[go: up one dir, main page]

CZ297198A3 - Prostředí pro kultivaci savčích buněk - Google Patents

Prostředí pro kultivaci savčích buněk Download PDF

Info

Publication number
CZ297198A3
CZ297198A3 CZ982971A CZ297198A CZ297198A3 CZ 297198 A3 CZ297198 A3 CZ 297198A3 CZ 982971 A CZ982971 A CZ 982971A CZ 297198 A CZ297198 A CZ 297198A CZ 297198 A3 CZ297198 A3 CZ 297198A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
culture medium
hbm
hepatocytes
cells
medium
Prior art date
Application number
CZ982971A
Other languages
English (en)
Inventor
Geoffrey D. Block
Original Assignee
University Of Pittsburgh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Pittsburgh filed Critical University Of Pittsburgh
Publication of CZ297198A3 publication Critical patent/CZ297198A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká obecně prostředí ke kultivaci savčích buněk. Zejména se týká kultivačního prostředí, které dovoluje dlouhodobou expansi a uchovávání buněčné populace savčích hepatocytů, od hepatocytů odvozených buněčných linií, od hepatocytů odvozených maligních buněk a jiných buněk.
Dosavadní stav techniky
Je dobře známo, že specifické buněčné linie lze pěstovat in vitro v optimálně formulovaném kultivačním nebo živném prostředí. Příklady některých kultivačních prostředí, vyvinutých ke speciálním účelům, jsou: RPMI Media 1640, prostředí pro pěstování lidských B-lymfoidních buněk a maligních buněk, Changovo prostředí pro pěstování buněk amniotických fluidních buněk, Medium 199 pro pěstování myších fibroblastových buněk, Minimal Essential Medium (MEM), minimální prostředí pro růst připojených savčích buněk, a Leibovitzovo prostředí pro růst v nepřítomnosti oxidu uhličitého. Taková různá prostředí se od sebe navzájem odlišují tím, že obsahují podstatně odlišné složky například podstatně odlišné aminokyseliny, vitaminy, organické soli, stopové prvky a jiné organické sloučeniny, které podporují maximální růst pěstovaných buněk.
Pro růst savčích buněk se chemicky definovaná prostředí obvykle doplňují různými séry, například zárodečným telecím sérem nebo sérem nově narozených telat a jinými nedokonale definovanými růstovými faktory. Hlavním nedostatkem sér však je, že jejich složky mohou kolísat v širokých mezích, čímž se do živného prostředí zavádějí nedefinované biologické složky, což přispívá k variabilitě biochemických a buněčných jevů. Kromě • ·
-· 2* • ** · toho je sérum nákladné a může vyústit v kritické imunitní reakce u pacienta, použije-li se buněk ke klinickým účelům.
Regenerace jater se dosahuje především buněčným oddělením zralých dospělých hepatocytů (Grisham J.W. a kol. Cancer Res. 22, str. 842, 1962). Tyto buňky, nebo jejich fragmenty mají velkou kapacitu pro klonální růst, jak to bylo ukázáno transplantačními experimenty hepatocytů do ektopických míst (Jirtle, R.L. a kol., Cancer Res. 42, str. 3000, 1982) a na transgenických myších modelech (Rhim J.A a kol., Science 263, str.1149, 1994). V několika studiích však bylo ukázáno, že jsou-li játra stimulována k regeneraci, zatímco je proliferace zralých hepatocytů potlačena, objeví se a proliferují fakulativní kmenové buňky (například Thorgeirsson S.S. a kol., Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 204, str. 253, 1993). Takové buňky, někdy nazývané oval cells mohou dospívat v hepatocytech v definovaných zvířecích modelech nebo v dukturálních strukturách buněk (ductural hepatocytes) se smíšenými hepatocytovými a žlučovodovými epithe1iálními markéry (Gerber M.A. a kol., Amer. J. Path 110, str. 70, 1983; a Vandersteenhoven M.A. a kol., Arch.
Pathol. Lab. Med. 114, str. 403, 1991). Málo je však poznatků o jejich původu a o řídicích mechanismech, které regulují jejich fenotypické přechody na hepatocyty nebo duktulární buňky.
Přes velkou kapacitu hepatocytů proliferovat in vivo, přímo nebo prostřednictvím růstu fakulativních kmenových buněk, není dosud důkladně porozuměno jejich fenotypickému přechodu vzhledem k pouze omezenému úspěchu v růstu hepatocytů v primární kultuře. Je typická okolnost, že hepatocyty v primární kultuře pod vlivem primárních mitogenů vstupují do jedné nebo dvou divizí a pak buňky dgenerují a odumírají. Proto různí badatelé neuspěli ve vývoji prostředí, které dovolí, aby hepatocyty jak pro 1 iferovaly, tak přežívaly.
Například Berry, M.M. a kol. (J. Cell. Biol. 43, str. 506, 1969) objevil perfusní techniku kollagenázy, která dovoluje
-:3 jaterním tkáním disociaci do buněčných elementů jejich složek, založenou na velikosti. Později popsali Bissell D.M. a kol. (J. Cell. Biol. 59 (3), str. 722, 1973) a Boney R.J. a kol. (In Vitro 9, str. 399, 1974) první způsoby kultivace izolovaných hepatocytů, které snad přežívaly jeden nebo dva dny. O dlouhodobé kultivaci hepatocytů na kolagenonových gelech po dobu maximálně 7 až 10 dní referuje Michalopoulos G. a kol. (Exp. Cell. Res. 94 (1), str. 70, 1975). Společnou vlastností všech uvedených systémů je, že hepatocyty byly ve všech těchto systémech udržovány v kultuře bez jakékoli známky proliferace buněk. Místo toho byly tyto systémy pouze udržovacími kulturami nepro1 iferujicích buněk po krátké období.
První úspěšný pokus iniciovat syntesu DNA v hepatocytech použil tehdy nově objeveného epidermálního růstového faktoru (EGF) (Richman R.A. a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 73, str. 3589, 1976). V následujících letech několik jiných skupin badatelů použilo EGF jako mitogenu pro hepatocyty a referovali o mitogenických efektech EGF a o jejich modulaci jinými faktory, jako například matricemi, jako je kolagen typu I, zinek a pro1 in.
Růstový faktor hepatocytů, známý též pod faaktor rozptylu (dále nazývaný HGF nebo HGF/SF)) byl objeven, klonován a nakonec sekvencován v závěru 80.let (Michalopoulos G. a kol., Federation Proceedings 42, str. 1023, 1983); Michalopoulos G. a kol., AACR Proceedings 24, str. 58, 1983; Michalopoulos G. a kol., Cancer Res. 44 (10), str. 4414, 1984; a
Miyazawa K. a kol., Biochem. Biophys. Res.Comun. 163, str.967, 1989). Zjistilo se, že HGF/SF je mitogen pro mnohé hepatocyty stejně jako pro epitheliální buňky. Význam HGF/SF pro játra je dán skutečností, že je spouštěčem pro regeneraci jater mechanismem vnitřní sekrece.
V poslední době ukázaly některé studie, že HGF/SF, epidermální růstový faktor (''EGF) a transformační růstový faktor • · _· 4*
α (TGFa) jsou primárními mitogeny pro hepatocyty v kultuře stimulováním omezené hepatocytové syntesy DNA v chemicky definovaných prostředích (například Michalopoulos G.K., Fed. Am. Soc. Exp. Biochem J. 4, str. 176, 1990). Tyto růstové faktory mají, jak se později ukázalo, úlohu in vitro při regeneraci jater po parciální hepatoktomii. Injekce HGF/SF, TGFa nebo EGF vyvolávaly v krysách synthesu DNA v hepatocytech (například Liu M.L. a kol., Hepatology 19, str. 1521, 1994).
Ve všech těchto systémech však, jak bylo referováno, vstupují hepatocyty do syntesy DNA a mitosy na pouze omezenou dobu, obvykle 1 až 3 dny. Po 1 až 2 cyklech syntesy DNA a dělení buněk, kultura degeneruje a všechny buňky odumřou přibližně v 7 až 1O dnech. Až dosud nebyla dokumentována expanse počtu hepatocytů v buněčné kultuře přidáním samotného EGF nebo HGF, nebo v kombinaci. Místo toho je množení v kulturách obsahujících tyto růstové faktory samočinně omezené a počet hepatocytů, které odumřou převažuje počet hepatocytů, které se nově vytvoří. Podobně je samočinně omezeno množení buněk v kulturách obsahujících jiné mitogeny hepatocytů jako je transformující růstový faktor, jako TGFa a kyselý fibroblastový růstový faktor.
V poslední době se v literatuře uvádí (Mitaka T. a kol., Hepatology 13 (1), str. 21, 1991; Mitaka T. a kol. Hepatology 16(2), str.440, 1992); Mitaka T. a kol., Virchows Arch. B Cell Pathol. Inci. Mol. Pathol. 62, str. 329, 1992; a Mitaka T. a kol., Cancer Res. 53, str. 31245, 1993), že přidáváním nikotinamidu, dexamethasonu a EGF do běžného kultivačního prostředí vedlo k vytváření kolonií malých hepatocytů vystupujících v husté kultuře parenchymálních hepatocytů standardní velikosti. V další studii Mitaka T. a kol. (J. Cell. Physiol. 157, str. 461, 1993) uvádí, že počty kolonií, vyvolaných kombinací EGF + HGF, EGF + TGFa a HGF + TGFa, se nelišily od počtu kolonií, vyvolaných tímto mitogenem samotným. V těchto studiích • · • · · _, ·C ·_ r ·
9^9 9 však nebyla významná expanse celkové buněčné populace, žádný náznak klonálního růstu a byla ztráta diferenciace.
Až dosud se nevyskytlo chemicky definované prostředí, doplňované nebo nedoplňované, které je schopno podporovat dlouhodobou proliferaci, diferenciaci a životnost hepatocytů. Zatímco pro mnohé účele je použití nedefinovaného doplňku uspokojivé, ve studiích, kde jde o růst, metabolismus a/nebo diferenciaci buněk v kultuře, je nanejvýš žádoucí mít doplněk, který je definovaný. Zavádění nedefinovaných složek do buněčné kultury může přispívat k variabilitě, nepředvídáteInosti a kontaminaci ve studijních výsledcích a aplikacích buněčné kultury. Používání definovaného prostředí je obzvlášt významné a výhodné v oblasti drogového metabolismu, vývoji umělých orgánů, transplantace buněk, genové terapii a v základních výzkumných studiích buněk.
Shora popsaná omezená schopnost hepatocytů proliferovat v primární struktuře bránila dlouhodobým studiím nebo použitím, které potřebovaly dlouhodobou životnost nebo proliferaci. Tím bylo bráněno aplikacím hepatocytových kultur k buněčným transplantacím a genové terapii. V důsledku toho zbývá poptávka po chemicky definovaném prostředí, které dovolí proliferaci hepatocytů a jejich dlouhodobé přežití. Mezi potenciální aplikace pro takové prostředí a hepatocytů a jiných takto pěstovaných buněk patří genová terapie, biologicky umělé orgány, buněčné transplantace, produkce drog a drogové a chemické testování .
Jak bylo shora uvedeno, neposkytuje dosavadní stav techniky systém kultivace hepatocytů, ve kterém hepatocyty expandují jako populace buněk trvalou proliferaci a takový systém je potřebný. Vynález poskytuje plně definované kultivační prostředí, které dovoluje trvalou proliferaci a dlouhodobou expansi hepatocytů.
• ·
-:6:
• · · · ·
Podstata vynálezu
Chemicky definované HBM kultivační prostředí pro udržování, diferenciaci a dlouhodobý růst savčích hepatocytů spočívá podle vynálezu v tom, že obsahuje
a) syntetické zásobní základní prostředí určené pro kultivaci savčích buněk a
b) růst hepatocytové buňky podporující množství složek, vybraných ze souboru zahrnujícího nikotinamid, aminokyseliny, transferrin, hormony, dexamethason, stopové kovy a jednoduché uhlohydráty volené ze souboru zahrnujícího D-glukózu a D-galaktózu a jejich jakékoliv kombinace.
Vynález je především zaměřen na pěstování savčích hepatocytových buněk pomocí chemicky definovaného prostředí, které dovolí dlouhodobou expansi buněčné populace. Pojmu chemicky definované prostředí se používá při kultivaci tkání k označení kultivačního prostředí o známém chemickém složení, jak kvalitativním tak kvantitativním, na rozdíl od prostředí, která obsahují přírodní produkty jako zvířecí séra.
Podle vynálezu se poskytuje nové chemicky definované prostředí k pěstování buněk. Toto prostředí podporuje soustavný klonální růst primárních hepatocytů a hepacytových buněčných linií, geneticky transformovaných hepatocytů a hepatocytů získaných z neoplastických zdrojů a vede k expansi buněčné populace. Toto prostředí dále umožňuje úplnou diferenciaci metabolických, strukturálních a sekrečních funkcí buněk v něm rostoucích. Za těchto podmínek prodělávají hepatocyty mnohonásobné proliferativní cykly. Jakmile je jednou dosaženo ovlivnění, nebo v přítomnosti specifických matričních složek, živných a/nebo růstových faktorů, přestanou se tyto proliferující buňky dělit a uchovají si zralý hepacytový fenotyp po mnoho měsíců nebo déle.
• · ·7 ·•« ·
Vynález se především týká kultivačního prostředí pro trvalou proliferaci a životnost hepatocytů. Dále se vynález týká kultivačního prostředí pro trvalou diferenciaci a životnost hepatocytů. Vynález se rovněž týká kultivačního prostředí pro soustavnou proliferaci hepatocytů, která se obrátí v úplnou diferenciaci když růst ustane.
Vynález se také týká poskytnutí kultivačního prostředí pro dlouhodobou expansi hepatocytů, které neobsahuje žádné sérum, takže prostředí je plně definované.
Ještě dále se vynález týká kultivačního prostředí pro soustavnou proliferaci, diferenciaci a životnost hepatocytů na různých matričních substrátech.
Cíle vynálezu se dosahuje jedním nebo několika následujícími způsoby.
Vynález se tedy týká chemicky definovaného kultivačního prostředí HBM pro údržbu, diferenciaci a dlouhodobý růst savčích hematocytů, zahrnujícího:
a) syntetické zásobní základní prostředí určené pro kultivaci savčích buněk a
b) růst hepatocytové buňky podporující složky, vybrané ze sou boru zahrnujícího nikotinamid, aminokyseliny, transferrin, hormony, dexamethason, stopové kovy a jednoduché uhlohydráty volené ze souboru zahrnujícího D-glukózu a D-galaktózu a jejich jakékoliv kombinace.
Podle výhodného provedení vynález poskytuje kultivační prostředí HBM obsahující dále pufr, antibiotika a albumin.
Vynález se také týká kultivačního prostředí pro savčí buňky, které obsahuje kompozici HGM definovanou v tabulce I a II, přičemž zásobní základní prostředí podle tabulky I před• ·
- :8 :stavuje směs DMEM takovou, že konečná koncentrace D-glukosy je s výhodou 2,0 g/1 a množství D-galaktosy je s výhodou přibližně 2,0 g/1.
Vynález a jeho výhody blíže objasňuje, nijak však neomezuje, následující podrobný popisu výhodného provedení, patentové nároky a připojené obrázky.
Seznam obrázků
Na obr. 1A-1C jsou grafy ukazující výsledky studií, při kterých byly krysí hepatocyty kultivovány ve zde popsaném prostředí HBM, doplněném růstovým faktorem, jak naznačeno. Všechny body vyjadřují průměry a směrodatnou odchylku nejméně tří oddělených kultur.
Na obr. IA je procento značených jader (BRdU) proliferujících buněčných kultur v různých dobách po izolaci hepatocytů. Buňky byly pěstovány v HBM doplněným HFG/SF a EGF. Na ose x jsou dny v kultivačním prostředí, na ose y procento značených jader.
Obr. IB ukazuje začlenění [3H] thymidinu (rozklad za minutu) do DNA v kulturách v různých časech po izolaci hepatocytů. Buňky byly vystaveny HGF/SF v HBM (kosočtverec), EGF v HBM (kolečko), HGF/SF + EGF v HBM )trojúhelnik) a kontrola, HBM samotná (čtverec). Na ose x jsou dny v kultivačním prostředí, na ose y DNA syntéza.
Obr. IC ukazuje množství DNA na destičku po různých dnech růstu buněk v prostředí HBM samotném (B ), HGF/SF v HBM (trojúhelník), EGF v HBM (obrácený trojúhelník) a HGF/SF + EGF v HBM (plné kolečko). Na ose x jsou dny v prostředí HGM na ose y jsou mikrogramy DNA v kultivačním prostředí.
• ·
- $ :• ·
Obr. 2 je graf znázorňující 15. den DNA na destičku krysích hepatocytů rostoucích v HBM s vyznačenými růstovými faktory. Buňky označené control (den t=O) a den 15 byly pěstovány v HBM bez jakýchkoli růstových faktorů. Na ose x jsou kultivační prostředí, na ose y jsou mikrogramy DNA v kultivačním prostředí.
Obr. 3 je graf ukazující míru synthesy DNA na destičku (gg/kultura) krysích hepatocytů 15. dne v HBM doplněném HGF/ SF a EGF, rostoucích na různých matricích. Na ose x CC znamená kolagen povlečený; ECL obchodní matrici; m COLL IV myší kolagen IV; CC VITROGEN znamená kolagen hovězí kůže typu I; PÓLY D LYS znamená póly D-Lysin; m LAMININ znamená myší laminin; h FIBRONECT znamená lidský fibronektin; a m COL I znamená myší kolagen I.
Obrázky 4A-4G jsou snímky hepatocytů pěstovaných v HBM jak zde popsáno, za různých podmínek.
Obr. 4A znázorňuje hepatocyty v prostředí HBM s HGF/SF a EGF 1. den po izolaci, ukazující subslití nepro1 iferujících hepatocytů.
Obr. 4B znázorňuje hepatocyty 4. dne v prostředí HBM indukovaném HGF/SF, ukazující typickou rozptýlenou morfologii.
Obr. 4C znázorňuje kultury hepatocytů jež dosáhly slití 15. dne, ukazující typickou morfologii.
Obr. 4D a 4E jsou volené mikrosnímky buněk z obr. 4A a 4C.
Obr. 4F a 4G jsou mikrosnímky vybarvených hepatocytů, jež byly transfektovány 3. dne s replikací defektních retrovirů obsahujících lac-Z a vybarvených na expresi β-galaktosinázy jak dále popsáno a pak fotografovaných 1. dne (obr. 4F) a 10.
- Ho • · ··· ······· · 4 49 dne (obr. 4G) po transfekci. Buňky byly pěstovány v prostředí HBM doplněném HGF/SF a EGF jak dále popsáno.
Obr. 5A a 5B jsou snímky Northernových skvrn ukazující expresi specifických genů v různých dnech v kulturách krysích hepatocytů udržovaných v HBM v přítomnosti HGF/SF a EGF, jak zde popsáno. Jako interních kontrol je použito exprese GAPDH a intenzity 28S RNA po vybarvení ethidiumbromidem.
Obr. 6A až 6F jsou snímky proliferujících krysích hepatocytů pěstovaných v prostředí HBM v přítomnosti HGF/SF a EGF, jak zde popsáno a jejich Northernových skvrn.
Obr. 6A je mikrosnímek s fázovým kontrastem kultur proliferujících hepatocytů překrytých 8. dne Matrigelem a fotografovaných 18. dne. Granulární cytoplasma a vzhled typických žlučových canadiculi se jeví jako světlé linky mezi buňkami.
Obr. 6B a 6C jsou snímky buněk 18. dne v kultuře, pořízené elektronovým mikroskopem při středním a velkém zvětšení, 10 dní po překrytí Matrigelem. Je patrný typický vzhled hepatocytové cytoplasmy jako lamel endop1astového reticulum obtáčejících mitochondri i, mikrotělesa s krystalickým středem, žlučové canaliculi (C) (obr. 6B), bujnou mitochondrii (M) a glykogen (G) (obojí na obr. 6C).
Obr. 6D je snímek Northernových skvrn ukazující zvýšenou expresi albuminu mRNA po přidání Matrigelu. Albumin MRNA je expresován do kontrolních kultur, těsně po izolaci z jater kollagenázou perfuzí a před kultivací. Exprese je minikální 8. den v kultuře. 3. a 7. dne po přidání Matrigelu (sloupce označené + ) došlo k nárůstu exprese albuminu mRNA. Jako interní kontroly je použito exprese GADPH.
Obr. 6E je snímek Northernových skvrn ukazující indukci
cytochromu IIB1 mRNA v kulturách ošetřených Matrigelem 8. dne a vystavených fenobarbitolu (PB) o 2 dny později (10. den kultivace). Buňky byly shromážděny 15. den kultivace. K plnění mRNA bylo použito jako kontroly exprese GAPDH.
Obr. 6F je snímek Northernových skvrn buněk pěstovaných přídavně s Matrigelem (přidaným 8. dne kultivace). Citrokeratin 19, markér žlučovodu expresovaný proliferujíčími hepatocyty je potlačen přísadou Matrigelu a není potlačen v kontrolní kultuře, jež nedostala Matrigel. Jako interní kontroly je použito 28S rRNA vybarvené ethidiumbromidem.
Obr. 7A až 7E ukazují výsledky studií znázorňující tvoření ductular/acinárních struktur v kulturách krysích hepatocytů udržovaných od začátku kultivace mezi dvěma gelovými vrstvami kolagenu typu I v HBM v přítomnosti HGF/AF. Obr. 7A až 7D znázorňují snímky kultur 15. dne.
Obr. 7A je mikrosnímek s fázovým kontrastem (100X) ukazující vzhled dukturálních struktur obklopených fibrilami kolagenu.
Obr. 7B je mikrosnímek (100X) parafinových sekcí z obr. 7A kolagenových gelů typu I vybarvených hematoxy1inem a eosinem.
Obr. 7C a 7D jsou snímky z elektronového mikroskopu buněk obklopujících stejný lumen avšak v odlišných místech kolem lumenu jedné ze duktulárních struktur patrných na obr. 7B. Obr. 7C ukazuje buňky morfologie podobné epitelia žlučovodu, s dlouhými rovnoběžnými kontakty spojenými s mnoha desmosomy a s nadbytkem keratinových inetrmediálních filamentů. Obr. 7D ukazuje buňky podobající se více hematocytovému fenotypů s drsným endoplastickým retikulem a mitochondriί, s hustě vybarvenými sekundárními lysosomy a s méně filamenty.
• · • · · ·
- a2 • ·
Obr. 7E je snímek Northernových skvrn ukazující, že exprese cytokeratinu 18 a 19 vzrůstá v kulturách s dukturálními/ acinárními strukturami, zatímco abumin je pouze mírně expresován.
Obr. 8 ukazuje snímek vybarvených hepacytových kultur v HBM doplněných HGF/SF a EGF jak zde popsáno, odebraných 1., 3. , 5. , 7., 10., 12. a 19. dne.
Podrobný popis vynálezu
Vynález poskytuje hepacytové základní prostředí, zde označované HBM, které dovoluje dlouhodobou expansi, diferenciaci a přežívání buněčné populace hepatocytů, z hepatocytů odvozených buněčných linií, jako je HepG2, hepatických zárodečných epiteliálních buněk a hepatických primárních hepatokarcinomových buněk in vitro. Dále může být prostředí podle vynálezu použito k pěstování buněk pankreatických ostrůvků, ledvinových tubulárních buněk, Ito buněk, malých střevních epitheliálních buněk a řady buněčných linií, například včetně buněk MRC5, CaCo a 3T3. HBM podle vynálezu uchovává metabolické cesty a syntézní funkce, například diferenciaci zralých dospělých hepatocytů. Kromě toho, je-li HBM podle vynálezu kombinováno se specifickými mitogeny a s kompozicemi extracelulární matrice, mohou být hepatocyty hnány k transdiferenciaci na struktury podobné žlučovodům. HBM podle vynálezu je možno použít k pěstování savčích hepatocytů a jiných buněk, včetně, aniž se na ně omezuje, buněk lidského, krysího, psího, vepřového, myšího a paviánního původu.
Prostředí HBM obsahuje vhodné úrovně zbytných a nezbytných aminokyselin a většiny iontů a stopových prvků, pufrů, vitaminů, uhlohydrátů, lipidů, proteinů a hormonů, takže může sloužit jako živné prostředí in vitro kultury savčích buněk.
Ve svém nejširším významu představuje vynález chemicky definované základní prostředí, HBM, které samo umožňuje dlouhé přežití, diferenciaci a růst savčích hepatocytů a jiných buněk. Kromě toho, v prostředí růstových faktorů, jako HGF/SF, EGF nebo TGFa, stejně jako jiných mitogenů, má růst buněk v doplněném HBM rychlejší populační expansi a klonální růst. Jak bylo dále dokázáno, HBM podle vynálezu, je-li doplněno HGF/SF způsobuje vytváření struktur podobných žlučovodům ve spojení s některými určitými konstrukcemi matrice. Jak je shora uvedeno, nejsou však takové růstové faktory nutné pro specifické diferenciační obrazy v primárních kulturách, nýbrř urychlují růst a populační expansi v případě potřeby pro specifické účely.
Prostředí HBM podle vynálezu představuje chemicky definované základní zásobní prostředí (dále označované SM) určené pro kultivaci savčích buněk. Základní zásobní prostředí může být s výhodou sestaveno pomocí modifikovaného Dulbeccova prostředí (Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM), jako jedné složky, vynález tím však není nikterak omezen, pokud jsou pro formulace splněna daná pravidla. Příklady jiných definovaných základních prostředí, kterých je možno použít podle vynálezu, zahrnují, aniž jsou na ně omezeny, například: Basal Media Eagle (BME), DMEM/F-12 (objemově 1:1 DMEM a F-12), Medium 199, F-12 (Ham) živná směs, F-10 (Ham) živná směs, Minimal Essential Media (MEM), Williamsova media E a RPMI 1640, která jsou všechna obchodními produkty společnosti Gibco -BRL/ Life Technologies, lne. Gaithersburg, MD. Obchodně je dostupných několik verzí mnoha z těchto prostředí, přičemž obzvlášř vhodná k sestavení HBM zahrnují, aniž jsou na ně omezena, DMEM 11966, DMEM 10314, MEM 11095 WillianTs Media E 12251, Ham F12 11059. MEM-alfa 12561 a Medium 199 11151 (všechna jsou obchodní produkty společnosti Gibco -BRL/Life Technologies,lne. , (katalog 1995-1996). Proto, je-li například L-arginin a/nebo D-glukóza již v zásobním základním prostředí v postačujícím množství, stačí popřípadě přidat dplňující složku jen malém množství.
V závislosti na příslušném složení tohoto základního zásobního prostředí, se pak SM doplní, jak je dále podrobněji uvedeno D-glukózou a/nebo D-galakózou, nikotinamidem, jinými složkami tvořícími aminokyseliny a stopové prvky jež nejsou již v SM obsaženy, jako je L-prolin, L-glutamin, L-arginin, Lornithin, zinek, mangan, měd a selen, vyčištěný transferrin, ke kterému je vázáno elementární železo nebo apo-transferrin, v kombinaci s glutonátem železa, hormony jako je dexamethason a inzulín a pH pufr, jako HEPES (N-[2-hydroxyethy1]piperazinN-[2-ethansulfonová kyselina]). Antibiotika, jako penicillin, streptomycin a indikátor pH, albumin a/nebo dextran, potřebné mastné kyseliny, alternativní pufry, vitaminy, osmotická činidla a jiné formy stopových prvků mohou být také případně přidány. Typicky má základní prostředí hodnotu pH 6,5 až 8,2, s výhodou 7,0-7,7 a nejvýhodněji 7,2-7,5. Fenolová červeň je typickým přidávaným indikátorem jako pomoc při indikaci pH. SM a dodatky představují prostředí HBM podle vynálezu.
Prostředí HBM může být případně doplněno jedním nebo několika růstovými faktory, jako například HGF/SF, EGF a TGFa, pokud je požadován zrychlený růst.
Do zásobního základního prostředí se k obsahu HBM přidávají jednoduché uhlohydráty D-glukóza a/nebo D-galaktóza. Použije-li se obou, jak D-glukózy, tak D-galaktózy, je součet jejich koncentrací s výhodou 8,0 g/1 nebo méně, avšak více než 0,01 g/1 při respektování obsahu D-glukózy případně obsažené v zásobním základním prostředí. Použije-li se pouze jednoho z uhlohydrátů, D-glukózy nebo D-galaktózy, je koncentrace s výhodou 5,0 -0,1 g/1. Například v uvedeném příkladu obsahuje smíšené DMEM zásobní základní prostředí 2,0 g/1 D-glukózy a další D-glukóza se nepřidávala. Jako doplněk se pak přidaly 2 g/1 D-galaktózy.
Ukázalo se, že nikotinamid, jiná složka HBM, uchovává hepatocytovou diferenciaci, usnadňuje expresi cytochromu P45O
- 15Ía prodlužuje přežívání hepatocytů v běžných kulturách o 10 až 14 dní (Rosenberg M.R. a kol. In Vitro 18, str. 775, 1982; a Inoue C. a kol., Biol. Chem. 264(9), str. 4747, 1989).
Transferrin je protein vážící železo, který je v interakci s transferrinovým receptorem na buněčné membráně. Slouží k transportu jak chelátových, tak železných iontů. Transferrin, s výhodou používaný podle vynálezu, je bud holotransferrin 30% nasycený železem nebo je úplně nenasycený (apotransferrin) a je kombinován s glukonátem železa.
Ukázalo se, že dexamethason, syntetický kortikosteroid, podporuje syntesu DNA vyvolanou EGF (Sand T.F. a kol., Acta Endocrionol. 109, str. 369, 1985). Dexamethasonem používaným podle vynálezu může být jakýkoli derivát kortisolu, jako například prednison, prednisilon, kortisol a hydrokortison.
Inzulín a inzulínu podobné růstové faktory jsou nutné k odbourávání glukózy, k transportu aminokyselin a k udržování četných intermediárních metabolických cest. Tyto jevy napomáhají uchovat diferenciaci a podporují proliferaci.
Začlenění L-argininu do HBM, v základním zásobním prostředí, nebo jeho doplnění, se jeví jako významné, jelikož hepatocyty v kultuře mají sklon ztrácet svou kapacitu syntetizovat arginin močovinovým cyklem. V nepřítomnosti L-argininu, nemohou hepatocyty v kultuře dlouho přežít, jelikož se stávají neschopnými syntetizovat L-arginin, čímž blokují jejich syntesu proteinu. Použití D-galaktózy spolu s D-glukózou je výhodné v HBM, jelikož kombinace dává největší růstový potenciál oproti jiným látkám samotným.
Jak je uvedeno shora, jsou HGF/SF, EGF a TGFa mitogeny vykonávající zlepšující proliferační účinek je-li jich použito společně nebo samotných v souladu s vynálezem. Následující seznam mitogenů, kterých lze použít k doplnění HBM podle vynálezu, není vyčerpávající. Je však třeba poznamenat, že tyto
- 16Í·· * · • · ι • · · · mitogeny nejsou nutné k přežití nebo k diferenciaci hepatocytů pěstovaných v HBM. Hepatocyty, pěstované v HBM, proliferují nižší rychlostí, než když se přidají mitogeny.
Inzulín, EGF, HGF a TGFa použité, v prostředích podle vynálezu, mohou být bud rekombinantně produkované, geneticky konstruované nebo izolované z přírodních zdrojů. Druhy mohou být například lidského, hovězího, myšího, vepřovího nebo krysího původu.
Některá výhodná zásobní základní prostředí - DMEM 11966, DMEM 10314, MEM 11095 a Williamsovo prostředí E 12251 obsahují následující složky na 1000 ml sterilní deionozované vody, jak dále uvedeno v tabulce I.
Tabulka I
Složení zásobních základních prostředí (mg/1)
Složka DMEM 11966 DMEM 10314 MEM 11095 Wi11iamsovo prostředí E 12251
Anorganické soli
CaCÍ2 (bezvodý) 200,00 200,00 200,00 200,00
CuS04.5H2O — — -- 0,0001
Fe(N03 )2 .9H2O 0, 10 0, 10 — 0,0001
KC1 400,00 400,00 400,00 400,OO
MnCl2 . 4H2O — — — 0,0001
MgS04 (bezvodý) 97,67 97,67 97,67 97,67
NaCI 6400,00 6400,00 6800,00 6800,00
NaHC03 3700,00 3700,00 2200,00 2200,00
NaH2 P04 . H2 0 125,00 125,00 140,00 —
NaH2 P04 — — — 140,00
ZnS04.7H2O — — -- 0,0002
Další složky:
D-glukóza — 4500,00 1000,00 2000,00
glutathion — — — 0,05
• ·
Φ· φ
• · ΐ7:• Φ • ···· • · ·· • · · · • φ #· ··· · φ • φ φ «φ φ*
methyl 1inoleát — -- -- 0,03
fenolová červeň 15,00 15,00 10,00 10,00
pyruvát sodný -- -- — 25,00
Aminokyse1iny:
L-alanin -- — — 90,00
L-arginin.HCl 84,00 84,00 126,00 —
L-arginin — -- — 50,00
L-asparagin.H2 0 -- -- — 20,00
L-asparagová kyselina — — — 30,00
L-cyste in — -- — 40,00
L-cyst in — 48,00 __ —
L-cyst in.2HC1 63,00 63,00 31,00 26,10
L-glutamin 584,00 584,00 292,00 --
L-glutamin kys. — -- — 50,00
glycin 30,00 30,00 — 50,00
L-histidin.HCl.H2O 42,00 42,00 42,00 —
L-hist idin — — — 15,00
L-isoleucin 105,00 105,00 5 2,00 50,00
L-1euc in 105,00 105,00 5 2,00 75,00
L-lysin.HCl 146,00 146,00 73,00 87,50
L-methyonin 30,00 30,00 15,00 15,00
L-f enylalanin 66,00 66,00 32,00 25,00
L-prolin — — -- 30,00
L-serin 42,00 42,00 — 10,00
L-threonin 95,00 95,00 48,00 40,00
L-tryptofan 16,00 16,00 10,00 10,00
L-tyros in.2Na.2H2 0 104,00 104,00 52,00 50,70
L-valin 94,00 94,00 46,00 50,00
Vitaminy:
kyselina askorbová — — — 2,00
biot in -- — — 0,50
D-Ca pantothenát 4,00 4,00 1 ,00 1,00
cholinchlorid 4,00 4,00 1,00 1,50
• ·
ergokarciferol -- -- — 0, 10
folová kyselina 4,00 4,00 1 ,00 1,00
i-inos i to 1 7,20 7,20 2,00 2,00
menadion
Na hydrogensulfát — — — 0,01
niacinamid 4,00 4,00 1,00 1 ,00
pyridoxin HCl -- 4,00 — --
pyridoxal HCl 4,00 — 1,00 1,00
riboflavin 0,40 0,40 0,10 0, 10
α-tokofero1f osf át disodium — — — 0,01
thiamin.HCl 4,00 4,00 1,00 1 ,00
vitamin A-acetát — — -- 0,10
vitamin Bi2 -- -- -- 0,20
Podle výhodného provedení vynálezu se do zásobního základ
ního prostředí podle tabulky I přidávaj í následující doplňují
cí složky uvedené v tabulce II do celkového objemu 1000 ml. U
vedená výhodná množství souhlasí s množstvími uvedenými dál
v příkladu, pro který bylo zásobní základní prostředí konstru
ováno ze 445 ml DMEM 10314 a 555 ml 11966 k zajištění končen
trace D-glukózy 2 ,0 g/1, takže se další D-glukóza nepřidávala
Je třeba si uvědomit, že při použití jiných zásobních základ
nich prostředí mohou se množství těchto přidávaných složek mě
nit.
Tabulka II
Přísady do SM pro HBM
Výhodné množství Rozsah koncentrace
jednotek/1 jednotek/1
D-galakóza 2 ,000 g 0,01 - 5,0 g*
D-glukóza 2 , 000 g* * 0,01 - 5,0 g*
nikot inamid 610 ,000 mg 1,00 - 3050 mg
L-pro1in 30 ,000 mg** 1,00 - 120 mg
L-arginin 84 , 000 mg* * 1,00 - 150 mg
L-ornithin 100,000 mg 1,00 - 500 mg
lidský holo-transferrin
(30% Fe-nasycený) 5,000 mg 0,10 - 100 mg
h-inzu1ί n 5,000 mg > 1011 M
dexamethason 1x10’7 M ΙΟ’12 -10_3M
ZnCl2 0,544 mg* * 1-3000 gg
MnS04 0,025 mg* * 1- 250 gg
ZnS04.7H2O 0, 750 mg* * 1-3000 gg
CuS04.5H2O 0,200 mg* * 1-1000 gg
selen 5,000 gg 1- 150 gg
L-glutamin * * *
(přídavně k SBM) 5,000 mM 2- 10 mM
HEPES 20,000 mM 5- 50 mM
* Použije-li se obou, jak D-glukózy, tak D-galaktózy, je ho
ní mez přibližně 8,0 g/1, při respektování případného množství obsaženého v příslušném použitém zásobním základním prostředí. Dolní mez při použití pouze D-glukózy nebo pouze D-galaktózy, je přibližně 0,01 g/1 nebo větší. Například v uvedeném příkladu je použito smíšeného prostředí DMEM obsahujícího 2,0 g/1 D-glukózy bez další přísady a 2,0 g/1 přidané D-galaktózy.
** Pokud už není v SM zásobním základním prostředí.
*** L-glutamin je požadovanou živnou půdou podle vynálezu, četná zásobní základní prostředí mají začleněný L-glutamin. Praktikům z oboru buněčných kultur je však dobře známo, že L-glutamin degraduje oxidací, takže veškerý L-glutamin je odbourán po několika měsících od výroby. Proto se do prostředí HBM podle vynálezu L-glutamin dodatečně přidává ke kompenzování popsaného úbytku.
V následující tabulce III je seznam látek, které lze případně přidávat do prostředí HBM k optimalizaci růstu buněk pro specifické účele a pro specifické druhy původu hepatocytů a specifické buněčné linie malignantních buněk. Rovněž tato množství se budou měnit podle toho, zda je příslušná složka už • · ·
- 20 i- : :
• · · · · obsažená v použitém zásobním základním prostředí.
Tabulka III
Případné přísady do HBM
Výhodné množství_Rozsah koncentrace jednotek/1 jednotek/1
albumin* 2,00 g 0-10,0 g
pěnici 11in* * 100,00 U 0-2500 U
streptomycin ** 100,00 Ug 0-2500 H-g
pyruvát sodný 0, 15 g 0-2,0 g
gama tokoferol 0,35 mg 0-3,5 mg
alfa tokoferol 0,15 mg 0-2,5 mg
vitamin D3 0,20 mg 0-1,8 mg
dextran* 2,00 g 0-5,0 g
glukonát železa*** 25,00 μg 0-100 Hg
kyselina liolová 1,00 g 0-5,0 g
apo-transferrin* * * 5,00 mg 0-20,0 mg
retinol 0,05 mg 0-2,0 mg
vitamin Bi2 0,15 mg 0-2,0 mg
kyselina askorbová 3,00 mg 0-10,0 mg
cholinchlorid 1,50 mg 0,2-12 »5 mg
biot in 0,75 mg 0,2-15 ,0 mg
* dextran může být náhradou za albumin ** může se použít i jiných antibiotik, jako například gentamycinu *** glukonát železa a apo-transferrin může být náhradou za železem nasycený holo-transferrin.
V případech, kdy se požaduje zrychlený růst, se mohou do HBM podle vynálezu přidat různé růstové faktory. I když se dává přednost HGF/SF, EGF a TGFa, je možno použít i jiných růstových faktorů. Výhodné množství takových růstových faktorů se mění podle příslušného použitého zdroje. Zde uvedená množství jsou proto nutně omezena na zde použité zdroje. V následujícím příkladu je použito jako přísady do HBM 20 ng/ml HGF/SF. EGF se s výhodou přidává v množství 20 ng/ml a TGFa byl s výhodou přidán v množství 20 ng/ml.
Následující příklady vynález objasňují, aniž ho jakkoli omezuj í.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a způsoby
Materiály
Při všech pokusech týkajících se izolace krysích hepatocytů je použito krysích samců Fischer 344 od Charles River (Pennsylvania). EGF a Matrigel (směs matričních složek odvozených z myších tumorů EHS) se získají od Collaborative Reseach (Waltham, MA). [3H] Thymidin je obchodní produkt společnosti ICN Radiochemicals (Irvine, CA). Kollagenasa k izolaci hepatocytů je obchodním produktem společnosti Boehringer Mannheim (Indianopolis, IN). Ke konstrukci kolagenových gelů je použito Vitrogenu (Celtrix Labs, Palo Alto, CA). Obecná reakční činidla, obchodní produkty společnosti Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO). HGF/SF k těmto studiím je varianta 5. Matrice
ECL je obchodní produkt společnosti Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY).
Izolace a kultivace hepatocytů
Krysí hepatocyty se izolují kalciovou dvoustupňovou technikou perfuse kollagenázy, kterou popsal Kost D.P. a kol. (J. Cell. Physiol. 147, str. 274, 1991). Všechny tyto techniky byly určeny k získání populace čistých hepatocytů. Na rozdíl od mnoha jiných systémů pěstování hepatocytů, nevyžaduje způsob podle vynálezu použití společné kultivace přiváděných buněk nebo kondiciovaného prostředí přiváděných buněk. Po izolaci hepatocytů se buňky suspendují v prostředích používaných k zachycení buněk na kultivačních destičkách. Těmito prostředími jsou MEM (GIBCO 12570) s NEAA (GIBCO 11140), inzulín 5 mg/1 a gentamycin 5 pg/ml. Hepatocyty se uloží v jedné vrstvě na kolagenový povlak, jak dále popsáno, a nechají se dvě hodiny přilnout. Používá se šestidůlkových destiček (9,8 cm2 na destičku) společnosti Corning. Při pokusech, při kterých nejsou hepatocyty vybízeny k proliferaci, nebo kde se provádí posuzování diferenciované funkce, se nanáší buňky v hustotě 80 000 hepatocytů na čtvereční centimetr povrchu. Při pokusech k vyvolání proliferace nebo genetické transdukce cizími DNA, se nanášejí hepatocyty v počáteční hustotě 1 000 nebo 10 000 hepatocytů na čtvereční centimetr povrchu. Nanášecí prostředí se nahrazuje prostředím HBM podle vynálezu dvě hodiny poté, kdy byly buňky přeplátovány a pak každých 48 hodin. Podle potřeby se přidává thymidin, růstové faktory a jiné přísady při výměně prostředí.
Lidské hepatocyty se izolují technikou perfuse kollagenázy (Strom S.C. a kol., Journal of National Cancer Institute 65 (5), str. 771 až 778, 1982). Buňky se pěstují stejně jako krysí hepatocyty, jak shora popsáno.
Gely kolagenu se připravují způsobem, který popsal Michalopoulos G.K a kol. (Exp. Cell. Res. 94, str. 70, 1975). Suché povlékání destiček kolagenem Matrigel se provádí podle doporučení výrobce. Matrigelové gely se získají přidáním 50 μΐ roztoku Matrigelu do 0,5 ml prostředí přímo na vrch přilnutých buněk.
Syntesa DNA se měří průnikem tritiovaného thymidinu do vysráženého materiálu trichloroctové kyseliny (TCA) (Kost D. P. a kol., 1991). Kolagenové gely jsou v případě potřeby živeny 2 mg kollagenázy na ml použitého prostředí MEM. Inkubace se pak provádí 30 minut při teplotě 37 ’C. Živené gely se zpracu23 I• · · jí NaOH následované TCA k vysrážení DNA, RNA a proteinů (Kost
D.P. a kol., 1991) .
Složení prostředí HBM
DMEM, HEPES, L-glutamin a antibiotika jsou obchodní produkty společnosti GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD). Směs ITS (inzulín, transferrin, selen) jsou obchodní produkty společnosti Boehringer, Mannheim. Všechna ostatní přísady jsou kvality pro kultivaci buněk (Sigma). Pokud není uvedeno jinak pro specifické pokusy, sestává zásobní základní prostředí z DMEM 11966 a DMEM 10314 smíšených k dosažení konečné koncentrace D-glukózy 2,0 g/1. V tomto případě bylo smíseno 445 ml DMEM 10314 s 555 ml DMEM 11966 k dosažení této koncentrace. Formulace tohoto zásobního základního prostředí je udána ve shora uvedené tabulce I. Výsledné smísené prostředí se pak doplní vyčištěným hovězím albuminem 2,0 g/1, D-galaktózou 2,0 g/1, L-ornitinem 0,1 g/1, L-prolinem 0,030 g/1, nikotinamidem 0,610 g/1,
ZnCl2 0,544 mg/1, ZnSO4.7H2O 0,750 mg/1, CuSO4.5H2O 0,20 mg/1, MnS04 0,025 mg/1, glutaminem 5,0 mM, ITS (rh-inzulín 5,0 mg/1, lidský transferrin 5,0 mg/1 [30% nasycené dvojmocné železo], selenem 5,0 pg/l), dexamethasonem 10-7M a pufrem HEPES 20,00 mM. Případně se přidá penicillin v množství 100 J/l a streptomycin 100 gg/l. Smíšené základní HBM se sterilizuje filtrací přes 0,22 pm nízko protein vázající filtrační systém (Corning), uskladní se při teplotě 4 °C a spotřebuje se do 4 týdnů. Pokaždé, když se prostředí mění, přidají se do čerstvého HBM podle potřeby růstové faktory ve stanovených koncentracích
Retrovirální transfekce a posouzení klonální expanse
Hepatocyty se napřed nanesou v množství 104/cm2 a nechají se růst v HBM doplněném HGF/SF (40 ng/ml) a EGF (20 ng/ml). Po hodinách se prostředí nahradí replikačně deficientním supernatantem amfotropického retroviru baleným z CR. ^.P (MFG • a
5xlO5 jednotek na ml) obsahujícím E-coli β-galaktosinázní gen pod LTR promotorem (Zitvogel L.H. a kol., Hum. Gene. Ther. 5, str. 1493, 1994). Přidá se 2 gg/ml Polybrenu. Supernatant se po 18 hodinách nahradí HBM, které bylo doplněno EGF v množství 20 ng/ml a HGF/SF v množství 40 ng/ml. Krátká exposice se supernatantem obsahujícím retrovirus neměla škodlivý vliv na přežití a proliferaci hepatocytů. Ve vyznačených časech se buňky fixují 0,5 % glutaraldehydem v PBS na 10 minut a vyvolávají se substrátem X-Gal 16 hodin při teplotě 37 °C. Převedené buňky expresující gen E-coli se vybarví pozitivně, jak patrno z obr. 4G a 4F. Příslušné kontroly pro každou složku jsou negativní na vybarvení X-Gal.
Transmisní elektronová mikroskopie
Vzorky pro transmisní elektronovou mikroskopii TEM) se fixují na kultivačních destičkách 1 až 1,5 hodiny v pufru 1,0 M kakodylátu sodného (hodnota pH 7,4), který obsahuje 2,5 % glutaraldehydu a 2 % formaldehydu. Destičky se pak opláchnou 2x pufrem 0,1 M kakodylátu sodného (hodnota pH 7,4) a 2x pufrem 0,1 M kakodylátu sodného obsahujícím 5 % sacharózy (hodnota pH 7,4). Udržují se v sacharózovém pufru 1 až 7 dní, opláchnou se 2x pufrem 0,1 M kakodylátu sodného (hodnota pH 7,4) a pak se dodatečně fixují po dobu jedné hodiny v 1% oxidu osmičelém v pufru O,1 M kakodylátu sodného. Destičky se znovu opláchnou v pufru, fixují se a zpracované kolagenovým gelem se žiletkou rozkrájejí na proužky. Proužky se přemístí do skleněných vzorkovacích fiol, dehydratují se odstupňovanými sériemi ethanolu (25 - 100%) a dvěma změnami propy1enoxidu a infiltrují se pryskyřicí Εροη-Araldit (BioTec, TK). Během dvou dnů se provede několik výměn pryskyřice, když kolagenové gely mají sklon zadržet propylenoxid. Kolagenové proužky se naplocho uloží a vytvrzují se přes noc při teplotě 60 °C.
Analysa genové exprese Northernovými skvrnami • · · · · · · • · · ······· • · · · · · ··· ······· · · «·
Extrace celkové RNA a mRNA z kultur
Celkové RNA se extrahují z neomytých buněčných kultur pomocí 2,0 ml RNAzolu B (BioTec) na důlek a vyčistí se podle výrobcových pokynů. Koncentrace a čistota RNA se zjistí obvyklou elektrofotometrií. Separace 20 gg RNA na sloupec se kompletují za denaturování 1% agarosových gelů a přemístí se na nylonové membrány (Amersham, Arlington Heights, IL) kapilární metodou. Po zesítění pod UV-světlem se membrány hybridizují přes noc se specifickými cDNA (jak naznačeno na obrázcích), které byly označeny [a~32p]dCTP použitím kitu Amersham random primer. Membrány se pak za velmi přísných podmínek promyjí a exponují se na film XAR (Eastman Kodak, Rochester, NY) 1 až 3 dny. Kvantifikace hybridizačních pásem RNA se provede laserovou denzitometrií .
Zdroje vzorků cDNA
Vzorky cDNA, použité ke studiu genové exprese, byly získány jako dar a na požádání jsou dostupné z následujících zdrojů: cytokeratin 8 poskytne Dr. Norman Marceau (Laval University), cytokeratin 14 Dr. Dennis Roop (Baylor College of Medicine), cytokeratin 18 Dr. Robert Oshima (LaJolla Cancer Research Foundation), cytokeratin 19 Dr. Amdre Royal (University of Montreal), TGFa (krysí) pochází od Dr. Davida Lee (University of North Carolina at Chápe 1 Hill), EGF-R (krysí) dodá Dr. Sheldon Earp (University of North Carolina at Chapel Hill), aFGF od American Type Culture Collection (ATCC) (katalogové číslo 78222), aFGF-R od ATCC (katalogové číslo 65796), uPA poskytne Dr. Jay Degen (University of Cincinnati), cytoSteve Strom (University of Pittsburg), cDNA α fetoproteinovou a transkripční faktorovou chromé 11B1 od Dr. pro albuminovou, analysu poskytl Dr. Joe Locker (University of Pittsburg).
Získané výsledky
- 26:-:
Vliv složek prostředí a substrátů matrice na proliferaci buněk.
Úplný popis prostředí HBM je uveden shora. K vyhodnocení relativního významu různých součástí prostředí byla provedena řada pokusů, jejichž výsledky jsou uvedeny v tabulce IV (A, B a C). Složky D-glukóza, albumin, dexamethason, transferrin a selen, nikotinamid a stopové prvky byly individuelně odvozeny ze složení plného prostředí HBM, jak patrno v tabulce IV A. Je vyznačena celková DNA na kulturu po 14 dnech růstu jak ukázáno. Jak je zřejmé, mělo odstranění dextramethasonu nejdramatičtější efekt, následovaný odstraněním nikotinamidu. V tavulce VIB je porovnán růst dosažený 14. dne mezi prostředím HBM obsahujícím transferrin dvojmocného železa (nasycené železo) oproti železem nenasycenému transferrinu. Přísada železa obsahujícího transferrin s dvojmocným železem (30% nasycení) se ukázala jako daleko účinnější v podporování růstu. Přísada elementárního železa (FeS04, 0,1 μΜ) do nenasyceného transferrinu nepřekovává rozdíl. Tabulka IV C poskytuje informace o relativním účinku D-glukózy, D-galaktózy a L-ornithinu v prostředí HBM. Všechny tyto tři složky jsou potenciálními zdroji energie buňkám, úplné zastavení růstu bylo patrno, když byly všechny tři složky odstraněny. Přísada D-glukózy samotné uchovala většinu odezvy, zatímco přísada D-galaktózy samotné byla méně účinná,. Ornithidin samotný má minimální účinek. Zjistilo se, že koncentrace 2 g na litr každého albuninu a Dglukózy je optimální, ačkoli efekty nebyly statisticky odlišné než 1 nebo 3 g na litr v každém případě. účinek úplného odstranění těchto složek je patrný z tabulky IV A.
Tabulka IV
A. Vliv odstranění specifických složek HBM na růst hepatocytů gg/důlek
DNA v čase nula 13,90+3,60
DNA 14. dne v HBM (s HGF/SF a EGF) doplněná následujícími složkami:
• · • · • ·
+ všechny součásti 84,90 ± 0,50
- glukóza 69,80 + 2,90
- albumin 68,70 + 0,50
- dexamethason 13,70 ± 0,20
- (transferrin a selen) 63,10 + 2,00
- nikotinamid 35,20 ± 1,70
- stopové prvky 65,00 ± 2,40
- všechny složky 20,20 ± 4,30
B. Vliv železa a transferrinu na růst hepatocytů
čas nula DNA 9,21 + 1 ,01
transferrin (dvoumocné železo)
(nasycený železem) 70,15 + 1,21
transferrin (dvoumocné železo) plus
přidané železo (5 pm) 1,83 ± 0,41
železem chudý transferrin 24,84 ± 4,30
železem chudý transferrin
plus přidané železo 1, 10 + 0,90
C. Vliv odstraněné glukózy, ornithinu nebo galdctózy
čas nula 11,00 + 0,40
kontrola (gluk. +, orn.+, gal+) 5 9,00 + 2,50
gluk.-, orn.-, gal. - 10,60 + 0,80
gluk.-, orn.+, gal. - 14,40 + 0,90
gluk.-, orn.-, gal. + 44,20 + 6,00
A gluk.+, orn.-, gal. - 59,00 + 4,00
gluk.+, orn.+, gal. - 62,70 + 1,40
* gluk.+, orn.-, gal. + 63,60 + 0,30
Uvedené složky HBM se odstraní a hepatocyty se nechají růst v modifikovaném prostředí 14 dní. Celková DNA na kulturu v mikrogramech byla měřena 14. dne k vyhodnocení růstu buněk, čas nula byl vzorek suspense hepatocytů, který byl očkován do destičky bezprostředně po izolaci buněk. Údaje jsou vyjádřeny jako průměry + směrodatná odchylka tří oddělených destiček.
• ·
I · · <
l * · · • « · · • · • « * ·
Difusní vstup hepatocytů do proliferace pod vlivem HGF/SF, EGF a TGFa.
Obr. 1A a IB ukazují úbytek thymidinu na pg DNA stejně jako BRdU index nukleárního značení v různých dnech v kultuře při růstu buněk v přítomnosti HGF/SF a EGF (40,20 ng/ml) jak shora popsáno. Jak je patrno, dochází k většině proliferace mezi 5. až 12. dnem. Kultury se slily 15. den a synthesa DNA se zpomalila. Vysoký index nukleárního značení během trvalé proliferace naznačuje, že proliferující buňky se odvozují přímo od zralých hepatocytů.
Růstové faktory HGF/SF, EGF, TGFa, KGF (keratinocytový růstový faktor), SCF (faktor kmenových buněk) a aFGF (kyselý fibrob1astový růstový faktor) se přidávaly do prostředí HBM jednotlivě. Z přidaných růstových faktorů způsobily HGF/SF, EGF a TGFa (znázorněné na obr. 2 jako TGFa) významnou proliferaci buněk, jak patrno z celkového množství DNA na kulturu 15. dne. Jestliže se přidaly KGF, aFGF a SCF samotné nebo v kombinaci, neměly žádný proliferační účinek, jak patrno z obr. 2. TGFa měl silněji proliferační účinek než kterýkoli jiný mitogen, byl-li přidán samotný do prostředí HBM. HGF/SF a EGF spolu měly nejsilnější proliferační účinek v daném časovém intervalu 15 dní než měly kterékoli jiné mitogeny samotné nebo v kombinacích. Přísada všech růstových faktorů dohromady neměla větší účinek než kombinovaná přísada HGF/SF a EGF, jak patrno z obr. 2. Podrobná kinetika buněk, vyvolaná HGF/SF a EGF samotným nebo v kombinaci, je patrná z obr. ÍC. DNA jako celek na kulturu je znázorněn v závislosti na čase v kultuře. Největší množství DNA shromážděné 15. dne je patrno s kombinací HGF/SF a EGF. DNA na kulturu 15. dne bylo 12-násobné než v čase 0, což reflektuje nárůst počtu buněk. HGF/SF a EGF byly přibližně stejně potentní. TGFa samotný byl více mitogenní než HGF/SF nebo EGF samotné.
• ·
Vliv matričních substrátů
Některé matriční substráty podporují růst buněk v tomto systému. Krysí hepatocyty se kultivují 15 dní v HBM doplněným HGF/SF (40 ng/ml) a EGF (20 ng/ml) a rostou na různých matricích, jak patrno na obr. 3. Buňky se kultivují, jak shora uvedeno. Suchý povlak s kolageny typu IV (myší), typu I (hovězí), fibronektin a laminin jsou stejně účinné v podporování růstu buněk, jak bylo vyzkoušeno měřením celkové DNA na kulturu 15. dne. Suchý povlak ECL (komerční derivát gelu EHS, UBI) vykázuje vynikající účinky. Povlak kolagenu typu I (vitrogen obchodní přípravek) se standardním způsobem používá pro pokusy, pokud není uvedeno jinak. O účinku matričních gelů při podporování specifických fenotypických konverzí v těchto kulturách je pojednáno dále.
Fenotypické změny hepatocytů během proliferace
Morfologie pro 1 iferujících buněk (kultivovaných ve shora popsaném HBM doplněném 40 ng/ml HGF/SF a 20 ng/ml EGF) se mění v různých časových úsecích po stimulaci proliferace buněk. Z normální morfologie hepatocytů, jak je zobrazena na obr. 4A, zaujímají pro 1 iferující buňky v prvních čtyřech dnech dlouhé výčnělky zaujímající fenotyp typicky popsaný jako roztrušující účinek HGF/SF na hepatocyty, jak patrno na obr. 4B a jak to popsal Michalopouloc G.K. a kol. (J. Cell. Physiol. 156, str. 443, 1993). Mezi 6. a 8. dnem pro 1 iferující buňky ztrácejí většinu svých cytoplasmických granulí, jádra se stávají méně výrazná, výčnělky se zmenšují a buňky začínají růst jako monovrstvové skvrny. Případně tyto skvrny splývají, když buňky dále rostou k vytvoření souvislé jedné vrstvy, jak patrno na obr. 4C. Zkoumáním elektronovou mikroskopií patrným na obr. 4D a 4E se ukazuje, že většina prvků typických pro dospělé hepatocyty zmizela. 15. dne nejsou žádné lamely endoplastického retikula kolem mitochondrií a nejsou žádné glykogenové
rozety nebo peroxisomy. Žlučové kanalikuly chybí. Došlo k prominentnímu nárůstu svazků keratinových mezilehlých vláken. Jádra jsou hranatá s velmi výraznými nukleoly. Po slinutí morfologie postupně tmavne na zralé diferencované hepatocyty, které vykazují například endoplasmické lamely retikula, mitochondrie, glykogen, peroxisomy, žlučové kanalikuly, podobně jako na obr. 6B a 6C.
Klonální růst proliferujících krysích hepatocytů je znázorněn na obr. 4F a 4G. Hepatocyty byly 3. dne transfektovány na kulturu s replikačně-deficientním retrovirem obsahujícím gen lac-Z pod vlivem virálního LTR a byly vybarveny k expresi β-galaktosidázy. Většinou se 4. dne v kultuře pozitivně vybarvily jednotlivé buňky (první den po transfekci), jak patrno z obr. 4F. Na druhé straně vybarvení 10. dne a pokračující do 28. dne ukázalo skvrny pozitivně zabarvených hepatocytů, konsistentní s klonálním růstem původních transfektovaných hepatocytů, jak patrno na obr. 4G. Procento lac-Z-pozitivních buněk (-20 %) se, jak se zdá, během kultivace nezměnilo.
Proliferující hepatocyty expresují změněné úrovně různých genů
Zkoumala se exprese několika specifických genů v proliferujících hepatocytech. Patřily mezi ně geny mRNA spojené s diferenciací hepatocytů (albumin, cytochrome IIB1, značený jako P45O na obr. 5A), geny kódující cytokeratinové markéry (cytokeratiny 14, 18 a 19) nebo odvozené od růstu hepatocytů (urokináza (uPA), HGF/SF a jeho receptor c-met (označený jako MET na obr. 5A), EGF (označený jako EGFR) a TGFa a jejich receptor, kyselý TGF a jeho receptor a TGFpl). Tyto geny se studují Northern skvrnovou analysou RNA z kultur kultivovaných v přítomnosti bud kombinace HGF/SF (40 ng/ml a EGF (20 ng/ml) (obr. 5A a 5B) nebo s TGFa samotného (20 ng/ml) (data neudána). Celková RNA byla izolována z kultur dne O, 6, 10, 15 a 21. V žádné ze zkoumaných časových lhůt nebyla patrna exprese HGF/SF ·· • · · • · · nebo TGFpl mRNA.
Jak patrno, byly v čase O obsaženy albumin a cytochrom IIB1 mRNA a postupně klesaly. Albumin mRNA vzrostl 21. dne, kdy byl také zjištěn mRNA pro a feto protein (AFP). mRNA pro cytokeratin 14, 18 a 19 v kultuře vzrůstala. mRNA trvale vzrůstala pro aFGF a TGFa. mRNA receptorů pro HGF/SF (MET, obr. 5A) a aFGF (obr. 5B aFGFR) zůstávala přítomná po celou dobu kultivace. Receptor EGF (EGFR) mRNA klesá od dne nula avšak zůstává expresovaný. Exprese GAPDH mRNA bylo použito jako reference úklidového genu. Dramatické zvýšení bylo pozorováno v expresi urokinázy stejně jako cytokeratinů 14 a 19. V kulturách byly pozorovány některé rozdíly od uvedeného modelu, takže místo HGF/SF a EGF se uchovaly v přítomnosti TGFa (20,0 ng/ml). V těchto kulturách byla lépe uchována během proliferace exprese albuminu a exprese HGF/SF, zatímco AFP se objevil dříve. (Data neudána). Přes pozorované rozdíly v obrazcích genové exprese, nebyly patrny morfologické rozdíly mezi buňkami rostoucími v přítomnosti TGFa nebo HGF/SF plus EGF, jakmile bylo dosaženo slinutí.
Proliferující hepatocyty převedené na zralé hepatocyty vlivem Matrigelu nebo přítomnosti neparenchymálních buněk nebo dobou v kultuře
Když byly kultury 8. dne překryty Matrigelem, došlo k rychlému (během 2 dnů) vzhledu žlučových kanalikul a organizování buněk do korku podobných struktur. Vzhled těchto buněk je patrý na obr. 6A. Jak patrno na snímku z elektronového mikroskopu na obr. 6B a 6C, mají tyto buňky typické znaky dospělých hepatocytů, včetně zvrásnění endoplasmického retikula kolem mitochondrií, žlučových kanalikul a přítomnosti glykogenu. Preparece mRNA se provádí z kultur vystavených Matrigelu po dobu 10 dní (dny 8 až 18 v kultuře). Exprese albuminu byla porovnána v den O v kultuře (okamžitě po kolagenásové perfusi),
8. den v kultuře (před překrytím Matrigelem) a v kulturách 3. a 7. dne po překrytí Matrigelem, jak patrno na obr. 6D. Přidání Matrigelu způsobuje deramatický nárůst exprese albuminu mRNA ve srovnání s kontrolními pro 1 iferujícími kulturami, v nichž ke minimálně zjistitelný, účinek fenobarbitolu (PB) na úroveň cytochromu P45O IIB1 mRNA v kulturách zpracovaných Matrigelem byl také měřen, jak patrno na obr. 6E. Matrigel je do kultur přidán 8. dne. PB je přidán o 2 dny později (10. den kultury). Buňky se shromáždily 5 dní po přísadě BP (v 15. den kultury). Přísada PB vyvolala v kulturách, zpracovaných Matrigelem, pouze cytochrom IIB1 mRNA. Indukce této mRNA fenobarbitolem je typická pro hepatocyty a nevyskytuje se v žádných jiných buňkách (Michalopoulos G. a kol., Science (Wash.DC) 193, str. 907, 1976). Hepatocytové kultury typicky ztrácejí schopnost odezvy na BP. Toto zjištění podporuje poznatek, že přísada Matrigelu do kultury proliferujících hepatocytů vyvolává fenotyp zralých hematocytů, jak je doloženo strukturou z elektronového mikroskopu znázorněnou na obr. 6B a 6C. Exprese cytokeratinu 19 (CK19) (obr. 6F) markér žlučovodu, expresovaný proliferujíčími hepatocyty před zavedením diferenciačních podmínek, také ukončuje expresi po přidání Matrigelu, jak patrno na obr. 5B.
Syntesa DNA se měří v kulturách vystavených Matrigelu a vykazuje podstatný pokles. K posouzení, zda diferenciace na morfologii zralých hepatocytů vyžaduje syntesu DNA, je do prostředí HBM přidáno 20 mM hydroxymočoviny. Ukázalo se (Michalopoulos, G.K. a kol., Cancer Res. 38, str. 1866, 1978) zrušení plánované semikonzervativní syntesy DNA v hepatocytech inhibici ribonukleotidové reduktázy. Hydroxymočovina se přidá do kultur před překrytím Matrigelem a ponechá se po dobu následujících 5 dní. Syntesa DNA poklesla na 3,93 % kontroly (bez hydroxymočoviny) v pro 1 iferujících kulturách udržovaných v nepřítomnosti Matrigelu a na 6,27 % kontroly (bez hydroxymočoviny) v kulturách udržovaných v přítomnosti Matrigelu. Ačkoli se syntesa DNA snížila na 6,27 % kontroly (+ Matrigel, bez ·· ·· • · · ·
hydroxymočoviny), konverse proliferujících hepatocytů na morfologii dospělých hepatocytů zůstává zcela neovlivněna a zahrnuje celou populaci.
HGF/SF (nikoli však TGFa nebo EGF) vyvolává v proliferujících hepatocytech diferenciaci na duktulární/acinární struktury v kolagenových gelech typu I.
Hepatocyty, udržované mezi dvěma vrstvami kolagenového gelu, si uchovávají svou morfologii a diferenciaci po dlouhou dobu (Michalopoulos G.K. a kol., J. Cell. Physiol. 156, str. 443, 1993).
Hepatocyty udržované v sendvičích kolagenového gelu v kulturách s běžným prostředím obsahujícím HGF/SF podléhají intenzivní proliferaci, vytvářejí prominentní výčnělky a případně jsou organizovány do struktur připomínajících hepacytové destičky. Zkoumá se chování hepatocytů, udržovaných mezi dvěma vrstvami kolagenového gelu, jak shora popsáno, avšak v přítomnosti HBM, doplněného HGF/SF nebo EGF, jak shora popsáno. Zjistilo se, že v prostředí doplněném EGF, prodělávají hepatocyty typické shora popsané přeměny. Na druhé straně v hepatocytech v HBM, doplněném HGF/SF samotným, se po expansi buněk identických svým vzhledem se shora popsanými proliferujíčími hepatocyty objevují 10. až 15. dne četné struktury tvarově podobné vodičům. To převládá a zaujímá většinu buněk, obsažených v kulturách. Od přibližně 10. dne až do 15. dne je většina buněk v kultuře uspořádána do takových vodičových struktur. Vzhled těchto struktur je znázorněn na obr. 7A. Histologické řezy jsou na obr. 7B (pořízeném světelnou mikroskopií) a obr. 7C a 7D (pořízených elektronovou mikroskopií). Struktury měly vodičovou nebo acinární konfiguraci. Některé buňky, obklopující tyto struktury, jsou velmi ztenčené a ve světelném nebo v elektronovém mikroskopu se jeví identicky jako epitel žlučovodů. Jiné jsou však větší a podobají se spíše vodičovým hepatocytům popsaným v dřívějších studiích na modelech in vivo.
• · • ·
Proliferace buněk (data neudána) pod EGF nebo HGF/SF v sendvičích kolagenového gelu je značně menší (< 25 % při největším píku) než proliferace patrná v kulturách na plastu pokrytém suchým kolagenem. Většina proliferace ustává 10. dne a vodičům podobné struktury se vyskytují, když proliferace buněk ustane (10. až 15. dne). Vodičové a acinární struktury byly také pozorovány v těchto kulturách, když HGF/SF a EGF byly kombinovány, byly však menší než při HGF/SF samotném. Pokud jde o překrytí Matrigelem, přídavné hydroxymočoviny k inhibici syntesy DNA (inhibice pod 5,1 % kontroly), neovlivňovaly vytváření vodičových struktur (data neudána). Obr.7E ukazuje, že tyto buňky expresují cytokeratin 19, který je charakteristický pro vodičové buňky (Sirica A.E., Prog. Liver Dis. 10, str. 63, 1992; a Sirica A.E Histol. Histopathol. 10, str. 433, 1995). Uchovalo se také malé množství exprese albuminu, konsistentní s přítomností hepatocytům podobných buněk uvnitř vodičových struktur, jak patrno na obr. 7D. Pozoruje se, že vodičové buňky uchovávají expresi CK19 v nepro1 iferujícím stavu (obr. 7F) na rozdíl od buněk diferencujících směrem k liniím dospělých hepatocytů, které přestávají expresovat tento žlučovodový význak.
Neutuchající růst a expanse polulace lidských hepatocytů v HBM v přítomnosti HGF/SF a EGF
Ačkoli nebyly kultury lidských hepatocytů charakterizovány tak rozsáhle jako kultury krysích hepatocytů, ukázalo se v dostupné literatuře, že tyto buňky prodělávají také omezené kolo syntesy DNA po stimulaci růstovými faktory a rychle v kultuře degenerují (Ismail T. a kol., Hepatology 14, str. 1076, 1991). Byla studována odezva lidských hepatocytů na HGF/ SF (40 ng/ml) a EGF (20 ng/ml) v prostředí HBM. Byly zjištěny podobné výsledky jako u krysích hepatocytů v primárních strukturách lidských hepatocytů, jak patrno na obr. 8. Lidské hepatocyty začínají rychle proliferovat 3. až 4. dne v kultuře a slití dosáhnou 19. dne.
• · • — ·
Jak bylo uvedeno shora, trvá současná potřeba prostředí, které dovolí pěstovat hepatocyty in vitro k expandování jako buněčná populace. HBM podle vynálezu tuto expansi dovoluje a umožňuje proto velmi potřebnou studii proliferujících hepatocytů. Vynález je také užitečný v četných jiných, dále popsaných aplikacích.
Například všechny běžné způsoby v terapii zaměřené na játra, které dosahují stabilní dlouhodobou expresi transferovaných genů, vyžadují aktivní oddělení buněk v průběhu počáteční transfekce. Normálně mají játra pouze jeden ve 20 000 hepatocytů v růstu S-fáze v kterýkoli jednotlivý den. Ke zvýšení proliferace buněk musí být odstraněna velká část (2/3) pacientových jater. Pak se injektuje intravaskulárně nosičový zdroj na játra zaměřeného genu. Alternativou k tomuto drastickousku jater (10 %), kultivace do kultury a pak difuse buněk kému zásahu je odebrání malého hepatocytů, jejich přenesení zpět do jater. Tento druhý způsob, i když je bezpečnější, méně nákladný a lépe řízený než způsob dřívější, je trvale brzděn nedostatkem kutivačního prostředí, jako je HBM, které dovoluje prodlouženou proliferaci, klonální expansi v podstatě všech kultivovaných buněk a jejich dlouhodobou životnost.
Konstrukce běžných mimotělních jaterních zařízení, založených na biologicky umělých jaterních tkáních, která zahrnují buněčné elementy, spočívá na transformovaných (tumorových) hepatocytech nebo zvířecích hepatocytech. Zvířecí buňky nepřežívají v používaných bioreaktorech po více než několik dní a neproliferujί, což vyvolává nutnost generovat bioreaktory častěji a v těsné blízkosti a k udržení všech potřebných prvků, materiálů a zvířecích donorů v očekávání potřeby. Kromě toho mohou mít zvířecí buňky některé nežádoucí aspekty, které je činí klinicky obtížnými nebo nebezpečnými v použití. Také nádorové buňky, používané v těchto zařízeních, přinášejí riziko pronikání buněk do pacienta a mohou proto potenciálně dávat vznik tumorů v pacientovi. Prostředí HBM podle vynálezu umožn-
mí produkci bioreaktorů obsahujících zvířecí a/nebo lidské hepatocyty a/nebo jiné buňky a poskytuje jedinečné zařízení ke zvyšování počtu buněk při uchování dlouhodobé životnosti a úplné diferenciace. Takové reaktory se také hodí k výrobě drog, drogového metabolismu, pro toxikologické studie a komplexní biologické studie.
Jiným potenciálním použitím prostředí HBM podle vynálezu je v autotransp1antaci hepatocytů. Transplantovat hepatocyty je poměrně nový přístup v léčení pacientů v posledním stadiu onemocnění jater. Způsob spočívá v použití donorových orgánů, kterých se nepoužívá k transplantaci orgánů. Autotransplantace má tu výhodu, že nevyžaduje imunitu potlačující drogy, není však proveditelná, jestliže není možno zvětšovat počet buněk a udržovat je při životě po dobu dostatečně dlouhou k tomu, aby se vrátily zpět do dárce. Explanty konečného stadia jater by mohly také poskytovat zdroj donorových hepatocytů za vybraných podmínek, včetně enkapsulace nebo genetické manipulace. Nezávisle na původu hepatocytů, expanse počtu buněk v dlouhodobých kulturách a replantace (například do sleziny, do nosných systémů, do peritonia ledvinových pánviček) neusnadňují účinně hepatické syntetické a detoxifikační procesy po prodlouženou dobu. Omezujícím bodem je nedostatek hepatocytů. HBM má možnost eliminovat tento nedostatek buněk a tím dramaticky rozšířit počet pacientů, kteří mohou být léčeni na selhání jater. Podobně může autotransplantace nebo heterotransplantace ostatními buňkami, vypěstovanými v prostředí podle vynálezu, rozšířit počet pacientů a řadu ošetření umožněných biobuněčnou terapií.
HBM podle vynálezu se může také hodit pro zkušební postupy drog a chemické testy. Téměř všechny drogy, chemikálie a jiné vyráběné produkty se musejí zkoušet na mutagenicitu a toxicitu v hepatocytových kulturách, jako součást předpisů FDA, USDA, NIOSH a EPA. Tyto testy se běžně provádějí na krysích hepatocytech v krátkodobé kultuře, vzhledem k dlouhodobé
- 37·-·
životnosti nebo významné proliferaci. Použití HBM (1) prodlouží testovací dobu (vlivem delší životnosti), (2) dovolí delší expozici při nižších koncentracích, (3) dovolí pozorovat mutagenicitu a toxicitu na proliferujících hepatocytech a (4) učiní dostupnými zdroje lidských hepatocytů, kterých by bylo možno použít při jiných toxikologických výzkumech.
Ačkoli byl vynález podrobně popsán k objasnění, je zřejmé, že takové detaily jsou pouze k objasnění a že mohou být pracovníky v oboru prováděny varianty, aniž se odchýlí od podstaty vynálezu,
Průmyslové využití
Chemicky definované prostředí pro kultivaci savčích buněk podporující uchování a dlouhodobý klonální růst savčích hepatocytů a jiných buněk.

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chemicky definované HBM kultivační prostředí pro udržování, diferenciaci a dlouhodobý růst savčích hepatocytů, vyznačující se tím, že obsahuje
    a) syntetické zásobní základní prostředí určené pro kultivaci savčích buněk a
    b) růst hepatocytové buňky podporující složky, vybrané ze souboru zahrnujícího nikotinamid, aminokyseliny, transferrin, hormony, dexamethason, stopové kovy a jednoduché uhlohydráty volené ze souboru zahrnujícího D-glukózu a D-galaktózu a jejich jakékoliv kombinace.
  2. 2. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje pufr.
  3. 3. Kultivační prostředí HBM podle nároku 2, vyznačující se t í m, že pufrem je HEPES.
  4. 4. Kultivační prostředí HBM podle nároku 2, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje antibiotika.
  5. 5. Kultivační prostředí HBM podle nároku 4, vyznačující se tím, že antibiotika jsou volena ze souboru zahrnujícího penicillin a streptomycin a jakoukoli jejich kombinaci .
  6. 6. Kultivační prostředí HBM podle nároku 4, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje albumin
  7. 7. Kultivační prostředí HBM podle nároku 6, vyznačující se tím, že albumin je volen ze souboru zahrnujícího albumin hovězího séra, lidský albumin, krysí albumin, vepřový albumin a koňský albumin.
  8. 8. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že syntetické zásobní základní prostře39 'r.
    dí je voleno ze souboru zahrnujícího DMEM, MEM, Williamsovo prostředí Ε, BME, DMEM/F-12, Media 199, F-12 (Ham), živnou směs, F-1O (Ham) živnou směs a PRMI media 1640.
  9. 9. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že amino kyseliny jsou voleny ze souboru zahrnujícího L-glutamin, L-ornithin, L-prolin a L-arginin a jakékoli jejich kombinace.
  10. 10. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako stopové prvky obsahuje zinek, mangan, měd a selen.
  11. 11. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako stopové prvky přídavně obsahuje chlorid zinečnatý, heptahydrát síranu zinečnatého, síran manganatý, pentahydrát síranu mědnatého a síran NaSeS04.
  12. 12. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že transferrin je volen ze souboru zahrnujícího holo-transferrin z 30 % nasycený železem a apotransferrin v kombinaci s glukonátem železa.
  13. 13. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako hormony obsahují inzulín a dexamethason .
  14. 14. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se tím, že syntetickým základním prostředím je DMEM.
  15. 15. Kultivační prostředí HBM podle nároku 14, vyznačující se tím, že DMEM obsahuje přibližně 0,1 až 5,0 g/1, s výhodou 2,0 g/1 D-glukózy.
  16. 16. Kultivační prostředí HBM podle nároku 1, vyznačující se t í m, že přídavně obsahuje množství růstových faktorů usnadňujících růst hepatocytových buněk.
    » 99 99 99
    99 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 99 • · 9 9999 9
    9 9 9 9 9
    9999999 99 99
  17. 17. Kultivační prostředí HBM podle nároku 16, vyznačující se tím, že růstové faktory jsou voleny ze souboru zahrnujícího HGF/SF, EGF a TGFa.
  18. 18. Kultivační prostředí HBM podle nároku 6, vyznačující se t í m, že přídavně obsahuje množství růstových faktorů usnadňujících růst hepatocytových buněk.
  19. 19. Kultivační prostředí HBM podle nároku 18, vyznačující se tím, že růstové faktory jsou voleny ze souboru zahrnujícího HGF/SF, EGF a TGFa.
  20. 20. Kultivační prostředí savčích buněk obsahující prostředek HGM definovaný v tabulkách I a II, kde zásobní základní prostředí z tabulky I obsahuje směs DMEM takovou, že konečná koncentrace D-glukózy je s výhodou přibližně 2,0 g/1 a množství D-galaktózy je s výhodou přibližně 2,0 g/1.
  21. 21. Kultivační prostředí HBM podle nároku 20, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje složky uvedené v tabulce III.
  22. 22. Kultivační prostředí HBM podle nároku 20, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje množství růstových faktorů usnadňujících růst hepatocytových buněk.
  23. 23. Kultivační prostředí HBM podle nároku 22, vyznačující se tím, že růstové faktory jsou voleny ze souboru zahrnujícího HGF/SF, EGF a TGFa.
  24. 24. Kultivační prostředí HBM podle nároku 21, vyznačující se tím, že přídavně obsahuje množství růstových faktorů usnadňujících růst hepatocytových buněk.
  25. 25. Kultivační prostředí HBM podle nároku 24, vyznačující se tím, že růstové faktory jsou voleny ze souboru zahrnujícího HGF/SF, EGF a TGFa.
CZ982971A 1996-03-18 1997-03-12 Prostředí pro kultivaci savčích buněk CZ297198A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/617,325 US6043092A (en) 1996-03-18 1996-03-18 Cell culture media for mammalian cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ297198A3 true CZ297198A3 (cs) 1999-03-17

Family

ID=24473190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ982971A CZ297198A3 (cs) 1996-03-18 1997-03-12 Prostředí pro kultivaci savčích buněk

Country Status (18)

Country Link
US (5) US6043092A (cs)
EP (1) EP0929662B1 (cs)
KR (1) KR20000064667A (cs)
CN (1) CN1217745A (cs)
AT (1) ATE343629T1 (cs)
AU (1) AU733373B2 (cs)
BG (1) BG102837A (cs)
BR (1) BR9708105A (cs)
CA (1) CA2249289A1 (cs)
CZ (1) CZ297198A3 (cs)
DE (1) DE69736861D1 (cs)
EA (1) EA199800835A1 (cs)
IL (1) IL126273A0 (cs)
NO (1) NO984314L (cs)
NZ (1) NZ331935A (cs)
PL (1) PL328922A1 (cs)
TR (1) TR199801859T2 (cs)
WO (1) WO1997034999A1 (cs)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2260097A (en) 1996-03-12 1997-10-01 Life Technologies, Inc. Hematopoietic cell culture nutrient supplement
EP2243827B2 (en) 1996-08-30 2017-11-22 Life Technologies Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
EP0953633A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-03 Livercell L.L.C. Cell culturing method and medium for producing proliferated, normal, differentiated human liver cells
BR9914465A (pt) 1998-09-29 2001-10-09 Gamida Cell Ltd Métodos para controlar a proliferação e a diferenciação de células-tronco e células progenitoras e uma composição farmacêutica para induzir a diferenciação em uma população de células
JP3553858B2 (ja) * 1999-08-25 2004-08-11 東洋紡績株式会社 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール
EP1210410B1 (en) * 1999-08-27 2008-01-16 Invitrogen Corporation Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
US6767741B1 (en) 1999-08-27 2004-07-27 Invitrogen Corporation Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
IL136232A0 (en) * 2000-05-18 2001-05-20 Bar Ilan University Res Author Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population
JP4998969B2 (ja) * 2000-06-01 2012-08-15 北海道公立大学法人 札幌医科大学 凍結保存可能な小型肝細胞の調製方法、およびその凍結保存方法
US6762053B2 (en) * 2000-06-09 2004-07-13 Vitrolife, Inc. Mammalian gamete and embryo culture media and culture media supplements
WO2002040995A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for estimating metabolic function of xenobiotic and induction thereof
US6506576B2 (en) 2001-03-14 2003-01-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Serum-and steroid-free culture media for cerebellar granule neurons
ATE410688T1 (de) * 2001-05-16 2008-10-15 Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad Verfahren zum nachweis und zur trennung undifferenzierter leberzellen mit dlk
EP1321515A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Ingenium Pharmaceuticals AG Method of culturing cells
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
WO2003062404A1 (en) 2002-01-25 2003-07-31 Gamida-Cell Ltd. Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
WO2003078567A2 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Gamida-Cell Ltd. Methods of inducing differentiation in ex vivo expanded stem cells
TWI288779B (en) * 2002-03-28 2007-10-21 Blasticon Biotech Forschung Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use
CN1649998A (zh) * 2002-03-29 2005-08-03 新加坡眼部研究所 为研究、临床眼晴表面移植和组织工程的应用而生长人类结膜组织等同物的方法
US20050130300A1 (en) * 2002-04-04 2005-06-16 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Method of culturing liver cells over long time
CN1662643A (zh) * 2002-05-28 2005-08-31 贝克顿·迪金森公司 人腺泡细胞的扩增和转分化
US20050054097A1 (en) * 2002-11-17 2005-03-10 Tony Peled EX-VIVO expansion of hematopoietic system cell populations in mononuclear cell cultures
KR101088223B1 (ko) * 2002-12-23 2011-11-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 단백질 생산을 위한 포유류 세포 배양 방법에서의 생산물품질 향상
IL154677A0 (en) 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
CA2517959A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 Gamida-Cell Ltd. Expansion of renewable stem cell populations using modulators of pi 3-kinase
US20040229355A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-18 Board Of Regents University Of Texas System Culture medium for long-term culture of hepatocytes
JP2007500196A (ja) * 2003-05-24 2007-01-11 バイヤースドルフ・アクチエンゲゼルシヤフト 化粧品の成分として使用される組織培養培地
US9200245B2 (en) 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
US7888110B2 (en) 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
US8597597B2 (en) 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
WO2005005608A2 (en) * 2003-06-30 2005-01-20 Lifescan, Inc. Compositions and methods for differentiating adipose stromal cells into pancratic beta cells
US7982751B2 (en) * 2003-07-11 2011-07-19 The University Of North Carolina Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop
US20050064524A1 (en) * 2003-08-11 2005-03-24 Mordechai Deutsch Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same
EP1698690B1 (en) * 2003-12-26 2010-04-28 Makoto Asashima Basal medium for es cell culturing
BRPI0506610A (pt) * 2004-02-03 2007-05-02 Chemagis Ltd montelucaste sódico amorfo, processo de preparação de montelucaste sódico amorfo, composição farmacêutica, método de tratamento utilizando a administração de montelucaste sódico amorfo, co-precipitado amorfo de montelucaste sódico e processo de preparação de co-precipitado amorfo de montelucaste sódico
EP1609462B1 (en) * 2004-04-22 2015-07-29 La Prairie Group AG Cosmetic or dermatological preparation comprising a nutrient medium phase
KR20060000547A (ko) * 2004-06-29 2006-01-06 라이프코드인터내셔날 주식회사 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지
US7403647B2 (en) * 2004-09-13 2008-07-22 Seng Enterprises Ltd. Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
ES2352344T3 (es) 2005-01-25 2011-02-17 Seng Enterprises Limited Dispositivo de microfluido para estudio de células.
US7409239B2 (en) * 2005-05-05 2008-08-05 The Hong Kong Polytechnic University Method for predicting the blood glucose level of a person
DE102005031532A1 (de) * 2005-07-01 2007-01-04 Cytonet Gmbh & Co. Kg Lagermedium für Zellen
US20070004036A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for keratinocyte culture
US20070003541A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for therapeutics
US20070128685A1 (en) * 2005-07-01 2007-06-07 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for cell culture
US7989205B2 (en) * 2005-10-06 2011-08-02 American Cryostem Corporation Cell culture media, kits and methods of use
US8288120B2 (en) 2005-11-03 2012-10-16 Seng Enterprises Ltd. Method for studying floating, living cells
US8846393B2 (en) * 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
US20070231901A1 (en) * 2005-12-02 2007-10-04 Shuichi Takayama Microfluidic cell culture media
EP1978802A2 (en) * 2006-01-24 2008-10-15 Northfield Laboratories, Inc. Polymerized hemoglobin media and its use in isolation and transplantation of islet cells
US20090004159A1 (en) * 2006-01-24 2009-01-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells
US20060223999A1 (en) * 2006-05-10 2006-10-05 Chemagis Ltd. Process for preparing montelukast and precursors thereof
WO2009081409A2 (en) 2007-12-26 2009-07-02 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
WO2009070722A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-04 University Of Massachusetts Lowell CELL CULTURE HYDROGEL WITH pH INDICATOR
EP2412800A1 (en) 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
EP3061808B1 (en) 2009-02-03 2020-08-12 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells
HUE027239T2 (en) * 2009-06-26 2016-10-28 Novo Nordisk As Preparation containing insulin, nicotinamide and arginine
WO2011022045A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Singh Ashok K Apparatus and process for generating and harvesting adult stem cells and fluid associated with it from skin and omentum for medical, cosmetic, and veterinary use
CN102344904B (zh) * 2010-08-02 2014-04-30 深圳华大基因科技有限公司 一种猪细胞培养基
US9506029B2 (en) 2010-12-30 2016-11-29 University Of Massachusetts Lowell Responsive cell culture hydrogel
CN102399742B (zh) * 2011-09-30 2014-07-30 东莞中山大学研究院 用于哺乳动物唾液腺上皮细胞和唾液腺干细胞培养的无血清培养液
JP6348848B2 (ja) 2012-02-13 2018-06-27 ガミダ セル リミテッド 間葉系幹細胞の増殖
US9493744B2 (en) 2012-06-20 2016-11-15 Genentech, Inc. Methods for viral inactivation and other adventitious agents
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
WO2014082685A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Swiss Stem Cell Foundation Serum-free medium for human mesenchymal stem cells
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
EP2977056B1 (en) * 2014-07-11 2018-09-12 Grifols Worldwide Operations Limited Transferrin for use in the treatment of hypoxia inducible factor (hif)-related neurodegenerative disorders
CN106318998B (zh) * 2015-07-08 2019-08-20 浙江海正博锐生物制药有限公司 用于提高重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物
TW202440903A (zh) 2015-08-04 2024-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法（一）
WO2017146646A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Agency For Science, Technology And Research Cell culture medium
CN112312771A (zh) * 2018-06-18 2021-02-02 橡树生物公司 使用化能自养的微生物生产富细胞培养基的方法
CN112410283A (zh) * 2019-08-03 2021-02-26 深圳市脉唐生物科技有限公司 禽蛋培养基
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
CN115369087B (zh) * 2021-05-17 2024-02-09 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肝癌原代细胞的培养基及培养方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4439521A (en) * 1981-10-21 1984-03-27 Ontario Cancer Institute Method for producing self-reproducing mammalian pancreatic islet-like structures
FR2543158B1 (fr) * 1983-03-24 1985-11-15 Inst Nat Sante Rech Med Milieu de culture de cellules animales sans serum, sans hormones et sans facteurs de croissance et procedes de culture primaire et d'obtention de lignees cellulaires utilisant ce milieu
US4902295A (en) * 1985-08-26 1990-02-20 Hana Biologics, Inc. Transplantable artificial tissue
NO162160C (no) * 1987-01-09 1989-11-15 Medi Cult As Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav.
DE3711699A1 (de) * 1987-04-07 1988-11-10 Fraunhofer Ges Forschung Medium zur kultivierung und proliferation von epithelialen zelltypen
US5529920A (en) * 1988-12-14 1996-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human liver epithelial cell line and culture media therefor
JPH03504330A (ja) * 1988-12-14 1991-09-26 アメリカ合衆国 ヒト肝上皮細胞系のための細胞培地
US5380660A (en) * 1989-02-02 1995-01-10 New England Medical Center Hospitals, Inc. Method of treating serum or serum-containing medium to inactivate an inhibitor of hepatocyte differentiation
EP0449445A3 (en) * 1990-03-27 1993-08-25 Pfizer Inc. Preparation of beta-ketoesters useful in preparing quinolone antibiotics
JPH0728732B2 (ja) * 1990-04-17 1995-04-05 日本石油株式会社 動物細胞増殖促進剤及び無血清培地
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DE69232535T4 (de) * 1991-06-24 2003-09-11 Hcell Technology, Inc. In langzeitkultur gehaltene hormon-absondernde pankreatische zellen
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
EP0597964A4 (en) * 1991-08-07 1994-11-30 Einstein Coll Med PROLIFERATION OF HEPATOCYTE PRECURSORS.
CA2146747C (en) * 1992-10-09 2006-12-19 Brian A. Naughton Liver reserve cells
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5587309A (en) * 1994-04-29 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of stimulating proliferation and differentiation of human fetal pancreatic cells ex vivo
US5695998A (en) * 1995-02-10 1997-12-09 Purdue Research Foundation Submucosa as a growth substrate for islet cells

Also Published As

Publication number Publication date
CN1217745A (zh) 1999-05-26
US20040166579A1 (en) 2004-08-26
NO984314D0 (no) 1998-09-17
NO984314L (no) 1998-11-17
US6670180B2 (en) 2003-12-30
PL328922A1 (en) 1999-03-01
CA2249289A1 (en) 1997-09-25
DE69736861D1 (de) 2006-12-07
NZ331935A (en) 2000-05-26
AU733373B2 (en) 2001-05-10
IL126273A0 (en) 1999-05-09
KR20000064667A (ko) 2000-11-06
BG102837A (bg) 1999-05-31
EP0929662B1 (en) 2006-10-25
AU2528797A (en) 1997-10-10
EP0929662A4 (en) 2002-12-04
ATE343629T1 (de) 2006-11-15
EA199800835A1 (ru) 1999-02-25
TR199801859T2 (xx) 1999-02-22
US6413772B1 (en) 2002-07-02
EP0929662A1 (en) 1999-07-21
WO1997034999A1 (en) 1997-09-25
BR9708105A (pt) 2000-01-04
US6043092A (en) 2000-03-28
US20060141447A1 (en) 2006-06-29
US20020155603A1 (en) 2002-10-24
US7022520B2 (en) 2006-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ297198A3 (cs) Prostředí pro kultivaci savčích buněk
Brower et al. Growth of cell lines and clinical specimens of human non-small cell lung cancer in a serum-free defined medium
CA2261292C (en) Chondrocyte media formulations and culture procedures
US6692961B1 (en) Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
Brandi et al. Bovine parathyroid cells: cultures maintained for more than 140 population doublings.
JP2000507812A (ja) 造血細胞培養栄養補充成分
JP2002529071A (ja) 軟骨細胞様細胞のための無血清培地
JP2007505625A (ja) 細胞培養培地
BR112012009848B1 (pt) Método de obtenção de células-tronco/progenitoras multipotentes de mamíferos capazes de se diferenciar em linhagens hepáticas e pancreáticas
Hatzinger et al. Rat kidney proximal tubule cells in defined medium: The roles of cholera toxin, extracellular calcium and serum in cell growth and expression of γ-glutamyltransferase
Parkinson et al. The epidermis
Tsao et al. Regulation of growth of cultured hepatic epithelial cells by transferrin
Oda et al. Dog pancreatic duct epithelial cells: long-term culture and characterization
US20050019310A1 (en) Method for culturing and expansion of mammalian undifferentiated epidermal kerainocytes exhibiting stem cell characteristics
US6737270B1 (en) Long-term three dimensional tissue culture system
EP0939797A4 (en) DEFINED SYSTEMS OF CULTURE OF EPITHELIAL CELLS AND USE OF SAID SYSTEMS
US6008047A (en) Cell culturing method and medium
JP2000512128A (ja) 哺乳類細胞用の細胞培養培地
JP2003530103A5 (cs)
Hoshi et al. Direct analysis of growth factor requirements for isolated human fetal hepatocytes
Van de Wijngaert et al. Role of mineralizing cartilage in osteoclast and osteoblast recruitment
MXPA98007554A (en) Cellular cultivation media for mamif cells
EP1059352A1 (en) Long term cell culture of human carcinoma
WO2024229106A1 (en) Media composition for induced pluripotent stem cell derived endothelial cell growth, monolayer formation, and cell-cell contact formation
Collodi et al. Serum-free media

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic