CZ219298A3 - Sloučeniny obsahující blokátory vstupu kalcia pro inhibici růstu buněk - Google Patents

Abstract

Obecnýmznakempředloženého řešeníje vyvolání smrti stinxdovaných buněk blokátoremvstupu Ca2+. Řešení zahrnuje ve svých různých aspektech podávání sloučenin, které vyvolávají buněčnou smrt, včetně podávání této sloučeniny savci, například člověku, z léčebných důvodů; sloučeniny, například sloučenina, kterámá blokátor vstupu Ca2+ a agens, které normálně stimuluje buňky, v nichž semá buněčná smrt vyvolat; sady sloučenin, například sadu, kterámá blokátor vstupu Ca2+ a agens, které normálně stinxduje buňky, ve kterých se mávyvolat buněčná smrt; použití takových sloučenin nebo sad sloučeninjako protizánětlivých látek a/nebo antiproliferačních látek; apoužití blokátoru vstupu Ca2+ nebo použití blokátoru vstupuCa2+ a agens pro přípravu léku pro použití na vyvolání buněčné smrti. Řešení zahrnuje způsob určení citlivosti nemocných zvířat k léčbě blokátoremvstupu Ca2+nebo korribinaci blokátoru vstupu Ca2+ a agens, které normálně stimuluje buňky, aby léčbamohlavyvolat buněčnou smrt. Řešení zahrnuje způsob screeningu potencionálních látekjako blokátorů vstupu Ca2+.

Description

Sloučeniny obsahující blokátory vstupu kalcia pro inhibici růstu buněk

Oblast techniky

Tento vynález se zabývá použitím blokátoru vstupu Ca²⁺ pro vyvolání usmrcení stimulované buňky a také způsobu léčby proliferativních onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Cílem léčby nádorových onemocnění je ve většině případů eliminace nebo kontrola růstu nádorových buněk za současného šetření normálních tkání. Proto se věnuje velká pozornost identifikaci znaků rozlišujících nádorové buňky od normálních buněk. Tyto odlišné rysy jsou cílem pro specifické léčebné zásahy.

Normální buněčný růst a vývoj je ve většině případů kontrolován vzájemnou interakcí rozpustných sekrečních ligand a specifických receptorů na povrchu stimulované buňky (Cell, 61:203-12(1990]) . Řada růstových faktorů nebo jejich receptorů má důležitou úlohu při kontrole buněčného růstu. Vzhledem k úzké vazbě mezi normálním a abnormálním buněčným růstem není překvapením, že tyto růstové faktory nebo jejich receptory jsou známými protoonkogeny, včetně neu, EGF^R (verb-b), c-fms (CSF-1^R) a c-kit. Protože růstové faktory nebo jejich receptory se často podílejí na vzniku nebo zachování nádorové buňky, mohou se tyto molekuly považovat za oprávněný cíl specifické terapie zaměřené na rušení nebo neutralizaci jejich stimulační aktivity.

Receptor c-kit je příkladem, kde byla dána nesprávná exprese nebo mutace do souvislosti s počtem nádorů. Kromě běžného výskytu u myeloidní leukemie (Siitonen etal., 1994) je receptor c-kit nalézán ve vysokém měřítku u malobuněčného typu rakoviny plic (Hida et al., 1994), nádorů ženského genitálního systému (Inoue et al. , 1994) a u rakoviny prsu • · · · ·

(Hines et al. , 1995). Ve většině těchto případů exprimují nádorové buňky jak c-kit, tak i SLF, což vede k autokrinní stimulaci posilující jejich nádorový charakter. Známá dominantní aktivační mutace c-kit byla identifikována také u mastocytomů lidského, myšího a krysího původu (Tsujimura et al., 1994; Tsujimura et al., 1995; Kanakura et al., 1994; Kitayama et al., 1995).

Příčinou mnoha forem rakoviny se zdají být dominantně transformační onkogeny a ztráta nádorové supresorové funkce. Například několik studií dokumentuje mutaci, nesprávnou expresi, nadměrnou expresi a autokrinní stimulaci receptorů růstového faktoru u buněk primární rakoviny prsu (Lupu et al. , 1992; Ethier, 1995; LeJeune et al., 1993) . Proto se mnoho badatelů zabývá novými metodami, které jsou specificky zaměřené na tyto molekuly (Kopreski et al. , 1996; Fry et al., 1995; Levitzki et al., 1995). Je také jasné, že ztráta funkce nádorových supresorů může přispívat ke vzniku nádorových buněk cestou buněčných generací, které již nepodléhají fyziologickým mechanismům buněčné smrti. Ztráta funkce nádorových supresorů je bohatě zdokumentovaná u rakoviny prsu (Horák et al. , 1991; Thor et al. , 1992; Wang et al. , 1993; Bargou et al. , 1995; Krajewski et al. , 1995; Lee, 1995). Důležitým důsledkem ztráty funkce nádorových supresorů může být rezistence na konvenční formy protinádorové terapie (Lu et al., 1996; Korsmeyer, 1995).

V protinádorové léčbě se běžně používají četná antiproliferativní agens. Z největší části jsou určené pro specifické působení na rychle se dělící buňky. Protože je však buněčné dělení normální jev u mnoha typů buněk v organismu, pozoruje se často toxicita vůči normální tkánicož limituje užitečnost a účinnost těchto agens.

Podobná situace existuje také u mnoha zánětlivých stavů, pro které je charakteristická abnormální nebo nadměrná buněčná aktivace a proliferace. Například u autoimunitních • · ft • · · ·

- 3 onemocnění buňky imunitního systému rozpoznávají vlastní antigeny přítomné u postiženého jedince jako cizorodé a reagují na ně. Běžné léčebné postupy u těchto onemocnění nespecificky ovlivňují imunitní soustavu jako celek, což může vést ke zvýšené vnímavosti k infekcím a dalším nežádoucím následkům.

Alergická onemocnění reprezentují jinou situaci, kdy nesprávné aktivační signály vedou k významnému onemocnění.

Proto je v těchto a v dalších situacích zapotřebí terapie zaměřené specificky na buňky reagující na dílčí růstový nebo aktivační signál.

Mobilizace Ca²⁺ z intracelulárních zásob následovaná vstupem extracelulárního Ca²⁺ cestou kanálů označených jako Store-Operated Channels, nazývané též I_crao kanály, (Hoth et al., 1992; Hoth et al., 1993; Penner et al., 1993) je běžnou signální událostí vyvolanou mnoha růstovými faktory, antigeny, Fc a receptory vázanými G-proteinem. Tento signál je následkem aktivace různých izoforem fosfolipázy C (PLC) vedoucík vytváření druhých poslů IP3 a diacylglycerolu (Rhee, 1991). Tento rychlý vzestup intracelulárního Ca²⁺ následovaný pozvolným sestupem byl zapojen do řady buněčných jevů včetně mitogenese, aktivace a buněčného pohybu (Lewis et al., 1995).

Ačkoliv byla prokázána souvislost vstupu Ca²⁺ s kontrolou apoptózy nebo programované buněčné smrti u mnoha typů buněk, přesný mechanismus účinku Ca²⁺ u apoptózy není znám (Orrenius et al. , 1992; Nicotera et al. , 1994; Dowd, 1995) . Bylo dokázáno, že nadměrné hladiny intracelulárního Ca²⁺ dosažené například iontoforézou způsobují apoptózu u řady experimentálních systémů (Kizaki et al., 1989; Tadakuma et al. , 1990). Zdá se, že apoptóza buněk sleziny zahrnuje působení Ca²⁺-dependentní endonukleázy (Ribeiro et al. ,

1993) a intracelulární zvýšení Ca²⁺ bylo spojováno s apoptózou jak aktivovaných hybridomů T buněk (Mercep et al.,

1989), tak i nezralých thymocytů (McConkey et al. , 1989). Nedávno Takata et al. (Takata et al., 1995) prokázal, že apoptóza B buněk zprostředkovaná povrchovými IgM je snížená za nepřítomnosti PLC-γ, což spojuje tuto formu apoptózy s mobilizací Ca²⁺. V kontrastu k těmto pozorováním se některé buňky zdají být chráněné před apoptózou vstupem Ca²⁺. Například IL-3 dependentní mastocyty a buněčné linie jsou před apoptózou způsobenou odebráním růstového faktoru cvhráněné přidáním Ca²⁺ (rodriguez-Tarduchy et al.,1992) a programovaná neuronální smrt je také potlačená zvýšením intracelulárního Ca²⁺ (lampeet et al., 1995).

Byly identifikovány určité proteiny, které zprostředkovávají jak pozitivní, tak i negativní efekty na apoptózu. Bcl-2 patří do skupiny příbuzných proteinů, jejichž prototypem je C. elegans ced-9 (Reed, 1994). Zatímco jedna třída členů skupiny (včetně Bcl-2) chrání buňky před signály apoptózy, jiná třída (včetně bax, proapoptotického členu této skupiny) apoptózu podporuje. Předpokládá se, že rovnováha mezi těmito dvěma skupinami určuje, zda dojde k buněčné apoptóze nebo zda buňka přežije (Oltvai et al. , 1993) .

Nadměrná exprese Bcl-2 proteinu vede k ochraně před apoptózou indukovanou širokou škálou činitelů včetně radiace, chemoterapeutik, oxidačních látek a steroidů (Korsmezer, 1995). Jiné signály apoptózy se však zdají být necitlivé k Bcl-2. Ty zahrnují buněčnou smrt indukovanou TNF, aktivaci Fas, aktivací indukovanou buněčnou smrt, anti IgM léčbu pomocí WEHI-231 buněk a klonální deleci zprostředkovanou superantigenem (Ashwell et al., 1987; Smith et al. , 1989; Jones et al. , 1990; Sentman et al. , 1991; Brown et al., 1992; Cuende et al., 1993; Memon et al., 1995; Miura et al., 1995). V některých případech bylo ukázáno, že tyto signály apoptózy mohou být neutralizovány inhibitory proteáz ze skupin interleukin-ΐβ konvertujícího enzymu (ICE), což ukazuje na účast těchto proteáz v apoptóze (Enari et al., 1995; Chinnaiyan et al., 1996).

Ketotifen, známý blokátor vstupu Ca²⁺ do buňky, inhibuje ve vysokých koncentracích aktivaci mastocytů a proliferaci mononukleárních buněk (Gushchin et al., 1985). Ukázalo se také, že ketotifen může být použit při kontrole symptomů spojených s mastocyty u neurofibromů (Riccardi et al., 1987; Riccardi et al., 1993). Ketotifen se ukázal také jako účinný při supresi symptomů systémové mastocytozy (Povoa et al., 1991) . Ketotifen také inhibuje odezvy T buněk na antigen, ale ne na PHA nebo tetanový toxoid (Kondo et al., 1994). Bylo referováno o tom, že ketotifen může inhibovat proliferaci lymfocytů stimulovaných mitogenem (Petrasch et al. , 1993). Vysoké koncentrace ketotifenu také inhibují zvýšení intracelulárního Ca²⁺ v lymfocytech a v prekursorech buněčné linie lidských monocytů U937 vyvolané T lymfocytovým mitogenem a adenosin trifosfátem. Avšak v pokusech in vivo nezměnila 7 denní léčba zdravých dobrovolníků dávkou 1 mg ketotifenu počet ani diferenciální rozpočet cirkulujících lymfocytů. Econazol, další z blokátorů vstupu Ca²⁺ do buňky, prokazatelně snižuje životaschopnost a počet buněk u NSl/Ag4 myelomových buněk při hladině 1 μg/ml (Denyer et al., 1985).

Sloučenina CAI, která má inhibiční vlastnosti vstupu Ca²⁺ do buňky, má schopnost potlačit růst nádorových buněk a růst HUVEC buněk vyvolaný FGF Kohn et al. , 1992; Kohn et al., 1994a; Kohn et al., 1994b).

Inhibice nádorového růstu a metastáz pomocí sloučenin obsahujících blokátory kalciového kanálu je popsaná v patentu US č. 4,690,935 (Taylor et al., 1987). Podávání blokátorů kalciového kanálu a sloučenin s platinou za účelem inhibice nádorového růstu a metastáz je popsáno v patentu US č. 4,906,646 (Honn et al., 1990).

Bylo dokázáno, Clotrimazol uvolňuje Ca²⁺ z nitrobuněčných zásob 3T3 buněk v množství, které in vivo • ·

inhibuje proliferaci. Působení clotrimazolu na Ca²⁺ zásoby je reversibilní. Clotrimazol má také inhibiční účinek na počet experimentálních plicních metastáz vyvolaných u SCID myší buňkami lidského melanomu (Benzaquen et al., 1995).

Podstata vynálezu Obecným znakem tohoto stimulovaných buněk pomocí vynález zahrnuje ve svých je vyvolání vynálezu blokátoru několika sloučenin způsobujících buněčnou smrt včetněpodávání sloučeniny savci, například člověku pro terapeutické účely, sloučeniny, například sloučeniny obsahující blokátor vstupu Ca²⁺ a agens, které normálně stimuluje buňky, ve kterých má být vyvolána buněčná smrt, sady sloučenin, například sada obsahující blokátor vstupu Ca²⁺ a agens, které normálně stimuluje buňky, ve kterých má být vyvolána buněčná smrt, vstupu Ca

2+ smrti

Tento aspektech podávání sloučenin nebo sad sloučenin jako látek a/nebo antiproliferačních látek, užití blokátoru vstupu Ca²⁺ nebo blokátoru vstupu Ca²⁺ a příslušného agens k přípravě léku pro použití k vyvolání buněčné smrti. Vynález zahrnuje způsob určení citlivosti nemocných zvířat k léčbě blokátorem vstupu Ca²⁺ nebo kombinací blokátoru vstupu Ca²⁺ a agens, které normálně stimuluje buňky tak, aby léčba mohla vyvolat buněčnou smrt. Vynález zahrnuje způsob screeningu potencionálních sloučenin jako blokátoru vstupu Ca²⁺.

V kontextu tohoto vynálezu je agens nebo faktor nebo liganda nebo jiný agonista, který normálně stimuluje buňku nebo buněčný receptor, tím, kdo stimuluje buňku nebo buněčný receptor. Taková stimulace obecně podporuje růst, přežití a/nebo aktivaci buňky. Jinými slovy, podle tohoto vynálezu je buněčná smrt vyvolána ve stimulované buňce. Podle zvláštního příkladu, jehož jednotlivosti jsou popsané níže, mastocyty, které jsou normálně stimulovány přítomností SLF, užití takových protizánět1ivých • · · 4 4 · jsou v přítomnosti kombinace SLF a blokátoru vstupu Ca²⁺ předurčeny k smrti. Takováto normální stimulace je obecně doprovázená vstupem Ca²⁺ do buňky.

Výhodné blokátory vstupu Ca²⁺ jsou blokátory kanálů nezávislých na napětí.

Výhodným předmětem léčby jsou lidé.

Výhodný způsob podle tohoto vynálezu je způsob vyvolání smrti buněk u savců, kteří toto potřebují, při kterém jsou tyto buňky schopné stimulace pomocí faktoru s doprovodným influx Ca²⁺, který zahrnuje podávání účinného množství takového faktoru a účinného množství blokátoru vstupu Ca²⁺ savcům.

Podle jiného výhodného provedení je u savce, který má buňky, které jsou stimulovány agens cestou vazby ligandy na receptor dané buňky s následným influxem Ca²⁺, vynález způsob vyvolání smrti buněk, zahrnující podání účinného množství blokátoru vstupu Ca²⁺ a účinného množství takové ligandy.

Podle dalšího výhodného provedení je vynález způsob vyvolání smrti buněk u savce v případě potřeby, u kterého mají buňky receptory citlivé ke specifickým agens, po jejichž navázání dijde k influxu kalcia Ca²⁺ do buňky a k aktivaci fosfolipázy C, a zahrnuje podání účinného množství blokátoru vstupu Ca²⁺ a účinného množství takového agens.

Podle ještě dalšího provedení je vynález způsob vyvolání buněčné smrti u savců, kteří to potřebují, pokud jsou buňky schopné stimulace pomocí faktoru s doprovázejícím influx Ca²⁺, který zahrnuje podávání savcům účinného množství beznapěťově otvíraného blokátoru vstupu Ca²⁺ a účinného množství takového faktoru.

Faktorem nebo agens atd. může být například protilátka působící agonisticky na buněčný receptor nebo přirozená liganda buněčného receptorů.

Buňkami mohou být mastocyty, monocyty, makrofágy,

fibroblasty, T lymfocyty, B lymfocyty, basofily nebo nádorové buňky.

Savec může být v případě potřeby antiproliferativní léčby lidský organismus trpící rakovinou, zejména rakovinou prsu, nebo pacient s alergií nebo autoimunitní poruchou.

Buňka (nebo skupina buněk) u které má být smrt vyvolána, může mít například povrchový receptor vybraný ze skupiny ckit receptor nebo mutovaný c-kit receptor, receptor T buňky, * CD3, FcyRII, FcyRIII, FceRI, receptor vázaný G proteinem, receptor pro bombesin, receptor pro peptid uvolňující gastrin, receptor pro bradykinin, receptor pro carbachol, receptor pro muskarinovou molekulu, receptor pro CCK-8, receptor pro vasopresin, receptor pro neurokinin, receptor pro substanci P, receptor pro purinergní molekulu, receptor pro TGF-α, receptor pro EGF, receptor pro heregulin, receptor pro erbBl, receptor pro erbB2, receptor pro erbB3, receptor pro erbB4, receptor pro PDGF, receptor pro SLF, receptor pro ligandu FLT-3, receptor pro zásaditý FGF, receptor pro kyselý FGF, receptor pro enothelin, receptor pro NGF, receptor pro VEGF a receptor pro HGF.

Faktor nebo agens podávané uvedeným buňkám se může zvolit ze skupiny SLF, TGF-α, EGF, heregulin, agonisté erbBl, agonisté erbB2, agonisté erbB3, agonisté erbB4, PDGF A, PDGF B, FLT-3 liganda, zásaditý FGF, kyselý FGF, , enothelin, NGF, VEGF, HGF, agonisté TCR, agonisté receptoru

CD3, agonisté FcyRII receptoru, agonisté FcyRIII receptoru, agonisté FceRI receptoru, agonisté G proteinem vázaných receptorů, bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptoru, CCK-8, vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptoru, ATP, adenosin, 1,25-dihydroxyvitamin D3 a jejich kombinací.

Buňkou může být hyperaktivní imunocyt a způsob může využívat protilátku, přičemž faktorem může být například ·· ·· • · · · • · · · «·· *·♦

- 9 ·· • · · ·· ·· ·· antigen této protilátky. Buňkou může být hyperaktivní imunocyt, na kterém je navázán IgE, a faktorem může být například agonista IgE.

Buňka může obsahovat IgE receptor a faktor může být protilátka vázající se na tento receptor.

Buňkami mohou být kasofily nebo mastocyty.

Blokátor vstupu Ca²⁺, a faktor, liganda atd. se mohou podávat odděleně.

Podle jednoho výhodného provedení se blokátor vstupu Ca²⁺ podává před agens.

Podle dalšího výhodného provedení se agens/faktor atd. a blokátor vstupu Ca²⁺ podávají v jediném kroku.

Stimulace buněk takovým agens za nepřítomnosti blokátoru vstupu Ca²⁺ podporuje s výhodou normálně růst, přežití a/nebo aktivaci buněk.

V určitém provedení, pokud buňky exprimují c-kit receptor, zahrnuje způsob podání účinného množství c-kit ligandy savci.

Pacientem může být jedinec s leukémií, s rakovinou plic nebo nádorovým růstem.

Faktorem podle tohoto vynálezu může být růstový faktor, který se váže na receptor buňky a tato vazba normálně způsobuje proliferaci buňky.

Pacientem může být pacient s rakovinou nebo hyperplazií.

Faktorem může být protein.

Faktorem může být survival faktor, který se váže na receptor uvedené buňky, a tato vazba prodlužuje za nepřítomnosti blokátoru vstupu Ca²⁺ dlouhověkost buňky.

Podle určitého provedení jsou buňky předchůdci hemopoetických buněk.

Faktorem může být aktivační faktor, který se váže k receptoru uvedené buňky, a tato vazba způsobuje normálně za nepřítomnosti blokátoru vstupu Ca²⁺ aktivaci buňky.

Blokátorm vstupu Ca²⁺ může být kterýkoli jeden nebo • «· ·· • · · « · · « · · · • · · · · • · » · ······· ·· • ·· »· • · · · · · • · · · · • · ··· ··# • · · «·· ·· ·« několik z Ni²⁺, ketotifen, aconazol, tenidap, CAI, Cd²⁺, Co²⁺, La³⁺, Mn²¹, SKF-96365 a cromolyn nebo jejich kombinace.

Podle jednoho provedení je vynález způsob indukce smrti konstitučně aktivovaných buněk savce, který to potřebuje, který zahrnuje podání účinného množství blokátoru vstupu Ca²⁺ tomuto savci. Aktivace s výhodou vede v uvedených buňkách ke zvýšení koncentrace Ca²⁺ nad hladiny obvyklé u uvedených buněk v neaktivovaném stavu. Konstituční aktivace může být výsledkem přítomnosti mutovaného c-kit receptoru.Pacient může mít mastocytózu.

Podle jiného provedení je vynález způsob indukce buněčné smrti u savce, který to potřebuje, při kterém jsou buňky podrobené autokrinní stimulaci, který zahrnuje podání účinného množství blokátoru vstupu Ca²⁺ savci. Blokátorem vstupu Ca²⁺ může být Ni²⁺.

Podle dalšího provedení je vynález farmaceutická sloučenina pro podání savci jako antiproliferativní agens k zabránění buněčného růstu, která zahrnuje blokátor vstupu Ca²⁺ a faktor, který se normálně váže na receptor uvedené buňky, aby způsobil vstup Ca²⁺ do buňky.

Sloučenina může být látka, u níž navázání takového faktoru na receptor vede normálně k aktivaci fosfolipázy C. Sloučenina může obsahovat blokátor vstupu Ca²⁺, který je beznapěťově otvíraný blokátor vstupu Ca²⁺. Faktorem může být ' protilátka působící agonisticky na receptor nebo přirozená liganda receptoru. Faktor by mohl být vybraný ze skupiny ’ SLF, TGF-a, EGF, heregulin, agonisté k erbBl, agonisté k erbB2, agonisté k erbB3, agonisté k erbB4, PDGF A, PDGF B, FLT-3 ligand, zásaditý FGF, kyselý FGF, enothelin, NGF, VEGF, HGF, agonisté TCR, agonisté CD3 receptoru, agonisté FcyRII receptoru, agonisté FcyRIII receptoru, agonisté FceRI receptoru, agonisté G-proteinem vázaných receptorů, bomběsin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptoru, CCK-8, • ·

- 11 ί*.

vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptorů., ATP, adenosin, 1,25-dihydroxyvitamin D₃ a jejich kombinace. Podle jednoho zvláštního sloučenina jako faktor SLF.

Sloučenina by mohla obsahovat protilátky imunocytu.

Sloučenina může zahrnovat faktor, provedení zahrnuje antigen povrchové který je agonistou

IgE.

Sloučenina může obsahovat faktor, kde navázání uvedeného faktoru na receptor podporuje normálně za nepřítomnosti blokátoru vstupu Ca²⁺ růst, přežití a/nebo aktivaci uvedené buňky. Podle dalšího aspektu je vynález sada farmaceutických sloučenin pro použití k zabránění buněčného růstu u savce, přičemž tato sada zahrnuje blokátor vstupu Ca²⁺ a faktor, který se normálně váže na receptor uvedené buňky a způsobuje vstup Ca²⁺ do buňky. Tímto faktorem může být látka, jejíž navázání na receptor má normálně za následek aktivaci fosfolipázy C.

Blokátorem vstupu Ca²⁺ může být beznapěťově otvíraný blokátor vstupu Ca²⁺.

Faktorem ve sloučenině může být protilátka agonisticky působící na receptor nebo přirozená liganda receptorů. Faktor může být vybraný ze skupiny SLF, TGF-α, EGF, heregulin, agonisté erbBl, agonisté erbB2, agonisté erbB3, agonisté erbB4, PDGF A, PDGF B, FLT-3 liganda, zásaditý FGF, kyselý FGF, enothelin, NGF, VEGF, HGF, agonisté TCR, agonisté CD3 receptorů, agonisté FcyRII receptorů, agonisté FcyRIII receptorů, agonisté FcsRI receptorů, agonisté G proteinem vázaných receptorů, bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptorů, CCK-8, vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptorů, ATP, adenosin a 1,25-dihydroxyvitamin D₃ a jejich kombinace. Faktor může být zejména SLF.

• · · • · · · povrchové protilátky navázání na receptor

- 12 Faktorem může být antigen imunocytu.

Faktor může být agonista IgE.

Faktor může být látka, jejíž podporuje normálně při absenci blokátoru vstupu Ca²⁺ růst, přežití a/nebo aktivaci uvedené buňky.

Podle jiného provedení zarnuje vynález použití farmaceutické sloučeniny podle vynálezu jako antiproliferativního nebo protizánětlivého agens.

Sada farmaceutických sloučenin podle předloženého vynálezu může být podle toho použita jako antiproliferativní nebo protizánětlivé agens.

Vynález zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru, který se normálně váže k receptoru buňky a způsobuje vstup Ca²⁺ do buňky, pro přípravu léku pro použití jako agens pro zabránění růstu uvedených buněk.

Vynález zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle vynálezu pro přípravu léku pro použití jako agens pro zabránění růstu uvedených buněk, u kterého vazba uvedeného faktoru na receptor má normálně za následek aktivaci fosfolipázy C.

Vynález zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle předloženého vynálezu k přípravě léku pro použití jako agens pro zabránění růstu uvedených buněk, u kterého je uvedený blokátor vstupu Ca²⁺ beznapěťově otvíraný blokátor vstupu Ca²⁺.

Podle jednoho zvláštního provedení zahrnuje vynález použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle vynálezu pro přípravu léku pro použití jako agens k zabránění růstu uvedených buněk, kde je uvedený faktor agonisticky působící protilátka k receptoru.

Jedno zvláštní provedení zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle vynálezu k přípravě léku pro použití jako agens pro zabránění růstu uvedených buněk, u • · • · · · • ♦ ·

- 13 kterého je uvedený faktor přirozená liganda receptoru.

Zvláštní provedení zahrnují použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle předloženého vynálezu k přípravě léku pro použití jako agens pro zabránění růstu uvedených buněk, u kterých je uvedený faktor vybraný ze skupiny SLF, TGF-a, EGF, heregulin, agonisté erbBl, agonisté erbB2, agonisté erbB3, agonisté erbB4, PDGF A, PDGF B, FLT-3 liganda, zásaditý FGF, kyselý FGF, enothelin, NGF, VEGF, HGF, agonisté TCR, agonisté CD3 receptoru, agonisté FcyRII receptoru, agonisté FcyRIII receptoru, agonisté FceRI receptoru, agonisté G-proteinem vázaných receptorů, bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptoru, CCK-8, vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptoru, ATP, adenosin, 1,25-dihydroxyvitamin D₃ a jejich kombinací. Faktor může být zejména SLF.

Jedno výhodné provedení zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle vynálezu k přípravě léku pro použití jako agens pro omezení růstu uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor antigen povrchové protilátky imunocytu.

Jedno výhodné provedení zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle vynálezu k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor agonista IgE.

Další provedení zahrnuje použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle vynálezu k přípravě léku pro použití jako antiproliferativní agens, u kterého navázání uvedeného faktoru na receptor podporuje normálně při absenci uvedeného blokátoru vstupu Ca²⁺ růst, přežití a/nebo aktivaci uvedené buňky.

Podle dalšího provedení je vynálezem způsob určování citlivosti nemocných savčích buněk na léčení blokátorem vstupu Ca²⁺ nebo blokátorem a faktorem, který dále aktivuje • · • · · ·

receptory buněk, který zahrnuje:

- stanovení, zda vzorek tkáně obsahuje hladinu PLC aktivity, která je vyšší ve srovnání s normální tkání, přičemž

- zvýšená hladina aktivované PLC ukazuje, že buňky jsou pravděpodobně citlivé na uvedenou léčbu.

Takovýto způsob může také zahrnovat získání vzorku nemocné tkáně.

Dále může tento způsob zahrnovat krok analýzy, který zahrnuje stanovení množství PLC substrátu, který reaguje za přítomnosti PLC získaného z předem stanoveného množství uvedené tkáně. Tento způsob může také zahrnovat izolaci PLC z předem určeného množství uvedené tkáně pomocí enzymelinked immunosorbent assay. PLC substrát může být [³H]-PIP₂.

Podle dalšího provedení je vynález způsob provádění výběru agens sloužících jako blokátor vstupu Ca²⁺, přičemž způsob zahrnuje kroky:

- kultivace první skupiny buněk za přítomnosti agens, při které mají buňky aktivovaný receptor, který podporuje vstup Ca²⁺ do buněk;

- kultivace druhé skupiny buněk za přítomnosti agens, při které buňky druhé skupiny postrádají aktivovaný receptor, který by podporoval vstup Ca²⁺ do buněk této druhé skupiny;

- zjištění, zda růst první skupiny buněk je menší než první předem stanovená hladina odpovídající růstu buněk první skupiny za nepřítomnosti agens a

- zjišťování, zdali růst druhé skupiny buněk je v podstatě týž jako druhá předem stanovená hladina odpovídající růstu buněk druhé skupiny za nepřítomnosti agens, kde růst růst první skupiny buněk menší než první předem stanovená hladina a růst druhé skupiny buněk v podstatě týž jako druhá stanovená hladina naznačuje, že agens je blokátor • ·

• · · ♦ · · ·· · · · · ·· φ · · · · • · · · · ♦ · • · · · * ······· ·· ···

- 15 vstupu Ca²⁺.

Reseptor první skupiny buněk může být aktivovaný konstitučně nebo je receptor první skupiny buněk podrobený autokrinní stimulaci, nebo je receptor první skupiny buněk aktivovaný exogenním agens.

Toto agens může být přirozená liganda receptoru první skupiny buněk. Receptor první skupiny buněk a receptor druhé skupiny buněk může být tentýž receptor.

U určitých provedení je receptor vybraný ze skupiny ckit receptor, receptor pro EGF a receptor pro FGF.

S výhodou jsou buňky první skupiny i buňky druhé skupiny lidské buňky.

Buňky první skupiny jsou s výhodou mastocyty, buňky druhé skupiny jsou mastocyty, receptor je c-kit receptor a první skupina buněk je kultivována za přítomnosti SLF.

Podle jednoho zvláštního provedení je první skupina buněk vybavená uvedeným receptorem této první skupiny buněk.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky IA až 1F znázorňují indukci smrti v BMMC pomocí kombinace růstových nebo aktivačních signálů s blokátory vstupu Ca²⁺. Cytotoxické zkoušky byly provedeny tak, jak je popsáno v materiálech a postupech. Na obrázcích IA až 1C byly BMMC inkubovány buď s SLF (500 ng/ml ve všech případech) (kroužky), nebo IL-3 (25 % WEHI-3 upravované medium ve všech případech) (čtverečky) a vyznačeným množstvím ketotifenu (obrázek ΙΑ) , econazolu (obrázek 1B) nebo Ni²⁺ (obrázek 1C). Na obrázku ID byly inkubovány s IL-3 a s vyznačenými množstvími SLF. Oddělené kroužky s udáním rozptylu obsahovaly také 2,5 mM Ni²⁺ a oddělené čtverečky nezahrnovaly žádný Ni²⁺. Na obrázku IE byly na BMMC navázány monoklonální SPE-7 s IgE anti-DNP, poté byly inkubovány s IL-3 a s vyznačenými množstvími DNP-HSA (Ag) , s 5 pMeconazolu (kroužky), nebo bez econazolu (čtverečky). Na

obrázku 1F byly BMMC inkubovány s IL-3 a s vyznačenými množstvími P substance, s 5|jMeconazolu (kroužky) , nebo bez econazolu (čtverečky). Ve všech případech bul stanoven poměr usmrcených buněk po 24 hodinové kultivaci spočítáním buněk, které dokázaly nebo nedokázaly vyloučit trypanovou modř. Údaj o chybě představuje standardní chybu po trojím měření.

Obrázky 2A a 2B znázorňují indukci buněčné smrti v 32Dkit nebo p815 buňkách s pomocí SLF a blokátoru vstupu Ca²⁺. 32D-kit buňky (obrázek 2A) nebo p815 buňky (obrázek 2B) byly inkubovány buď s SLF (plné sloupce) nebo s IL-3 (šrafované sloupce) a s vyznačenou koncentrací blokátoru vstupu Ca²⁺. Buněčná smrt byla stanovena po 18 hodinové kultivaci pomocí vyloučené trypanové modři.

Obrázky 3A až 3E znázorňují morfologii 32D-kit buněk inkubovaných s různými faktory a s blokátory vstupu Ca²⁺. 32D-kit buňky byly inkubovány jenom samotným SLF (obrázek 3A) , samotným IL-3 (obrázek 3B) , 5μΜ econazolu a SLF (obrázek 3C), nebo 5μΜ econazolu a IL-3 (obrázek 3D) po dobu 18 hodin. Podle obrázku 3E byly buňky inkubovány bez přidání faktoru. Buňky byly fotografovány fázovým kontrastem se zvětšením 400x.

Obrázek 4 znázorňuje graf relativního počtu 32D-kit buněk (osa y) jako funkci buněčného obsahu DNA. 32D-kit buňky byly inkubovány 18 hodin jen s SLF (obrázek 4A), jen s IL-3 (obrázek 4B), s 8 μΜ econazolu a SLF (obrázek 4C), nebo v 8 μΜ econazolu a IL-3 (obrázek 4D) . Obrázek 4E ilustruje situaci, kdy byly buňky inkubovány bez přidání faktoru.Buňky byly barveny propidium iodidem, jak je popsáno v materiálech a postupech, a pak byly pomocí průtokové cytometrie analyzovány na obsah DNA.

Obrázek 5 znázorňuje ochranu 32D-kit buněk kyselinou olejovou před apoptózou způsobenou SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺. 32D-kit buňky byly inkubovány po dobu 18 hodin s SLF a 5μΜ econazolu a s kyselinou olejovou (plný sloupec), nebo s ·· · · • · · ♦ · · • · · · · · • ·

- 17 SLF a 5μΜ econazolu a s kyselinou elaidonovou (šrafováný sloupec), nebo s IL-3 a 5μΜ econazolu a s kyselinou olejovou (čárkovaný sloupec). Podíl mrtvých buněk byl stanoven pomocí vyloučení trypanové modři.

Obrázky 6A a 6B ukazují účinek ionomycinu na apoptózu indukovanou SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺. Na obrázku 6A byly inkubovány 32D-kit buňky po dobu 18 hodin s 5μΜ econazolu a s vyznačenými množstvími ionomycinu buď za přítomnosti SLF (kroužky) nebo IL-3 (čtverečky) . Na obrázku 6B byly inkubovány 32D-kit-Bcl-2 buňky po dobu 18 hodin s 5 μΜ econazolu a s vyznačenými množstvími ionomycinu buď za přítomnosti SLF (kroužky) nebo IL-3 (čtverečky). Podíl mrtvých buněk byl stanoven pomocí vyloučení trypanové modři.

Obrázek 7A ukazuje Western blot buněčných lyzátů z 32Dkit buněk (čára 1) nebo z 32D-kit-Bcl-2 buněk (čára 2) . Buňky byly lyžovány, jak je uvedeno v materiálech a postupech, a separovány pomocí SDS-PAGE, byly přeneseny do nitrocelulózy a prokázány pomocí anti-Bcl-2 protilátek.

Obrázek 7B znázorňuje účinek nadměrné exprese Bcl-2 na apoptózu indukovanou SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺. 32D-kit buňky (plné sloupce) nebo 32D-kit-Bcl-2 buňky (šrafováné sloupce) byly inkubovány po dobu 18 hodin s SLF nebo IL-3 a 2,5, 5 nebo 10 μΜ econazolu a podíl mrtvých buněk byl stanoven pomocí vyloučení trypanové modři. V doplňkových kultivacích byla obdobně testována životaschopnost buněk za nepřítomnosti jakéhokoli faktoru nebo jen s přidaným samotným IL-3. Účinek přidaných 25 nebo 250 μΜ YVAD-CHO na životaschopnost buňky byl také vyhodnocen v oddělených kulturách, do kterých nebyly přidány žádné faktory.

Obrázek 8 znázorňuje účinek YVAD-CHO na apoptózu způsobenou SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺. 32D-kit buňky byly inkubovány buď s SLF za nepřítomnosti YVAD-CHO (kroužky), nebo s SLF za přítomnosti 25 μΜ YVAD-CHO (trojúhelníky) , nebo IL-3 (čtverce) s vyznačenými množstvími econazolu.

• · · ·· • *

- 18 Podíl mrtvých buněk byl vyhodnocen po 18 hodinové kultivaci pomocí vyloučení trypanové modři.

Obrázek 9A ukazuje apoptózu indukovanou blokátorem vstupu Ca²⁺ v nádorových buňkách, které mají nepřetržitě aktivovaný receptor. 2,5 x 10⁴ SK-BR3 buněk (ATCC cat. # HTB30) bylo inkubováno 18 hodin v důlcích destiček s 96 důlky v 0,1 ml RPMI plus 0,5 % FBS s (kroužky) nebo bez (čtverečky) lOng/ml EGF (epidermální růstový faktor) a s vyznačenými koncentracemi econazolu. Podíl mrtvých buněk byl vyhodnocen vyloučením trypanové modři po 18 hodinách v kultuře.

Obrázek 9B ukazuje apoptózu indukovanou blokátorem vstupu Ca²⁺ v autokrinně stimulovaných rakovinných buňkách prsu za různých podmínek, kontrola; sloupec 2: 20 μΜ econazolu; sloupec 3: 20μΜ econazolu a ΙΟμΜ YVAD-CHO (ICE inhibitor); sloupec 4: 20μΜ econazolu a 100 pMYVAD-CHO; sloupec 5: 20μΜ econazolu a 0,1 nM ionomycinu (kalcium ionophore); sloupec 6: 20μΜ econazolu a 10 nM ionomycinu; sloupec 7: 20μΜ econazolu a 1 μΜ ionomycinu; sloupec 8: 20μΜ econazolu a 10 μΜ kyseliny olejové (inhibitor PLC aktivace); a econazolu a 100 μΜ kyseliny olejové.

Obrázek 10 znázorňuje apoptózu

MDA-MB-231 Sloupec 1:

sloupec 9: 20μΜ způsobenou EGF a blokátorem vstupu Ca²⁺ v buňkách pocházejících z rakoviny prsu člověka. 2,5 x 10⁴ MCF-7 buněk bylo inkubováno 18 hodin v důlcích destiček s 96 důlky v 0,lml DMEM a 0,5% FBS s (kroužky) nebo bez (čtverečky) lOng/ml EGF a s vyznačenými koncentracemi econazolu. Podíl mrtvých buněk byl stanoven po 18 hodinové kultivaci testem vyloučení trypanové modři.

Obrázek 11A ukazuje účinek blokátoru vstupu Ca²⁺ a aktivačního faktoru na leukemické buňky myši, kterým byl intravenózně podán SLF. Myším bylo intravenózně inokulováno 1 x 10⁷ G418-rezistentních 32D-kit buněk. Mezi 3 a 5 týdny po inokulaci (Experiment 1 & 3; 5 týdnů, experiment 2; 3 týdny) bylo myším podáno 100 mg/kg ketotifenu orálně • · • · ·

zavedenou žaludeční sondou. Za čtyři hodiny po léčbě ketotifenembylo myším intravenózně podáno 15 μ9 SLF. Za další dvě hodiny bylo myším podáno dalších 100 mg/kg ketotifenu p.o. Následující den byly myším odstraněny sleziny a v nich zkoumána přítomnost leukemických buněk dáním buněk do 0,3 % agaru v růstovém médiu obsahujícím 20 % WEHI-3 středně uchovávaném a 1 mg/ml G418 tak, aby byly odhaleny pouze G418-rezistentní leukemické buňky. Kolonie byly sčítány za dalších 7 dní.

Obrázek 11B je podobný obrázku 11A. V tomto případě byla ale u slezin zkoumána přítomnost všech buněk schopných tvořit kolonie v agaru jako odezva na IL-3. Byly pozorovány jak leukemické, tak i normální buňky.

Obrázek 12 znázorňuje účinek blokátoru vstupu Ca²⁺ a aktivačního faktoru na leukemické buňky myši, kterým byl subkutánně podán SLF. Myším bylo intravenózně inokulováno 1 χ 10⁷ 32D-kit buněk. Za tři týdny bylo myším podáno 100 mg/kg ketotifenu orálně zavedenou žaludeční sondou. Po čtyřech hodinách od léčby ketotifenem bylo myším injikováno subkutánně 15 μg SLF. Za dvě hodiny po této injekci byla myším podána další dávka ketotifenu ve výši 100 mg/kg p.o. Následující den jim byly odstraněny sleziny a v nich zkoumána přítomnost leukemických buněk jejich uložením do 0,3 % agaru v růstovém mediu obsahujícím 20 % WEHI-3 středně uchovávané a 1 mg/ml G418 tak, aby byly odhaleny pouze G418rezistentní leukemické buňky. Za dalších 7 dní byly sčítány kolonie.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a postupy

Buňky. Mastocyty pocházející z kostní dřeně (BMMC) byly získány, jak bylo popsáno dříve (Berger et al. , 1994). Byly pěstovány v OPTI-MEM (Gibco, Burlington, ON) s dodaným 10 % • ·. ·· · ·· ·· ·· · · ···· ··♦· * ···· ···· • ··*· ····♦··♦ • · · · · ♦ · ··« ···· ·· ··· ·· ··

FBS tepelně inaktivovaným a 2 % WEHI-3 supernatantem sloužícím jako zdroj IL-3. 32D-kit buňky (dar od Dr. Marka Mindena, Ontario Cancer Institute) jsou na IL-3-dependentní (závislé) myelomonocytární buněčné linie, které exprimují ckit (Hu et al., 1995). 32D-kit buňky vyrůstaly v RPMI (Gibco) doplněném 10 % tepelně inaktivovaným FBS, 2 % WEHI-3 supernatantem a 1 mg/ml G418 (Gibco). Buněčná linie p815 je myší mastocytomová buněčná linie. Buňky p815 byly pěstovány v RPMI doplněném 10 % tepelně inaktivovaným FBS. Komplex Bcl-2 gp+e NIH 3T3 buněk byl pěstován v Dulbeccově modifikaci Eagleova media (DMEM - Gibco) doplněné 10 % FBS a 2 μg/ml puromycinu (Sigma, St.Louis, Mo). Všechny buněčnélinie také obsahují 55 μΜ β-mercaptoethanolu a antibiotika (obě Sigma). Buňky SK-BR3, MDA-MB231 a MCF-7 byly získány z ATCC. SK-BR3 a MDA-MB231 buňky byly pěstovány v RPMI půdě doplněné 10 % tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra. MCF-7 buňky byly pěstovány v DMEM mediu doplněném 10 % tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem a lidským insulinem (Sigma) v dávce 10 μ9/ιη1.

Generace buněk Bcl-2 nadměrně exprimujících 32D-kit. gp + e bcl-2 retroviral producer buňky byly dar od Dr. Y. BenDavida (Toronto). Obsahují retrovirový vektor založený na LXSNexprimujicí geny jak pro puromycinovou rezistenci , tak i pro myší bcl-2. Z důvodů infekce byla souvislá vrstva obalových gp+e buněk pěstována 24 hodin spolu s 32D-kit buňkami. Neadherované 32D-kit buňky byly pak odstraněny, pěstovány 48 hodin a pak odděleny jako bcl-2 nadměrně exprimující buňky za přítomnosti 2 μg/ml puromycinu.

Produkce rekombinantního SLF. Rekombinantní myší Steel Factor (SLF) byl vyprodukován v rozpustné formě v E. coli za použití pFLAG.ATS,IPTG-inducible secretion expression vector (InterScience, Markham, ON). Tento vektor obsahuje osm aminokyselinových N-terminálních FLAG epitopů (InterScience). E. coli obsahující pFLAG.ATS.SLF plasmid ·· ·· • · · • · · ··· ···

- 21 byly přes noc inkubovány při 37 °C v Luria Broth (Gibco) se 100 μg/xnl ampicilinu (Sigma) . Tato kultura pak byla 20 x rozředěna a pěstována až do OD₆₀o 0,4-0,5, než byly indukovány 33 ng/L IPTG (Gibco) . Tyto kultury pak byly inkubovány přes noc při 37 °C a buňky byly stočeny po 20 minut při 10,000 otáčkách za minutu. Bakteriální supernatant byl přefiltrován přes 0,22 mikronový filtr a skladován při 80 °C s 1 mM chloridu vápenatého CaCl₂ a 100 μΜ PMSF. FLAGSLF byl afinně purifikován na sloupci z Anti-FLAG Ml myších monoklonálních protilátek kovalentně navázaných na agarový gel (InterScience). Tento monoklonváže FLAP epitop Ca²⁺dependentním způsobem umožňujícím eluci (vyluhování absorbované látky) pomocí chelátového přebytku Ca²⁺ s EDTA. Sloupec byl nejprve ekvilibrován 30 ml PBS + 1 mM CaCl2 chloridu vápenatého. Bakteriální supernatanty prošly přes sloupec třikrát. Sloupec byl hojně omýván PBS + 1 mM CaCl₂ chloridu vápenatého. FLAG-SLF spojovací protein byl eluován 6 alikvotními částmi 1 ml PBS + 2mM EDTA. Ty byly shromážděny, koncentrovány, dialyzovány od PBS a zkontrolovány na čistotu stříbrnou skvrnou.

Ostatní reagenty Monoklonální myší dinitrophenyl (DNP) specifická IgE, klon SPE-7,jakož i lidský albuminový DNP-HSA antígen byly získány ze SIGMA. Substance P, všechny blokátory vstupu Ca²⁺, ionomycin, kyselina olejová a kyselina elaidová, EGF a bFGF byly rovněž získány ze Sigma. Ionomycin byl uložen jako lmM roztok v DMSO při -20 °C. Kyselina olejová a elaidová byly skladovány v bezplynových ethanolových roztocích o koncentracích IM respektive lOOmM, těsně uzavřeny pod ochranou No₂ a uchovávány při -20 °C. YVAD-CHO ICE peptid inhibující proteázy byl získán od Amersham (Arlington Heighs, IL) a uchováván jako lmM roztok v DMSO při -20 °C.

Zkoušky buněčné smrti 2,5 x 10⁴ BMMCs, 32D-kit nebo P815 buňky byly umístěny v destičkách s 96 důlky v 0,1 ml RPMI • · · « • · «

44··« 44 ·· • · · 4 • 4 4 · • ·44 444 • 4 obsahujícího 0,5 % FBS. Buňkám byly dodány buď SLF, substance P nebo IL3 plus blokátor kanálu Ca²⁺. V případě přidání IgE byly buňky inkubovány s 10 pg/ml SPE-7 po dobu 45 minut při teplotě 4 °C, následně 3 x promyty RPMI, 0,5 % FBS a pak uloženy v destičkách s 96 důlky a přidáno 100 ng/ml DNP-HSA. Podíl mrtvých buněk byl určován po 18 nebo 24 hodinové kultivaci počítáním buněk, které byly nebo nebyly schopné vylučovat trypanovou modř.

Analýza obsahu DNA 1,25 χ 10⁶ buněk bylo inkubováno 18 nebo 24 hodin, jak bylo popsáno výše. Buňky byly stočeny a resuspendovány ve Vindelově reagentu: 3,4mM Tris-pH 8,75 μΜ propidium jodid (od Sigma), 0,1 % NP-40, 700 u/1 RNAse (Sigma) a 10 mM NaCl.Bu“nky pak byly analyzovány průtokovou cytometrií.

Western Blotting 1 χ 10⁶ 32D-kit a 32D-kit~bcl2 buněk bylo promyto v PBS a re suspendováno v lyzolovém pufru obsahujícím 1 % NP-40, 10 % glycerolu v TBS s inhibitory: 500 μΜ ortovanadátu sodného (sodium-orthovanadate), 10 gg/ml aprotininu, 10 μg/ml leupeptinu a 1 mM PMSF (všechno Sigma) a inkubováno při 4 °C po dobu 20 minut. Lyzáty byly centrifugovány při 12.000 otáček za minutu po dobu 10 minut a supernatant byl přidán ke stejnému množství vzorkového pufru s p2-merkaptoethanolem. Vzorky byly separovány pomocí 12 % SDS-PAGE a přeneseny do nitrocelulózy. Skvrna byla blokována 5% práškem plnotučného mléka, 0,1% TWEEN-20 (ICN, Aurora OH) v PBS a prokázána pomocí anti-bcl-2 protilátek (U.B.I., Lake Placid, NY) . Western skvrna byla vyvinuta pomocí chemiluminiscenčních reagentů (Amersham).

Myši Pro in vivo experimenty 32D-kit bylo použito myších samců C3H/he starých 6 až 8 týdnů, získaných z Charles River Laboratories, Boston, Massachusetts. Myším bylo intravenózně inokulováno 1 χ 10⁷ leukemických buněk. Tři až pět týdnů po inokulaci bylo myším podáno 100 mg/ml ketotifenu (Sigma) v objemu 0,4 ml vody orálně zavedenou

ft ftft · • » · · • ft·· ··· • · • ftftftft žaludeční sondou. Po první léčbě ketotifenem bylo myším intravenózně nebo subkutánně injikováno 15 μg SLF v PBS. Druhá léčba ketotifenem následovala po podání SLF.

Experiment 1: blokátory kanálku Ca²⁺ konvertují aktivační signály na signály smrti.

Mastocyty jsou normálně stimulovány k proliferaci pomocí SLF, což je liganda pro c-kit receptor tyrosin kínázy. Jak je však ukázáno na obrázcích 1A-C, tento proliferační signál se přeměňuje na smrtící signál, jsou-li buňky inkubovány společně s blokátorem vstupu Ca²⁺, jako je ketotifen, econazol nebo Ni²⁺. Naproti tomu se smrt nepozoruje, jestliže jsou mastocyty inkubovány společně s blokátorem vstupu Ca²⁺ a s IL-3. Simultánní inkubace mastocytů s SLF, blokátorem vstupu Ca²⁺ a IL-3 stále vede k buněčné smrti (obrázek ID) , což ukazuje, že IL-3 není ochranou pro tento určitý smrtící signál. Blokátory vstupu Ca²⁺ sami o sobě neurychlují smrt mastocytů způsobenou odstraněním růstových nebo survival faktorů (neznázorněno). Indukce buněčné smrti pomocí SLF a blokátoru vstupu Ca²⁺ se zvyšuje s rostoucími koncentracemi SLF. Toto naznačuje, že existuje signalizační vlastnost spojená s SLF, ale nikoli s IL-3, které je zapotřebí k vyvolání této formy buněčné smrti v kombinaci s blokátorem. Účinkem blokátoru vstupu Ca²⁺ není jednoduše rušit nebo neutralizovat stimulační vlastnosti SLF. Blokátor se spíše spojí s kritickým signálem generovaný SLF, aby přeměnil aktivační dráhu na dráhu buněčné smrti.

Ačkoli jak SLF, tak i IL-3 působí na mastocyty mitogenně, vstup Ca²⁺ způsobuje pouze SLF (Columbo et al., 1994; Rao et al., 1994). Proto byly zkoumány účinky dalších o i dvou signálů schopných mobilizovat Ca v mastocytech na buněčnou životaschopnost. Přemostění vysoce afinního receptoru pro IgE antigenem zahájí řadu signalizačních

99

9 9 9

9 9 9

999 999

9 • ·· ·· ·· · · · · ·

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

999 9999 99 9 událostí včetně PLC-γ a mobilizace Ca²⁺, jejichž výsledkem je degranulace mastocytů (Jouvin et al. , 1995). Účinek na životaschopnost mastocytů stimulovaných Ag (antigenem) a IgE za přítomnosti blokátoru vstupu Ca²⁺ je ukázaný na obrázku IE. Jak je ukázáno, je buněčná smrt indukovaná tehdy, když jsou mastocyty stimulovány pomocí IgE a antigenu za přítomnosti econazolu, kdežto samotná antigenní stimulace nebo stimulace samotným econazolem vliv na buněčnou životaschopnost nemají. Ni²⁺ a ketotifen se také zkříženě naváží na IgE receptor, aby vyvolaly buněčnou smrt (neznázorněno).

Mastocyty také reagují na amphiphilické kationické peptidy jako je substance P (Bueb et al., 1990; Mousli et al., 1990). Tyto molekuly přímo stimulují heterotrimerické G-proteiny vedoucí k PLC-β aktivaci, mobilizaci Ca²⁺ a za přítomnosti suboptimálních hladin antigenu a IgE k degranulaci mastocytů. Jak je ukázáno na obrázku 1F, indukuje se buněčná smrt také tehdy, když jsou mastocyty stimulovány substancí P za přítomnosti econazolu. Stupeň buněčné smrti za přítomnosti blokátoru vstupu Ca²⁺ se zvyšuje se stoupajícími koncentracemi Ag nebo substance P, podobně jako je tomu s SLF. Protože všechny tyto tři signály (ale nikoli IL-3) mobilizuj i Ca²⁺, což vede ke vstupu Ca²⁺, je pravděpodobné, že mobilizace Ca²⁺ je požadovaný signál k vyvolání buněčné smrti v kombinaci s blokátory vstupu Ca²⁺.

Také byla zkoušena indukce buněčné smrti pomocí kombinace aktivačního signálu a blokátoru vstupu Ca²⁺ v jiných buňkách, než jsou mastocyty. 32D buňky jsou c-kit negativní, IL-3 dependentní myelomonocytární buňky, které umírají po odstranění faktoru apoptózou (Baffy et al., 1993). Přenos a exprese c-kit v těchto buňkách je činí citlivé k SLF in vitro a činí je tumorigenní in-vivo (Hu et al., 1995). Jak je ukázáno na obrázku 2A, činí exprese c-kit receptoru tyto buňky citlivé k vyvolání buněčné smrti • · · • · ·

působením SLF a blokátoru vstupu Ca²⁺.

Byla popsána řada na faktoru nezávislých tumorů, které jsou transformovány díky konstituční aktivaci nebo autokrinní stimulaci receptorů růstovým faktorem. Jeden příklad faktoru nezávislého tumoru je mastocytom p815, který roste za nepřítomnosti přidaného faktoru díky přítomnosti mutovaného, konstitučně aktivovaného c-kit receptoru (Tsujimura et al., 1994). Jak je ukázáno na obrázku 2B, jsou za nepřítomnosti přidaného stimulu SLF postačující pro vyvolání buněčné smrti buněk p815 samotné blokátory vstupu Ca²⁺. Toto pravděpodobně reflektuje nezávislou vazebnou povahu signalizace pomocí c-kit receptoru p815 a tudíž její schopnost vyvolat spolu s blokátorem vstupu Ca²⁺ buněčnou smrt. Tyto výsledky ukazují, že vyvolání buněčné smrti SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺ není omezené pouze na mastocyty, ale může se pozorovat také u jiných buněčných typů, zejména u těch s vysoce aktivovanými receptory.

Experiment 2: Indukovaná smrt BMMC a 32D-kit buněk má charakter apoptózy.

Jak vizuální zkoumání mastocytů, tak i 32D-kit buněk následující po léčbě SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺ odhalilo charakteristické rysy apoptózy včetně jaderné kondenzace a narušení membrán (obrázek 3C) . Rovněž byl měřen obsah DNA, který se během apoptózy charakteristicky fragmentuje a kterého ubývá. Jak je ukázáno na obrázcích 4A a 4B a shrnuto v tabulce 1, léčba 32D-kit buněk SLF nebo samotným IL-3 po dobu 18 hodin nevyvolala vznik buněčné populace se subdiploidním DNA obsahem, kdežto econazol a SLF, ale ne IL3, vyvolaly vznik velké buněčné populace se subdiploidní DNA (obrázky 4C a 4D). Buňky 32D-kit jsou známé tím, že podlehnou apoptóze, jsou-li zbavené růstového faktoru. Po 18ti hodinovém odstranění růstového faktoru ukazovaly 32D• · · · · · · • · · ·

- 26 kit buňky mírný podíl buněk se subdiploidním DNA obsahem. Tato populace se podstatně zvýší za 24 hodin po odstranění faktoru (data jsou neznázorněná). Proto je proces apoptózy indukovaný blokátorem vstupu Ca²⁺ a SLF rychlejší než apoptóza pozorovaná po odstranění faktoru. U mastocytů je po léčbě SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺ také prokázán subdiploidní obsah DNA (tabulka 1) shodný s indukcí buněčné smrti mechanizmem apoptózy.

Tabulka 1

Obsah sub GI DNA vBMMC nebo 32D-kit buňkách upravených econazolem a faktorem.
bez	Obsah econazolu	sub GI (%) 8μΜ econazolu
BMMC
IL-3	25,4	20,4
SLF	6,8	66,8
Odstranění faktoru	6,18	n.d.
32D-kit
IL-3	1,6	4,8
SLF	2,3	35
Odstranění faktoru	9,2	n.d.

(1) BMMC byly inkubovány s 8μΜ econazolu a IL-3 (25 % WEHI conditioned media), SLF (500ng/m.), nebo bez faktoru po dobu 24 hodin, označeny propidium jodidem a analyzovány na obsah DNA.

(2) 32D-kit buňky byly před analýzou obdobně inkubovány po dobu 18 hodin. n.d.: neurčeno.

Experiment 3: Ochrana buněk kyselinou olejovou před apoptózou indukovanou SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺.

Pozorování, že Ca²⁺ mobilizační signály mohou v kombinaci s blokátory vstupu Ca²⁺ indukovat apoptózu, • · • · · · · · • · • · ·»

- 27 naznačuje, že je tento efekt zprostředkováván aktivací fosfolipázy C. Aby se stanovilo, je-li aktivace PLC pro buněčnou smrt důležitá, byl zkoumán účinek kyseliny olejové, u níž bylo ukázáno, že inhibuje PLC aktivaci jako odezvu na epidermální růstový faktor (EGF) (Casabiell et al. , 1993), na indukci apoptózy. Tento inhibiční efekt, který nemění vazbu EGF nebo aktivaci tyrosin kinázy EGF receptorem, je pozorován pouze u cis-9-octadecenové kyseliny (kyselina olejová), ale ne u trans-9-octadecenové kyseliny (kyselina elaidová) (Casabiell et al., 1991). 32D-kit buňky byly inkubovány s econazolem a SLF nebo IL-3 buď za přítomnosti kyseliny olejové, nebo kyseliny elaidové. Jak je ukázáno na obrázku 5, byly buňky 32D-kit vystavené SLF a blokátoru kanálku Ca²⁺ zachráněny před buněčnou smrtí kyselinou olejovou, ale nikoli kyselinou elaidovou. Rozsah účinnosti kyseliny olejové je mezi l-ΙΟΟμΜ, což odpovídá koncentracím požadovaným pro PLC inhibici (Casabiell, Zugaza, 1993). Toto sledování je shodné s požadavkem na aktivaci fosfolipázy C při indukci apoptózy v kombinaci s blokátory vstupu Ca²⁺.

Experiment 4: Ochrana buněk ionomycinem před apoptózou vyvolanou kombinací SLF a blokátoru vstupu Ca²⁺.

Vstup Ca²⁺, který následuje po aktivaci receptoru, je zprostředkován otevřením store-operated Ca²⁺ kanálků (zvaných též Icrac) (Penner et al., 1993). Je pravděpodobné, že Icrac kanálek je terčem inhibice, protože účinnost, s kterou tři sloučeniny, ketotifen, econazol a Ni²⁺, indukují v kombinaci s SLF buněčnou smrt, koreluje s jejich schopností inhibovat Icrac (Franzius et al., 1994). Bylo také vypozorováno, že blokátory napěťově otvíraných kalciových Ca²⁺ kanálků verapamil a nifedipin jsou neúčinné pro indukování buněčné smrti, jsou-li kombinovány s SLF (neznázorněno). Tento výsledek naznačuje, že indukce buněčné • fr • · · · · ··· · ·· · • · ··· · · · · • · ·· · · · ······ • · · · · · · «·· ···· ·· ··· ·· ··

- 28 smrti v kombinaci s SLF je specifická pro beznapěťově zavírané blokátory vstupu Ca²⁺.

Byly vylíčeny další nespecifické účinky jak econazolu, tak i ketotifenu (Franzius, Hoth, 1994). Aby bylo stanoveno, je-li pro indukci buněčné smrti kritická blokáda vstupu Ca²⁺, byl zkoumán účinek kalcium ionoforovaného ionomycinu na indukci apoptózy. Jak je ukázáno na obrázku 6A, ionomycin chrání 32D-kit buňky před smrtí vyvolanou SLF a blokátorem vstupu Ca²⁺ v závislosti na koncentraci, při maximální ochraně při lOnM. Vzhledem ke specificitě ionomycinu pro Ca²⁺ (Liu et al. , 1978) tyto výsledky naznačují, že je to specifická blokáda vstupu Ca²⁺, která je požadovaná pro vyvolání apoptózy, v kombinaci s aktivačními signály. Vyšší koncentrace ionomycinu, které způsobují krajní hladiny intracelulárního Ca²⁺, mají za následek znovuobnovení buněčné smrti. To demonstruje, že v kontextu aktivace buňky mohou oba extrémy vstupu Ca²⁺ indukovat buněčnou smrt.

Experiment 5: Účinek Bcl-2 na apoptózu indukovanou SLF a blkátorem vstupu Ca²⁺ v 32D-kit buňkách.

Třída proteinů Bcl-2 byla pevně spojena s ochranou buněk před apoptózou indukovanou širokou škálou různých agens. Exprese Bcl-2 koreluje s proliferujícími buňkami (Hockenbery et al., 1991; Veis et al. , 1993) a je negativně regulovaná nádorovým supresorem p53 (Miyashita et al., 1994) a nadměrná exprese Bcl-2 chrání 32D buňky před smrtí apoptózou, která následuje po odstranění faktoru (Nunez et al. , 1990; Baffy, Miyashita et al. , 1993). Proto byl zkoumán účinek nadměrné exprese Bcl-2 proteinu na indukci apoptózy blokátorem vstupu Ca²⁺ a SLF. 32D-kit buňky byly infikovány retrovirovým vektorem (Schwarze et al. , 1995) obsahujícím Bcl-2 gen, aby mohla vzniknout buněčná linie s nadměrnou expresí Bcl-2 (obrázek 7A). Buňky byly testovány na citlivost k apoptóze a • · · · · ···· • · ·· · · · ······ • · · · · · · ··· ···· ·· ··· ·· ··

- 29 bylo zjištěno, že nadměrná exprese Bcl-2 chrání 32D-kit buňky před apoptózou vyvolanou odstraněním faktoru (obrázek 7B) . Jak je však také ukázáno na obrázku 7B, nedokáže nadměrná eacprese Bcl-2 v 32D-kit buňkách ochránit tyto buňky před apoptózou indukovanou SLF a econazolem. Tato pozorování vedla k závěru, že k indukci buněčné smrti blokátorem a SLF dochází nezávisle na Bcl-2.

32D-kit-Bcl-2 buňky byly podobně chráněné před apoptózou SLF a blokátorem o nízkých hladinách ionomycinu (obrázek 6B) , avšak, na rozdíl od 32D-kit buněk, u nich nebyla prokázána signifikantní buněčná smrt při vyšších hladinách ionomycinu. Tyto výsledky tedy ukazují, že se u aktivovaných buněk smrt vyvolaná blokádou Ca²⁺ liší od smrti vyvolané nadměrnými hladinami vstupu Ca²⁺, alespoň na úrovni Bcl-2 citlivosti.

Experiment 6: Účinek inhibitoru ICE proteázy na buněčnou smrt indukovanou blokátorem vstupu Ca²⁺ a SLF a na buněčnou smrt indukovanou odstraněním faktoru.

TNF-α a Fas liganda jsou dva příklady signálů vyvolávajících apoptózu, u kterých nadměrná exprese Bcl-2 neumí zajistit ochranu (Memon et al., 1995; Strasser et al., 1995). V těchto případech je apoptóza zprostředkována proteázami ze skupiny interleukin-ΐβ konvertujícího enzymu. Aby se určilo, jestly byly proteázy ICE třídy zapojeny do indukce apoptózy pomocí SLF a blokátoru vstupu Ca²⁺, byly buňky inkubovány spolu s tetrapeptid-aldehydovým ICE inhibitorem YVAD-CHO (Mashima et al., 1995; Vasilakos et al., 1995). Zjistili jsme, že YVAD-CHO chrání 32D-kit buňky před apoptózou indukovanou topoisomerásovým inhibitorem etoposidu (neznázorněno). Bylo také zjištěno, že YVAD-CHO zajišťuje rezistenci na apoptózu indukovanou SLF a econazolem (obrázek 8) , ale selhává jako ochrana 32D-kit • 4 · 4 buněk před apoptózou indukovanou odstraněním faktoru (obrázek 7B). Je tedy pravděpodobné, že apoptóza indukovaná kombinací růstového nebo aktivačního signálu s blokátorem vstupu Ca²⁺ je zprostředkovaná proteázou podobnou ICE.

Experiment 7: Účinek blokátoru Ca²⁺ a EGF na lidské rakovinné buňky.

Studie ukázaly zapojení receptorů růstového faktoru u rakoviny prsu. Například bylo zjištěno, že u více než 45 % rakovin prsu byl pozitivní EGF^R (Fox et al., 1994; Franzius et al. , 1994). ErbB2, receptor růstového faktoru blízce příbuzný s EGF^R je nadměrně exprimován ve 30-40 % všech rakovin prsu (Slamon, et al., 1989). Aby se stanovilo, můželi být buněčná smrt indukována u těchto buněk blokátory vstupu Ca²⁺ a aktivačními signály, byly SK-BR3 buňky inkubovány s nebo bez EGF a za přítomnosti econazolu. SK-BR3 buňky (ATCC cat.# HTB-30) pocházejí z lidského adenokarcinomu prsu. Jsou tumorigenní u holých myší. Tyto buňky obsahují mutovaný gen p53 (Elstner, et al., 1995), nemají estrogenový receptor a exprimují vysoké hladiny molekul erbB2 (Li. et al. , 1993), což vede k neustálé aktivaci tohoto receptoru. Jak je ukázáno na obrázku 9A, indukuje econazol ekvivalentní hladiny smrti u SK-BR3 buněk za přítomnosti i za nepřítomnosti EGF.

Buněčná linie MDA-MB-231 je vysoce anaplastický karcinom prsu. Je také tumorigenní pro holé myši, ale exprimuje jen nízké hladiny erbB2. Nicméně je FGF^R pozitivní a je stimulována autokrinním způsobem bFGF (el Yazidi et al., 1995) . Byly provedeny experimenty pro stanovení citlivosti buněk MDA-MB-231 k blokátoru vstupu Ca²⁺ a vlivu kyseliny olejové, ionomycinu a YVAD-CHO na indukci buněčné smrti blokátorem. Výsledky jsou shrnuty na obrázku 9B. Jak je naznačeno, MDA-MB-231 buňky podléhají apoptóze jako odezva • ·

- 31 na vystavení blokátoru vstupu Ca²⁺ econazolu. Navíc se zdá, že mechanismus apoptózy pro MDA-MB-231 buňky indukovaný blokátorem vstupu Ca²⁺ má shodné znaky s mechanismem apoptózy pro 32D-kit buňky. Ionomycin, kyselina olejová a YVAD-CHO mohou ochránit MDA-MB-231 buňky předbuněčnou smrtí indukovanou blokátorem vstupu Ca²⁺.

MCF-7 buňky (ATCC cat.#HTB-22) jsou derivované z rakoviny prsu lidského organismu. Tyto buňky jsou tumorigenní pro holé myši, zvláště jsou-li myši léčeny estrogenem (Benz, et al. , 1993), nebo jsou-li buňky enkapsulovány v matrigelu (Noel, et al., 1995). Uvádí se, že tyto buňky jsou stimulovány EGF (Godden et al. , 1992) . Aby se určila citlivost těchto buněk k buněčné smrti vyvolané blokátorem vstupu Ca²⁺ a aktivačním signálem, byly MCF-7 buňky inkubovány 18 hodin s a bez lOng/ml EGF s různými koncentracemi econazolu. Jak je ukázáno na obrázku 10, jsou MCF-7 buňky náchylnější k buněčné smrti vyvolané econazolem za přítomnosti lOng/ml EGF než za jeho absence. Experimenty znázorněné na obrázcích 9A, 9B a 10 společně ukazují, že některé buňky rakoviny prsu budou projevovat zvýšenou citlivost k blokátorům za přítomnosti aktivačního faktoru, jako je EGF.

Experiment 8: Účinek blokátoru vstupu Ca²⁺ a SLF na 32Dkit leukemické buňky in vivo.

Za účelem stanovení účinnosti kombinace blokátoru vstupu Ca²⁺ s aktivačním signálem in vivo byly myši očkované dependentním faktorem a G418-rezistentními 32D-kit leukemickými buňkami léčeny kombinací ketotifenu a SLF. V jedné skupině pokusů byly odejmuty slezinné buňky a zkoumány na přítomnost leukemických buněk tak, že se buňky uložily do agaru v růstovém mediu obsahujícím 20 % středně uchovávaného WEHI-3 a 1 mg/ml G418, aby byly detekovány pouze G418• · · * • · · · ·· · ···

- 32 rezistentní leukemické buňky. V další skupině pokusů byly sleziny zkoumány na přítomnost všech buněk schopných tvořit kolonie v agaru jako reakci na IL-3, to jest leukemických i normálních buněk. Jak je ukázáno na obrázku 11A, mohou být u naočkovaných zvířat zjištěny v každém experimentu G418rezistentní buňky tvořící kolonie. Hladiny zjištěné ve slezinách inokulovaných zvířat se liší zvíře od zvířete, avšak většina zvířat obsahuje mezi 30 a 1.000 G418rezistentních kolonií. Aritmetický průměr počtu kolonií u inokulovaných ale neléčených zvířat je 69.938, ačkoliv jedno zvíře obsahovalo velmi vysokou hladinu leukemických buněk. Pokud není toto zvíře započítáno, je aritmetický průměr počtu kolonií 391. Geometrický průměr je u této skupiny 813 kolonií na slezinu. Počet G418-rezistentnxch kolonií u zvířat, kterým byl injikován SLF, měl pouze sklon být vyšší než u zvířat, kterým faktor podán nebyl, a měnil se mezi 65 a 31.000 s aritmetickým průměrem 7.399 a geometrickým průměrem 1.545 kolonií na slezinu. Tot zvýšení detekovaného počtu kolonií by mohlo být charakteristickým znakem ke stimulaci leukemických buněk SLF. U myší, kterým byl podán samotný ketotifen, se počet detekovaných kolonií mění mezi 114 a 27.645 s aritmetickým průměrem 5.502 a geometrickým průměrem 849. U zvířat léčených ketotifenem a SLF se počet zjistitelných kolonií mění od 8 do 537 s aritmetickým průměrem 131 a geometrickým průměrem 61 G418-rezistentních kolonií na slezinu. Analýza těchto dat užívající jednostranný t-test (po logaritmické transformaci) ukazuje, že je pouze 6,2 % pravděpodobnosti, že se neléčená a léčená skupina nebudou navzájem lišit. Není-li do analýzy zahrnuto to jedno zvíře z neléčené skupiny, které obsahovalo velmi vysoké hladiny leukemických buněk, pak je pravděpodobnost, že se od sebe neléčená a léčená skupina nebudou lišit, 8,9 %.

Podobné porovnání skupiny zvířat která dostala » · · · ·· · ···

- 33 ketotifen samotný, oproti těm, která dostala ketotifen a SLF, ukazuje, že pravděpodobnost, že tyto skupiny nejsou odlišné, je 0,8 % a rozdíl mezi nimi je tedy podstatný. Tento výsledek naznačuje, že zatímco samotný ketotifen má na leukemické buňky in vivo aktivitu malou, kombinace ketotifenu a SLF má za následek podstatné snížení počtu leukemických buněk.

Tabulka 2

Pravděpodobnost v (%), že skupina A a B nejsou rozdílné v G418-rezistentních koloniích (1).
skupina A	jen 32D-kit	32D-kit + SLF	32D-kit + ketotifen	32D-kit + SLF + ketotifen
skPina B \
jen 32D-kit		33,7 (2,4)	49,1 (16,6)	6,2 (8,9)
32D-kit+SLF			35,2	1,9
32D-kit + ketotifen				i co o
32D-kit+SLF ketotifen

(1) Logaritmy dat z obrázku 11A byly vzájemně porovnávány za pomoci jednostranného t-testu. Je ukázána pravděpodobnost v %, že se ty dvě srovnávané skupiny od sebe neliší. Čísla v závorkách jsou tytéž pravděpodobnosti stanovené tehdy, kdy v analýze není zahrnuto to jedno zvíře z neléčené skupiny s velmi vysokými počty leukemických buněk.

Podobná analýza byla provedena pro celkový počet buněk tvořících kolonie ve slezině těchto myší a tato data jsou představena v obrázku 11B. Aritmetický průměr počtu kolonií u myší, kterým nebyly inokulovány leukemické buňky, je 857 a geometrický průměr 669. Aritmetický průměr počtu kolonií u ·· ·· • · · · • · · · • ··· ··· • · ·· ··

- 34 inokulovaných ale neléčených zvířat je 84.073, avšak jedno zvíře obsahovalo velmi vysoké hladiny leukemických buněk. Pokud toto zvíře není zahrnuto, je aritmetický průměr počtu kolonií 3.448. Geometrický průměr z této skupiny je 4.573 kolonií na slezinu. Počet kolonií nezávislých na IL-3 zjištěný u zvířat, kterým byl injekčně podán SLF, měl tendenci být vyšší než u zvířat, která tento faktor nedostala, s aritmetickým průměrem 18.212 a geometrickým průměrem 5.171 kolonií na slezinu. Toto zvýšení zjistitelného počtu kolonií by mohl být charakteristickým znakem pro stimulaci leukemických buněk s SLF. U myší, které dostaly samotný ketotifen, je aritmetický průměr 7.715 se střední geometrickou hodnotou 2.320. U zvířat léčených ketotifenem a SLF byl aritmetický průměr 793 a geometrický průměr IL-3-dependentních kolonií na slezinu 66. Analýza těchto dat pomocí jednostranného t-testu (po logaritmické transformaci) ukazuje, že existuje 2 % pravděpodobnost, že se od sebe neléčená a léčená skupina neliší. Pokud to jedno zvíře v neléčené skupině, které obsahovalo velmi vysoké hladiny leukemických buněk, není do této analýzy zahrnuto, potom je pravděpodobnost, že se od sebe neléčená a léčená skupina navzájem neliší, 5,1 %. Podobně naznačuje porovnání skupin léčených pouze SLF nebo pouze ketotifenem oproti skupinám léčeným ketotifenem a SLF dohromady také to, že je 2 % nebo 1,6 % pravděpodobnost, že tyto skupiny nejsou odlišné.

- 35 «φ φφ φφφ φ φ φφφ φ φφ φ φ φ φφφ φφφφ φ φφφφ φ φ φφφ φφφ φ φ φφφ φ φ φφφ φφφφ φφ φφφ φφ φφ

Tabulka 3

Pravděpodobnost v %, že se skupina A a B neliší v počtu IL-3 dependentních kolonií (1) .
\skupina A skupina b\	žádné buňky	pouze 32D-kit	32D-kit + SLF	32D-kit+ ketotifen	32D-kit+SLF + ketotifen
žádné buňky		8	2,4	23,4	10,2
pouze 32D-kit			46,3 (1,8)	30,9 (34,8)	2 (5,1)
32D-kit + SLF				22,8	2
32D-kit+ ketotifen					1,6

(1) Logaritmy dat z obrázku 11B byly navzájem porovnávány za využití jednostranného t-testu. Je sdělena pravděpodobnost v %, že dvě porovnávané skupiny nejsou vzájemně odlišné. Čísla v závorkách jsou tytéž pravděpodobnosti stanovené tehdy, není-li do této analýzy započítáno to jedno zvíře z neléčené skupiny s velmi vysokými počty leukemických buněk.

Byl proveden další experiment, při kterém byly myši inokulované 32D-kit buňkami léčené p.o. ketotifenem a SLF byl podán subkutánně. Jak je ukázáno na obrázku 12, za těchto okolností se nezdálo, že by měla kombinace SLF s ketotifenem signifikantní účinekna počet leukemických buněk ve slezinách léčených myší. Tento experiment ukazuje, že způsob podávání aktivačního faktoru a pravděpodobně také relativní časování těchto dvou substancí může ovlivnit účinnost určitého terapeutického postupu.

Výsledky výše uvedených experimentů popisují nový způsob vyvolání apoptózy. Tento způsob využívá kombinace blokády vstupu Ca²⁺ do buňky, jejíž receptor, pokud je aktivován za normálních okolností, vede ke vstupu Ca²⁺, s faktorem, který • · ««· ···« ·· ··· ·· *· • · I • · « « · · · · I

- 36 tento receptor aktivuje. Ve zvláštním provedení je se vstupem Ca²⁺ spojená aktivace fosfolipázy C.

Například bylo ukázáno, že pro indukci apoptózy v mastocytech se mohou SLF, substance P, a IgE a antigen, avšak nikoli IL-3, kombinovat s blokátory vstupu Ca²⁺ (beznapěťově zavíranými). Tato forma apoptózy nevyžaduje nezbytně proliferativní signály, protože jak SLF, tak i IL-3 působí proliferativně, zatímco substance P a antigen-IgE jsou pouze slabě proliferativní. Protože zesilující signál vede ke zvýšené apoptóze, bude tato forma buněčné smrti nejefektivnější, budou-li blokátory vstupu Ca²⁺ kombinovány s vysoce aktivovanými receptory. Toto pozorování podporuje p815 mastocytom, který má konstitučně aktivovaný c-kit receptor a je citlivý na samotné blokátory vstupu Ca²⁺ (obrázek 2B). Buňky SK-BR3 a MDA-MB-231 jsou také citlivé na samotné blokátory vstupu Ca²⁺. Tot také naznačuje, že buňky s podobnými mutacemi (nebo podléhající autokrinní stimulaci) mohou být citlivé k apoptóze navozené touto skupinou léků.

Pozorování, že kyselina olejová může zvrátit apoptózu indukovanou SLF a blokátorem naznačuje potřebu aktivačního signálu, který se projeví aktivací fosfolipázy C alespoň u některých provedení. Také ionomycin může chránit buňky před buněčnou smrtí indukovanou SLF a blokátorem, což naznačuje, že k indukci apoptózy je zapotřebí specifické blokády vstupu Ca²⁺. Apoptóza indukovaná SLF a blokátorem je necitlivá na nadměrnou expresi Bcl-2, avšak může být zvrácena inhibitorem ICE proteáz. To ukazuje alespoň v některých provedeních na roli ICE nebo některého představitele ze skupiny ICE proteáz v tomto mechanismu apoptózy.

Tím, že určité proliferující buňky mají vysoce aktivované receptory (obrázek 9A), což má za následek aktivaci PLC, zahrnuje tento vynález způsob určení citlivosti takovýchto buněk na léčbu blokátorem vstupu Ca²⁺nebo blokátorem a faktorem, který dále aktivuje ··· ··· • · ·· ··

- 37 receptory buněk. Takovýto způsob zahrnuje:

- získání vzorku nemocné tkáně;

- určení, zda tato tkáň obsahuje zvýšenou hladinu PLC ve srovnání s normální tkání;

- pokud tkáň obsahuje zvýšenou hladinu PLC, pak stanovení, zda je PLC aktivován.

Je-li v tkáni nalezena takováto zvýšená hladina aktivovaného PLC, pak jsou buňky pravděpodobně léčitelné, to jest, lze indukovat jejich smrt, omezit proliferaci atd. , vystavením těchto buněk blokátoru vstupu Ca²⁺ nebo blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru, který dále aktivuje receptory, které produkují signál, který vede ke zvýšení hladin aktivovaného PLC.

K prokázání, že u rakoviny prsu jsou zvýšené hladiny enzymu ve srovnání s normálními kontrolami, byla použita anti-PLC specifická antiséra. Pro stanovení hladin aktivovaného PLC může být použita imunoprecipitace s antifosfotyrosinovými protilátkami následovaná Western blotting s anti-PLC protilátkami, protože PLC, která je tyrosin fosforylována, má být pravděpodobně aktivována (Arteaga et al., 1991).

Enzymová aktivita PLC může být zkoušena přímo (Huang et al., 1995). Stručně, buňky, které se mají analyzovat, jsou lyžovány, PLC imunoprecipitovány za využití specifického PLC antiséra (k dispozici například z Upstate Biotechnology Inc, Lake Placid, New York) a enzym je prokázán pomocí [³H]-PIP₂ (z New England Nuclear, Boston, Massachusetts) jako substrát v liposomech (90 % DMPM, 10 % PIP₂) v pufru obsahujícím

0,3mM celkových lipidů v 50 mM tris (pH 8), 0,1 mM CaCl₂ chloridu vápenatého. Reakce jsou ukončené přidáním 0,2 M CaCl₂ chloridu vápenatého v 1 M HC1. Precipitované vezikuly se sbírají na filtračních deskách (jako jsou Millipore 96dobře hydrofobické MultiScreen DP desky) a inositol fosfátový produkt reakce, který je přítomný při průtoku, se • · · · ·

999 999

- 38 • ·· · · aktivuje pomocí scintilačního počítání.

Pozorování, že ionomycin může jak chránit před buněčnou smrtí, tak i ji indukovat, naznačuje, že oba extrémy vstupu Ca²⁺ mohou vést k apoptóze. Avšak v obou případech se zdá být buněčná aktivace žádoucí, protože za nepřítomnosti SLF byla pozorována pouze minimální buněčná smrt. Nadměrná exprese Bcl-2 chránila buňky pouze před smrtí indukovanou vysokými koncentracemi ionomycínu, což naznačuje, že mechanismy tvořící základ buněčné smrti při těchto dvou extrémech vstupu Ca²⁺ nejsou identické, alespoň ne na úrovni citlivosti k Bcl-2. Při vysokých koncentracích ionomycinu tak mohou být buňky vystaveny přetížení Ca²⁺ a určité buňky vystavené této formě toxicity jsou známé jako chráněné prostřednictvím Bcl-2 (Strasser et al. , 1991; Reed, 1994). Předpokládalo se, že možný mediátor smrti způsobené vysokým Ca²⁺ může být Ca²⁺ dependentní fosfatázový kalcineurin, který, jak se ukázalo, zesiluje apoptózu v T buňkách (Shibasaki et al. , 1995) a v B buňkách (Bonnefoy et al. ,

1994) .

Zde popsané výsledky (obrázky 7B a 8) ukazují, že Bcl-2 a ICE jsou zapojené do regulace různých mechanismů apoptózy. Zatímco pomocí Bcl-2 (ale nikoli pomocí ICE inhibitoru) jsou buňky chráněné před apoptózou, která je následkem odstranění faktoru, chrání ICE inhibitor (ale nikoli Bcl-2) před kombinací blokátoru vstupu Ca²⁺ a SLF. Pokusy s dalšími signály indukujícími apoptózu jsou také v souladu s těmito pozorováními (Cuende, et al. , 1993; Memon et al. , 1995; Strasser et al., 1995; Vasilakos et al., 1995; Parijs et al. , 1996) . Nedávno bylo také ukázáno, že Fas aktivace inhibuje vstup Ca²⁺ do T buněk zprostředkovaný anti-CD3 bez ovlivňování uvolňování Ca²⁺ z nitrobuněčných zásob (Kovacs et al., 1995).

Ketotifen je dobře známý antialergický a antiastmatický lék, který ukazuje jak antagonismus histaminového H1 ·· ·· • · · · » 9 9 9

9 99 9

9

99 receptoru, tak i překážku vstupu Ca²⁺ (Martin et al. , 1978; Grant et al. , 1990) . Vzhledem k tomu, že se vstup Ca²⁺ podílí na degranulaci mastocytu, je inhibice tohoto procesu přijatelný mechanismus pro jeho protizánětlivé účinky. Výsledky popsané na tomto místě proto naznačují, že blokátor vstupu Ca zejména ketotifen, může být podán spolu s

VC²⁺ edy antiproliferativní vázáni jakoukoli teorií vhodným aktivačním signálem k léčbě alergických symptomů. Blokátory vstupu Ca²⁺ byly navrženy jako antiproliferativní agens (Riccardi, 1987; Felder et al., 1991; Kohn et al., 1991; Estacion et al., 1993; Petrasch et al., 1993; Kondo et al., 1994; Bucklez et al., 1995; De Vries et al., 1995). Zde popsané výsledky naznačují, že by tyto sloučeniny byly účinnější, kdyby byly spojené se silným proliferativním nebo aktivačním signálem. Kombinace blokátorů vstupu Ca²' s proliferativními nebo aktivačními signály může tedy mít silné, avšak specifické antiproliferativní nebo protizánětlivé vlastnosti.

Vynálezci si nepřejí být vysvětlující přesný mechanismus, kterým je způsobený vstup Ca²⁺ do buněk. Zde prezentované výsledky však potvrzují souvislost mezi indukcí buněčné smrti a podáním buňce kombinace blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru, který se váže k receptoru takové buňky, aby za normálních podmínek vyvolal aktivaci receptoru a tak způsobil vstup Ca²⁺,

Takovým faktorem může být přirozená liganda receptoru, to jest liganda, která působí na receptor za přirozených podmínek, agonisticky působící protilátka atd. Alespoň v některých případech zahrnuje vstup aktivaci PLC. V mnoha případech zahrnuje aktivace stimulaci buňky, kde stimulace zahrnuje proliferaci, aktivaci a/nebo přežití buňky.

Výsledky ukázané na obrázku 9A naznačují, že v případě konstitučně aktivovaných buněk, u kterých se receptor normálně aktivuje ligandou následovanou vstupem Ca²⁺, může buněčnou smrt vyvolat podání samotného blokátoru vstupu φφ φφ • · φ * φ φ · · φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ

ΦΦ • · φφ φφ

Ca²⁺. Zde uveřejněný vynález zahrnuje tedy také podání blokátorů vstupu Ca²⁺ proindukci smrti v buňkách, které mají konstitučně aktivovaný receptor a u kterých vyvolá aktivace receptorů vstup Ca²⁺ do buňky.

Je také možné, aby buňky, které mají receptory, které jsou aktivovány jako odezva na faktor produkovaný samotnou buňkou, byly léčeny blokátorem Ca²⁺ a tak došlo k buněčné smrti.

S ohledem na určité známé faktory mohou být také při indukci buněčné smrti účinné například SLF, varianty SLF, liganda c-kit receptorů. Podle postupů známých odborníkům by se například mohly vyvinout agonistické protilátky c-kit receptorů. Mohly by být účinné také jiné malé molekuly se schopností přemostit receptory a indukovat vstup Ca²⁺. Samotný SLF by se mohl modifikovat mutacemi, aby došlo ke stabilizaci jeho molekuly a tím k prodloužení poločasu v savčím organismu. Alternativně nebo navíc by se mohl SLF modifikovat konjugací s polyethylenglykolem (PEG), aby se prodloužilo jeho dlouhodobé užití.

Namísto IgE a jeho antigenu by mohla být v případě mastocytů použita například protilátka proti samotnému buněčnému IgE receptorů. Je pravděpodobné, že protilátka schopná zkřížené vazby s IgE receptory by nanejvýš pravděpodobně způsobila výskyt vstupu Ca²⁺.

V případě nemocných s alergií jsou alergen-specifické imunoglobuliny z třídy IgE produkovány B buňkami, které byly pro produkci tohoto speciálního izotypu stimulovány alergen specifickými T lymfocyty. IgE protilátky jsou secernovány B lymfocyty do extracelulárního prostoru, kde se mohou navázat na specifické receptory nazývané FcsRI, které se nacházejí na povrchu mastocytů nebo basofilů. V případě setkání těchto mastocytů nebo bazofilů s polyvalentním alergenem, který se rozpozná jejich IgE navázaných na povrchu, mohou být IgE receptory zkříženě vázány a aktivovány, což způsobuje • 99 9·

9 9 9 9

9 9 9 9

9 999 999

9 9

999 99 99

- 41 • ···· et

9

9

9 9

9 uvolnění jednoho nebo více přeformovaných mediátorů, jako je histamin, a případně syntézu a uvolnění dalších zánětlivých molekul, jako jsou leukotrieny, prostaglandiny a cytokiny. Tato komplexní odezva tedy využívá řadu různých buněčných typů a molekul, z nichž všechny jsou možné cíle v modulaci alergické odpovědi. Mezi ně patří B lymfocyty produkující alergen specifické IgE, T lymfocyty exprimující T buněčné receptory specifické pro alergen, mastocyty a basofily, na jejichž povrchu je alergen specifický IgE. Protože všechny signály přenášené těmito receptory mobilizuji Ca , bude možné je pro indukci buněčné smrti kombinovat s blokátory vstupu Ca²⁺, jak bylo ukázáno pro IgE a antigen na mastocytech.V případě B buněk, které exprimují membránové IgE, přemostí tyto molekuly specifické anti-IgE sloučeniny, což bude mít za následek přenos signálu. Takovými sloučeninami mohou být například protilátky, jaké popsal Chang v US patentech 5,422,258 a 5,428,133 nebo Rupp et al., v US patentu č. 4,940,782.

Navíc se mohou použít i fragmenty těchto protilátek, jako (Fab)₂ reagens nebo další sloučeniny, které rozpoznají a přemostí povrchové IgE B lymfocytů. Mají-li být specificky zasaženy B buňky, bylo by vhodné použít reagens, která přednostně rozpoznají IgE na povrchu B buněk, avšak nikoli IgE, pokud je vázané na mastocytech nebo basofilech.

V situacích, kdy je žádoucí specificky eliminovat B buňky produkující protilátky, které rozpoznají určitý antigen, může sám antigen, je-li polyvalentní a podaný v dostatečném množství, poskytnout dostatečný signál v

Λ 1 kombinaci s blokátorem vstupu Ca , takže budou B buňky produkující protilátku usmrceny. Alternativně mohou být také použity antiidiotypické protilátky, které rozpoznají variabilní oblasti protilátky, která je produkovaná B buňkou. Potenciální cíle takové léčby by zahrnovaly B buňky produkující protilátky k vlastnímu antigenu, což vede k

- 42 autoimunitnímu onemocnění.

Existují samozřejmě i další buněčné receptory, které po navázání ligandy na receptor vedou ke vstupu Ca²⁺ do buňky. Agonisty receptoru růstového faktoru v rozsahu tohoto vynálezu zahrnuji TGF-α (transformující růstový faktor), EGF, heregulin a další agonisté erbBl,2,3 & 4, PDGF A a B (destičkový růstový faktor), SLF, FLT-3 (tyrosin kinease jako fms) liganda, zásadité i kyselé FGF (fibroblastové růstové faktory) (skupina příbuzných růstových faktorů), enothelin, NGF nervový růstový faktor), VEGF (vaskulární andotelový faktor), HGF (SF) (jaterní růstový faktor; scatter factor). Agonisté receptorů řetězcového imunitního rozpoznávání zahrnují agonisty antigenového receptoru B buněk (to jest specifické antigeny rozpoznávané B buňkami) včetně protilátek, které přemosťují povrchový imunoglobulin, agonisty receptorů T buněk, jako jsou protilátky rozeznávající specifické TCR, protilátky CD3 nebo další agonisticky působící agregované protilátky a jiné reagenty, které aktivují FcyRII a FcyRIII, a agonisté FceRI receptoru na mastocytech a basofilech. Agonisté receptorů vázaných G proteinem jsou také zahrnuté v rozsahu poučení podle tohoto vynálezu: bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol a další agonisté muskarinového receptoru, CCK-8, vasopresin, neurokininy, jako substance P, agonisté purinergního receptoru zahrnující ATP a adenosin, 1,25-dihydroxyvitamin D3. Existuje také mnoho neurotransmiterů, které stimulují vstup Ca²⁺. V experimentech obdobných experimentu, který je zde popsaný, lze ukázat, že buněčná smrt může nastat v důsledku podání blokátoru vstupu Ca²⁺ a ligandy. Pro použití se mohou také vyvinout varianty takových ligand a agonisticky působících protilátek k receptoru a mohou se testovat pomocí pokusů podobných pokusům popsaných výše, při kterých se měří buněčná smrt jako odezva na podání takovýchto variant v

- 43 • ····

kombinaci s blokátorem vstupu Ca2+.

Blokátory vstupu vápníku zahrnují navíc k blokátorům, které jsou popsané ve spojení s výhodnými provedením, tenidap, CAI, Cd²⁺, Co²⁺, La³⁺, Mn²⁺, SKF-96365 a kromolyn, ačkoliv jich existuje mnohem více než těch, které jsou odborníkům známé (Lewis, et al., 1995).

V každém případě se dá zjistit, že kombinace agens vážících se na receptor podaných v kombinaci s jedním nebo více blokátory vstupu Ca²⁺ je pro vyvolání požadované buněčné odpovědi nejúčinnější.

Jak je naznačeno experimenty, které jsou zde uveřejněny, je to recptor a normální odpověď buňky na signály vyvolané vhodnou vazbou na receptor, co je důležité pro určení, zda se může buněčná smrt indukovat podáním receptorové ligandy (nebo jiného agonisticky působícího agens) a blokátoru vstupu Ca²⁺. Nicméně je známé, že i jiné typy buněk než ty, které byly použity ve zde popsaných experimentech, exprimovaly přinejmenším v určitém stadiu svého životního cyklu takové receptory, které by vytvářely normální buněčnou odezvu potřebnou pro aplikaci vynálezu, který je zde popsán. Příklady dalších buněčných typů známých tím, že exprimují ckit receptor a reagují na SLF, jsou hemopoetické progenitorové buňky, melanocyty a germinální buňky. Příklady buněčných typů, které mohou exprimovat receptory, které váží další ligandy, přičemž tato vazba normálně vede k potřebné odpovědi, zahrnují buňky zhoubných nádorů prsu exprimující EGF a FGF receptory a buňky zhoubných nádorů tlustého střeva exprimující PDGF receptory.

Takové buňky v tumorigenním, hyperplastickém nebo vysoce aktivním stádiu mohou být léčeny podáním vhodného vazebného faktoru a blokátoru vstupu Ca²⁺ podle tohoto vynálezu. Podle tohoto vynálezu bude tedy možné poskytovat léčbu například osobám trpícím rakovinou, mastocytosou, autoimunitním zánětlivým onemocněním nebo alergií.

• · · • · · • · • · · • · • ···· ··

Bylo zjištěno, že c-kit receptor je nadměrně exprimován u leukemických buněk (Muroi et al., 1995) a také byl zjištěn ve vysokém procentu u malobuněčné rakoviny plic (Hilda et al., 1994), u nádorů ženského genitálního ústrojí (Inoue et al., 1994) amůže se vyskytovat také na mastocytech infiltrujících neurofibromy (Hirota et al. , 1993). Takovéto případy jsou tedy primárními kandidáty pro léčbu podle předloženého vynálezu.

V případech, kdy se buňky, na které se má působit ve smyslu tohoto vynálezu, konstitučně aktivují (obrázek 9A) , nemusí již být nezbytné zahrnout agens pro stimulování signálu generovaného navázáním receptorů, protože už je takový signál vyvolán. V takovém případě může být blokátor vstupu Ca²⁺ podán bez doprovodného agens stimulujícího receptor. Je známo, že určité tumorové buňky jsou již tako aktivovány, a proto mohou být léčeny tímto způsobem. V mastocytech lidského původu a hlodavců byla nalezena c-kit aktivující mutace (Kanakura et al. , 1994; Kitayama et al. ,

1995). To neznamená, že by za určitých okolností nebylo výhodné posílit takový signál podáním vhodného faktoru spolu s blokátorem Ca²⁺.

Počátečním krokem ke stanovení, zda by byl určitý buněčný typ citlivý k léčbě podle předloženého vynálezu, by bylo stanovení, zda vazba ligandy na receptor exprimovaný na buněčné membráně povede ke zvýšení koncentrace intracelulárního Ca²⁺. Pro určení hladin, při kterých je indukována buněčná smrt, se pak může provést podání různých koncentrací ligandy a blokátoru vstupu Ca²⁺ buněčným kulturám analogicky k příkladům popsaným pro buňky podle provedení, která jsou uvedena zde.

Pro jednotlivé indikace se bude vhodné dávkování měnit například v závislosti na subjektu, způsobu podání a charakteru a závažnosti léčeného onemocnění a podobně.

Uspokojivé výsledky jsou zjištěny pro denní dávky agens • φ •φ· φφφ • φ φφ · ·

- 45 vázajícího receptor sahající zhruba od 0,1 mg na kilogram hmotnosti těla zvířete přibližně do 1 mg na kilogram hmotnosti těla, ačkoliv toto se může měnit v závislosti na konkrétním agens nebo subjektu léčby nebo léčené nemoci. Pro denní dávku může být dále výhodné, rozdělit ji na 2, 3, 4 nebo více dávek.

Je-li agens polypeptid, jako je růstový faktor, může být podán například ve formě intradermální, intramuskulární nebo intravenózní injekce.

Farmaceutická sloučenina obsahující složku, která váže receptor, podle předloženého vynálezu, by zahrnovala alespoň jeden farmaceuticky vhodný nosič, rozpouštědlo, vehiculum, lubricans, pufr, antibakteriální, objemové agens, antioxidanty a podobně, přičemž tato sloučenina by se vyráběla obvyklým způsobem smísením s farmakologicky vhodným nosičem, rozpouštědlem atd.. Jednotná dávková formule obsahuje například přibližně od 0,025 mg asi do 50 mg sloučeniny.

Za předpokladu, že agens dosáhlo cílové buňky, jak je

Λ I požadováno, mohly by se blokátory vstupu Ca připravit a podat podle známých receptů.

K zasažení specifické buňky, řekněme například B buňky, která produkuje určitý IgE, mohla by se vytvořit agonisticky působící protilátka proti povrchové části daného IgE. Vhodný blokátor nebo blokátory vstupu Ca²⁺ by se mohl vhodně navázat (například kovalentní vazbou) na danou protilátku tak, aby navázání protilátky na povrchový IgE uvedlo blokátor do kontaktu s buňkou, na kterou má působit.

·· ·

- 46 ODKAZY

Přesné údaje o výše citovaných odkazech jsou uvedené níže. Všechny z vyjmenovaných odkazů jsou zahrnuty v tomto seznamu.

Arteaga, C.L., Johnson, M.D., Todderud, G„ Coffey, R.J., Carpenter, G., Page, D.L. (1991) Elevated content of the tyrosine kinase substráte phospholipase C-gamma 1 in primary human breast carcinomas. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10435-9.

Ashweil, J.D., Cunningham, R.E., Noguchi, P.D. & Hernandez, D. (1987) Cell growth cycle block of T cell hybridomas upon activation with antigen. J. Exp. Med., 165,173-194.

Baffy, G., Miyashita, T., Williamson, J.R. & Reed, J.C. (1993) Apoptosis induced by withdrawal of interleukin-3 (IL-3) from an IL-3-dependent hematopoietic cell line is associated with repartitioning of intracellular calcium and is blocked by enforced Bcl-2 oncoprotein production. J. Biol. Chem., 268, 6511-9.

Bargou, R. C., Ρ. T. Daniel, Μ. Y. Mapara, K. Bommert, C. Wagener, B. Kallinich, H. D. Royer and B. Dorken. (1995) Expression of the bcl-2 gene family in normál and malignant breast tíssue: low bax-alpha expression in tumor cells correlates with resistance towards apoptosis. Int. J. Cancer. 60, 854-9.

Benz, C. C., G. K. Scott, J. C. Sarup, R. M. Johnson, D. Tripathy, E. Coronado, Η. M. Shepard and C. K. Osborne. (1993) Estrogen-dependent, tamoxifen-reslstant tumorigenic growth of MCF-7 cells transfected with HER2/neu. Breast Cancer Res. & Trtmnt. 24, 85-95.

Benzaquen, L. R., C Brugnara, H. R. Byers, S. Gattoni-Ceili and J. A. Halpern (1995)

Clotrimazole Inhibits cell proliferation in vitro and in vivo. Nátuře Medicine 1, 534-40.

Berger, S.A., Mak, T.W. & Paige, C.J. (1994) Leukocyle common antigen (CD45) is requlred for immunoglobulln E-mediated degranulation of mast cells. J. Exp. Med., 180, 471-6.

Bonnefoy, B.N., Genestier, L., Flacher, M. & Revillard, J.P. (1994) The phosphoprotein phosphatase calcineurin Controls calcium-dependent apoptosis in B cell lineš. Eur. J. Immunol., 24, 325-9.

Brown, D.M., Warner, G.L., Ales-Martinez, J.E., Scott, D.W. & Phlpps, R.P. (1992)

Prostaglandin E2 induces apoptosis in immature normál and malignant B lymphocytes. Clin. Immunol.l mmunopathol., 63, 221-9.

Buckley, N.E., Su, Y., Milstien, S. & Spiegel, S. (1995) The role of calcium influx in cellular proliferation induced by interaction of endogenous ganglioside GM1 with the B subunit of cholera toxin. Biochim. Biophys. Acta, 1256, 275-83.

Bueb, J.L., Mousli, M., Bronner, C., Rouot, B. & Landry, Y. (1990) Activation of Gi-like proteins, a receptor-independent effect of kinins in mast cells. Molec. Pharmacol., 38,

816-22.

• ·

- 46a « · • · · * · 9

9 999 • 4 · · ·

Casabiell, X., Pandiella, A. & Casanueva, F. (1991) Regulation of epidermal-growth-factorreceptor signál transduction by cis-unsaturated fatty acids. Biochem. J., 278, 679-87.

Casabiell, X., Zugaza, J.L., Pombo, C.M., Pandiella, A. & Casanueva, F.F. (1993) Oleic acid blocks epidermal growth factor-activated early intracellular signals without altering the ensuing mitogenic response. Exp. Cell Res., 205, 365-73.

Chang, T-w. Chirneric anti-human IgE-monoclonal antibody which binds lo secreted IgE and rnernbrane-bound IgE expressed by IgE-expressing B cells bul not lo IgE bound to FC receptors. United States Patent No. 5,428,133 issued June 27, 1995.

Chang, T-w. Methods for producing high affinity anti-human IgE-monoclonal antibodies which hind to IgE on IgE-bearing B cells but not basophils. United States Patent No. 5,422,258 issued June 6, 1995.

Chlnnaiyan, A.M., Orth, K., 0'Rourke, K., Duan, H., Poirier, G.G. & Dixit, V.M. (1996) Molecular ordering of the cell death palhway. J. Biol.Chem. 271, 4573-6.

Columbo, M., Botana, L.M., Horowitz, E.M., Lichtenstein, L.M. & MacGlashan, D.J. (1994)

Studies of the intracellular Ca2+ levels in human adult skin mast cells activated by the ligand for the human c-kit receptor and anti-lgE. Biochem. Pharmacol., 47, 2137-45.

Cuende, E., Ales-Martinez, J.E., Ding, L., Gonzalez-Garcia, M., Martinez-A, C. & Nunez, G. (1993) Programmed cell death by bcl-2-dependent and independent mechanisms in B lymphoma cells. EmboJ., 12, 1555-60.

Denyer et al. (1985) The effects of econazole on the growth of murine myeloma cells and its use in hybridoma production. Developments in Biological Standardization, 60, 503-8.

De Vries, G.W., McLaughlin, A., Wenzel, M.B., Perez, J., Harcourt, D„ Lee, G., Garst, M. & Wheeler, L.A. (1995) The antiinflammatory activity of topically applied novel calciumchannel antagonists. Inflammation, 19, 261-75.

Dowd, D.R. (1995) Calciurn regulation of apoptosis. Adv. Second Mess. & Phospho. Prot. Res., 30, 255-80.

el Yazidi, I. and Y. Boilly Marer. (1995) Production of acidic and basic fibroblast growth factor by the hormone-lndependent breast cancer cell line MDA-MB-231. Anticancer Res. 15, 783-90.

Elstner, E., I. M. Linker, J. Said, T. Umiel, V. S. de, I. P. Shintaku, D. Heber, L. Binderup, M. Uskokovic and Η. P. Koeffler. (1995) 20-epi-vitamln D3 analogues: a novel class of potent inhibitors of proliferalion and inducers of differentiation of human breast cancer cell lineš. Cancer Res. 55, 2822-30.

Enari, M., Hug, H. & Nagata, S. (1995) Involvement of an ICE-like protease in Fas-mediated apoptosis. Nátuře, 375, 78-81.

Estacion, M. & Mordan, L.J. (1993) Competence induction by PDGF requires sustained calciurn influx by a mechanism distinct from storage-dependent calcium influx. Cell

Calciurn, 14, 439-54.

- 46b «4 *

• 4

Elhier, S. P. (1995) Growth faclor synthesis and human breast cancer progression. [Review],

J. Nad.Cancer Inst. 87, 964-73.

Felder, C.C., Ma, A.L., Lioíta, L.A. & Kohn, E.C. (1991) The antiproliferalive and antimetastatic compound L651582 inhibits muscarinic acetylcholine receptorstirnulated calcium influx and arachidonic acid release. J. Pharmacol. Exp. Therapeut., 257, 967-71.

Fox, S. Β., K. Smith, J. Hollyer, M. Greenall, D. Hastrich and A. L. Harris. (1994) The epidermal growth factor receptor as a prognostic markér: results of 370 patients and review of 3009 patients. Breast Cancer Res. & Trtmnt. 29, 41-9.

Franzius, D., Hoth, M. & Penner, R. (1994) Non-specific effects of calcium entry antagonists in mast cells. Pfíugers Archiv/Eur.J. Physiol., 428,433-8.

Fry, D. W. and J. M. Nelson. (1995) tnhibition of basic fibroblast growth factor-mediated tyrosine phosphorylation and protein synthesis by PD 145709, a member of the 2thioindole class of tyrosine kinase inhibitors. Anti Cancer Drug Design. 10, 607-22.

Godden, J., R. Leake and D. J. Kerr. (1992) The response of breast cancer cells to steroid and peptide growth factors. Anticancer Res. 12,1683-8.

Grant, S.M., Goa, K.L., Fitton, A. & Sorkin, E.M. (1990) Ketotifen. A review ofits pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in asthma and allergic disorders. Drugs, 40, 412-48.

Gushchin et al. (1985) Ketotifen effect on secretion of histamine from basophiis and on proliferative response of mononuclear cells of human peripheral blood. Allergologia et Immunopathologia, 13, 111-21.

Hida, T., R. Ueda, Y. Sekido, K. Hibi, R. Matsuda, Y. Ariyoshi, T. Sugiura, T. Takahashi and T. Takahashi. (1994) Ectopic expression of c-kit in small-cell lung cancer. Int. J. Cancer. Suppl. 8, 108-9.

Hines, S. J., C. Organ, M. J. Kornstein and G. W. Krystal. (1995) Coexpression of the c-kit and stem cell factor genes in breast carcinomas. Cell Growth & Diff. 6, 769-79.

Hirota, S., S. Nornura, H. Asada, A. Ito, E. Morii and Y. Kitamura. (1993) Possible involvement of c-kit receptor and its ligand in increase of mast cells in neurofibroma tissues. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 117, 996-9.

Hockenbery, D.M., Zutter, M., Hickey, W., Nahm, M. & Korsmeyer, S.J. (1991) BCL2 protein is topographically restricted in tissues characterized by apoptotic cell death. Proč.

Nad. Acad. Sci. U.S.A., 88, 6961-5.

Honn, K. V., J. D. Taylor and J. M. Onoda. Method and composition for the treatment of tumors by administering a platínum coordination compound and a calcium channel blocker compound of the dihydropyridine class. United States Patent No. 4,906,646 issued March 6, 1990.

• · fl · · flfl • · · · · · « • · · · · · fl » fl fl·· «·· • flfl ··

9 99 9 · · fl· • · fl

- 46c fl · í .· • flfl · · · · fl fl

Horák, Ε., K. Smith, L. Bromley, S. LeJeune, M, Greenall, D. Lané and A. L. Harris. (1991) Mutant p53, EGF receptor and c-erbB-2 expression in human breast cancer. Oncogene. 6, 2277-84.

Hoth, M. & Penner, R. (1992) Depletion of intracellular calcium Stores activates a calcium current in mast cells. Nátuře, 355, 353-6.

Hoth, M. & Penner, R. (1993) Calcium release-activated calcium current in rat mast cells. J. Physiol., 465, 359-86.

Hu, Q., Trevisan, M., Xu, Y„ Dong, W„ Berger, S.A., Lyman, S.D. & Minden, M.D. (1995) cKIT expression enhances the leukemogenic potential of 32D cells. J. Clin. Invest., 95, 2530-8.

Huang, P.S, Davis, L., Huber, H., Goodhart, P.J., Wgrzyn, R.E., Oliff, A., & Heimbrook, D.C. (1995) An SH3 domain is required for the mitogenic activiiy of microinjected phospholipase C-gamma 1. FEBS Letters, 358, 287-92.

Inoue, M., S. Kyo, M. Fujita, T. Enomoto and G. Kondoh. (1994) Coexpression of the c-kit receptor and the stem cell factor in gynecologicai tumors. Cancer Res. 54, 3049-53.

Jones, L.A., Chin, L.T., Longo, D.L. & Kruisbeek, A.M. (1990) Peripheral clonal elimination of functional T cells. Science, 250, 1726-9.

Jouvin, M.H., Numerof, R.P. & Kinet, J.P. (1995) Signál transduction through the conserved motifs of the high affinity IgE receptor Fc epsilon Rl. Sem. Immunol., 7, 29-35.

Kanakura, Y„ T. Furitsu, T. Tsujimura, J. H. Butterfield, L. K. Ashman, H. Ikeda, H. Kltayama, Y. Kanayama, Y. Matsuzawa and Y. Kitamura. (1994) Activating mutations of the c-kit proto-oncogene in a human mast cell leukemia cell line. Leuk. 8 Suppl 1,18-22.

Kitayama, Η., Y. Kanakura, T. Furitsu, T. Tsujimura, K. Oritani, H. Ikeda, H. Sugahara, H. Mitsui, Y. Kanayama, Y. Kitamura and a. I. et. (1995) Constitutively activating mutations of c-kit receptor tyrosine kinase confer factor-independent growth and tuinorigenicity of factor-dependent hematopoietic cell lineš. Blood. 85, 790-8.

Kizaki, H., Tadakuma, T., Odaka, C., Muramatsu, J. & Ishimura, Y. (1989) Activation of a suicide process of thymocytes through DNA fragmentation by calcium ionophores and phorbol esters. J. Immunol., 143,1790-4.

Kohn, E.C., Sandeen, M.A. & Liotta, L.A. (1992) In vivo efficacy of a novel inhibitor of selected signál transduction pathways including calcium, arachidonate, and inositol phosphates. Cancer Res., 52, 3208-12.

Kohn, E. C., W. Jacobs, Y. S. Kim, R. Alessandro, S.W. Stetler and L. A. Liotta. (1994)

Calcium influx modulates expression of matrix metalloproteinase-2 (72-kDa type IV collagenase, gelalinase A). J. Biol. Chem. 268, 21505-11.

Kohn, E. C., Felder, C. C., Jacobs, W., Holmes, K. A., Day, A., Freer R., and Liotta, L. A.

(1994a) Structure-function analysis of signa! and growth inhibition by carboxyamidotrizole, CAl. Cancer Res., 54, 935-42.

• β · · · ·

- 46d

Kondo, N., Fukutomi, O., Kameyama, T., Nishida, T„ Li, G.P., Agata, H„ Shinbara, M.,

Shinoda, S., Yano, M. & Orii, T. (1994b) Suppression of proliferative responses of lymphocytes to fooď antigens by an antí-allergic drug, ketotifen fumarate, in patients with food-sensitive atopic dermatilis. Int. Arch. Allergy & Immunol., 103, 234-8.

Kopreski, M. S., A. Lipton, H. A. Harvey and R. Kumar. (1996) Growth inhibition of breast cancer cell lineš by combinations of anti-P185HER2 monoclonal antibody and cylokines. Anticancer Res. 16, 433-6.

Korsmeyer, S.J. (1995) Regulators of cell dealh. Trends Genet., 11, 101-5.

Kovacs, B. & Tsokos, G.C. (1995) Cross-linking of the Fas/Apo-1 antigen suppresses the

CD3-mediated signál transduction events in human T lymphocytes. J. Immunol., 155, 5543-9.

Krajewski, S., C. Blomqvísl, K. Franssila, M. Krajewska, V. M. Wasenius, E. Niskanen, S. Nordling and J. C. Reed. (1995) Reduced expression of proapoptotic gene BAX is associated with poor response rates to combinalion chemotherapy and shorter survival in women with metastatic breast adenocarcinoma. Cancer Res. 55, 4471-8.

Lampě, P.A., Cornbrooks, E.B., Juhasz, A., Johnson, E.J. & Franklin, J.L. (1995) Suppression of programmed neuronal death by a thapsigargin-induced Ca2+ influx. J. Neurobiol., 26, 205-12.

Li, B. D., K. D. Bauer, W. P. Carney and R. B. Duda. (1993) Detection of c-erbB-2 oncoprotein expression in breast tissue by mulliparameter flow cytometry. J. Surg. Res. 54,17988.

Lee, E. Y. (1995) Tumor suppressor genes and their alterations in breast cancer. Sem. Cancer Biol. 6, 119-25.

LeJeune, S., R. Leek, E. Horák, G. Plowman, M. Greenall and A. L. Harris. (1993)

Amphiregulin, epidermal growth factor receptor, and estrogen receptor expression in human primary breast cancer. Cancer Res. 53, 3597-602.

Levilzki, A. and A. Gazit. (1995) Tyrosine kinase inhibition: an approach to drug development. [Review], Science. 267, 1782-8

Lewis, R.S. & Cahalan, M.D. (1995) Potassium and calcium channels in lymphocytes. Annu. Rev. Immunol., 13, 623-53.

Liu, C. & Hermann, T.E. (1978) Characterization of ionomycin as a calcium ionophore. J.

Biol. Chem., 253, 5892-4.

Lu, Q. L., P. Ábel, C. S. Foster and E. N. Lalani. (1996) bcl-2: role in epitheiial differentiation and oncogenesis. [Review], Hum. Pathol. 27,102-10.

Lupu, R., R. B. Dickson and Μ. E. Lippman. (1992) The role of erbB-2 and its ligands in growth control of malignant breast epithelium. [Review] J. Ster. Biochem. & Molec. Biol. 43, 229-36.

• » • « • » • · ·

- 46e «» * ♦ · ♦ • · » · • · 4 » · • · · » ««·«··· » ·

Mariin, U. & Romer, D. (1978) The pharmacological properties of a new, orally active anlianaphylaclic compound: Ketotifen, a Benzocycloheptathiophene. Arzneim.Forsch./Drug Res., 28, 770-82.

Mashima, T., Nailo, M., Fujita, N., Noguchi, K. & Tsuruo, T. (1995) Identification of actin as a substráte of ICE and an ICE-like protease and involvement of an ICE-like protease but not ICE in VP-16-induced U937 apoptosis. Biocem. Biophys. Res. Commun., 217, 1185-92.

McConkey, D.J., Harzell, P., Amador-Perez, J.F., Orrenius, S. & Jondal, M. (1989) Calciumdependenl killing of immature thymocytes by stimulation via the CD3/T cell receptor complex. J. Immunol., 143,1801.

Memon, S.A., Mořeno, M.B., Petrák, D. & Zacharchuk, C.M. (1995) Bcl-2 Blocks

Glucocorticoid- but not Fas- or Activation-lnduced Apoptosis in a T Cell Hybridoma. J. Immunol., 155, 4644-52.

Mercep, M., Noguchi, P.D. & Ashwell, J.D. (1989) The cell cycle block and lysis of an activated T cell hybridoma are distinct processes with different Ca2+ requirements and sensitivity to Cyclosporine A. J. Immunol., 142, 4085-92.

Miura, M., Friedlander, R.M. & Yuan, J. (1995) Tumor necrosis factor-induced apoptosis is mediated by a CrmA-sensitive cell death pathway. Proč. Nati. Acad. Sel. U.S.A., 92, 8318-22.

Miyashita, T., Krajewski, S., Krajewska, M., Wang, H.G., Lin, H.K., Liebermann, D.A.,

Hofíman, B. & Reed, J.C. (1994) Tumor suppressor p53 is a regulátor of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene, 9,1799-805.

Mousli, M., Bueb, J.L., Bronner, C., Rouol, B. & Landry, Y. (1990) G protein activation: a receptor-independent mode of action for cationic amphiphilic neuropeptides and venom peptides. Trends Pharmacol. Stí., 11, 358-62.

Muroi, K., M. Nakamura, Y. Amemiya, T. Suda and Y Miura. (1995) Expression of c-kit receptor (CD117) and CD34 in leukemic cells. [Review], Leukemia & Lymphoma. 16, 297-305.

Noel, A., V. Borcy, M. Bracke, C. Gilles, J. Bernard, P. Birembaut, M. Mareel and J. M.

Foidart. (1995) Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nudě mice. Anticancer Res. 15,1-7.

Nicotera, P., Zhivotovsky, B. & Orrenius, S. (1994) Nuclear calcium transport and the role of calcium in apoptosis. Cell Calcium, 16, 279-88.

Nunez, G., London, L., Hockenbery, D., Alexander, M., McKearn, J.P. & Korsmeyer, S.J.

(1990) Deregulated Bcl-2 gene expression selectively prolongs survival of growth factor-deprived hemopoietic cell lineš. J. Immunol., 144, 3602-10.

Oltvai, Z.N., Milliman, C.L. & Kormeyer, S.J. (1993) Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 74, 609-619.

- 46f

9 9

9 9

9 9 999

9

9 9 9

Orrenius, S„ Burkitt, M.J., Kass, G.E.N., Dypbukt, J.M. & Nicotera, P. (1992) Calcium ions and oxidative cell injury. Ann. Neuroí, 32, S33-S42.

Parijs, L.V., Ibraghimov, A. & Abbas, A.K. (1996) The roles of coslimulation and Fas in T cell apoptosis and peripheral tolerance. ímmunity, 4, 321-8.

Penner, R., Fasolato, C. & Hotli, M. (1993) Calcium influx and its control by calcium release. (Reviewj. Curr. Op. Neumbioí, 3, 368-74.

Petrasch, S., van, T.L., Motulsky, H.J., Brodde, O.E. & Michel, M.C. (1993) Effects of ketotifen on human lymphocyles in vitro and in vivo. Arzneim.-Forsch../Drug Res., 43, 904-8.

Povoa et al. (1991) Journal of Internal Medicine, 229, 475-7.

Rao, P. & Mufson, R.A. (1994) Human interleukin-3 stimulates a phosphatidylcholine specific phospholipase C and protein kinase C translocation. CancerRes., 54, 777-83.

Reed, J.C. (1994) Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J.Cell Biol., 124,1-6. Rhee, S.G. (1991) Inositol phospholipids-specific phospholipase C: interaction of the gamma isoform with tyrosine kinase. TiBS, 16, 297-301.

Ribeiro, J.M. & Carson, D.A. (1993) Ca²7Mg²⁺ -dependent endonuclease from human spleen: purificafion, properties, and role in apoptosis. Biochem., 32, 9129.

Riccardi, V.M. (1987) Mast-cell stabilization to decrease neurofibroma growth. Preliminary experience with ketotifen. Arch. Dermatol., 123,1011-6.

Riccardi, V. M. (1993) A controlled multiphase trial of ketotifen to mlnimize neurofibromaassociated pain and itching. Arch. Dermatol., 129, 577-81.

Rodriguez-Tarduchy, G., Prupti, M., Lopez-Rivas, A. & Collins, M.K.L (1992) Inhibition of apoptosis by calcium ionophores in IL-3-dependent bone marrow celíš is dependent upon production of IL-4. J. Immunoí, 148,1416-1422.

Rupp, B. J., L. E. Kahn. Monoclonal antibodies against IgE-associated determinants, hybrid cell lineš producing these antibodies, and use therefor. United States Patent No. 4,940,782 issued July 10, 1990.

Schwarze, M.M. & Hawley, R.G. (1995) Prevention of myeloma ceil apoptosis by ectopic bcl-2 expression or interleukin 6-mediated up-regulation of bcl-xL. CancerRes., 55, 2262-5.

Sentman, C.L., Shutter, J.R., Hockenbery, D., Kanagawa, O. & Korsmeyer, S.J. (1991) bcl-2 inhibits multiple forms of apoptosis but not negative selection in thymocytes. Cell, 67, 879-88.

Sliibasaki, F. & McKeon, F. (1995) Calcineurin functions in Ca²⁺-activated cell death in mammalian cells. J. Cell. Bioí, 131, 735-43.

Siifonen, T., E. R. Savolainen and P. Koistinen. (1994) Expression of the c-kit proto-oncogene in myeloproliferative disorders and myeiodysplastic syndromes. Leuk. 8, 631-7.

Slamon, D. J., W. Godolphin, L. A. Jones, J. A. Holt, S. G. Wong, D. E. Keith, W. J. Levin, S.

G. Stuart, J. Udove, A. Ullrich (1989) Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science. 244, 707-12.

« *

Smith, C.A., Williams, G.T., Kingston, R., Jenklnson, E.J. & Owen, J.J.T. (1989) AntibodieS to CD3/T cell receptor complex induce apoptosis in immature T celíš in thymic cultures. Nátuře, 337, 181-4.

Strasser, A., Harris, A.W. & Cory, S. (1991) Bcl-2 transgene inhibi ts T cell death and perturbš thymic self-censorship. Cell, 67, 889-99.

Strasser, A., Harris, A.W., Huang, D.C.S., Krammer, P.H. & Cory, S. (1995) Bcl-2 and

Fas/APO-1 regulate dislinct pathways to lyphocyte apoptosis. EMBO J., 14, 6136-47.

Tadakuma, T., Kizaki, H., Odaka, C., Kubota, R., Ishimura, Y., Yagita, H. & Okumura, K.

(1990) CD4+CD8+ thymocytes are susceptible to DNA fragmentation induced by phorbol ester, calcium ionophore and anti-CD3 antibody. Eur. J. Immunol., 20, 77984.

Takata, M., Homma, Y. & Kurosaki, T. (1995) Requirement of phospholipase C-y2 activation in surface immunoglobulin M-induced B cell apoptosis. J. Exp. Med., 182, 907-914.

Taylor, J.D., K. V. Honn. Inhibition of tumor growth and metastasis with calcium channel blocker compounds. United States Patent No. 4,690,935, issued September 1,1987.

Thor, A. D., D. I. Moore, S. M. Edgerton, E. S. Kawasaki, E. Reihsaus, Η. T. Lynch, J. N.

Marcus, L. Schwartz, L. C. Chen, B. H. Mayall and a. I. et. (1992) Accumulation of p53 tumor suppressor gene protein: an independent markér of prognosis in breast cancers.

J. Natl.CancerInst. 84, 845-55.

Tsujimura, T., Furitsu, T., Morimoto, M., Isozaki, K., Nomura, S., Matsuzawa, Y., Kitamura, Y.

& Kanakura, Y. (1994) Ligand-independent activation of c-kit receptor tyrosine kinase in a murine mastocytoma cell line P-815 generated by a point mutation. Blood, 83, 2619-26.

Tsujimura, T., T. Furitsu, M. Morimoto, Y. Kanayama, S. Nomura, Y. Matsuzawa, Y. Kitamura and Y. Kanakura. (1995) Substitution of an aspartic acid results in constitutive activation of c-kit receptor tyrosine kinase in a rat tumor mast cell line RBL-2H3. Int. Arch. Allergy & Immunol. 106, 377-85.

Vasilakos, J.P., Ghayur, T., Carroll, R.T., Giegel, D.A., Saunders, J.M., Quintal, L., Keane,

K. M. & Shivers, B.D. (1995a) IL-1 beta converting enzyme (ICE) is not required for apoptosis induced by lymphokine deprivation in an IL-2-dependent T cell line. J. Immunol., 155, 3433-42.

Veis, D.J., Sentman, C.L., Bacil, E.A. & Korsmeyer, S.J. (1993) Expression ořthe Bcl-2 protein in murine and human thymocytes and in peripheral T lymphocytes. J.

Immunol., 151, 2546-54.

Wang, Ν. P., H. To, W. H. Lee and E. Y. Lee. (1993) Tumor suppressor activity of RB and p53 genes in human breast carcinoma ceils. Oncogene. 8, 279-88.

Claims (49)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina obsahující blokátor vstupu kalcia pro inhibici růstu buněk, zejména farmaceutická sloučenina pro podání savci jako antiproliferativní agens k zabránění buněčného růstu, která zahrnuje kromě blokátoru vstupu Ca²⁺ faktor, který se normálně váže na receptor uvedené buňky a tím způsobí vstup Ca²⁺ do buňky.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, u které vazba uvedeného faktoru na receptor vede normálně aktivaci fosfolipázy C.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, u které je uvedený blokátor vstupu Ca²⁺ beznapěťově hradlovaný blokátor vstupu Ca²⁺.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1,2 nebo 3, u které je uvedený faktor protilátka působící agonisticky na receptor.
5. 5. Sloučenina podle nároku 1,2 nebo 3, u které je uvedený faktor přirozená liganda receptorů.
6. 6. Sloučenina podle nároku 1,2 nebo 3, u které je uvedený faktor vybraný ze skupiny SLF, TGF-ot, EGF, heregulin, agonisté erbBl, agonisté erbB2, agonisté erbB3, agonisté erbB4, PDGF A, PDGF B, FLT-3 liganda, zásaditý FGF, kyselý FGF, enothelin, NGF, VEGF, HGF, agonisté TCR, agonisté CD3 receptorů, agonisté FcyRII receptorů, agonisté FcyRIII receptorů, agonisté FcoRI receptorů, agonisté Gproteinem vázaných receptorů, bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptorů, CCK-8, vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptorů, APP, adenosin a 1,25-dihydroxyvitamin D₃ a jejich kombinací.
7. 7. Sloučenina podle nároku 6, u které je uvedený faktor

   SLF.
8. 8. Sloučenina podle nároku 1, u které je uvedený faktor antigen povrchové protilátky imunocitu.

   • ·

   Φ * »· • φφφ · φφφ φ • φ φφφ • ΦΦΦ • φ · φ · φ • φ · ♦ · » φ · φφ φ φ · φφ φ* φφ » ♦ · · » * φ φ φφφ »*♦ φ ·

   ---^6—
9. 9. Sloučenina podle nároku 1, u které je uvedený faktor agonista IgE.
10. 10. Sloučenina podle nároku 1, u které vazba uvedeného faktoru na receptor podporuje normálně za nepřítomnosti uvedeného blokátoru vstupu Ca²⁺ růst, přežití a/nebo aktivaci uvedené buňky.
11. 11. Sada farmaceutických sloučenin pro použití na zabránění buněčného růstu u savce, která zahrnuje blokátor vstupu Ca²⁺ a faktor, který se normálně váže na receptor uvedené buňky, takže způsobuje vstup Ca²⁺ do buňky.
12. 12. Sloučenina podle nároku 11, u které vazba uvedeného faktoru na receptor vede normálně k aktivaci fosfolipázy C.
13. 13. Sloučenina podle nároku 11 nebo 12, u které je uvedený blokátor vstupu Ca²⁺ beznapěťově hradlovaný blokátor vstupu Ca²⁺.
14. 14. Sloučenina podle nároku 11,12 nebo 13, u které je uvedený faktor protilátka působící agonisticky na receptor.
15. 15. Sloučenina podle nároku 11,12 nebo 13, u které je uvedený faktor přirozená liganda receptoru.
16. 16. Sloučenina podle nároku 11,12 nebo 13, u které je uvedený faktor vybraný ze skupiny SLF, TGF-α, EGF, heregulin, agonisté erbBl, agonisté erbB2, agonisté erbB3, agonisté erbB4, PDGF A, PDGF B, FLT-3 liganda, zásaditý FGF, kyselý FGF, enothelin, NGF, VEGF, HGF, agonisté TCR, agonisté CD3 receptoru, agonisté FcyRII receptoru, agonisté FcyRIII receptoru, agonisté FcsRI receptoru, agonisté G proteinem vázaných receptorů, bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptoru, CCK-8, vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptoru, APP, adenosin a 1,25-dihydroxyvitamin D₃ a jejich kombinací.
17. 17. Sloučenina podle nároku 16, u které je uvedený faktor SLF.

    ·« * · ·« · · ·« ·« • ♦ « · · « · « ··«· • ftft · * ♦ · ft » · · • · ft · · » · · • ·· · ·· «« «· « · ««
18. 18. Sloučenina podle nároku 11, u které je uvedený faktor antigen povrchové protilátky imunocytu.
19. 19. Sloučenina podle nároku 11, u které je uvedený faktor agonista IgE.
20. 20. Sloučenina podle nároku 11, u které vazba uvedeného faktoru na receptor podporuje za nepřítomnosti uvedeného blokátoru vstupu Ca²⁺ růst, přežití a/nebo aktivaci uvedené buňky.
21. 21. Použití farmaceutické sloučeniny podle nároku 1,2,3, 4,5,6,7 nebo 10 jako antiproliferativního agens.
22. 22. Použití farmaceutické sloučeniny podle nároku 1,2,3, 4,5,6,7,8,9 nebo 10 jako protizánětlivého agens.
23. 23. Použití komponent sady podle nároku 11,12,13,14,15, 16,17 nebo 20 jako antiproliferativního agens.
24. 24. Použití komponent sady podle nároku 11,12,13,14,15, 16,17,18,19 nebo 20 jako protizánětlivého agens.
25. 25. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru, který se normálně váže na receptor buňky a způsobuje tak vstup Ca²⁺ do buňky, k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk.
26. 26. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku 25 k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého vede normálně vazba uvedeného faktoru na receptor k aktivaci fosfolipázy C.
27. 27. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku 25 nebo 26 k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený blokátor vstupu Ca²⁺ beznapěťově hradlovaný blokátor vstupu Ca²⁺.
28. 28. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku

    25, 26 nebo 27 k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor protilátka agonisticky působící na receptor.
29. 29. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku

    25, 26 nebo 27 k přípravě léku pro použití jako agens

    144 ·

    144 44 1

    4 14 tu

    1 4 4 1 1

    11114 1 1

    4 4 4 4 4 44 44 «·

    -w —— inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor přirozená liganda receptoru.
30. 30. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku 25, 26 nebo 27 k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor vybraný ze skupiny SLF, TGF-cc, EGF, heregulin, agonisté erbBl, agonisté erbB2, agonisté erbB3, agonisté erbB4, PDGF

    A, PDGF B, FLT-3 liganda, enothelin, NGF, VEGF, HGF, receptoru, agonisté FcyRII receptoru, zásaditý FGF, kyselý FGF, agonisté TCR, agonisté CD3 receptoru, agonisté FcyRIII agonisté FceRI receptoru, agonisté G proteinem vázaných receptorů, bombesin, gastrin, peptid uvolňující gastrin, bradykinin, karbachol, agonisté muskarinového receptoru, CCK-8, vasopresin, neurokininy, substance P, agonisté purinergního receptoru, APP, adenosin a 1,25dihydroxyvitamin D₃ a jejich kombinací.
31. 31. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku 30 k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor SLF.
32. 32. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku 25 k přípravě léku pro použití jako agens inhibující růst uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor antigen povrchové protilátky imunocytu.
33. 33. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru podle nároku 25 k přípravě léku pro použití jako agens pro inhibování růstu uvedených buněk, u kterého je uvedený faktor agonista IgE.
34. 34. Použití blokátoru vstupu Ca²⁺ a faktoru z nároku 25 k přípravě léku pro použití jako antiproliferativní agens, u kterého vazba uvedeného faktoru na receptor normálně za nepřítomnosti uvedeného blokátoru vstupu Ca²⁺ působí růst, přežití a/nebo aktivaci uvedené buňky.

    ···· »♦»· «··· «·* » · ♦ · · * « · * · · » ♦ * · · · * ··« *»· • » · » · · · · • · · · * * « * ·· ·· 4» ¹ Gíř
35. 35. Způsob určování citlivosti nemocných savčích buněk na léčbu blokátorem vstupu Ca²⁺ nebo blokátorem a faktorem, který dále aktivuje receptory buněk, zahrnující:

    - analyzování, zda vzorek tkáně obsahuje hladinu PLC aktivity vyšší ve srovnání s normální tkání, kde

    - zvýšená hladina aktivované PLC ukazuje, že buňky jsou pravděpodobně citlivé na uvedenou léčbu.
36. 36. Způsob podle nároku 35, který dále zahrnuje získání vzorku nemocné tkáně.
37. 37. Způsob podle nároku 35 nebo 36, u kterého fáze analyzování vzorku zahrnuje stanovení množství PLC substrátu, který reaguje za přítomnosti PLC získaného z předem určeného množství uvedené tkáně.
38. 38. Způsob podle nároku 37, který dále zahrnuje izolaci PLC z předem určeného množství uvedené tkáně pomocí enzymelinked immunosorbent assay.
39. 39. Způsob podle nároku 37 nebo 38, u kterého je uvedený PLC substrát [³H]-PIP2.
40. 40. Způsob uchovávání agens sloužících jako blokátor vstupu Ca²⁺, kde způsob zahrnuje fáze:

    - kultivace první skupiny buněk v přítomnosti agens, při které mají buňky aktivovaný receptor, který podporuje vstup Ca²⁺ do těchto buněk;

    - kultivace druhé skupiny buněk za přítomnosti agens, při které buňky této druhé skupiny postrádají aktivovaný receptor, který by podporoval vstup Ca²⁺ do těchto buněk;

    - zjištění, zda růst buněk v první skupině je menší než první předem stanovená hladina odpovídající růstu buněk první skupiny bez přítomnozti agens; a

    - zjištění, zda je růst buněk v druhé skupině v podstatě stejný jako druhá předem stanovená hladina odpovídající růstu buněk druhé skupiny za nepřítomnosti agens; u kterého

    - růst buněk v první skupině menší než první předem stanovená hladina a růst buněk v druhé skupině v podstatě • ftft » • ti ·» ftft ftft • · · ft « ftft «ftft « ftft ♦ · ft * · ft ftftft ft ft · • ftftft ftft ftft «ft stejný jako druhá předem stanovená hladina naznačuje, že uvedený agens je blokátor vstupu Ca²⁺.
41. 41. Způsob podle nároku 40, u kterého se receptor první skupiny aktivuje konstitučně.
42. 42. Způsob podle nároku 40, u kterého je receptor první skupiny buněk podroben autokrinní stimulaci.
43. 43. Způsob podle nároku 40, u kterého se receptor první skupiny buněk aktivuje exogenním agens.
44. 44. Způsob podle nároku 43, u kterého je agens přirozená liganda receptoru první skupiny buněk.
45. 45. Způsob podle nároku 40, 43 nebo 44, u kterého je receptor první skupiny buněk a receptor druhé skupiny buněk tentýž receptor.
46. 46. Způsob podle nároku 40,43,44 nebo 45, u kterého je receptor vybraný ze skupiny c-kit receptor, receptor pro EGF a receptor pro FGF.
47. 47. Způsob podle nároku 40,41,42,43,44,45 nebo 46, u kterého jsou buňky první skupiny i buňky druhé skupiny lidské buňky.
48. 48. Způsob podle nároku 40,41,42,43,44,45 nebo 47, u kterého jsou buňky první skupiny mastocyty, buňky druhé skupiny jsou mastocyty, receptor je c-kit receptor a první skupina buněk se kultivuje za přítomnosti SLF.
49. 49. Způsob podle nároku 40, u kterého se první skupina buněk vybaví uvedeným receptorem první skupiny buněk.