin (Baker et col.., Science 244 (1989) 217) a inaktivní formy genu Rb byly prokázány v případě různých nádorů zejména v retinoblastomech nebo v rakovinách mesenchimu jako např. osteosarkomy.

Protein p53 je nukleární fosfoprotein 53kD, který je exprimován ve většině normálních tkání. Je zahrnut do řízení buněčného cyklu (Mercer et al. Critic Rev. Eucar. Gene Express, 2, 251, 1992), transkripční regulace (Fieds et al., Sciences (1990) 249, 1046), replikace DNA (Wilcoq and Lané, (1991), Nátuře 349, 4290 a Bargonnetti et al., (1992) Cell 65 1083) a indukce apoptózy (Shaw et al., (1992) P.N.A.S. USA 89, 4495). Každá buněčná expozice k činitelům schopným například poškodit DNA iniciuje kaskádu buněčné signalizace, která vede k posttranskripční modifikaci proteinu p53 a k transkripční aktivaci proteinem p53 určitého počtu genů, jako jsou např. gadd45 (growth arrest and DNA damage) (Kaštan et coli. Cell, 71, 587-597, 1992), P21 WAF/CIP (ElDeiry et colll, Cancer Res., 54, 1169-1174, 1994), nebo také mdm2 (mouše double minuté) (Barak et coli., EMBO J., 12, 461-A68, 1993).

V dokumentu WO 93/20238 je popsáno zjištění genů zodpovědných za některé typy nádorů, mezi kterými jsou uvedeny zmutované tumor-supresorové geny a p53. Inaktivace p53 tak zmutované tumor-supresorové geny a p53. Inaktivace p53 tak vede k tumorogenezi, přičemž zmutovaný gen p53 byl nalezen v mnoha případech lidského karcinomu. Dále je zde popsáno, že vznik nádorů indukuje gen Mdm2 a současně je popsána exprese hMdm2 a zjištění, že některé sloučeniny (malé molekuly a peptidy) inhibují tuto expresi mohou mít terapeutický účinek.

Z tohoto jasně vyplývá, že vyjasnění různých biologických funkcí souboru implikovaných protei50 nů zejména ve způsobu buněčné signalizace, jejich způsobu fungování ajejich charakteristických znaků je hlavním zájmem pro porozumění karcenogeneze a upřesnění terapeutických účinných metod řízených proti rakovině.

-1 CZ 298806 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití sloučeniny schopné alespoň částečně inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Md2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.

Výhodně se použití týká sloučeniny schopné vazby v úrovni domény 1-134 sekvence proteinu Mdm2 znázorněné v SEQ ID N°l. Výhodně se použití týká sloučeniny, kterou je sloučenina scFV řízená proti doméně 1-134 proteinu Mdm2. Výhodně jde o použití, při kterém je sloučenina ío částečně nebo zcela reprezentována peptidy 1-52, 1-41, 6-41, 16-25, 18-23 sekvence p53 reprezentované v SEQ ID N°2 nebo jejich deriváty. Výhodně se použití týká sloučeniny schopné vazby k doméně, sousedící s doménou 1-134 reprezentovanou v SEQ ID N°1 proteinu Mdm2, a schopné v důsledku této vazby působení na onkogenní aktivitu proteinu. Výhodně jde o použití, při kterém je uvedená sloučenina schopna vazby s oblastí C-konce proteinu Mdm2. Výhodně jde o použití, při kterém je sloučeninou transkripční faktor zvolený ze souboru zahrnujícího TFII, TPB a TAF250. Výhodně jde o použití, při kterém je sloučeninou sloučenina schopná vazby s oblastí 135-491 proteinu Mdm2. Výhodně jde o použití, při kterém je sloučeninou částečně nebo úplně proteinu zvolený ze souboru zahrnujícího proteiny Rb a L5 a transkripční faktor E2F.

Předmětem vynálezu je rovněž použití nukleové kyseliny kódující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.

Výhodně jde o použití, při kterém se jedná o

- antimediátorové nukleové kyseliny,

- oligonukleotidové ligandy schopné vazby přímo k doméně proteinu Mdm2 a inhibice jeho onkogenní aktivity,

- nukleové kyseliny částečně nebo zcela kódující peptidy nebo proteiny schopné oligomerace sjednou z domén Mdm2 a inhibice její onkogenní aktivity,

- nukleové kyseliny kódující intracelulámí protilátky řízené proti doméně 1-134 sekvence proteinu Mdm2 znázorněné v SEQ ID N°l. Výhodně jde o použití, při kterém antimediátorovou nukleovou kyselinou je DNA kódující komplementární RNA nukleové kyseliny kódující protein Mdm2 a schopná blokování jeho transkripce a/nebo translace nebo ribozym. Výhodně se jedná o použití, při kterém je nukleová kyselina ve formě komplexu s DEAE-dextranem, s jádrovými proteiny nebo s lipidy nebo s kationtovými polymery ve formě lipozomů nebo jako taková. Výhodně se jedná o použití, při kterém nukleová kyselina je součástí vektoru. Výhodně se jedná o použití, při kterém nukleové kyselina je součástí virálního vektoru zvoleného ze souboru zahrnujícího adenoviry, retroviry a adenoasociované viry.

Předmětem vynálezu je rovněž virální vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující sloučeninu schopnou inhibovat alespoň částečně onkogenní aktivitu proteinu Mdm2. Výhodně virální vektor obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující scFV nebo peptid schopný vazby v úrovni domény 1-134 proteinu Mdm2 reprezentované v SEQ ID N°1 proteinu Mdm2. Výhodně je virální vektor zvolený ze souboru zahrnujícího adenoviry, retroviry a adenoasociované viry.

Výhodně je virálním vektorem adenovirus nebo retrovirus.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice určená pro léčení rakovin v souvislosti s p53 nul, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje sloučeninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2, jak je definována výše.

Předmětem vynálezu je také použití nukleové sekvence kódující intracelulámí protilátky řízené proti doméně 1-134 proteinu Mdm2 znázorněné v SEQ ID N°1 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakoviny v souvislosti s p53 nul.

-2CL 298806 B6

Protein Mdm2 je fosfoprotein o molekulové hmotnosti 90 kD, exprimovaný od genu mdm-2 (murine double minuté 2). Tento gen mdm2 byl klonován na počátku v živelné tumorální buňky BALB/c 3T3 a bylo konstatováno, že silná exprese zvyšuje silně tumorální schopnost (Cahilly—

Snyder et coli. Sómat. Cell. Mol., Genet., 13, 235-244, 1987, Fakharzadeh et coli, EMB J. 10, 1565-1569, 1991). Komplex Mdm2/p53 byl identifikován ve více buněčných liniích obsahujících divoký protein p53 i mutované proteiny p53 (Martiner et coli, Genes Dev., 5, 151-159, 1991). Mimo jiné bylo ukázáno, že Mdm2 inhibuje transkripční aktivitu proteinu p53 na promotoru, stejně jako aktivitu svalové kreatin-kinázy indikující, že Mdm2 může regulovat aktivitu proteinu ío p53 (Momand et col, Cell, 69, 1237-1245, 1992, Oliver et coli. Nátuře, 362, 857-860, 1993).

Vzhledem k souboru výsledků proteinu Mdm2 je tedy v současné době zejména uznán jako modulátor aktivit proteinu p53. Když divoké proteiny p53 nebo mutované proteiny vyvolávají komplexy inhibuje jejich transkripční aktivitu a přispívá tímto způsobem k deregulaci buněčné proliferace. Následkem toho využití těchto informací o stránce terapeutické spočívá hlavně v hledání prostředků pro zabránění této blokaci proteinu p53 proteinem Mdm2.

Předkladatel prokázal, že tento protein Mdm2 má charakter čistě onkogenní, totiž úplně odlišný od onkogenního charakteru spojeného s jeho komplexní formou s proteinem p53. Protein Mdm2 rozvíjí onkogenní vlastnosti v souvislosti s proteinem p53 nul. Pro podpoření tohoto objemu a to, že onkogenní vlastnosti Mdm-2 jsou nezávislé na proteinu p53 a že zejména nevyplývají z inhibice transaktivační aktivity divokého proteinu p53, jsme pozorovali, že mutant proteinu p53 (p53 (14-19), Lin et al, Genes Dev., 1994, 8, 1235-1246), který má zachované své transaktivační vlastnosti, ale který je neinteraguje s Mdm-2, je neschopný blokovat onkogenní vlastnosti Mdm-2, je schopný odblokovat zastavení buněčného cyklu vGl indukovatelného silnou expresí pl07. Mdm-2 se jeví jako důležitý regulátor faktorů obsažených v řízení buněčného cyklu jiných než p53.

Předložený vynález vyplývá částečně s prokázání, že proteinová sekvence 1-134 identifikované sekvence SEQ ID N°1 proteinu Mdm-2 je dostatečná pro vyjádření onkogenního potenciálu výše uvedeného proteinu.

Předložený vynález vyplývá také z prokázání, že je možné určit tento onkogenní charakter proteinu Mdm2 za použití sloučenin, které jsou schopné s ním interagovat. Předložený vynález popisuje také účinné systémy zejména dovolující odevzdání in vivo, přímo do tumorů, takovýchto sloučenin a tedy boj proti vývoji rakovin. Předložený vynález předkládá také nové přístupy účinné zejména pro léčení tumorů zejména v souvislosti s p53 nul, například pro léčení adenokarcinomů tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomů plic, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny ovarií, rakoviny močového měchýře, glioblastomů atd.

První předmět vynálezu spočívá tak v použití sloučeniny schopné antagonizovat zejména onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.

Ve smyslu předloženého vynálezu se chápe rakovinou v souvislosti s p53 nul rakovina, kde protein p53 bude neschopný vykonávat své funkce supresorového genu tumoru jakoukoliv modi45 fikací nebo jakýmkoliv jiným mechanizmem než fixací Mdm-2 na P53, fixací zabraňující proteinu p53 hrát svou roli supresoru tumoru a umožňující buňkám zabránit růst, který je řízený proteinem p53. Mezi těmito modifikacemi nebo mechanizmy blokujícími aktivitu supresoru tumoru p53 se mohou citovat například genetické poruchy genu p53 (bodové mutace, delece atd.), interakce s jinými proteiny než Mdm-2, velmi rychlá proteolytická degradace proteinu p53 spojená s přítomností proteinu E6 viru lidských papilomů vysoce nebezpečných, jako jsou HPV-16 a HPV-18atd.

Ve smyslu předloženého vynálezu onkogenní aktivita proteinu Mdm2 může být dosažena podle dvou metod.

-3CZ 298806 B6

Je přednostně uskutečněna, když zasahuje přímo na úrovni oblasti 1-134 proteinu. Každý protein schopný se vázat ktéto oblasti bude mít antigonistickou úlohu vůči onkogenním vlastnostem proteinu Mdm2.

Nicméně účinek inhibitoru může zejména být dosažen interakcí sloučeniny se sousední oblastí, jako například oblast 135—491 proteinu mdm2, vyjádřené na sekvencí SEQ ID N°1 nebo sekvencí C-konce vyjádřené na sekvencí SEQ ID N°l. Podle toho se předložený vynález týká mimo jiné použití každé sloučeniny takové, která neinteraguje s touto oblastí přímo a je nicméně schopná určit onkogenní vlastnost.

Podle zvláštního způsobu se předložený vynález týká sloučeniny schopné se vázat na úrovni oblasti 1-134 přípravy farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.

Ze sloučenin schopných interagovat přímo na úrovni oblasti 1-134 proteinu Mdm2, se může citovat zejména scFV specificky řízený proti této oblasti.

ScFV jsou molekuly mající vazebné vlastnosti srovnatelné s molekulami protilátek a jsou intracelulámě aktivní. Jedná se zejména o molekuly tvořené peptidem odpovídajícím vazebnému místu variabilní oblasti lehkého řetězce protilátek znovu spojených peptidovou spojkou k peptidu odpovídajícímu vazebnému místu variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky. Předkladatelem je ukázáno, že ScFv mohou být produkovány in vivo přenosem genu (viz přihláška vynálezu WO 94/29446).

Může se zejména jednat o peptidy nebo proteiny již známé pro svou schopnost se specificky vázat s oblastí 1-134 proteinu Mdm2 jako například s celkem nebo částí vazebné domény proteinu p53 se sekvencí SEQ ID N°1 a zejména o celek nebo část jednoho z peptidů 1-52, 1 -41 a 6—41 sekvence p53 vyjádřené SEQ ID N°2 (Oliner et al., Nátuře, 1993, 362, 857-860) nebo jednodušeji o celek nebo část peptidu 16-25 (Lané et al., Phil. Trans. R. Soc. London B., 1995, 347, 83-87) nebo o stejné peptidy 18-23 lidského proteinu p53 nebo myšího nebo také o blízké peptidy odvozené do peptidů již dříve citovaných, ve kterých kritická rezidua pro interakci s Mdm-2 by byla zachována (Picksley et al., Oncogene, 1994, 9, 2523-2529).

Sloučeniny podle vynálezu se zejména mohou vázat k oblasti sousedící s oblastí 1-134 Mdm2 přítomnou v SEQ ID N°l, přičemž tato sloučenina působí v důsledku této vazby na onkogenní aktivitu proteinu Mdm2. Z tohoto titulu se mohou uvést sloučeniny interagující na úrovni oblasti

C-konce výše uvedeného proteinu, jako například transkripční faktory TFII, TBP a TaF250 stejně jako proteiny interagující na úrovni oblasti 135—491 Mdm2 vyjádřené SEQ ID N°l, jako například proteiny L5 (ribozomální protein) a Rb (retinoblastomový protein) a transkripční faktor E2F (řízení Rb).

Jiný předmět předloženého vynálezu se týká zejména použití scFV specificky řízeného proti této oblasti 1-134 sekvence vyjádřené SEQ ID N°1 proteinu Mdm2 z pohledu přípravy farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin.

Ve smyslu vynálezu se rozumí, že soubor interakcí citovaných výše určuje důsledně onkogenní charakter Mdm2. Mimoto tyto proteiny mohou být použity úplně nebo zčásti v případech, kde je prokázána jejich aktivní část oproti vazebným doménám s proteinem Mdm2, a že tato interakce vede k chorobě onkogenního charakteru.

V rámci předloženého vynálezu tyto sloučeniny mohou být použity takové jaké jsou nebo výhodně ve formě genetických konstrukcí, umožňujících jejich expresi in vivo.

Způsob provedení předloženého vynálezu zejména výhodný spočívá v prokázání nukleové sekvence kódující sloučeniny schopné antagonizovat alespoň částečně onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.

-4CZ 298806 B6

Z této perspektivy nukleové kyseliny použité v rámci vynálezu mohou být různých typů. Jedná se zejména:

- o antimediátorové nukleové kyseliny

- o oligoribonukleotidy schopné fixovat přímo jednu z oblastí proteinu Mdm2 a inhibovat jeho onkogenní aktivitu (oligonukleotidový ligand)

- o nukleové kyseliny kódující celek nebo část peptidů nebo proteinů schopných se oligomerizovat s jednou z oblastí Mdm2 a inhibovat jeho onkogenní aktivitu

- o nukleové kyseliny kódující intracelulámí protilátky (například různé fragmenty jediného řetězce pocházejícího z protilátek) řízené proti oblasti 1-134 sekvence SEQ ID N°1 proteinu

Mdm2.

Podle zvláštního způsobu předloženého vynálezu nukleová kyselina je antimediátorová nukleová kyselina. Tato antimediátorová kyselina je DNA kódující komplementární RNA nukleové kyseli15 ny kódující protein Mdm2 a je schopná blokovat jeho transkripci nebo/a jeho translaci (antimediátorová RNA) nebo ribozym.

Později byl prokázán nový typ nukleových kyselin schopných regulovat expresi cílového genu. Tyto nukleové kyseliny se nehybridují s buněčnou mRNA, ale přímo s dvouvláknovou geno20 mickou DNA. Tyto nové přístupy jsou založeny na prokázání, že určité nukleové kyseliny jsou schopné specificky interagovat ve velkém pruhu dvoušroubovice DNA na úrovni oligopurinoligopyrimidinové sekvence, totiž na úrovni oblastí majících oligopurinové sekvence na vláknu a oligopyrimidinové sekvence na komplementárním vláknu a tak tvoří trojšroubovici. Báze třetího vlákna (oligonukleotid) tvoří vodíkové vazby (Hognessovy vazby nebo Hognessovy inverze) s puriny párů bází - párování bází Watsonovo-Criskovo. Nukleové kyseliny byly popsány zejména Pr. Hélene v Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569.

Antimediátorové nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu mohou být sekvencí DNA kódující antimediátorovou RNA nebo ribozymy. Antimediátorové RNA takto vytvořené mohou interagovat s mRNA nebo cílovou genomickou DNA a tvořit s ní dvouvláknový nebo třívláknový helix. Může se zejména jednat o antimediátorové sekvence (oligonukleotidy), případně chemicky modifikované, schopné interagovat přímo s genem nebo cílovou RNA.

Vždy podle upřednostňovaného způsobu uvedení předloženého vynálezu nukleová kyselina je antimediátorový oligonukleotid takový, jaký byl již definován, případně chemicky modifikovaný. Může se jednat zejména o oligonukleotidy, jejichž fosfodiesterový skelet byl modifikován chemicky, například fosfonátové oligonukleotidy, fosfotriesterové, fosforamidátové a fosforthiolátové, které jsou popsány například v přihlášce vynálezu WO 94/08003. Může se jednat zejména o oligonukleotidy alfa nebo konjugované oligonukleotidy s ěinitely jako jsou akrylátové sloučeniny.

Ve smyslu předloženého vynálezu se jedná o oligonukleotidové ligandy, oligoribonukleotidy nebo oligodeoxyribonukleotidy schopné se specificky vázat k proteinu Mdm-2, aby inhiboval svou onkogenní funkci. Takovéto nukleotidy mohou být například prokázány technikami „vývoj in vitro“ jako například technikou SELEX (Edgington, Bio/technology, 1992, 10, 137-140,

Brevets US 5 270 163 a WO 91/198113).

Všeobecně tyto nukleové kyseliny mohou být lidského původu, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virového, syntetického atd. Mohou být získány všemi odborníkům známými technikami a zejména chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami zahrnujícími modifikaci chemic50 kou nebo enzymovou sekvencí získaných tříděním bank.

Jak je naznačeno dále, mohou být včleněny do vektorů, jako například plazmidových vektorů, virových nebo chemických. Mohou být zejména podávány jako takové ve formě DNA podle

-5CZ 298806 B6 technik popsaných v přihlášce vynálezu WO 90/11092 nebo ve formě komplexu například ve formě komplexu s DEAE-dextranem (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), s nukleárními proteiny (Kaneda et al., Science 234 (1989) 375) s lipidy nebo kationickými polymery (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413) nebo ve formě lipozomů (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980)

10431) atd.

Sekvence použitá v rámci předloženého vynálezu tvoří část vektoru. Použití takového vektoru umožňuje vskutku zlepšení podávání nukleové kyseliny do buněk k ošetření a také umožňuje zvýšit jejich stabilitu v uvedených buňkách a tím umožňuje získat trvalý terapeutický účinek. Je možné vložit více sekvencí nukleové kyseliny do stejného vektoru, tím se zvýší také účinnost ío léčení.

Použitý vektor může být různého původu, tím okamžikem, co je schopný transformovat zvířecí buňky, zvláště rakovinové lidské buňky. V upřednostňovaném způsobu uvedení vynálezu se používá virový vektor, který může být vybrán mezi adenoviry, retroviry, viry AAV nebo viry Herpes.

Z tohoto pohledu předložený vynález má také pro předmět každého virového vektoru obsaženou, vloženou do svého genomu, nukleovou kyselinu kódující sloučeninu schopnou antagonizovat alespoň částečně onkogenní vlastnost proteinu Mdm2.

Předložený vynález se týká každého rekombinantního viru obsahujícího sekvenci nukleových kyselin kódujících sloučeninu schopnou se vázat k proteinu Mdm2 tak, aby vytvořil svůj onkogenní potenciál. V této souvislosti sekvence nukleových kyselin mohou kódovat jeden z peptidů, proteinů nebo transkripčních faktorů předem identifikovaných.

Tato sekvence nukleových kyselin kóduje scFv nebo peptid schopný interagovat na úrovni domény 1-134 (SEQ ID N°l) proteinu Mdm2.

Výhodně viry použité v rámci vynálezu jsou přednostně defektivní, tudíž jsou neschopné se replikovat autonomním způsobem v infikované buňce. Všeobecně, genom defektních virů použitých v rámci předloženého vynálezu je tedy zbaven alespoň sekvencí nezbytných k replikaci výše uvedeného voru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď vyloučeny (úplně nebo zčásti), nebo učiněny nefunkční, nebo substituované jinými sekvencemi, zejména sekvencí kódující sloučeniny, které mají antagonistickou roli na onkogenní vlastnosti proteinu Mdm2. Defektní viru nicméně zachovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné kenkapsidaci virových částic.

Jedná se zejména o adenoviry, různé sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se tak trochu mění, a které byly charakterizovány. Mezi těmito sérotypy se přednostně používají v rámci předloženého vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) nebo adenoviry zvířecího původu. V rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry původu psího, hovězího, myšího (například: Mávl, Beard et al, Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího (například: SAV). Adenovirus zvířecího původu je adenovirus psí zejména adenovirus CAV2 (souche manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800) například). V rámci předloženého vynálezu se přednostně používá adenoviru lidského původu nebo psího původu nebo jejich směs.

Defektní adenoviry podle předloženého vynálezu zahrnují ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a sekvenci kódující modulátor. V genomu adenoviru podle vynálezu gen El a alespoň jeden z genů E2, E4, L1-L5 jsou nefunkční. Uvažovaný virový gen může být zbaven nefunkčnosti všemi odborníkům známými technikami a zejména totální supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více bází v určitém nebo určitých genech. Takové modifikace mohou být dosaženy in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu například prostřednictvím technik genetického oboru nebo zase léčením prostřednictvím mutagenních agentů.

Rekombinantní defektní adenoviry podle předloženého vynálezu mohou být připraveny všemi odborníkům známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham,

-6CZ 298806 B6

EMBO J. 3 (1984), 2917). Zvláště mohou být připraveny obecnou rekombinancí mezi adenovirem a plazmidem nesoucím mezi jiným sekvenci DNA kódující inhibitor ETA. Obecná rekombinace nastává po kotransfekci. řečeného adenoviru a plazmidu v linii přizpůsobených buněk. Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná výše uvedenými elemen5 ty a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenoviru zejména v integrované formě, aby se zabránilo nebezpečí rekombinace. Jako příklad linie se může zmínit lidská ledvinová embrionámí linie 293 (Graham et al, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména zahrnutou ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12%). Strategie konstrukce vektorů řízených adenoviry byly také popsány v přihláškách vynálezu FR 93 05954 a ío FR 93 08596.

Adenoviry, které jsou rozmnoženy, jsou získány a purifikovány podle klasických technik molekulární biologie, jakje naznačeno v příkladech.

Co se týče virů AAV, jedná se o vir DNA velikosti relativně malé, které se začleňují do genomu buněk, které jsou infikované, stabilně a regiospecificky. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez toho, aby měly vliv na indukci růstu, morfologii nebo diferenciaci buněk. Nezdá se, že jsou zahrnuty do patologií u lidí. Genom AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 47000 bází, a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) se 145 bázemi, sloužící jako původce replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě hlavní části nesoucí enkapsidační funkce: na levou část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný do virové replikace a exprese virových genů a pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezu popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých geny rep nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zejména a popisuje se jejich použití pro přenos in vitro (na buňkách v kultuře) nebo in vivo (přímo od organizmu) výše uvedeného genu zejména. Rekombi30 nantní defektní AAV podle předloženého vynálezu mohou být připraveny kotransfekci v buněčné linii infikované pomocným lidským virem (například adenovirem) plazmidu obsahujícího sekvenci kódující inhibitor ETS lemovaný dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV a plazmidu nesoucího geny enkapsidace (geny rep a cap) AAV. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Co se týče virů Herpes a retrovirů, konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991Ú 203, EP 453242, EP 178220, Bemstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Zejména retroviry jsou integrované viry selektivně infikující buňky ve fázi dělení. Tvoří tak vektory zejména pro rakovinové aplikace. Genom retrovirů zahrnuje zejména dvě LTR, sekvenci enkapsidace a tři kódované oblasti (gag, pol a env.). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů, geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány zčásti nebo úplně a nahrazeny heterologní sekvencí nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být vytvořeny od různých typů retrovirů takových, jako jsou zejména MoMuLv („murine moloney leukemia virus“, ještě nazvané MoMLV), MSV („murine moloney sarcoma virus“), HaSV („harvey sarcoma virus“), SNV („spleen necrosis virus“) RSV („rouš sarcoma virus“) nebo také Friendův virus.

Pro vytvoření rekombinantních retrovirů obsahujících sekvenci zájmu je všeobecně konstruován plazmid obsahující zejména LTR, sekvencí enkapsidace a u vedenou sekvenci zájmu, potom použít pro transfekci buněčné linie enkapsidace schopné přenést retrovirální vadné funkce do plazmidu. Všeobecně linie enkapsidace jsou tak schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takovéto linie enkapsidace byly pospány ve vedlejších oborech, zejména linie PA317 (US 4 861719), linie PsiCRIP (WO 90/02806) a linie Gp+envAm-12 (WO 89/07150). Jinak rekombinantní retroviry mohou zahrnovat modifikace na úrovni LTR za účelem zrušení trans55 kripční aktivity stejně jako rozsáhlou sekvenci enkapsidace obsahující část genu gag (Bender et

-7CZ 298806 B6 al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantní retrovirální produkty jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Ve vektorech vynálezu sekvence kódující sloučeninu, která má antagonistické vlastnosti vůči onkogenním vlastnostem Mdm2 je umístěna pod kontrolou signálů umožňujících svou expresi v tumorálních buňkách. Přednostně se jedná o signály heterologní exprese, tudíž o různé signály přirozeně odpovědné za expresi inhibitoru. Může se jednat zejména o sekvence odpovědné za expresi jiných proteinů nebo syntetické sekvence. Zejména se může jednat o sekvence promotoru eukaryontních genů nebo virových genů. Například se jedná o sekvence promotoru pocházející ío z genomu buňky, která se požaduje infikovat. Stejně se může jednat o sekvence promotoru vzniklého z genomu viru, tam obsahuje použitý virus. V tomto ohledu se mohou citovat například promotory El A, MLP, CMV, LTR-RSV atd. Mimoto tyto sekvence exprese mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, sekvencí regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově specifickou. Může být zajímavé použití zejména signálů exprese specificky aktivních nebo většinově aktivních v tumorálních buňkách tak, aby sekvence DNA byla nejen exprimovaná, ale i produkovaná svým účinkem virus, který efektivně infikoval tumorální buňku.

Ve způsobu realizace se vynález týká rekombinantního defektního viru obsahujícího sekvenci cDNA kódující sloučeninu mající antagonistické vlastnosti na onkogenní charakter Mdm2 pod řízením virového promotoru, vybraného s výhodou mezi LTR-RSV a promotorem CMV.

Vždy v upřednostňovaném způsobu vynálezu se týká defektního rekombinantního viru obsahujícího sekvence DNA kódujícího sloučeninu, která má antagonistické vlastnosti na onkogenní charakter Mdm2 pod řízením promotoru, který umožňuje většinovou expresi v tumorálních buňkách.

Exprese je považována jako většinová ve smyslu vynálezu i v tom případě, kdyby zbytková exprese byla pozorována v jiných buněčných typech, úrovně exprese jsou vyšší v tumorálních buňkách.

Předložený vynález se týká zejména nukleové sekvence kódující intracelulámí protilátky nebo také scFV řízené proti oblasti 1-134 sekvence proteinu Mdm2 vyjádřené sekvencí SEQ ID N°1 pro přípravu farmaceutické kompozice určené všeobecně k léčení rakoviny.

Týká se také každé farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 nebo sekvenci nukleových kyselin kódujících takovouto sloučeninu. Podle způsobu realizace vynálezu takto kompozice zahrnuje jeden nebo více rekombinantních defektních virů takových, jaké byly dříve popsány. Tyto farmaceutické kompozice mohou být sestaveny z pohledu způsobu podávání: topikálně, orálně, parenterálně, intranazálně, intra40 venózně, intramuskulámě, podkožně, intraokulámě, intradermálně atd. Farmaceutické kompozice vynálezu přednostně obsahují farmaceutické vehikulum vhodné pro injikovatelnou formulaci, především pro injikováni přímo do tumoru pacienta. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické roztoky nebo kompozice suché, zejména lyofilizované, které přidáním podle okolnosti sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují konstituci injikovatelných roztoků. Injekce přímo do tumoru pacienta je výhodná, protože umožní soustředit terapeutický účinek přímo na úrovni postižené tkáně.

Dávky použitých rekombinantních defektních virů pro injikaci mohou být přizpůsobeny vzhledem k různým parametrům, zejména vzhledem k virovým vektorům, ke způsobu použitého ošetření. Všeobecně jsou rekombinantní adenoviry podle vynálezu formulovány a podávány ve formě dávek obsahujících mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, výhodněji 10⁶ až 10¹⁰ pfu/ml. Termín pfu („plaque forming unit“) odpovídá infekční schopnosti roztoku virů a je určen infekcí vhodné buněčné kultury a počtem plaků infikovaných buněk po 48 hodinách. Techniky určení titru virového roztoku jsou dobře popsány v literatuře. Co se týče retrovirů, kompozice podle vynálezu mohou obsahovat přímo produkované buňky z pohledu jejich implantace.

-8CZ 298806 B6

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou zejména výhodné pro neutralizaci onkogenní aktivity proteinů Mdm2 a proto pro modulování proliferace určitých buněčných typů.

Zejména tyto kompozice jsou přijatelné pro léčení rakovin souvisejících s p53 nul jako například následující rakoviny: adenokarcinomů tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomu plic, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny ovarií, rakoviny močového měchýře, glioblasty atd.

Předložený vynález je výhodně použit in vivo pro destrukci hyperproliferativních buněk (v proliferaci nenormální). Je tak aplikovatelný pro destrukci tumorálních buněk nebo buněk hladkého svalstva varkulámí stěny (restenóza).

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

Seznam obrázků

Obrázek 1: Znázornění proteinů Mdm2 A až F.

Obrázek 2: Graf transfekce buněk Saos-2 s plasmidy exprimujícími různé proteiny Mdm-2. Obrázek 3: Schematické znázornění inhibice transformačních vlastností Mdm2 různými p53. Obrázek 4: Účinek silné exprese Mdm2 na buněčný cyklus.

Obrázek 5: Účinek silné exprese Mdm2 na buněčný cyklus.

Všeobecné techniky molekulární biologie

Metody klasicky používané v molekulární biologii jako je preparativní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu ceznatého, elektroforéza na agarozovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, srážení DNA v prostředí šalinu ethanolem nebo izopropanolem, transformace v Escherichia coli atd. jsou odborníkům dobře známé metody a jsou obsáhle popsané v odborné literatuře (Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausbel F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons, New York, 1987).

Za účelem vytvoření vazeb fragmenty DNA mohou být separovány podle jejich velikosti elektroforézou na agarozovém gelu nebo akrylamidovém gelu, extrudovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, sráženy ethanolem, potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Doplňování vyčnívajících 5'konců může být provedeno Klenowovým fragmentem DNA Polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podle doporučení dodavatele. Destrukce vyčnívajících 3' konců se provádí v přítomnosti DNA Polymerázy I fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Desrukce vyčnívajícího 5' konce se provádí působením nukleázy Sl.

Mutageneze in vitro usměrňovaná syntetickými oligonukleotidy může být provedena podle metody vyvinuté Taylorem a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použití soupravy distribuované Amersham.

Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou řečenou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K.B: et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití „DNA thermal cycler“ (Parkin

-9CZ 298806 B6

Elmer Cetus) podle doporučení výrobce. Amplifikace genomické DNA se provádí zejména za následujících podmínek: 5 minut při teplotě 100 °C, 30 jednominutových cyklů při teplotě 95 °C, 2 minuty při teplotě 58 °C, potom 3 minuty při teplotě 72 °C prostřednictvím vhodných sond. Produkty amplifikace se analyzují elektroforézou na gelu.

Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou podle Sangera a kol. (Proč. Nati. Acid. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) za použití soupravy distribuované Amersham.

Materiál a metody

1. Použité konstrukce

- plazmid pBKCMV je uvedený na trh Stratagenem a obsahuje gen rezistentní k neomycinu,

- plazmid pC53ClN3 a P53-4.2.N3 kódující divoký p53 a P53 R273H pocházejí od A. Levine (Hinds et al., Cell Growth and Diff. (1990), 1, 571),

- plazmid pBKp53(R273H) obsahuje lidský minigen p53. Je získán od pD53-4.2.N3,

- plazmid pBKMdm2 byl získán klonováním v pBKCMV kazety, kódování spočívající v nevyjádřené oblasti konce sekvence kódující souvislý β-globin sekvence kódující mdm2,

- plazmid pGKhydro exprimuje gen rezistentní k hydromycinu (Nátuře (1990) 384, 649-651),

- plazmid pCMVNeoBam umožňující expresi genu rezistentního k neomycinu (Hinds et al.

(1990) Cell. Growth and Diff., 1, 571-580),

- plazmidy pCMVplO7 a pCMVCD20 umožňující expresi proteinu pl07 a označení povrchu CD20 (Zhu et al. (1993) Genes and Development, 7, 1111-1125),

- plazmidy pCMVE2F-4 a pCMVE2F-5 umožňující expresi proteinů E2F-4 a E2F-5 (Sardet et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Se., 92, 2403-2407),

- plazmidy pLexA, pLexA (6-41), pLexA(16-25) umožňující expresi DNA vazebné oblasti

LexA (aa 1 až 87) volné nebo fixované s p53 (6^H ) nebo p53( 16-25). pLexA(641) a pLexA(1625) byly získány od plazmidu pLexApolylI vytvořeného LGME (Strasbourg),

-plazmidy eukaryiontní exprese pl07: (pl07(385-1068), pl07(1—781) apl07(781—1068) (Zhu t al., EMBOJ. 14(1995) 1904),

- plazmid pSGKlHAplO7 umožňuje expresi in vitro a in vivo pl07.107 je v souvislosti se sekvencí Kozák a epitop HA je exprimován ve fúzi k C-konci pl07,

- plazmidy pBC-MDM2 a pBC-MDM2 (1-134) byly získány klonováním MDM2 a MDM2(1134) v pBC (Chatton et al., Biotechniques 18 (1995) 142),

- plazmidy pGex-MDM2 a pGex-MDM2(l-177) byly získány klonováním MDM2 a MDM2 (135 17) v pGex.

2. Metoda:

Exprese p53 je určena Westernem Blottingem na buněčném extraktu pomocí monoklonálních protilátek DO 1.

Exprese mRNA kódující protein Mdm2 je určena semikvantitativní RT-PCR. Nepřítomnosti kontaminace DNA je ověřena PCR.

Příklad 1: Prokázání transformovaných vlastností mdm2

Buňky Saos-2 jsou transfekovány buď plazmidem pBKMDM2, srovnávacím plazmidem pBKp53 (R273H) nebo srovnávacím plazmidem p53 negativním pBKCMV, potom vybrány na základě rezistence ke Geneticinu 418(G418).

-10CZ 298806 B6

V prvním pokusu byly vybrány klony individuálně a rozmnoženy tak, že ve druhém pokusu neizolované klony byly umístěny do kultivační agarové půdy soft.

10⁴ buněk bylo naočkováno dvojmo do 0,375% soft agaru. Po 24 hodinách se určil celkový počet kolonií s více než 50 buňkami a stejně i počet buněk každé kolonie (velikost kolonií). Každá udaná hodnota odpovídá průměru čtyř dvojmo provedených pokusů. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce I. Klony v pokusu n°l odpovídající mdm2 jsou identifikovány jako Ml až M6, klony proteinu p53 (R273H) jako p53—1 až p53-6 a kóny kontrolní jako Col až Co5.

Jak bylo očekáváno Col a Co4 neexprimují transfektovaný mdm2 a Col-3 neexprimují protein p53.

Tabulka I

	růst na kultivačním médiu agar soft, kolonie (velikost)	exprese
MDM2	P53
pokus 1 (izolované klony)	MDM2	Ml	634 (100-600)	+	ND
M2	594 (100-600)	++	ND
M3	46^ (100-600)	+	ND
M4	310 (50-500)	++	ND
M5	57 (50-20Q)	+/-	ND
M6	23 (50)	+	ND
	kontrola	Col	97 (50-200)	-	-
Co2	68 (50-200)	ND	-
Co 3	35 (50-100)	ND	-
Co 4	11 (50)	-	ND
Co5	4 (50)	ND	ND
	p53R (273)H	p53-l	190 (50-600)	ND	+++
p53-2	137 (50-300)	ND	+++ +
p53-3	88 (50-200)	ND	+++
p53-4	53 (50-200)	ND	++ +
p53-5	47 ¢50-200)	ND	++
p53-6	38 (50-100)	ND	+
pokus 2	MDM2	M-Pl	395 (100-1000)	++	ND
kontrola	Co-Pl	21 (50-200)	ND	ND
Co-P2	18 (50-200)	ND	ND

-11 CZ 298806 B6

Tabulka I-pokračování

	růst na kultivačním médiu agar soft, kolonie (velikost)	exprese
MDM2	P53
pokus 3	MDM2	M-Pl	255 (50-300)	ND	ND
M-P2	220 (50-300)	ND	ND
	kontrola	Co-Pl	110 (50-200)	ND	ND
Co-P2	110 (50-200)	ND	ND
Co-P3	100 (50-100)	ND	ND
Co-P4	75 (50-100)	ND	ND

Příklad 2: Oblast N-konce Mdm2 (1-134) sekvence ID N°1 je nezbytná a dostatečná pro stimulaci růstu buněk Saos-2 na agaru soft.

Buňky Saos-2 jsou transfektovány buď s plazmidy pBKCV, které vyjadřují zároveň rezistenci neo a proteiny mdm-2 A až F popsané na obrázku 1, anebo se srovnávacím plazmidem pBKCMV, potom vybrány na základě rezistence k G418. Zbylé buňky jsou shromážděny, ampliio fikovány a testovány pro tvorbu kolonií na agaru soft. Výsledky na obrázku 2 jsou vyjádřeny počtem vytvořených kolonií na agaru soft vztažených k počtu mdm-2 (A). Tyto výsledky pocházejí ze dvou reprezentativních nezávislých pokusů transfekce, ve kterých mezi 3 a 7 jamkou byly testovány různé buňky, podle konstrukce. Jasně se ukázalo, že oblast N-konce mdm-2 má onkogenní vlastnosti. Nejúčinnější konstrukce odpovídá úplnému proteinu.

Pokus 3: Reverze onkogenních vlastností Mdm-2 divokým proteinem p53, mutantů proteinu p53 a fragmentů proteinu p53.

Část buněk Saos-2 transformovaných Mdm-2 je kotransfektována s plazmidem pGKHygro a nebo pC53ClN3 (p53) pC53^1.2N3 p53(R(273)H, p53 (1-52), _PLexA(6-41), pLexA(16-25), pLexA, p53(L14Q, F19S), p53(L22Q, W23S), nebo pCMVNeoBam, potom vybraná na základě rezistence khydromycinu v přítomnosti G418. 10 000 buněk pocházejících z 3 až 5 jamek nezávislých rezistentních buněk jsou zaočkovány dvojmo na agar soft (0,375 %). Po 25 dnech kultivace byly sečteny kolonie, které obsahují alespoň 50 buněk. Obrázek 3 ukazují výsledky reprezentativního pokusu a schematicky vyjadřuje různé testované p53 pro inhibici transformačních vlastností Mdm-2. Z tohoto pokusu vyplývá, že samotné konstrukce umožňují expresi proteinů schopných se vázat s proteinem mdm-2 případně s p53, p53 R273H, p53( 1 —52), LexA (6-41), LexA (16-25) inhibují onkogenní vlastnosti Mdm-2. Naproti tomu dvojnásobní mutanti, kteří jsou uvedeni, kteří ztratili svou schopnost vázat mdm-2 (Lin et al., Gene Dev., 1994, 8,

1235-1246) nemají účinek inhibitoru. Skutečnost, že mutant p53 (14-19), který má zachované transaktivační vlastnosti divokého proteinu p53 neinhibuje transformaci proteinem Mdm-2 potvrzuje, že onkogenní vlastnosti proteinu Mdm-2 jsou nezávislé na inhibici transaktivačních vlastností proteinu p53 proteinem Mdm-2.

Příklad 4: Mdm-2 inhibuje blokaci Gl buněčného cyklu indukovaného pl 07 v buňkách Saos-2

Buňky Saos-2 jsou kotransfektovány se třemi typy plazmidů, (i) plazmidem pro expresi CD-20 (pCDVCD20, 2 pg, kódující značení povrchu buňky CD-20), (ii) plazmidem (9 pg) exprese typu CMV (promotor cytomegaloviru) bez kódované sekvence nebo kódujícím Mdm-2 (PBKCMVMdm2), oblast 1-134 Mdm-2 (PBKCMVdm2(l-134), E2F^1 nebo E2F-5

- 12CZ 298806 B6 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5) a (iii) vektorem exprese pl07 (pCMVplO7, 9 pg). Buňky jsou pak zpracovány pro analýzu FACScan, jak popsal Zhu et al,. Gene Dev., 1993, 7, 1111-1125). Výsledky reprezentativního pokusu jsou uvedeny na obrázku 4. Je jasně ukázáno, že v nepřítomnosti silně exprimovaného pl07 exprese Mdm-2 nebo jeho oblasti 1-134 nemá vliv na buněčný cyklus. Naproti tomu exprese Mdm-2 a jeho oblastí 1-134 je schopná zrušit zastavení buněčného cyklu G1 indukovaného pl07. Tento příklad jasně ukazuje, že Mdm-2 nejí jen inhibitor transaktivační aktivity proteinu p53, ale také pozitivní regulátor buněčného cyklu schopný inhibovat implikované faktory v řízení tohoto cyklu.

ίο V podobném pokusu buňky Saos-2 byly kotransfektovány s 1 pg pl07(385—1068), 8 pg pCMVNéoBam, 1 pg pXJMDM2, 8 pg pXJ41 a 2 pg pCMVCD20. Výsledky reprezentativního pokusu jsou vyznačeny na obrázku 5. Ukazují, že exprese MDM2 může ukončit blokaci G1 indukovanou pl 07 a mutantem delece pl 07 (385-1068), který je schopný interagovat s MDM2.

Příklad 5: MDM2 interaguje in vitro a in vivo s pl07

Tento příklad ukazuje fyzikální interakci mezi MDM2 a pl07 in vitro a in vivo. Tyto výsledky jsou korelovány s aktivitou MDM2 na úrovni buněčného cyklu (příklad 4).

5.1 In vitro pl 07 značený S35 in vitro je uvedeno v kontakt s proteinem GST-MDM2 (vektor pGex-MDM2) nebo GST-MDM2(1-177) (vektor pGex-MDM2(l-177)), které jsou imobilizovány na kuličkách glutathion sepharózy. P107 vázaný kMDM2 je potom detekován na polyakrylamidovém gelu autoradiograficky. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

5.2. In vivo

Buňky Cos jsou kotransfekovány s plazmidem pBC-MDM2 nebo pBC-MDM2(l-134), které exprimují proteinovou fúzi GTS-MDM2 nebo GST-MDM2(1-134) s plazmidem exprese pl07 nebo mutantem pl07. Komplexy proteinů GST-MDM2-plO7 pocházející z buněčných extraktů jsou izolovány na kuličkách glutathion sepharózy a proteinu pl07 jsou detekovány pomocí Western blot s polyklonální protilátkou anti-pl07 (santa Cruz pl 07-Cl 8). Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II

	p!07	plQ7 (385-1068)	pl07 (1-781)	pl07 (385-1068)
In Vivo
GST-MDM2	+	+	+	+
GST-MDM2(1-134)	+	nd	nd	nd
In Vitro
GST-MDM2	+	nd	nd	nd
GST-MDM2(1-177)	+	nd	nd	nd

Výsledky ukazují přítomnost interakce protein-protein mezi MDM2 a pl07 in vitro, ale i v buňce. Oblast MDM2 nezbytná pro buněčnou transformaci (1-134) je oblast, která interaguje spi 07. Tato oblast byla lokalizována, jak bylo nalezeno, zejména v části „kapsové oblasti“, oblasti „A“ a oblasti „mezemík“.

-13 CZ 298806 B6

Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace:

(i) dodavatel:

(A) Jméno: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) Ulice: 20, Raymond ARON (C) Město: ANTONY (E) Země: Francie (F) Směrovací číslo: 92165 (G) Telefon: 40 91 69 22 (H) Fax: (1)40 91 72 96 (ii) podavatel:

(A) Jméno: INSTITUT DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MED1CALE (INSERM) (B) Ulice: 101, Ruoe de Tolbiac (C) Město: Paříž Cedex 13 (E) Země: Francie (F) Směrovací číslo: 75654 (G) Telefon: 44 23 60 61 (H) Fax: 45 85 68 56 (ii) název vynálezu: Antagonisti onkogenní aktivity proteinu MDM2 a jejich použití v léčení rakovin (iii) počet sekvencí: 2 (iv) způsob luštění počítačem:

(A) Typ nosiče: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) sytém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Release #1.0, Version # 1.30 (OEB) (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1476 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/Cle: CDS (B) umístění: 1...1476 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:

ATG

TGC

AAT

ACC

AAC

ATG

TCT

GTA

CCT

ACT

GAT

GGT

GCT

GTA

Met

Cys

Astl

Thr

Asn

Met

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Gly

Ala

Val

1

5

10

ACC

ACC

TCA

CAG

ATT

CCA

GCT

TCG

GAA

CAA

GAG

ACC

CTG

GTT

Thr

Thr

Ser

Gin

Ile

Pro

Ala

Ser

Glu

Gin

Glu

Thr

Leu

Val

15

20

25

- 14CZ 298806 B6

AGA CCA AAG CCA TTG CTT TTG	AAG	TTA TTA AAG TCT GTT GGT	126
Arg Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys	Leu Leu Lys Ser Val Gly
30 35	40
GCA CAA AAA GAC ACT TAT ACT	ATG	AAA GAG GTT CTT TTT TAT	168
Ala Gin Lys Asp Thr Tyr Thr	Met	Lys Glu Val Leu Phe Tyr
45	50	55
CTT GGC TAG TAT ATT ATG ACT	AAA	CGA TTA TAT GAT GAG AAG	210
Leu Gly Gin Tyr Ile Met Thr	Lys	Arg Leu Tyr Asp Glu Lys
60		65 70
CAA CAA CAT ATT GTA TAT TGT	TCA	AAT GAT CTT CTA GGA GAT	252
Gin Gin His Ile Val Tyr Cys	Ser	Asn Asp Leu Leu Gly Asp
75		80
TTG TTT GGC GTG CCA AGC TTC	TCT	GTG AAA GAG CAC AGG AAA	294
Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe	Ser	Val Lys Glu His Arg Lys
85 90		95
ATA TAT ACC ATG ATC TAC AGG	AAC	TTG GTA GTA GTC AAT CAG	336
Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg	Asn	Leu Val Val Val Asn Gin
100 105		110
CAG GAA TCA TCG TAC TCA GGT	ACA	TCT GTG AGT GAG AAC AGG	378
Gin Glu Ser Ser Asp Ser Gly	Thr	Ser Val Ser Glu Asn Arg
115	120	125
TGT CAC CTT GAA GGT GGG AGT	GAT	CAA AAG GAC CTT CTA CAA	420
Cys His Leu Glu Gly Gly Ser	Asp	Gin Lys Asp Leu Val Gin
130		135 140
GAG CTT CAG GAA GAG AAA CCT	TCA	TCT TCA CAT TTG GTT TCT	462
Glu Leu Gin Glu Glu Lys Pro	Ser	Ser Ser His Leu Val Ser
145		150
AGA CCA TCT ACC TCA TCT AGA	AGG	AGA GCA ATT AGT GAT ACA	504
Arg Pro Ser Thr Ser Ser Arg	Arg	Arg Ala Ile Ser Glu Thr
155 160		165
GAA GAA AAT TCA GAT GAA TTA	TCT	GGT GAA CGA CAA AGA AAA	546
Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu	Ser	Gly Glu Arg Gin Arg Lys
170 175		180
CGC CAC AAA TCT GAT AGT ATT	TCC	CTT TCC TTT GAT GAA AGC	588
Arg His Lys Ser Asp Ser Ile	Ser	Leu Ser Phe Asp Glu Ser
185	190	195
CTG GCT CTG TGT GTA ATA AGG	GAG	ATA TGT TGT GAA AGA AGT	630
Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg	Glu	Ile Cys Cys Glu Arg Ser
200		205 210

- 15CZ 298806 B6

AGT

AGC

AGT

GAA

TCT

ACA

GGG

ACG

CCA

TCG

AAT

CCG

GAT

CTT

672

Ser

Ser

Ser

Glu

Ser

Thr

Gly

Thr

Pro

Ser

Asn

Pro

Asp

Leu

215

220

GAT

GCT

GGT

GTA

AGT

GAA

CAT

TCA

GGT

GAT

TGG

TTG

GAT

CAG

714

Asp

Ala

Gly

Val

Ser

Glu

His

Ser

Gly

Asp

Trp

Leu

Asp

Gin

225

230

235

GAT

TCA

TCA

GAT

CAG

TTT

AGT

GTA

GAA

CCC

GAA

GTT

GAA

756

Asp

Ser

Val

Ser

Asp

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Phe

Glu

Val

Glu

240

245

250

TCT

CTC

GAC

TCA

GAA

GAT

TAT

AGC

CTT

AGT

GAA

GAA

GGA

CAA

798

Ser

Leu

Asp

Ser

Glu

Asp

Tyr

Ser

Leu

Ser

Glu

Glu

Gly

Gin

255

260

265

GAA

CTC

CTA

GAT

GAA

GAT

GAT

GAG

GTA

TAT

CAA

GTT

ACT

GTG

840

Glu

Leu

Ser

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

Val

Tyr

Gin

Val

Thr

Val

270

275

280

TAT

CAG

GCA

GGG

GAG

AGT

GAT

ACA

GAT

TCA

TTT

GAA

GAA

GAT

882

Tyr

Gin

Ala

Gly

Glu

Ser

Asp

Thr

Asp

Ser

Phe

Glu

Glu

Asp

285

290

CCT

GAA

ATT

TCC

TTA

GCT

GAC

TAT

TGG

AAA

TGC

ACT

TCA

TGC

924

Pro

Glu

ile

Ser

Leu

Ala

Asp

Tyr

Trp

Lys

Cys

Thr

Ser

Cys

295

300

305

AAT

GAA

ATG

AAT

CCC

CCC

CTT

CCA

TCA

CAT

TGC

AAC

AGA

TGT

966

Asn

Glu

Met

Asn

Pro

Pro

Leu

Pro

Ser

His

Cys

Asn

Arg

Cys

310

315

320

TGG

GCC

CTT

CGT

GAG

AAT

TGG

CTT

CCT

GAA

GAT

AAA

GGG

AAA

1008

Trp

Ala

Leu

Arg

Glu

Asn

Trp

Leu

Pro

Glu

Asp

Lys

Gly

Lys

325

330

335

GAT

AAA

GGG

GAA

ATC

TCT

GAG

AAA

GCC

AAA

CTG

GAA

AAC

TCA

1050

Asp

Lys

Gly

Glu

Ile

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Leu

Glu

Asn

Ser

340

345

350

ACA

CCA

GCT

GAA

GAG

GGC

TTT

GAT

GTT

CCT

GAT

TGT

AAA

AAA

1092

Thr

Gin

Ala

Glu

Glu

Gly

Phe

Asp

Val

Pro

Asp

Cys

Lys

Lys

355 360

- 16CZ 298806 B6

ACT

ATA

GTG

AAT

GAT

TTC

AGA

GAG

TCA

TGT

GTT

GAG

GAA

AAT

1134

Thr

Ile

Val

Asn

Asp

Ser

Arg

Glu

Ser

Cys

Val

Glu

Glu

Asn

365

370

375

GAT

GAT

AAA

ATT

ACA

CAA

GCT

TCA

CAA

TCA

CAA

GAA

AGT

GAA

1176

Asp

Asp

Lys

Ile

Thr

Gin

Ala

Ser

Gin

Ser

Gin

Glu

Ser

Glu

380

385

390

GAC

TAT

TCT

CAG

CCA

TCA

ACT

TCT

AGT

AGC

ATT

ATT

TAT

AGC

1218

Asp

Tyr

Ser

Gin

Pro

Ser

Thr

Ser

Ser

Ser

Ile

ile

Tyr

Ser

395

400

405

AGC

CAA

GAA

GAT

GTG

AAA

GAG

TTT

GAA

AGG

GAA

GAA

ACC

CAA

1260

Ser

Gin

Glu

Asp

Val

Lys

Glu

Phe

Glu

Arg

Glu

Glu

Thr

Gin

410

415

420

GAC

AAA

GAA

GAG

AGT

GTG

GAA

TCT

AGT

TTG

CCC

CTT

AAT

GTC

1302

Asp

Lys

Glu

Glu

Ser

Val

Glu

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Asn

Ala

425

430

ATT

GAA

CCT

TGT

GTG

ATT

TGT

CAA

GGT

CGA

CCT

AAA

AAT

GGT

1344

Ile

Glu

Pro

Cys

Val

Ile

Cys

Gin

Gly

Arg

Pro

Lys

Asn

Gly

435

440

445

TGC

ATT

GTC

CAT

GGC

AAA

ACA

GGA

CAT

CTT

ATG

GCC

TGC

TGG

1386

cys

Ile

Val

His

Gly

Lys

Thr

Gly

His

Leu

Met

Ala

Cys

Phe

450

455

460

ACA

TGT

GCA

AAG

AAG

CTA

AAG

AAA

AGG

AAT

AAG

CCC

TGC

CCA

1428

Thr

Cys

Ala

Lys

Lys

Leu

Lys

Lys

Arg

Asn

Lys

Pro

Cys

Pro

465

470

475

GTA

TGT

AGA

CAA

CCA

ATT

CAA

ATG

ATT

GTG

CTA

ACT

TAT

TTC

1470

Val

Cys

Arg

Gin

Pro

Ile

Gin

Met

Ile

Val

Leu

Thr

Tyr

Phe

480

485

490

CCC

TAG

1476

Pro

4

(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 1182 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA ío (iii) hypotetická: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:

(A) jméno/Cle: CDS (B) umístění: 1 ...1182

- 17CZ 298806 B6 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:

ATG

GAG

GAG

CCG

CAG

TCA

GAT

CCT

AGC

GTC

GAG

CCC

CCT

CTG

42

Met

Glu

Glu

Pro

Gin

Ser

Asp

Pro

Ser

Val

Glu

Pro

Pro

Leu

1

5

10

AGT

CAG

GAA

ACA

TTT

TCA

GAC

CTA

TGG

AAA

CTA

CTT

CCT

GAA

84

Ser

Gin

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp

Leu

Trp

Lys

Leu

Leu

Pro

Glu

15

20

25

AAC

AAC

GTT

CTG

TCC

CCC

TTG

CCG

TCC

CAA

GCA

ATG

GAT

GAT

126

Asn

Asn

Val

Leu

Ser

Pro

Leu

Pro

Ser

Gin

Ala

Met

Asp

Asp

30

35

40

TTG

ATG

CTG

TCC

CCG

GAC

GAT

ATT

GAA

CAA

TGG

TTC

ACT

GAA

168

Leu

Met

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp

Ile

Glu

Gin

Trp

Phe

Thr

Glu

45

50

55

GAC

CCA

GGT

CCA

GAT

GAA

GCT

CCC

AGA

ATG

CCA

GAG

GCT

GCT

210

Asp

Pro

Gly

Pro

Asp

Glu

Ala

Pro

Arg

Met

Pro

Glu

Ala

Ala

60

65

70

CCC

CCC

GTG

GCC

CCT

GCA

CCA

GCA

GCT

CCT

ACA

CCG

GCG

GCC

252

Pro

Pro

Val

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Ala

Pro

Thr

Pro

Ala

Ala

75

80

CCT

GCA

CCA

GCC

CCC

TCC

TGG

CCC

CTG

CCA

TCT

TCT

GTC

CCT

294

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ser

Trp

Pro

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

Pro

85

90

95

TCC

CAG

AAA

ACC

TAC

CAG

GGC

AGC

TAC

GGT

TTC

CGT

CTG

GGC

336

Ser

Gin

Lys

Thr

Tyr

Gin

Gly

Ser

Tyr

Gly

Phe

Arg

Leu

Gly

100

105

110

TTC

TTG

CAT

TCT

GGG

ACA

GCC

AAG

TCT

GTG

ACT

TGC

ACG

TAC

378

Phe

Leu

His

Ser

Gly

Thr

Ala

Lys

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Tyr

115

120

125

TCC

CCT

GCC

CTC

AAC

AAG

ATG

TTT

TGC

CAA

CTG

GTC

AAG

ACC

420

Ser

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys

Met

Phe

Cys

Gin

Leu

Ala

Lys

Thr

130

135

140

TGC

CCT

GTG

CAG

CTG

TGG

GTT

GAT

TCC

ACA

CCC

CCG

CCC

GGC

462

Cys

Pro

Val

Gin

Leu

Trp

Val

Asp

Ser

Thr

Pro

Pro

Pro

Gly

145

150

ACC

CGC

GTC

CGC

GCC

ATG

GCC

ATG

TAC

AAG

CAG

TCA

CAG

CAC

504

Thr

Arg

Val

Arg

Ala

Met

Ala

Ile

Tyr

Lys

Gin

Ser

Gin

His

155

160

165

ATG

ACG

GAG

GTT

GTG

AGG

CGC

TGC

CCC

CAC

CAT

GAG

CGC

TGC

546

Met

Thr

Glu

Val

Val

Arg

Arg

Cys

Pro

His

His

Glu

Arg

Cys

170

175

180

-18CZ 298806 B6

TCA

GAT

AGC

GAT

GGT

CTG

GCC

CCT

CCT

CAG

CAT

CTT

ATC CGA

588

Ser

Asp

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Pro

Gin

His

Leu

Ile Arg

185

190

195

GTG

GAA

GGA

AAT

TTG

CGT

GTG

GAG

TAT

TTG

GAT

GAC

AGA AAC

630

Val

Glu

Gly

Asn

Leu

Arg

Val

Glu

Tyr

Leu

Asp

Asp

Arg Asn

200

205

210

ACT

TTT

CGA

CAT

AGT

GTG

GTG

GTG

CCC

TAT

GAT

CCG

CCT GAG

672

Thr

Phe

Arg

His

Ser

Val

Val

Val

Pro

Tyr

Glu

Pro

Pro Glu

215

220

GTT

GGC

TCT

GAC

TGT

ACC

ACC

ATC

CAC

TAC

AAT

TAC

ATG TGT

714

Val

Gly

Ser

Asp

Cys

Thr

Thr

Ile

His

Tyr

Asn

Tyr

Met Cys

225

230

235

AAC

AGT

TCC

TGC

ATG

GGC

GGC

ATG

AAC

CGG

AGG

CCC

ATC CTC

756

Asn

Ser

Ser

Cys

Met

Gly

Gly

Met

Asn

Arg

Arg

Pro

Ile Leu

240

245

250

ACC

ATC

ATC

ACA

CTG

GAA

GAC

TCC

AGT

GGT

AAT

CTA

CTG GGA

798

Thr

Ile

Ile

Thr

Leu

Glu

Asp

Ser

Ser

Gly

Asn

Leu

Leu Gly

255

260

265

CGG

AAC

AGC

TTT

GAG

GTG

CGT

GTT

TGT

GCC

TGT

CCT

GGG AGA

840

Arg

Asn

Ser

Phe

Glu

Val

Arg

Val

Cys

Ala

Cys

Pro

Gly Arg

270

275

280

GAC

CGG

CGC

ACA

GAG

GAA

GAG

AAT

CTC

CGC

AAG

AAA

GGG GAG

882

Asp

Arg

Arg

Thr

Glu

Glu

Glu

Asn

Leu

Arg

Lys

Lys

Gly Glu

285

290

CCT

CAC

CAC

GAG

CTG

CCC

CCA

GGG

AGC

ACT

AAG

CGA

GCA CTG

924

Pro

His

His

Glu

Leu

Pro

Pro

Gly

Ser

Thr

Lys

Arg

Ala Leu

295

300

305

CCC

AAC

AAC

ACC

AGC

TCC

TCC

CCC

CAG

CCA

AAG

AAG

AAA CCA

966

Pro

Asn

Asn

Thr

Ser

Ser

Ser

Pro

Gin

Pro

Lys

Lys

Lys Pro

310

315

320

CTG

GAT

GGA

GAA

TAT

TTC

ACC

CTT

GAG

ATC

CGT

GGG

CGT GAG

1088

Leu

Asp

Gly

Glu

Tyr

Phe

Thr

Leu

Gin

Ile

Arg

Gly

Arg Glu

325

330

335

CGC

TTC

GAG

ATG

TTC

CGA

GAG

CTG

AAT

GAG

GCC

TTG

GAA CTC

1050

Arg

Phe

Glu

Met

Phe

Arg

Glu

Leu

Asn

Glu

Ala

Leu

Glu Leu

340

345

350

- 19CZ 298806 B6

AAG

GAT

GCC

CAG

GCT

GGG

AAG

GAG

CCA

GGG

GGG

AGC

AGG

GCT

1092

Lys

Asp

Ala

Gin

Ala

Gly

Lys

Glu

Pro

Gly

Gly

Ser

Arg

Ala

355

360

CAC

TCC

AGC

CAC

CTG

AAG

TCC

AAA

AAG

GGT

CAG

TCT

ACC

TCC

1134

His

Ser

Ser

His

Leu

Lys

Ser

Lys

Lys

Gly

Gin

Ser

Thr

Ser

365

370

375

CGC

CAT

AAA

AAA

CTC

ATG

TTC

AAG

ACA

GAA

GGG

CCT

GAC

TCA

1176

Arg

His

Lys

Lys

Leu

Met

Phe

Lys

Thr

Glu

Gly

Pro

Asp

Ser

380

385

390

GAC TGA 1182

Asp *

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití sloučeniny schopné alespoň částečně inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 ío pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.
2. 2. Použití podle nároku 1 sloučeniny schopné vazby v úrovni domény 1-134 sekvence proteinu Mdm2 znázorněné v SEQ ID N°l.

   15
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, při kterém je sloučeninou sloučenina scFV řízená proti doméně 1-134 proteinu Mdm2.
4. 4. Použití podle nároku 1 nebo 2, při kterém je sloučenina částečně nebo zcela reprezentována peptidy 1-52, 1-41, 6—41, 16-25, 18-23 sekvence p53 reprezentované v SEQ ID N°2 nebo jejich

   20 deriváty.
5. 5. Použití podle nároku 1 sloučeniny schopné vazby k doméně, sousedící s doménou 1-134 reprezentovanou v SEQ ID N°1 proteinu Mdm2, a schopné v důsledku této vazby působení na onkogenní aktivitu proteinu.
6. 6. Použití podle nároku 1 nebo 5, při kterém je tato sloučenina schopna vazby s oblastí C-konce proteinu Mdm2.
7. 7. Použití podle nároků 1, 5 nebo 6, při kterém je sloučeninou transkripční faktor zvolený ze 30 souboru zahrnujícího TFI1, TPB a TAF250.
8. 8. Použití podle nároku 1 nebo 5, při kterém je sloučeninou sloučenina schopná vazby s oblastí 135^491 proteinu Mdm2.

   35
9. 9. Použití podle nároků 1, 5 nebo 8, při kterém je sloučeninou částečně nebo úplně protein zvolený ze souboru zahrnujícího proteiny Rb a L5 a transkripční faktor E2F.
10. 10. Použití nukleové kyseliny kódující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti

    40 s p53 nul.

    -20CZ 298806 B6
11. 11. Použití podle nároku 10, při kterém se jedná o

    - antimediátorové nukleové kyseliny,

    - oligonukleotidové ligandy schopné vazby přímo k doméně proteinu Mdm2 a inhibice jeho

    5 onkogenní aktivity,

    - nukleové kyseliny částečně nebo zcela kódující peptidy nebo proteiny schopné oligomerace s jednou z domén Mdm2 a inhibice její onkogenní aktivity,

    - nukleové kyseliny kódující intracelulámí protilátky řízené proti doméně 1-134 sekvence proteinu Mdm2 znázorněné v SEQ ID N°1.
12. 12. Použití podle nároku 11, při kterém antimediátorovou nukleovou kyselinou je DNA kódující komplementární RNA nukleové kyseliny kódující protein Mdm2 a schopná blokování jeho transkripce a/nebo translace nebo ribozym.

    15
13. 13. Použití podle některého z nároků 10 až 12, při kterém je nukleová kyselina ve formě komplexu s DEAE-dextrane, s jádrovými proteiny nebo s lipidy nebo s kationtovými polymery ve formě lipozomů nebo jako taková.
14. 14. Použití podle jednoho z nároků 10 až 12, při kterém nukleová kyselina je součástí vektoru.
15. 15. Použití podle nároku 14, při kterém nukleová kyselina je součástí virálního vektoru zvoleného ze souboru zahrnujícího adenoviry, retroviry a adenoasociované viry.
16. 16. Virální vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující sloučeninu schopnou inhibo25 vat alespoň částečně onkogenní aktivitu proteinu Mdm2.
17. 17. Virální vektor podle nároku 16 obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující scFV nebo peptid schopný vazby v úrovni domény 1-134 proteinu Mdm2 reprezentované v SEQ ID N°1 proteinu Mdm2.
18. 18. Virální vektor podle nároku 16 nebo 17 zvolený ze souboru zahrnujícího adenoviry, retroviry a adenoasociované viry.
19. 19. Virální vektor podle nároku 16 až 18, kterým je adenovirus nebo retrovirus.
20. 20. Farmaceutická kompozice určená pro léčení rakovin v souvislosti s p53 nul, vyznačená tím, že obsahuje sloučeninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2, jak je definována v nárocích 1 až 10.

    40
21. 21. Farmaceutická kompozice určená pro léčení rakovin v souvislosti sp53 nul, vyznačená tím, že obsahuje sekvenci nukleových kyselin kódující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2, jak je definována v nároku 11 nebo 12.
22. 22. Farmaceutická kompozice podle nároku 21, výhodně formulovaná pro intratumorální

    45 podání, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden virální vektor podle některého z nároků 13 až 19.
23. 23. Použití podle nároku 11 nukleové sekvence kódující intracelulámí protilátky řízené proti doméně 1-134 proteinu Mdm2 znázorněné v SEQ ID N°1 pro přípravu farmaceutické kompozice

    50 určené k léčení rakoviny v souvislosti s p53 nul.

    5 výkresů